DE2409696C2 - Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents
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Description
enthält
2. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch Μ
gekennzeichnet, daß das Reagenz zusätzlich eine Puffersubstanz enthält
3. Prüfvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanz einen
pH-Wert von 5—8 aufrechterhalt, wenn sie mit der
Flüssigkeit in Berührung kommt
4. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische System mit
CholesterinesterhydrolaseaktivitätCholesterinesterhydrolase und einen Gallenenzym-Co-Faktor dafür Μ
umfaßt
5. Prüfvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Gallenenzym-Co-Faktor
Chol-, Glycochol-, Taurochol- und/oder Taurodeoxycholsäure
oder ein Salz davon ist
6. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Bestimmung von
mindestens einem der Reaktionsprodukte ein Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid ist, umfassend
eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und einen Indikator, der in Gegenwart von Peroxid
und der Substanz mit Peroxidaseaktivität unter Farbänderung oxidiert wird.
7. Prüfvorrichtung nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger saugfähig für die
flüssige Probe ist.
so
Die Erfindung betrifft eine Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin-Gehalten in Flüssigkeiten,
wie z. B. Körperflüssigkeiten. Das Bestimmungsverfahren
mittels der erfindungsgemäßen Prüfvorrichtungen beruht auf dem Nachweis von freiem
Cholesterin, indem Wasserstoffperoxid bestimmt wird, das durch die Wirkung eines chemischen Systems mit
Cholesterinoxidaseaktivität auf das Freie Cholesterin freigesetzt wird. Ein bevorzugtes Mittel zur Bestimmung
des freigesetzten Wasserstoffperoxids umfaßt jö eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und einen
Oxidations-Indikator. Die Zugabe eines chemischen Systems mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität zu dem
Mittel, welches zur Bestimmung von freiem Cholesterin dient, ergibt ein integrales Prüfmittel zur Bestimmung
von Gesamtcholcstcrin.
Cholesterin findet sich in nahezu allen pflanzlichen und tierischen Zellen, entweder in freier Form oder in
Form von Estern, Freies Cholesterin bezeichnet Cholesterin in seinem nicht umgesetzten Zustand
(/^-Cholesterin oder ChoIest-5-en-3/i-ol). Gesaratcholesterin
bezeichnet die Summe aus freiem Cholesterin und seinen Esterderivaten wie dem Ljnoleat, Oleat, Palmitat
Arachidonat, PaJmitoleat, Linolenat, Stearat und Myristat
Cholesterin findet sich in konstanten Mengen im Serum bei normalen Bedingungen. Im allgemeinen sind
25% des Gesamtcholesterins im Serum in Form von freiem Cholesterin vorhanden, während die restlichen
75% in Form von Esterderivaten vorliegen.
Es ist ziemlich gut gesichert, daß der Gesamtcholesteringehalt
des ganzen Blutes in direktem Zusammenhang steht mit bestimmten Erkrankungen bei Menschen und
Tieren. Zu diesen Krankheiten, die im Zusammenhang mit Gesamtcholesteringehalten im Blut stehen, gehören
die Leberzellen betreffende Krankheiten, Unregelmäßigkeiten des Schilddrüsenstoffwechsels, Gallenabflußstörungen
und vielleicht als wichtigste Arteriosklerose und andere Gefäßerkrankungen. Bis in die letzten 10
Jahre war es üblich, den Gesamiehölesteringehalt des
gesamten Blutes zu bestimmen. Aber es ist jetzt bekannt, daß der Serumgehalt durch Faktoren verändert
wird, die den Gehalt in den roten Zellen nicht beeinflussen. Als Ergebnis davon werden die meisten
klinischen Bestimmungen sowohl des freien als auch des gesamten Cholesterins an Serum und nicht an gesamtem
Blut durchgeführt
Da die klinische Bedeutung von Gehalten an freiem und Gesamtcholesterin zunehmend anerkannt wird,
führte der Bedarf an schnellen und zuverlässigen Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin in Flüssigkeiten
zu erhöhten Forschungsanstrengungen. Dadurch wurden zahlreiche neue Verfahren und Modifizierungen
von üblichen Verfahren entwickelt Eine allgemeine Behandlung der vielen Verfahren, die für Cholesterinbestimmungen
zur Zeit zur Verfügung stehen, findet sich in American Journal of Clinical Pathology, Bd. 25 :1 (1955)
S. 433-46. Allgemein umfassen die zur Zeit üblichen Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in
Flüssigkeiten, besonders in Serum, die vier Grundschritte der Extraktion von freiem Cholesterin und Cholesterinestern
aus der Flüssigkeit, Verseifung der Cholesterinester zu freiem Cholesterin, Isolierung des freien
Cholesterins, das dabei entsteht und Bestimmung des isolierten freien Cholesterins. Das allgemein übliche
oder Standardverfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin ist das Verfahren von Abell, et al., in the
Journal of Biological Chemistry, ΒΛ 195 (1952) S. 357).
