DE2635040C2 - Reagenz zur Hydrolyse von Glyzerin-Fettsäureestern, sowie Verfahren zur Analyse einer wäßrigen Flüssigkeit mit einem Gehalt an Glyzerin-Fettsäureestern - Google Patents

Reagenz zur Hydrolyse von Glyzerin-Fettsäureestern, sowie Verfahren zur Analyse einer wäßrigen Flüssigkeit mit einem Gehalt an Glyzerin-Fettsäureestern

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DE2635040C2 DE19762635040 DE2635040A DE2635040C2 DE 2635040 C2 DE2635040 C2 DE 2635040C2 DE 19762635040 DE19762635040 DE 19762635040 DE 2635040 A DE2635040 A DE 2635040A DE 2635040 C2 DE2635040 C2 DE 2635040C2
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Description

Die Erfindung betrifft ein Reagenz zur Hydrolyse von Glyzerin-Fettsäureestern, insbesondere die Bestimmung von Triglyzeriden in wäßriger Flüssigkeit, wobei die Hydrolyse dieser Triglyzeride verbessert wird.
Im Blutserum liegen Triglyzeride als Serumlipide vor, die in Verbindung mit Plasmaproteinen Lipoproteine bilden. Weitere Lipoproteine, die die Bestimmung des Triglyzerinspiegels im Blut stören können, sind Phospholipide Cholesterin und Cholesterinester. Die Bestimmung von Serum-Triglyzeriden ist von hoher diagnostischer Bedeutung, da angenommen wird, daß erhöhte Serum-Triglyzeridspiegel für arterosklerotische Ablagerungen im Körper verantwortlich sind.
Zu Verfahren zur Bestimmung des Triglyzeridspiegels im Blut gehört beispielsweise das klassische Verfahren der Extraktion der Triglyzeride aus dem Serum mittels organischer Lösungsmittel, Entfernung der störenden Phospholipide und Verseifung der Triglyzeride unter Freisetzung der entsprechenden Fettsäuren und des Glyzerins. Dieses Verfahren ist insofern nachteilig, als entweder mit einem phospholipiden Adsorbers oder mit einem Lösungsmittelsystem gearbeitet werden muß, das bevorzugt die Triglyzeride extrahiert
Ein weiteres Verfahren ist in Clin. Chem. Bd. 20,1974, S. 57 beschrieben, bei dem die Serum-Triglyzeride mit einem gekoppelten Ezymsystem gespalten und das erhaltene Glyzerin durch kinetische Messung mit GDH (Glyzerin-Dehydrogenase) und NRD quantitativ erfaßt werden können.
In der US-PS 37 03 591 werden die Triglyzeride durch ein Reagenz hydrolisiert, das aus einer Lipase von Rhizopus Delemar und einer Protease besteht. Dabei wird das erzeugte Glyzerin mit Hilfe von enzymatischen Kopplungsreaktionen UV-spektralfotometrisch bestimmt.
Die US-PS 37 59 793 betrifft die enzymatische Hydrolyse von Serum-Triglyzeriden mit Hilfe von Rhizopus-Arrhizus-Lipase.
In der DE-OS 23 23 609 ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Triglyzeriden beschrieben, bei dem zur Spaltung der Triglyzeride bestimmte Lipasen von Mikroorganismen eingesetzt werden. Das erhaltene Glyzerin wird anschließend nach bereits angegebenen Verfahren UV-spektralfotometrisch bestimmt.
Die vorstehenden enzymatischen Verfahren sind insofern nachteilig, als einerseits Proteasen vorliegen müssen, die auch das Lipaseprotein abbauen, andererseits die Lipase bestimmte Glyzerinesterpositionen selektiv angreift, während andere Positionen nur schlecht oder bei hohen Konzentrationen hydrolisiert werden. Die hierdurch eingesetzten hohen Enzymmengen verteuern derartige Verfahren erheblich.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagenz zur Hydrolyse von Glyzerinfettsäureestern zur Verfügung zu stellen, mit dem eine quantitative Hydrolyse von Glyzerinfettsäureestern unter gleichzeitiger Absenkung der Lipasemengen, insbesondere von Rhizopus-Arrhizus-Lipasemengen ermöglicht wird.
Die Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist das in Anspruch 1 angegebene Reagenz.
Durch die erfindungsgemäß eingesetzte Lipase, die aus einer Mischung von Rhizopus-Arrhizus-Lipase und Candida-Cylindracea-Lipase besteht, wird die Hydrolyse von Giyzerinfettsäureestern, insbesondere von Triglyzerid-Lipoproteinen im Blutserum sichergestellt. Das erhaltene Glyzerin wird dabei nach bekannten Analyseverfahren bestimmt.
Die Erfindung eignet sich für zahlreiche Analysezwecke; insbesondere ist sie auf die Hydrolyse von Triglyzerin-Lipoproteinen im Serum während der Triglyzeridbestimmung gerichtet.
Eine der Triglyzeridanalysen wird nach folgender Gleichung durchgeführt:
H2C-OCOR, H2C-OH
I Lipase I
> HC —
HC-OCOR2 H2C-OCOR3
H2C-OH
R1COOH OH + R2COOH R3COOH
Das erhaltene Glyzerin und mittels Glyzerokinase (GK) in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) zu Glyzerin-1 -Phosphat nach folgender Gleichung phosphoryliert:
H2C-OH HC- OH + ATP H2C-OH
GK
H2C-OPO4 HC- OH + ADP H2C-OH
Das erhaltene Glyzerin-1-Phosphat wird in Gegenwart von Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) durch Glyzerin-Phosphat-Dehydrogenase (GPDH) zu Dihydroxyaceton-phosphat dehydriert:
H2C-OPO4 HC—OH + NAD HjC — OH
