DE2506712C3

DE2506712C3 - Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin

Info

Publication number: DE2506712C3
Application number: DE19752506712
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr.Rer.Nat. Beaucamp; Wolfgang Dr.Phil.Nat. Gruber; Gunter Lang; Hans Moellering; Peter Dr. Rer.Nat. Roeschlau
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1974-03-01
Filing date: 1975-02-18
Publication date: 1980-05-14
Also published as: DE2506712B2; AT335626B; DE2559875C2; DE2559875B1; DE2506712A1; ATA167974A

Description

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins mit Cholesterinesterase und anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins nach bekannten Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß gebundenes Cholesterin mit Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rugosa, freigesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus Rhizopus spec. WS 90027 oder Aspergillus spec. WS 90030 verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus

Actinomyces aureoverticillium
Actinornyccs cyaneofuscatus
Actinomyces griseomycini
Actinomyces longisporus-fl.
Actinomyces malachiticus
ActinomycLS roseolus
Actinomyces toxytricini
Actinomyccs variahilis
Streptomyces spec.
Streptnmyces autotruphicus
Streptomyces canescens
Streptomyces chartrcusis
Streptomycs michiganensis
Streptomyces murinus
Streptomyces hachijocnsis
Streptomyces caelestcs
Streptiimyccs tendac
Nocardia ruhra
Candida mycoderma
Candid;, alhicans
C'uncidii alhicans
Candida alhicans
Candida spec.
Cimninghaniella elcgans
Mueor niuccdi)
Pcnicillium spec.
AspiTgillusspec.
verwendet wird

4. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung vollenzyniatisch durch Kombination mit einer enzymatischen Hestimmung fur freies Cholesterin durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase und cm Enzym zur Hestimmung von freiem C hnlesterin gleichzeitig zugesetzt werden.

6. Verfallen nach einem der Ansprüche 1 Ins 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus verwendet wird, der auf einem Cholestcrincstcihaltigen Nährmcdkim gezüchtet wurde.

7. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin bestehend aus Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rügösa, und einem System z.ur Bestimmung von freiem Cholc^ sterin.

8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Choleslcrincslcrase aus ei' η em Mikroorganismus gemäß Anspruch 2 oder 3 enthält.

WS 90002 WS 90003 WS 90004 WS 90005 WS 90006 WS 90007 WS 9000S WS 90009 WS 90010 WS 90011 WS 90(112 WS 90013 WS 90014 WS 9(M) I 5 WS 90016 WS 90017 WS 900IS WS 90019 WS 90020 WS will»: 1 WS 9(1022 WS 00023 WS 90024 WS 90025 WS 90026 WS 9OO2.S WS 90(129 Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder von gebundenem Cholesterin gemäß dem Oberhegriff des Anspruchs Ϊ.

Cholesterin liegt in biologischem Material, wie z. B. Serum u. dgl., teils in freier Form, teils in gebundener Form als Ester vor. Zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin oder des gesamten Cholesterins ist es erforderlich, das in gebundener Form vorliegende Cholesterin zuerst freizusetzen. Dies erfolgte bisher durch Verseifung entweder unter alkalischen Bedingungen, beispielsweise mit alkoholischer Kalilauge oder mit Cholesterinesterase. Nach der Verseifung kann das freigesetzte Cholesterin dann nach einer der bekannten Methoden, entweder chemisch oder enzymatisch, bestimmt werden. Die chemische Bestimmung kann beispielsweise nach dem Verfahren von I.iebermann-Burchard erfolgen, die enzymatische Bestimmung kann mittels Cholestcrinoxydase, Cholesterindehydrogenase oder Cholesterindehydrase erfolgen. Da bekannterweise die einzelnen Cholestennester als auch das freie Cholesterin hei den chemischen Bestimmungsmethoden unterschiedliche Extinktionskocffizicnten haben, ist es erforderlich, die Cholesterinester durch Verseifung in freies Cholesterin überzuführen.

Bei dem aus der DE-AS 2 224 132 bekannten Verfahren erfolgt die Verseifung der Cholesterinester mit Cholsterincsterase aus Pankreas oiler Leber. Dieses Verfahren beseitigt die Nachteile der alkalischen Freisetzung und gestattet eine vollenzymatische Cholesterinhcstimmimg. Ein Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, daß die erwähnte bekannte Cholesterinesterase das im biologischen Material in Form von Eistern sehr unterschiedlicher Säuren vorliegende gebundene Cholesterin mit erheblich unterschiedlicher Geschwindigkeit spaltet und außerdem die Spaltraten nicht quantitativ sind, sondern nur maximal Wk erreichen (J. of Biol. Chem. 244. 1937 bis 1945 [l')69|). Daher kann dieses Enzym nur in Kombination mit einer Reaktion zufriedenstellend im Rahmen der Cholesterinhestimmung eingesetzt werden, welche freigesetztes Cholesterin gleich aus dem Gleichgewicht abzieht.

Aufgabe der Erfindung ist es daher ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin zu schaffen, welches die obenerwähnten Nachteile beseitigt.