Nach diesem Verfahren werden die Cholesterinester verseift durch Inkubieren mit alkoholischem Kaliumhydroxid
und das freie Cholesterin wird dann mit Petroläther extrahiert. Das isolierte freie Cholesterin
wird spektrophotometrisch bestimmt mit Hilfe eines modifizierten Liebermann-Burchard-Reagenz (Essigsäureanhydrid,
Schwefelsäure und Essigsäure). Dieses Standardverfahren und die zahlreichen sonstigen zur
Verfügung stehenden Verfahren besitzen die klinischen Nachteile, daß sie sehr komplizierte Verfahren sind,
wobei zahlreiche Reagenzien angewandt werden müssen und außerordentlich zeitraubend sind.
In der DE-PS 22 24 132 ist bereits ein Verfahren und ein Reagenz zur Bestimmung von Cholesterin vorgeschlagen
worden, das die Bestimmung von Gesamtcholesterin mit Hilfe von Cholesterinesterase in Verbindung
mit Cholesterinoxidase unter Ermittlung des Sauerstoffverbrauchs oder des gebildeten H2O2 bzw.
Cholestenon betrifft'
Es hat sich nun gezeigt, daß Prüfvorrichtungen zur
Bestimmung von sowohl freiem als auch Gesamtcholesterin
entwickelt wt,4en können auf der Grundlage der katalysierten Abbaureaktionen von freiem Cholesterin
und Cholesterinestenu Die Erfindung betrifft eine
Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in einer flüssigen Probe, bestehend aus einem Träger,
der mit einem Reagenz versehen ist, welches
a) ein System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität,
b) ein chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivitätund
c) Mittel zur Bestimmung von mindestens einem der Reaktionsprodukte (vorzugsweise Wasserstoffperoxid),
die entstehen, wenn freies Cholesterin mit dem chemischen System mit Cholesterinoxidaseaktivität
in Gegenwart von Sauerstoff zusammengebracht wird,
enthält Ein besonders bevorzugtes Mittel zur Bestimmung
von Wasserstoffperoxid umfaßt ein Reagenzsystem, umfassend eine Substanz mit peroxidativer
Wirksamkeit und eine Indikatorsubstanz, die in Gegenwart von Peroxid und der Substanz mit
peroxidativer Wirksamkeit oxidiert wird und die dabei ihre Farbe ändert Es ist auch bevorzugt, daß ein
Puffermaterial, das imstande ist, einen pH-Wert zwischen 5 und 8 aufrecht zu erhalten, wenn es mit der
Flüssigkeitsprobe zusammenkommt, in dem Reagenz enthalten ist Vorzugsweise enthält das Reagenz zur
Bestimmung von freiem Cholesterin auch ein oberflächenaktives Mittel, das imstande ist, das gesamte in der
flüssigen Probe vorhandene freie Cholesterin löslich zu machen bzw. zu soJubilisieren.
Ein bevorzugtes chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität
umfaßt das En. ym Cholesterinesterhydrolase
und einen Gallenenzym-Co-Faktor dazu. Das Prüfmittel kann auch eine Substanz zur Hemmung
bzw. Verhinderung des Bakterienwachstums enthalten, wie Natriumazid, um das störende Wachstum von
Bakterien zu verhindern.
