DE2316637A1 - Verfahren zur bestimmung von cholesterin - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von cholesterin

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Description

Patentanwälte Dipl.-Inc F. Veickmann, 2316637
Dipl.-Ing. H.^EicxMANN. DIPL.-PHYS. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
■ 8 MÜNCHEN 86, DEN HKW POSTFACH 860 820
int. Nr. 1883 möhlstrasse 22, rufnummer 983921/22
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, 68 Mannheim 31, Sandhofer Str.112-132
Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin
Zusatz zu Patent . (Patentanmeldung P 22 24 132.3-52)
Gegenstand des Hauptpatentes ist ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Cholesterin in wässrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H2Op bzw. Cholestenon bestimmt wird. Um nach diesem Verfahren auch gebundenes Cholesterin bestimmen zu können, wird in einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens in einem Ansatz zunächst freies Cholesterin bestimmt, dann Cholesterinesterase zugesetzt und anschließend das gebundene Cholesterin bestimmt.
Das Vorkommen einer Cholesterinesterase ist z.B. für Pankreas, Leber und andere Organe sowie für Mikroorganismen bereits bekannt. Durch die Verwendung einer derartigen Cholesterinesterase ergibt sich gegenüber einer Verseifung von gebundenem
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Cholesterin durch alkalische Hydrolyse, beispielsweise mit alkoholischer Kalilauge, der Vorteil einer vollenzymatisehen und damit der medizinischen Routinediagnostik besser zugänglichen Methode. Bei der chemischen Hydrolyse ergeben sich nämlich Schwierigkeiten bei der anschließenden enzymatisehen Bestimmung, welche eine sorgfältige Aufarbeitung des Hydrolysate vor Durchführung der enzymatisehen Bestimmung erforderten.
Durch die Verwendung von Cholesterinesterase konnte zwar dieser Nachteil beseitigt werden. Es bestand jedoch bisher die Schwierigkeit, daß es mehrere Esterasen gibt, die für die Abspaltung der verschieden langen Fettsäurereste, mit denen das Cholesterin z.B. im Serum verestert vorliegt, spezifisch sind« Da die bekannten Cholesterinesterasen vor einer Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin erst gereinigt werden mußten, ergab sich hierbei eine Trennung dieser unterschiedlichen Aktivitäten und eine quantitative Erfassung des Gesamteholesterins im Serum mit derartigen Cho-Iesterinesterasepräparaten erwies sich als schwierig.
Hinzu kommt, daß die Reinigung der meist in Lipoidmembranen gebundenen Enzyme umständlich ist und daher zu einem Präparat führt, das schon aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik kaum in Betracht kommt.
Aufgabe der Erfindung war die Beseitigung dieser Schwierigkeit und die Schaffung eines Präparates mit Chol&sterinesterasewirksamkeit, welches auf einfachste Weise erhältlich ist und aufgrund seiner einfachen Zugänglichkeit auch für die Routinediagnostik in Betracht kommt. Insbesondere war es eine Aufgabe der Erfindung, ein Präparat der genannten Art zu schaffen, welches in der Praxis die verschieden langen
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Fettsäuren am Cholesterin mit gleicher Geschwindigkeit abspaltet lind diese Abspaltung in so kurzer Zeit vollzieht, daß hierdurch keine merkliche Verzögerung im Routinetest gegenüber der für die Bestimmung von freiem Cholesterin benötigten Zeit erforderlich ist.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgeraäß dadurch, daß man zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin den Mikroorganismus Candida eylindraeea oder ein aus demselben hergestelltes Aufschlußprodukt mit Cholesterinesteraseaktivität zusetzt. Bevorzugt wird hierbei die Verwendung eines direkt aus dem genannten Mikroorganismus erhaltenen Acetontrockenpulvers. Es kann aber auch nicht aufgeschlossener Mikroorganismus oder eine daraus angereicherte Cholesterinesterase verwendet werden.