H2C—OPO4
GPDH I ► HC — 0 + NADH
H2C—OH
Das erhaltene NADH reduziert die violette Farbe des Iodnitrotetrazoliums (INT) in Gegenwart von Phenazin-Methosulfat (PMS) als Katalysator, wobei das farbige Formazan gebildet wird:
NADH + INT
PMS
NAD + INT—Formazan
Das erhaltene INT-Formazan wird spektralfotometrisch bei 505 nm gemessen.
Für die Durchführung der vorstehend angegebenen Reaktionen hat es sich bewährt, bestimmte Reagenzien, nämlich ein Triglyzeridenzymreagenz, ein Triglyzeridpufferreagenz, ein Triglyzerid-INT-Reagenz und ein Triglyzeridverdünnungsreagenz, anzusetzen. Nachstehend sind diese Reagenzien angegeben:_
Triglyzeridenzymreagenz Reaktionsfreudige Bestandteile/dl:
Rhizopus-Arrhizus-Lipase mit den in den nachstehenden Beispielen angegebenen Mengen 25 000 Einheiten GPDH (Kaninchenmuskel)
360 Einheiten GK (C. mycoderma)
Triglyzerid-Pufferreagenz Reagierende Bestandteile (G/V):
0,06% Magnesiumchlorid 0,13% ATP
1,31% NAD
Candida-Cylindracea-Lipaseeinlieiten mit den in den nachstehenden Angaben angegebenen Mengen.
Nicht reagierende Bestandteile: ■* Phosphatpuffer
Stabilisatoren
Bakteriostatische Mittel
Triglyzerid-INT-Reagenz Reagierende Bestandteile (G/V):
0,03% INT
0,005% PMS
Triglyzerid-Verdünnungsreagenz HCl 0,1 η
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert:
Beispiele
Die Analysen wurden unter Verwendung unterschiedlicher Anteile der beiden Lipasen durchgeführt. In der ersten Gruppe wurde die Menge der Rhizopus-Arrhizus-Lipase auf 40 Einheiten pro Prüfung festgesetzt, wobei 50 μΐ je 0,05 ml menschlichen Serums analysiert wurden. »Bezugsmittel« bzw. »Bezugshoch« bezieht sich auf normale und erhöhte BezugskontroUstandardseren mit Triglyzeridspiegeln von 140 mg/dl bzw. 564 mg/dl. Die folgenden Extinktionen wurden erzielt:
40 45 50
Beispiel Candida- Extinktion Bezugshoch
Cylindracea Bezugsmittel
Einheiten pro Prüfung 0,586
1 4,2 0,171 0,645
Il 8,4 0,189 0,676
III 16,8 0,197 0,673
IV 42 0,201 0,677
V 63 0,201
60
Beispiel Rhizopus-Arrhizus- Extinktion Bezugshoch
Einheiten pro Prüfung Bezugsmittel 0,625
VI 10 0,111 0,710
VII 20 8,138 0,738
VIII 38,3 0,180 0,744
IX 48,3 0,191 0,743
X 67,6 0,194
Auf der Grundlage einer Kurvenanpassung der vorerwähnten Ergebnisse wurde die Konzentration von Candida Cyclindracea-Lipase bei 22 Einheiten je Prüfung optimiert; bevorzugt war der Bereich von 16 bis 40 Einheiten je Test Dieser bevorzugte Bereich basiert darauf, daß eine im wesentlichen vollständige Hydrolyse bei mehr als 16 Einheiten je Prüfung erzielt wird und daß mehr als 40 Einheiten je Prüfung unnötig kostspielig sind. In den folgenden Beispielen wurde das oben beschriebene Verfahren wiederholt, wobei die Konzentration von Candida Cylindracea-Lipase auf 22 Einheiten pro Prüfung festgesetzt wurde. In den folgenden Beispielen wurden Bezugsstandardkontrollseren, auf die als »Bezugsmittel« und »Bezugshoch« Bezug genommen wird, mit normalen und erhöhten Triglyzeridspiegeln von 140 mg/dl bzw. 564 mg/dl benutzt. Die Extinktionen waren folgendermaßen:
Auf der Grundlage einer Kurvenanpassung wurde die Konzentration von Rhizopus Arrhizus-Lipase bei 35 Einheiten je Prüfung optimiert; bevorzugt war der Bereich von 30 bis 50 Einheiten je Prüfung. Dieser Bereich basiert auf einer ausreichend vollständigen Hydrolyse am unteren Ende und der Vermeidung unnötiger Kosten am oberen Ende.
Es wird bemerkt, daß die Menge der in der vorliegenden Lipase erforderlichen Rhizopus-Arrhizus-Lipase beträchtlich geringer als die in einer nur aus Rhizopus Arrhizus bestehenden Lipase erforderlichen Menge ist. Man weiß nicht, warum diese so ist, und die folgende Theorie kann nicht für die vorliegende Erfindung bindend sein. Man glaubt jedoch, daß die Rhizopus-Arrhizus-Lipase die Alpha- und Alpha-Primär-Stellungen des Triglyzerid-Lipoproteins und die Candida-Cylindracea-Lipase die Beta-Stellungen danach angreifen.
Mono- und Diglyzeride können auch hydrolysiert werden Triglyzeride bilden jedoch die vorherrschende Form von Glyzerinfettsäureestern im Serum. Die vorliegende Erfindung ist eine Verbesserung der Hydrolyse triglyzerider Lipoproteine. Die Erfindung wird nicht durch die Verwendung besonderer Farbenkopplungsreaktionsbestandteile begrenzt. Die Verbesserung stellt die Hydrolyse von Triglyzerid-Lipoproteinen sicher und senkt die Analysekosten durch eine Reduzierung der erforderlichen Rhizopus-Arrhizus-Lipasemenge.
Gegenüber den in der DE-OS 23 23 609 beschriebenen Lipasen, die sämtlich unspezifisch die Hydrolyse von Triglyzeriden katalysieren, wird erfindungsgemäß eine Mischung aus zwei Lipasen eingesetzt, deren Hydrolysereaktion von der Esterposition abhängig ist. Dadurch wird eine quantitative Esterhydrolyse innerhalb kurzer Zeit und mit rehr geringen Lipasemengen sichergestellt.