Das Bestimmungsverfahren von Cholesterin in einer FIpssigkeitsprobe mittels der oben beschriebenen
erfindungsgemäßen Prflfvorrichtung umfaßt das Zusammenbringen
der flüssigen Probe mit der Prüfvorrichtung und die Beobachtung der auftretenden (Färb) Reaktion.
Es ist bevorzugt, daß die entstehende Reaktion eine vorher bestimmte Zeit ablaufen kann, bevor die
ίο auftretende Wirkung beobachtet wird. Es ist luch
bevorzugt, das Gemisch der flüssigen Probe und der Prüfvorrichtung mit einer sauren Substanz zusammenzubringen,
um die Entwicklung der Indikatorreaktion zu verstärken. Halbquantitative Ergebnisse werden erhal-
ten, wenn man die entstehende colorimetrische Reaktion visuell beobachtet und die Farbreaktion mit
einer Standardfarbkarte vergleicht Quantitative Ergebnisse werden erhalten, wenn man die auftretende
Farbreaktion instrumenten beobachtet
Unter dem Ausdruck »Bestimmung« ist sowohl der
qualitative Nachweis als auch die halbquantitative oder
quantitative Analyse zu verstehen, soweit nicht anders
angegeben.
Das der Prüfvorrichtung zugrunde liegende Verfahren beruht zum Teil auf der Tatsache, daß bei der
Reaktion von freiem Cholesterin in Gegenwart von molekularem Sauerstoff und bestimmten chemischen
Systemen, die Cholesterinoxidaseaktivitat besitzen, Wasserstoffperoxid gebildet wird. Der Ausdruck »Cholesterinoxidaseaktivität«
der hier verwendet wird, bezieht sich auf die Katalyse von freiem Cholesterin über eine Oxidations-Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid
als Produkt entsteht Die Reaktion zwischen derartigen chemischen Systemen und freiem Choleste-
rin und die anschließend vorzugsweise angewandten Mittel zur Bestimmung des mit Hilfe des Reagenzes
gebildeten Wasserstoffperoxids, kann durch die folgenden chemischen Gleichungen angegeben werden:
_ Cholesterinoxidase- ,.,„.,. , «, ,-,
Freies Cholesterin + O2 /l4-Cholesten-3-on + H2O2,
Aktivität
H2O2 + Indikator
peroxidative Wirksamkeit
oxidierter Indikator (Farbänderung).
Selbstverständlich kann freies Cholesterin auch bestimmt werden durch Bestimmung des freigesetzten
44-Cholesten-3-ons.
Es hat sich gezeigt, daß, wenn das oben angegebene System angewandt wird zusammen mit einem chemischen
System, das Cholesterinesterhydrolaseaktivität besitzt, durch die Cholesterinester in freies Cholesterin
umgewandelt werden können, man ein Mittel zur Bestimmung von Gesamtcholesterin erhält Der Ausdruck
»Cholesterinesterhydrolaseaktivität« bezeichnet die Katalyse von Choleterinestern zu freiem Cholesterin
durch Hydrolyse. Diese Katalyse kann durch die folgende Gleichung angegeben werden:
55
Cholesterinesterhydrolase- . . „,.,.· , c „ ·· .„„_
Cholesterinester » freies Cholesterin + Fettsauren.
Aktivität
Ein chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivität kann erhalten werden durch verschiedene Verfahren
und in verschiedenen Formen. Üblicherweise wird ein derartiges System erhalten durch Extraktion natürlich
vorkommender Substanzen wie Mikroorganismen, die durch die Folgenden beispielhaft angegeben werden
können:
Verschiedene Mycobakterien wie Mycobakterium rubrum, verschiedene Nocardia wie Nocardia crythropois
und verschiedene Streptomyeesstimme.
Ein besonderes chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivitat
ist das Enzym Cholesterinoxidase, das erhalten worden ist durch Extraktion von Mycobakterium
rubrum nach dem Verfahren, das angegeben ist in Methods in Enzymology Bd. 1, herausgegeben von
Colowick und Kaplan. Ararlemie Press (New York.
