NO146557B

NO146557B - Fremgangsmaate ved bestemmelse av totalt kolesterol i en biologisk vaeskeproeve, og preparat for anvendelse ved fremgangsmaaten

Info

Publication number: NO146557B
Application number: NO740693A
Authority: NO
Inventors: Peter Newman Tarbutton
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1973-03-01
Filing date: 1974-02-28
Publication date: 1982-07-12
Also published as: DD110118A5; JPS502594A; NO146558C; CA1138312A; NL181368C; NL181368B; DE2409696A1; NO751299L; BG26960A4; NO146557C; AR201939A1; SE390069B; IN139877B; NO146558B; NL7401974A; DE2409696C2; AU6456674A; BE811728A; ES437270A1; ES423559A1

Description

Kolesterol finnes i nesten alle plante- og dyreceller,

enten i sin fri form eller i esterform. Fri kolesterol angir kolesterol og sin uomsatte tilstand^ ^-kolesterol, eller kolest-5-en-33~ol. Total kolesterol angir summen av fri kolesterol og dens esterderivater slik som linoleat, oleat, palmitat, arakidonat, palmitoleat, linolenat, stearat og myristatestere. Kolesterol finnes i konstante mengder i serum under normale betingelser. Vanligvis er 25 % av den totale kolesterolkonsentrasjon i serum

fri kolesterol mens de gjenværende 75 % er i form av esterderivater.

Det er fastslått at det totale kolesterolinnhold i blodet

er direkte forbundet til visse sykdommer hos mennesker og dyr. Blant de mange sykdommer som er funnet å være forbundet med det totale kolesterolinnhold i blodet er hepatocellulære thyroid-metabolisme-forstyrrelser, galleobstruksjon og kanskje viktigst atherosclerose og andre vaskulære sykdommer. Inntil det siste tiår var det vanlig å bestemme det totale kolesterolinnhold av fullblod, men det er nå kjent at seruminnholdet påvirkes av faktorer som ikke påvirker innholdet av de røde celler. Følgelig utføres de fleste kliniske bestemmelser av både fri og total kolesterol på serum i stedet for på fullblod.

Ettersom den kliniske betydning av fri og totalt kolesterolinnhold ble stadig mer akseptert, resulterte behovet for hurtige og pålitelige metoder for bestemmelse av kolesterol i væsker i forskningsanstrengelser som ga et utall nye prosedyrer og modifikasjoner på basis av konvensjonelle prosedyrer. En generell behandling av den omfattende tilgjengelige metodikk for kolesterolbestemmelser kan finnes i American Journal of Clinical Pathology Vol. 25: 1 (1955) side 433 - 46. Generelt sett innbefatter de foreliggende metoder for bestemmelse av total kolesterol i væsker, spesielt i serum, fire hovedtrinn, nemlig ekstraksjon av den fri kolesterol og kolesterolesterene fra væsken, forsåpning av kolesterolesterene til fri kolesterol, isolering av den fri kolesterol som erholdes, og bestemmelse av den isolerte fri kolesterol. Den generelt aksepterte eller standardmetoden for bestemmelse av total kolesterol er den metode som er beskrevet av Abell et al. i Journal of Biological Chemistry, Vol. 195 (1952) på side 357. Ved denne metode forsåpes kolesterolesterene ved oppvarming med alkoholisk kaliumhydroxyd, og den fri kolesterol ekstraheres deretter med petroleumether. Den isolerte fri kolesterol bestemmes spektrofotometrisk ved bruk av et modifisert Leibermann-Burchard reagens (eddiksyreanhydrid, svovelsyre og eddiksyre). Denne standardmetode og utallige andre tilgjengelige metoder er beheftet med de ulemper at de er meget kompliserte prosedyrer som krever utallige reagenser og som er uhyre tids-krevende .

Det er nå funnet at testpreparater og fremgangsmåten for bestemmelse av både fri og total kolesterol kan tilveiebringes basert på de katalyserte nedbrytningsreaksjoner av fri kolesterol og kolesterolestere.