Hrfindungsgemaß gelingt dies durch ι in Verfahren zur Hestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterins mit Cholesterinesterase und anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins nach bekannten Methoden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß gebundenes Cholesterin mit Cliölcstcriiieslcrase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rugosa, freigesetzt wird.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung der Tatsache, daß in Mikroorganismen nicht nur Cholcstcrinestciasc vorhanden ist, was nicht vorhersehbar war, sondern daß die Cholcstcrincsterasc

aus Mikroorganismen den bekannten Cholesterinesterasen anderen Ursprungs überlegen ist, eine quantitative Spaltung der verschiedenen vorkommenden Cholesterinester mit etwa gleicher Geschwindigkeit durchführt und außerdem auch inagesamt wesentlich rascher spaltet als das bisher bekannte Enzym. Aufgrund dieser Eigenschaften kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Kombination mit nichtenzymatischen Cholesterinbestimmungsmethoden vorteilhaft angewendet werden und die vollenzymatische Cholesterinbestimmung wird erheblich verbessert, was insbesondere eine wesentlich leichtere Adaption des Verfahrens auf die Durchführung in Analysenautomaten ermöglicht.

Aus Nocardia restrictus war zwar bereits eine Steroidesterase bekannt, hierbei handelt es sich jedoch um ein anderes Enzym, welches die .!^-Stellung nicht angreift. Da alle Cholesterinester eine 3/3-Estergruppe enthalten, stellen sie kein Substrat dieses bekannten Enzyms «Jir.

Die Verwendung einer Cholesterinesterase aus dem Mikroorganismus Candida rugosa bzw. cynlindracea zur Freisetzung von gebundenem Cholesterin bei einem Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin ist bereits in der älteren Anmeldung DE-OS 2315501 vorgeschlagen.

Es wurde gefunden, daß verschiedene Mikroorganismen besonders aktive Cholesterinesterasen enthalten und daher im Rahmen des eifindungsgemäßen Verfahrens ohne Abtrennung und Reinigung der' Cholesterineslerasen direkt eingesetzt werden können. Dies hat neben der besonders einfachen Zugänglichkeit auch den Vorteil, dab hei U;,(erlassung jeder Trennung und Anreicherung d<_r Cholesterincsterase die Gefahr vermieden wird, daß aus d. r in der Praxis meist vorliegenden Mischung mehrerer, für verschiedene Cholesterinester spezifischer Cholcsterinesterasen eine Trennung derselben, die eine quantitative Erfassung alles gebundenen Cholesterins sehr erschweren würde, vermieden wird.

Hinzu kommt noch, daß die Reinigung der meist in Lipoidmembrancn gebundenen Cholcterinesterasen umständlich ist und daher zu einem Präparat führt, das aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik weniger gut geeignet ist als ein ohne jegliche En/ynireinigung brauchbares Mikroorganismenpraparat.

Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden beim erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung einer Cholesterinesterase aus Aspergillus spec. WS 90030 erhalten. !Dieser Mikroorganismus kann direkt als solcher oder in aufgeschlossener Form, beispielsweise als Acetontrockenpulver im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden. Ebenso ist aber natürlich auch die Verwendung eines angereicherten Cholcsterinesterasepräparates aus diesem Mikroorganismus möglich, wobei ein besonderer Vorteil darin besteht, daß eine gewisse Anreicherung hier sehr einfach erzielt werden kann. Ähnlich günstige Eigenschaften wurden gefunden bei