1955)S,678-8|),
Die Herstellung kann kurz folgendermaßen beschrieben
werden. Nasse, gepackte Zellen von Mycobakterium rubrum werden nach einem üblichen Verfahren, zum
Beispiel durch Vermählen in Sand, aufgebrochen. Das
vermahlene Material wird in einem Puffer, wie einem Phosphatpuffer suspendiert und zur Entfernung der
unlöslichen Substanzen zentrifugiert Der Puffer, der das lösliche Protein enthält, von dem Cholesterinoxidase ein
Teil ist, wird dann behandelt, um störende niedermolekulare
Substanzen, z. B, durch Dialyse zu entfernen.
Ein chemisches System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität
kann ebenfalls nach verschiedenen Verfahren in zahlreichen Formen erhalten werden. Üblicherweise
wird ein solches System erhalten durch Extraktion von natürlich vorkommenden Substanzen wie tierischem
oder menschlichem Pancreas, Leber oder Eingeweiden bzw. Gedärmen. Handelsübliches Pancreatin
ist besonders geeignet Aufgrund seiner hohen proteolytischen Aktivität muß es jedoch gereinigt
werden, um eine derartige Aktivität zu entfernen, wie später näher beschrieben wird.
Gemäß der vorliegenden Erfinduirg erfolgt die Bestimmung von freiem Cholesterin vorzugsweise unter
Anwendung eines Mittels zur Bestimmung des unter dem Einfluß eines chemischen Systems mit Cholesterinoxidaseaktivität
gebildeten Wasserstoffperoxids: Geeignet sind hierfür alle bekannten Mittel und Verfahren
zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid in Flüssigkeiten. Eine besonders günstige Arbeitsweise umfaßt die
Anwendung eines Reagenzes, umfassend eine Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit und einen Indikator, der
in Gegenwart von Peroxid und der Substanz mit peroxidativer Wirksamkeit oxidiert wird und der zu
einer colorimetrischen Reaktion oder Farbänderung führt
Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit umfassen solche natürlich vorkommenden Peroxidasen wie
Meerrettich-Peroxidase und Kartoffelperoxidase. Andere Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit bzw.
peroxioativer Aktivität umfassen bestimmte organische
Substanzen wie normales ganzes Blut rote Blutzellen, lyophilisiertes ganzes Blut, Urohämin, Metalloporphyrine
usw. Bestimmte anorganische Substanzen sind ebenfalls geeignet wie Jodidsalze und Molybdatsalze,
Eisensulfocyanat Eisentannat, Eisenferrocyanid und Kaliumchromsuifat.
Indikatorsubstanzen der oben angegebenen Art umfassen Oxidations-Reduktions-Indikatorer, mit einem
Öxidations-Reduktions-Potential, das geeignet ist Wasserstoffperoxid
in Gegenwart von Substanzen mit peroxidativer Wirksamkeit nachzuweisen bzw. zu bestimmen. Derartige Indikatoren umfassen o-Tolidin,
Syringaldazin, Vanillinazin, die Kombination von Phenol und 4-Aminoantipyrin, 2,7-Diaminofluorin, Benzidin
und Derivate von Benzidin wie o-Dianisidin.
In der erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung ist vorzugsweise ein Puffermaterial enthalten, das im Stande
ist, einen pH-Wert von vorzugsweise 5 bis 8 aufrecht zu erhalten, wenn es mit der zu untersuchenden flüssigen t,o
Probe zusammenkommt, Ein solcher pH-Bereich sichert die Stabilität der Bestandteile des Reagenzes, besonders,
wenn das Enzym Cholesterinoxidase angewandt wird. Der günstigste pH-Bereich für den Nachweis und
die Bestimmung von Cholesterin unter Anwendung von μ Cholesterinoxidase liegt bei ungefähr 6,6. Es kann ein
beliebiges Puffermaterial angewandt werden, solange es
den entsprechenden pH-Bereich einstellt und die Wirksamkeit des Reagenzes zum Nachweis von
Gesamtcholesterin nicht stört
Ein oberflächenaktives Mittel, das im Stande ist, im
wesentlichen das gesamte in der Flüssigkeitsprobe vorhandene Cholesterin löslich zu machen, ist vorzugsweise
in der Prüfvorrichtung enthalten, da freies Cholesterin in bestimmten Flüssigkeiten, wie wäßrigen
Lösungen, nur gering löslich ist Wenn im Reagenz e>n
GaJlen-Co-Faktor enthalten ist ist ein oberflächenaktives
Mittel nicht erforderlich, da der Gallen-Co-Faktor selbst als löslich machendes Mittel wirkt So braucht bei
Anwendung von Cholesterinesterhydrolase und deren Gallen-Co-Faktor kein löslich machendes Mittel für das
freie Cholesterin zugesetzt zu werden, wodurch sich das Reagenz vereinfacht Oberflächenaktive Mittel, die
angewandt werden können, umfassen sowohl ionische als auch nichtionische oberflächenaktive Mittel und
verschiedene andere Detergenzien, die als löslich machende Mittel bekannt sind. Gallensalze sind
besonders geeignet Solche oberflächenaktive Mittel, die sowohl als löslich machnde Mittel für freies
Cholesterin als auch als Co-Faktoren für Cholesterinesterhydrolase
geeignet sind, umfassen Chol-, Glycochol-,
Taurochol- und Taurodeoxycholsäure und deren Salze. Die Natriumsalze dieser Verbindungen sind
besonders geeignet.