Bei Candida eylindraeea handelt es sich um einen großtechnisch produzierten Mikroorganismus, der seit Jahren aufgrund seiner Lipaseaktivität im Handel erhältlich ist und technologisch angewendet wird. Die gebräuchliche Handelsform dieses Mikroorganismus in Form eines mit Lactose stabilisierten Trockenpulvers (Acetontrockenpulver) erv/ies sich als besonders gut geeignet für das Verfahren der Erfindung.
Die Erfindung beruht auf der unerwarteten Feststellung, daß der genannte Mikroorganismus eine Cholesterinesterase von außerordentlicher Aktivität enthält. Es ist ohne weitere Reinigung dieses Mikroorganismus möglich, durch Zusatz . einer sehr geringen Menge desselben unter pH-Wert- und Tem-, peraturbedingungen wie sie bei der enzymatischem. Cholesterinbestimmung zur Anwendung kommen, innerhalb weniger Minuten eine quantitative Freisetzung von Cholesterin aus seinen Estern zu erzielen.
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Wie bereits erwähnt, sind die handelsüblichen Formen von Candida cylindracea für.das Verfahren der Erfindung beson-. ders geeignet. Diese handelsüblichen Formen sind üblicherweise mit Kohlehydraten v/ie Lactose stabilisiert. Bei den im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einsatz kommenden sehr geringen Mengen des Mikroorganismus bzw. seines ■ Trockenpräparates stören derartige Stabilisierungsmittel die CholesterinbeStimmung nicht und können vernachlässigt werden.
Wie bereits erwähnt, kann im Rahmen der Erfindung auch ein angereichertes Pro'teinpräparat mit Cholesterinesterase verwendet werden. Eine derartige Anreicherung kann beispielsweise vom handelsüblichen Acetontrockenpulver ausgehen und aus einer Dialyse, Behandlung mit schwach-basischem Anionenaustauscher und Ammoniumsulfatfraktionierung bestehen.. Auf diese Weise gelingt leicht eine 20- bis 30-fache Anreicherung der Cholsterinesterase. Günstige Ergebnisse wurden erzielt, wenn zuerst eine Behandlung mit einem mit Diäthylaminoäthänolgruppen modifizierten Dextranpräparat, anschließend eine Ammoniumsulfatfraktionierung, bei der die Fraktion 1,8 bis 2,4 molar gewonnen wurde, und anschließende Chromatographie dieser Fraktion auf dem vorstehend genannten Austauschermaterial durchgeführt wurde„
Die erfindungsgemäß verwendete Cholesterinesterase aus Candida eylindracea weist im schwach-sauren Bereich zwischen pH 5 und 6,5 sehr gute Stabilität auf. Das pH-Optimum des Enzyms liegt bei 7,5. Eine Besonderheit des Enzyms liegt darin, daß ein besonders guter Ablauf der katalytischen Reaktion bei relativ hohem Salzgehalt 'des Reaktionsmediums erfolgt. Vorzugsweise wird daher in einer 0,2 bis O5S M9 insbesondere 0,4 bis 0,6 M, Pufferlösung gearbeitet. Der pH-Wert kann im Bereich zwischen 4,5 und 7,5 liegen«, vorzugsweise im oben erwähnten Bereich pH 5 bis 6,5«
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Die verschiedenen Möglichkeiten zur Ausführung der CholesterinbeStimmung sind im oben erwähnten Hauptpatent ausführlich beschrieben. Prinzipiell kann der Sauerstoffverbrauch, die HpOp-Bildung oder die Cholestenonbildung gemessen werden. Die Bestimmung des SäuerstoffVerbrauchs kann beispielsweise gasehromatographisch, polarometrisch oder nach dem Polarisationsverfahren erfolgen. Diese Bestimmungsmethoden sind an sich bekannt. Gebildetes Wasserstoffperoxyd kann titrimetrisch, potentiometrisch, polarograph!sch und colorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt ist die enzymatische Bestimmung unter Verwendung von Katalase oder Peroxydase, insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von ß-Diketonen wie Acetylaceton und niedrigen Alkoholen oder die Bestimmung mittels Peroxydase in Gegenwart eines Chromogens wie 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Cholestenon wird mit Hilfe von Ketoreagenzien, z.B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin bestimmt.