En fremgangsmåte og et middel til bestemmelse av fri kolesterol utgjør søknadsgjenstanden for Norsk patentsøknad 751299, avdelt fra foreliggende søknad.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved bestemmelse av totalt kolesterol i en biologisk væskeprøve ved først å omdanne kolesterolestere til fri kolesterol ved omsetning med kolesterolesterhydrolase, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at kolesterol omsettes ved pH 5-8 i nærvær av oxygen med kolesteroloxydase til kolestenon og hydrogenperoxyd, og at kolesterolmengden avleses på kjent måte, enten ved å bestemme mengden av dannet hydrogenperoxyd ved hjelp av en fargereaksjon, eller ved å bestemme mengden av dannet kolestenon spektrofotometrisk. Oppfinnelsen angår også et preparat for anvendelse ved bestemmelse av totalt kolesterol i en biologisk væskeprøve, inneholdende kolesterolesterhydrolase for å omdanne kolesterolestere til fri kolesterol, hvilket er kjennetegnet ved at det dessuten inneholder kolesteroloxydase for å omdanne fri kolesterol ved pH 5-8 og i nærvær av oxygen til kolestenon og hydrogenperoxyd, og indikatoranordninger for bestemmelse av, på kjent måte, enten mengden av dannet hydrogenperoxyd, eller mengden av dannet kolestenon, fortrinnsvis inkorporert i en bærer.

Et spesielt foretrukket middel for bestemmelse av hydrogenperoxyd omfatter et reagenssystem som innbefatter en bestanddel med peroxydativ aktivitet og et indikatormateriale som oxy- ' deres i nærvær av peroxyd og bestanddelen med peroxydativ aktivitet og som forandrer farve derved. Et foretrukket kjemisk system med kolesterolesterhydrolaseaktivitet omfatter enzymet kolesterolhydrolase og en galleenzym-kofaktor. Preparatet inneholder fortrinnsvis også buffermateriale som er i stand til å opprettholde pH mellom 5 og 8 når preparatet bringes i kontakt med væskeprøven. Preparatet kan også innbefatte en bakterieinhibitor slik som natriumazid, for å forhindre forstyrrende bakterievekst.

Det foretrekkes også å bringe blandingen av væskeprøven og testpreparatet i kontakt med en sur bestanddel for å fremme frem-kalling av indikatorresponsen. Semi-kvantitative resultater erholdes ved å observere den resulterende farverespons visuelt og sammenligne en slik respons med et standard farvekart. Kvantitative resultater erholdes ved å observere den resulterende farverespons ved hjelp av instrumentelle midler.

Fremstilling av et ekstrakt inneholdende kolesterolesterhydrolase som er hovedsakelig fri for proteolytisk aktivitet kan innbefatte trinnene: kombinering av en bestanddel inneholdende kolesterolesterhydrolase, slik soiti pancreatin, og en første vandig væske som kan omfatte et uorganisk salt i løsning, separering av væsken og den faste fase som dannes, føring av den sepa-rerte væskefase gjennom en kolonne inneholdende en adsorbent som omfatter en adsorbent-aktiv diethylaminoethyldel, og føring av en annen vandig væske omfattende en uorganisk saltløsning gjennom kolonnen, hvilken uorganiske saltløsning er istand til å eluere kolesterolesterhydrolase fra kolonnen. Kolonneadsorbenten innbefatter fortrinnsvis diethylaminoethylcellulose. En bestanddel istand til å beskytte kolesterolesterhydrolase mot proteolytisk aktivitet innbefattes også fortrinnsvis både i første og andre væske.

Den vedlagte tegning viser en kurve som viser sammenset-ningen av fraksjonsbestanddelene i kolonneutløpet ved bruk av den kolesterolesterhydrolase-renseprosess som er beskrevet i eksempel 3.

I den etterfølgende beskrivelse menes med bestemmelse enten kvalitativ, semi-kvantitativ eller kvantitativ analyse om ikke annet er spesifisert.