Die Bestimmung von Gesamtcholesterin umfaßt grundsätzlich das Zusammenbringen der zu untersuchenden
Flüssigkeitsprobe mit einer (erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung, wie sie oben beschrieben sind, und
Beobachtung der auftretenden Reaktion. Die Reaktion ist vorzugsweise eine colorimetrische Reaktion oder
eine Farbänderung, die erreicht wird durch Anwendung von Indikatormaterialien, wie sie oben beschrieben sind.
Das Reagenz ist erfindungsgemäß in einem Träger eingebaut z. B. durch Imprägnieren von adsorbierenden
Kissen, wobei die Prüfvorrichtung entsteht. Die Vorrichtung kann z. B. in die Flüssigkeitsprobe eingetaucht
werden, um das Reagenz mit der Flüisigkeitsprobe
in Berührung zu bringen.
Es ist bevorzugt, daß man die Reaktion zwischen den Bestandteilen des Prüfmittels und der flüssigen Probe
eine ausreichend lange Zeit ablaufen läßt, um die Entwicklung einer ausreichenden colorimetrischen
Reaktion zu fördern, die zuverlässige und empfindliche Ergebnisse liefert
Diese Inkubation kann von einer so kurzen Zeit wie ungefähr 1 Minute bis zu einer längeren Zeit, z. B. über
Nacht variieren. Bei Anwendung der bevorzugten Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid beträgt
die Inkubationszeit üblicherweise zwischen 0,5 bis 1 Stunde und die Inkubationstemperatur 0 bis 500C,
vorzugsweise ungefähr 37° C. Es hat sich gezeigt daß ;-dch die Zugabe einer sauren Substanz, z. B. von
Schwefelsäure zu der Flüssigkeitsprobe die Farbentwicklung bei Anwendung der bevorzugien Prüfvorrichtung
fördert
Halbquantitative Ergebnisse werden erhalten, wenn die Reaktion visuell beobachtet und mit einer
Standardfarbicarte verglichen wird, die die Reaktion bei
Anwendung bekannter Konzentrationen von Cholesterin zeigt
Quantitative Ergebnisse werdet« erhalten, wenn spektrophotometrische oder Reflexionsverfahren zur
Besinnung der Farbreaktion angewandt werden, die
dann mit einer Standardkurve verglichen wird.