Gegenstand der Erfindung ist weiter auch ein Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von HpO2 oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin, bei dem das Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin aus Candida eylindracea, insbesondere in Form eines Aeetontrockenpulvers desselben oder einer aus demselben erhaltenen Proteinfraktion mit Cholesterinesteraseaktivität besteht. In einer ersten bevorzugten Ausführungsform besteht dieses Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Puffer, einzeln oder gemischt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterin-
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esteraseaktivität, Peroxydase, Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt. Als Chromogen wird 2,2I-Aminobenzthiazolinsulfonsäure bevorzugt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Reagens aus Cholesterinoxydase, einem Candida cylindracea-Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit und einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt.
Die oben erwähnten bevorzugten Reagenskombinationen können außer den angeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächen, aktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und in Kachweissystemen für Wasserstoffperoxyd bzw. Cholestenon üblich.
Vorzugsweise enthalten die oben erwähnten Reagenskombinationen die essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen: .-"""". ' . ■
1. 13 bis 150 TJ Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontroekenpulver (bezogen auf das Protein), 2 χ 104 bis 5 x 105 U Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton und 2 bis 10 ml Methanol in 100 ml Ammoniumionenhaltigem Puffer pH 5 bis 7 sowie gegebenenfalls 0,02 bis 0,3 ml eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan.
2. 3 bis 40 TJ Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein),
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sowie 2 χ 10 bis 1 χ 1Cr U Peroxydase, 50 "bis 200 mg 2,2'-AminobenztMazolinsulfonsäure sowie gegebenenfalls 0,05 bis 0,5 ml oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan, in 100 ml Puffer pH 6 bis 8«
3. 0,1 bis 1 IT Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontroekenpulver (bezogen auf das Protein), 1 bis 5 ml einer 1 mM Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin sowie gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel.
4. 2 bis 100 U Cholesterinoxydase, 0,05 bis 0,5 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver (bezogen auf das Protein), sowie gegebenenfalls 0,1 bis 2,0 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan), in 50 ml Puffer pH 5 bis 9, vorzugsweise in 0,5 m Hatriumphosphatpuffer pH 7,5.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige Verseifung von gebundenem Cholesterin durchführen. Beispielsweise wird unter den Bedingungen der Cholesterinbestimmung mit Cholesterinoxydase erfindungsgemäß eine quantitative Spaltung von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem Zusatz von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver in einer Menge zwischen 0,1 und 0,3 mg erzielt.
* Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
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Beispiel 1
In Serum wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 der deutschen Patentanmeldung P 22 24 132.3-52 beschriebenen Verfahrens der Gehalt an freiem Cholesterin zu 63 mg$ (63 mg in 100 ml) bestimmt. Zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin wurde eine Vergleichsprobe des Serums 30 Minuten mit alkoholischer Kalilauge bei 700C behandelt. Uach Neutralisation und erneuter Messung des vorhandenen Cholesterins ergab sich ein Gesamtgehalt von 181 mg$ Cholesterin. Hieraus ergibt sich, daß 118 mg Cholesterin/100 ml in gebundener Form vorlagen.
Das Verfahren wurde mit unbehandeltem Serum wiederholt, jedoch wurden zu Beginn der Bestimmung·0,3 mg (bezogen auf das Protein) Candida cylindracea-Acetontrockenpulyer in handelsüblicher Form zugesetzt. Fach 3 Minuten ergab die polarographisehe Bestimmung einen Gehalt von 183 mg$ Gesamt-Cholesterin. -
Beispiel 2
Das Verfahren von Beispiel 2 des Stammpatentes wurde wiederholt unter Zusatz von 0,1 mg Candida cylindracea-Acetontrockenpulver. Die erhaltenen Ergebnisse hinsichtlich des Gehaltes an gebundenem Cholesterin standen in guter Übereinstimmung mit den durch alkalische Verseifung erhaltenen Resultaten. Dies zeigt, daß keine Störung der üblichen Wasserstoff peroxydnachweisreaktion vorliegt. " '
Ein entsprechendes Ergebnis wurde erhalten, wenn gemäß Beispiel 4 des Stammpatentes gebildetes Cholestenon bestimmt wurde und in Gegenwart von Candida cylindracea-Acetontrockenpulver gearbeitet wurde.