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Reagenz zur Hydrolyse von Glyzerinfettsäureestern für die quantitative Bestimmung der Fettsäuren und/oder des Glyzerins in einer wäßrigen Lösung, wobei dieses Reagenz eine Lipase aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß als Lipase eine Mischung aus einer Rhizopus-Arrhizus-Lipase und einer Candida-Cylindracea-Lipase eingesetzt wird.
2. Verfahren zur Analyse einer Glyzerinfettsäureester enthaltenden wSßrigen Flüssigkeit, bei dem der Ester zu Glyzerin und freien Fettsäuren mittels einer Lipase hydrolisiert wird und die Menge des freigesetzten Glyzerins bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die Esterhydrolyse mit einer Mischung aus Rhizopus-Arrhizus-Lipase und Candida-Cylindracea-Lipase durchführt.
DE19762635040 1975-08-05 1976-08-04 Reagenz zur Hydrolyse von Glyzerin-Fettsäureestern, sowie Verfahren zur Analyse einer wäßrigen Flüssigkeit mit einem Gehalt an Glyzerin-Fettsäureestern Expired DE2635040C2 (de)

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GB1515195A (en) 1978-06-21
FR2320552A1 (fr) 1977-03-04
IT1065245B (it) 1985-02-25
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JPS5225694A (en) 1977-02-25

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