Bei der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck »chemisches Systerrf mit einer »gewissen« enzymati-
sehen Aktivität« alle chemischen Verbindungen einzeln
oder in Kombination, die die angegebene enzymatische Aktivität besitzen. Es ist nicht bekannt, ob diskrete
Moleküle oder Enzyme mit der gewünschten Aktivität verbunden sind, da das Reagenz hergestellt wird aus ί
Auszügen natürlich vorkommender Substanzen, wobei die Auszüge die gewünschte Aktivität besitzen. Zum
Beispiel kann Cholesterinoxidaseaktivität erhalten werden aus einem Auszug des Mikroorganismus Mycobakterium
rubrum, und es ist nicht bekannt, ob ein einziges in
Molekül oder Enzym für die Aktivität verantwortlich ist. Die Aktivität kann bestimmte Enzym-Co-Faktoren oder
komplizierte Enzymsysteme umfassen. Es ist nicht erforderlich, daß Enzyme beteiligt sind, da das System
mit Cholesterinoxidaseaktivität nur eine katalytische ιϊ
Aktivität besitzt und kein Reagenz darstellt, das entweder bei der Reaktion verbraucht wird oder zur
Bildung eines Produktes dient. So tritt die Wirkung nur als katalytische Aktivität in Erscheinung, und bei der
vorliegenden Erfindung wird daher der Ausdruck ü\
chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivität angewandt. Die gleiche Situation trifft auf die
Cholesterinesterhydrolaseaktivität zu. Es ist jedoch über bestimmte chemische Systeme, die diese Aktivität
besitzen, Näheres bekannt. Zum Beispiel ist bekannt. i=>
daß die Enzymcholesterinesterhydrolase einen Enzym-Co-Faktor
erfordert, der von der Galle stammt. Diese Galleenzym-Co-Faktoren umfassen Chol-. Glycochol-,
Taurochol- und Taurodeoxycholsäurcn und ihre Salze.
Es ist erforderlich, daß, wenn das Reagenz Proteine i"
wie Enzyme in dem katalytischen chemischen System umfaßt, die Prüfvorrichtung im wesentlichen frei ist von
proteolytischer Aktivität, d. h. frei von Substanzen, die den Abbau von Proteinen beschleunigen. Wenn eine
proteolytische Aktivität vorliegt, werden die Proteine π zerstört und dadurch ihre Teilnahme an der katalytischen
Aktivität verschlechtert bzw. verhindert. Der Enzym-Co-Faktor für Cholesterinesterhydrolase
schützt dieses Enzym vor einer proteolytischen Zerstörung und wirkt außerdem bei der katalytischen *n
Aktivität des chemischen Systems mit Cholesterinoxidase und Peroxidase sind auf diese Weise nicht
geschützt. So darf, wenn die Prüfvorrichtung diese Substanzen enthält, keine proteolytische Aktivität
vorhanden sein. So erfordert die Anwendung von ■«">
extrahierter Cholesterinesterhydrolase mit solchen Proteinen wie Cholesterinoxidase und Peroxidase ein
Verfahren zur Herstellung eines Auszugs enthaltend Cholesterinesterhydrolase, die im wesentlichen frei ist
von proteolytischer Aktivität V1
Ein solches Verfahren besteht darin, daß man eine Substanz, enthaltend Cholesterinesterhydrolaseaktivität
und eine erste wäßrige Flüssigkeit, die ein anorganisches Salz in Lösung enthalten kann, zusammengibt,
die entstehende flüssige und feste Phase trennt « die flüssige Phase durch eine Säule gibt, enthaltend ein
Adsorbenz, das einen adsorptionsfäb'gen Diäthyiaminoäthylanteil
besitzt, und eine zweite wäßrige Flüssigkeit umfassend eine anorganische Salzlösung, durch die
Säule leitet wobei die anorganische Salzlösung im Stande ist die Cholesterinesterhydrolase von der Säule
zu eluieren. Es hat sich gezeigt daß bei einer geeigneten
Konzentration an anorganischen Salzen, Cholesterinesterhydrolase eine größere Affinität zu Adsorbenzien
mit Diäthylaminoäthylanteilen besitzt als Substanzen rr.it proteoiytiseher Aktivität Ein bevorzugtes Adsorbtionsmittel
ist Diäthyiaminoäthylcellulose, obwohl der Duthylaminoäthylantei! auch an ein anderes Gerüst
oder anderen Träger gebunden sein kann als Cellulose. Andere Trägerteile umfassen die verschiedenen Cellulosederivate
usw.