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Beispiel 3
Zur Anreicherung der Cholesterinesteraseaktivität wurde handelsübliches Acetontrockenpulver von Candida cylindracea in Kaliumphosphatpulver pH 6,0 gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Nach Entfernung der als Stabilisierungsmittel enthaltenen Lactose ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 0,3 U/mg Protein in der dialysierten lösung.
Die so erhaltene Lösung wurde mit einem mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifizierten Ionenaustauscher auf Dextranbasis verrührt, der Austauscher abgetrennt und mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0 eluiert. Im Eluat ergab sich eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 1,2 IT/mg.
Die so erhaltene-lösung wurde einer Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen. Die zwischen 1,8 und 2,4 M Ammoniumsulfat ausfallende Proteinfraktion wurde abgetrennt. Sie wies eine spezifische Cholesterinesteraseaktivität von 2,5 U/mg auf.
Das erhaltene Produkt wurde erneut in Phosphatpuffer pH 6,0 aufgelöst, gegen den gleichen Puffer bis zur Salzfreiheit dialysiert und dann über eine Säule, die mit dem gleichen Anionenaustauscher wie oben angegeben gefüllt war, chromatographiert. Die Elution erfolgte wiederum mit 0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0. In der Fraktion mit Cholesterinesteraseaktivität ergab sich eine spezifische Aktivität von 7 U/mg Protein.
Das so erhaltene angereicherte Cholesterinesterasepräparat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben in der CholesterinbeStimmung eingesetzt. Die eingesetzte Menge betrug jedoch lediglich 0,001 mg, bezogen auf Protein. Das Ergebnis entsprach dem von Beispiel 1.
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- ίο -
Die Cholesterinesterase aus Candida cylindracea kann nach, den üblichen Methoden der Ensymfeinreinigung weiter gereinigt werden. Anstelle der oben genannten Anreicherungsschritte können auch andere übliche biochemische Reinigungsschritte wie z.B. Fällung bzw. Fraktionierung mit Polyäthylenimin, organischen Lösungsmitteln oder Salzen, Chromatographie über Molekularsiebmaterialien oder schwache Anionenaustauscher mit anderen funktionellen Gruppen als Diäthylaminoäthanolgruppen, Protaminsulfatfällung und dgl. angewandt werden.
Der erfindungsgemäss verwendete Candida Cylindracea ist am 17.9.1962 hinterlegt worden in der offiziellen USA-Kultursammlung unter der Bezeichnung "Candida Gylindracea nov. Sp. 14830".
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Claims (3)

  1. Patentansprüche
    MJ Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin, wobei dieses in wässrigem Medium mit Cholesterinoxydase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes H2O2 oder Cholestenon bestimmt wird gemäß Patent . ... ... (Patentanmeldung P 22 24 152.3-52), dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin Candida cylindracea oder ein daraus hergestelltes Präparat mit Cholesterinesterase-Wirksamkeit zusetzt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Candida cylindracea in Form eines · Acetontrockenpulvers zuge-.setzt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine durch Herstellung eines Acetontrockenpulvers aus Candida cylindracea, Behandlung mit einem Anionenaustauscher, Ammoniumsulf atf raktionierung zwischen 1,8 und 2,4 M und Chromatographie über Anionenaustauscher erhaltene Cholesterinesterase zugesetzt wird.
    4* Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinoxydase, einem System zur Bestimmung von HpOp oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon und einem Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin gemäß Patent . ... ,.. (Patentanmeldung P 22 24 132.3), dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Verseifung von verestertem Cholesterin aus Candida cylindracea oder einem daraus hergestellten Präparat mit Cholesterinesterasewirksamkeit besteht.
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DE2316637A 1973-03-28 1973-04-03 Verfahren zur bestimmung von cholesterin Pending DE2316637A1 (de)

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