ALiIIiOiH)L-L¹S aureoverticillium WS 'J0002

Actinomyces cyaneofuscatus WS ¹JUUlU

Actinomyces griseomycini WS 90004

Actinomyces longisporus-fl. WS 90005

Actinomyces malachiticus WS 90006

Actinomyces roseolus WS 90007

Actinomyces toxytricini WS 90008

Actinomyces variabilis WS 90009

Streptomyces spec. WS 90010

Streptomyces autotrophicus WS 90011

Streptomyces canescens WS 90012

Streptomyces chartreusis WS 90013

Streptomyces michiganensis WS 90014

Streptomyces murinus WS 90015

Streptomyces hachijoensis WS 90016

Streptomyces caelestes WS 90017

Streptomyces tendae WS 90018

Nocardia rubra WS 9Ou 19

Candida mycoderma WS 90020

Candida albicans WS 90021

Candida albicans WS 90022

Candida albicans WS 90023

Candida spec. WS 90024

Cunninghamella elegans WS 90025

Mucor mucedo WS 90026

Rhizopus spec. WS 90027

Penicillium spec. WS 90028

Aspergillus spec. WS 90029

Wie bereits erwähnt, besteht ein besonders wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß mit den Cholesterinesterasepräparaten aus Mikroorganismen eine raschere und quantitative Freisetzung des Cholesterins aus seinen Estern möglich ist. Insbesondere mit dem obenerwähnten bevorzugten Mikroorganismus ist es möglich, durch direkten Zusatz desselben in ein :r sehr geringen Menge und unter Beibehaltung der pH-Wert- und Temperaturbedingungen, wie sie bei der nachfolgenden enzvmatisehen Cholesterinbestimmung erwünscht sind, innerhalb weniger Minuten eine quantitative Freisetzung des Cholesterins zu erzielen. Dabei wurde gefunden, daß die üblichen Stabilisierungsmittel auf Kohlehydratbasis, welche für solche Mikroorganismen verwendet werden, im Rahmen des vollenzymatischen Verfahrens der Cholesterinbestimmung nicht stören Wie erwähnt, kann für das erfindungsgemäße Verfahren auch eine abgetrennte und angereicherte Cholesterinesterase aus Mikroorganismen verwendet ' werden. Eine geeignete Anreicherung iälJl sich erzielen, indem von einem Acetontrockenpulver des Mikroorganismus ausgegangen wird und dieses einer Dialyse, einer Behandlung mit schwach-hasischem Anionenaustauscher und einer Ammonsulfatfraktionierung unterzogen «ird. Auf diese Weise gelingt leicht eine 20- bis 3(!fache Anreicherung der Cholesterinesterase. Als schwach-basischer Anionenaustauscher erwies sich ein mit Di.ith)!aminoathanol-' gruppen modifiziertes Präparat auf Kohlehydrathasis ' als besonders geeignet. Bei der Ammonsulfatfraktinnierung wird vorzugsweise die Fraktion zwischen I.N und 2,4 Mol Ammonsulfat gewonnen Die so erhaltene En/ymfraktion wird anschließend vorzugsweise auf dem genannten Austauschermaterial chromatographiert.

Besonders günstige Ergebnisse wurden im Rahmen der Erfindung mit Mikroorganismen erhalten, welche auf einem Cholesterincsterhaltigen Nahrmedium gezüchtet wurden. Hierbei kann der (holesterinesler ¹ oder eine Cholestcrinestermischung als einzige Koh-Ienstoffqticlle Während der Züchtung zugesetzt werden oder zusammen mit einer anderen Kohlenstoffquelle verwendet werden, Besonders bevorzugt wird die Verwendung von Mikroorganismen, die in einem ' mehrstufigen Züchtuiigsverfahren erhalten wurden, wobei sie in der ersten Stufe auf einem geeigneten Kohlenstofflieferanten, wie Glycerin, und in der zweiten Stufe auf einem Cholesterinester gez.üchtet wer-

den. Ein geeignetes Züchtungsverfahren ist beispielsweise in den deutschen Offenlegungsschriften 2224133 und 2307518 beschrieben.

Die Wirksamkeit der Cholesterinesterase wird vorzugsweise durch Zusatz oberflächenaktiver Substanzen gesteigert. Besonders bevorzugt wird ein Zusatz von Hydroxypolyäthoxydodecan.

Wie bereits erwähnt, wird besonders bevorzugt das Verfahren der Erfindung vollenzymatiach durchgeführt, d. h. die anschließende Cholesterinbestimmung m erfolgt ebenfalls enzymatisch, z. B. unter Verwendung von Cholesterinosydase, Cholesterindehydrase oder Cholesterindehydrogenase.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus '5 Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rugosa, und einem Reagens zur Bestimmung von freiem Cholesterin.

Das Reagens kann zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen enthalten.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige Verseifung von gebundenem Cholesterin durchführen. Beispielsweise wird unter den Bedin- -'"> gungen der Cholesterinbestimmung mit Cholesterinoxydase erfindungsgemäß eine quantitative Spaltung von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem Zusatz von Aspergillus sp. WS 90030 Acetontrockenpulver in einer Menge zwischen i¹' 0,1 und 0,3 mg erzielt.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter.

Beispiel

10 g Diammoniumhydrogenphosphat werden in 100 ml Wasser gelöst und mit 85%iger Phosphorsäure auf pH 7,0 eingestellt. Dann werden 10^s U Katalase zugesetzt. Mit der so erhaltenen Lösung wird eine Mischung von 0,2 ml Acetylaceton, 10 ml Methanol und 0,1 g Hydroxypolyäthoxydodecan auf 100 ml aufgefüllt. Zu dieser Lösung werden 2,5 U Cholesterinesterase aus Rhizopus spec. (WS 90027) gegeben.

5,0 ml der so erhaltenen Lösung werden mit 0,02 ml Serum bzw. 0,02 ml einer Cholesterin-Standard-Lösung mit einem Gehal't von 200 mg% Cholesterin gemischt. Aliquotes der serumhaltigen sowie der cholesterinstandardhaltigen Probe werden mit je 0,1 U Cholesterinoxydase verletzt und 60 Minuten bei 37° C inkubiert. Dann wird der gebildete Farbstoff bei 405 nm photometrisch gemessen unter Berücksichtigung des Proben-Leerwertes.

Der Cholesteringehalt der serumhaltigen Probe betrug - unter Benutzung eines Standards als Bezugsgroße - 154 mg% Gesamtcholesterin. Die Kontrollbestimmung mit Cholcsterinesterase aus Candida rugosa ATCC 14830 anstelle von Cholesterinesierase aus Rhizopus spec. (WS 90027t ergab den gleichen Wert.