Die erste wäßrige Flüssigkeit kann ein organisches Salz in Lösung enthalten oder nicht. Sowohl die erste als
auch die zweite wäßrige Flüssigkeit enthalten möglichst einen Puffer, um einen pH-Wert für die Cholesterinesterhydrolase
aufrecht zu erhalten, der sich auf deren katalytische Aktivität nicht nachteilig auswirkt. Der
pH-Wert des Puffers sollte zwischen 5 und 8 liegen. Das Optimum ist bei pH 6,6. Günstig ist es, wenn das
anorganische Salz selbst eine derartige Pufferfunktion ausübt. Besonders ge, gncte erste und zweite Flüssigkeiten
sind Kaliumphosphatlösungen mit einer Konzentration von bis zu 0,05 m bzw. zwischen 0.15 und 1.0 m.
Anorganische Salzlösungen mit einer lonenstärke entsprechend den Kaliumphosphatlösungen in den oben
angegebenen Bereichen können ebenfalls die ersten und zweiten wäßrigen Flüssigkeiten ausmachen. Beispiele
IUr .anorganische Saizpuffer, die angewandt werden
können, umfassen Acetat-, Citrat-, Tartrat- und Phthalatpuffer. Es ist auch günstig, wenn sowohl die ersten als
auch die zweiten Flüssigkeiten eine Substanz enthalten, die imstande ist, Cholesterinesterhydrolase vor proteolytischer
Aktivität zu schützen, wie C'hol-, Glycochol-. Taurochol- und Taurodeoxycholsäuren und deren Salze.
Ein Bakterienhemmstoff kann ebenfalls in der ersten und zweiten wäßrigen Lösung vorhanden -,ein. um
störendes Bakterienwachstum zu verhindern. Ein besonders geeigneter Bakterienhemmstoff ist Natriumazid.
Flüssige Proben, die erfindungsgemäß untersucht
werden können, sind vorzugsweise wäßrige Lösungen, wenn das bevorzugte Reagenz zur Bestimmung von
Wasserstoffperoxid angewandt wird. Solche flüssigen Proben umfassen Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin,
Plasma usw. sowie andere Lösungen enthaltend freies oder Gesamtcholesterin wie sie bei Labor- oder
Herstellungsverfahren auftreten.
In der erfindungsgemäßen Prüfvorrichtung ist das Reagenz in einem Träger enthalten. Geeignete Träger
sind imstande, die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe zu absorbieren und umfassen saugfähiges Papier, Pappe,
polymere Kissen, poröse Kunststoffe usw. Das trockene Reagenz kann in einem Träger imprägniert, der Träger
kann damit überzogen, es kann chemisch an den Träger gebunden, physikalisch darin eingeschlossen sein oder
es kann irgendeine Kombination davon vorliegen. Der Träger kann auch mit einem Halter oder Stützglied
verbunden oder auf andere Weise daran befestigt sein.
Die erfindungsgemäße Prüfverrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin ist gegenüber den
bekannten Mitteln einfach und schnell. Sie ist außerordentlich geeignet zur klinischen Anwendung durch
Personen mit minimalen technischen Kenntnissen und führt zu einer Erhöhung der Anzahl von Cholesterinbestimmungen,
wie sie von Ärzten gefordert wird. Es ist besonders überraschend, daß es möglich war, ein
wirksames Bestimmungssystem zu entwickeln, das so komplex ist wie die Prüfvorrichtung zur Bestimmung
von Gesamtcholesterin. In ihrer bevorzugten Ausführungsform umfaßt diese Prüfvorrichtung die Enzyme
Cholesterinoxidase, Cholesterinesterhydrolase und Peroxidase, einen Enzym-Co-Faktor und ein Oxidaiions-Reduktions-Indikatormaterial
zusammen mit einem Träger. Dieses System erfordert keine mühsame
Steuerung der Versuchsbedingungen, um quantitative Ergebnisse zu liefern.
Claims (1)
1. Prüfvorrichtung zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in einer flüssigen Probe, bestehend aus
einem Träger, der mit einem Reagenz versehen ist, welches
a) ein System mit Cholesterinesterhydrolaseaktivität,
b) ein chemisches System mit Cholesterinoxidaseaktivitätund
c) Mittel zur Bestimmung von mindestens einem der Reaktionsprodukte, die entstehen, wenn
freies Cholesterin mit dem chemischen System mit Cholesterinoxidaseaktivität in Gegenwart
von Sauerstoff zusammengebracht wird,
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