Foreliggende oppfinnelse er basert delvis på den oppdagelse at hydrogenperoxyd dannes ved reaksjon av fri kolesterol i nærvær av molekylært oxygen og visse kjemiske systemer med kolesteroloxydaseaktivitet. Som anvendt her henviser kolesteroloxydaseaktivitet til katalysen av fri kolesterol gjennom en oxydasjonsreaksjon som danner hydrogenperoxyd som et produkt. Reaksjonen mellom slike kjemiske systemer og fri kolesterol og de etterfølgende foretrukne midler for bestemmelse av hydrogenperoxydet som dannes ved bruk av reagenset kan representeres ved følgende kjemiske ligninger:

Fri kolesterol kan også bestemmes ved å bestemme det £^-kolesten-3-on som frigies.

Det er også funnet at når det ovenfor angitte system anvendes i forbindelse med et kjemisk system med kolesterolesterhydrolaseaktivitet som er effektiv til å omdanne kolesterolestrene til fri kolesterol, kan midler for bestemmelse av total kolesterol tilveiebringes. Som angitt her angir kolesterolesterhydrolaseaktivitet katalysen av kolesterolestere til fri kolesterol gjennom hydrolyse. Denne katalyse kan representeres ved følgende ligning:

Et kjemisk system med kolesteroloxydaseaktivitet kan erholdes på forskjellige måter og i flere former. Vanligvis kan

et slikt system erholdes ved ekstraksjon av naturlig forekommende materialer slik som mikroorganismer som kan eksemplifiseres ved . det følgende: forskjellige mycobakterier slik som Mycobacterium rubrum, forskjellige nocardia slik som Nocardia erythropolis og forskjellige streptomyces.

Et spesielt kjemisk system med kolesteroloxydaseaktivitet er enzymet kolesteroloxydase som erholdes ved ekstraksjon av Mycobacterium rubrum ifølge den metode som er beskrevet i Methods in Enzymology Vol. 1, ed. Colowick og Kaplan, Academic Press (New York, 1955) på sider 678 - 81. Fremstillingen kan kort beskrives som følger: våtpakkede celler av Mycobacterium rubrum rives i stykker etter kjente metoder slik som ved oppmaling i sand. Det oppmalte materiale suspenderes i en buffer slik som en fosfatbuffer og sentrifugeres for å fjerne det uløselige materiale. Bufferen som inneholder det løselige protein, av hvilket kolesteroloxydase er en del, behandles deretter for å fjerne forstyrrende lavmolekylære materialer slik som ved dialyse.

Et kjemisk system med kolesterolesterhydrolaseaktivitet

kan erholdes på flere måter og i forskjellige former. Vanligvis erholdes et slikt system ved ekstraksjon av naturlig forekommende bestanddeler slik som animalsk eller human pancreas , lever og innvoller. Kommersiell pancreatin er spesiell nyttig, imidler-tid må denne på grunn av dens høye innhold av proteolytisk aktivitet underkastes rensing for å fjerne slik aktivitet hvilket vil diskuteres nærmere i det etterfølgende.

Bestemmelsen av fri kolesterol ved bruk av et kjemisk system med kolesteroloxydaseaktivitet er avhengig av midler for bestemmelse av det hydrogenperoxyd som dannes ved den katalyserte reaksjon. Slike midler som kan anvendes innbefatter alle kjente teknikker for bestemmelse av hydrogenperoxyd i væsker. Et spesielt foretrukket middel innbefatter bruk av et reagens omfattende en bestanddel med peroxydativ aktivitet og et indikatormateriale som oxyderes i nærvær av peroxyd og bestanddelen med peroxydativ aktivitet, og som gir en farverespons eller farveforandring.

Bestanddeler med peroxydativ aktivitet omfatter slike naturlig forekommende peroxydaser som pepperrotperoxydase og potet-peroxydase. Andre bestanddeler med peroxydativ aktivitet innbefatter visse organiske materialer slik som normalt fullblod, røde blodceller alene, lyofilysert fullblod, urohemin, metalloporphy-riner og så videre. Visse uorganiske forbindelser er også nyttige slik som jodsalter og molybdatsalter, jernsulfocyanat, jerntannat, jern(II)-ferrocyanid og kaliumkromsulfat.

Indikatormaterialer av den type som er beskrevet her innbefatter dem som er oxydasjons-reduksjonsindikatorer med et oxydasjons-reduksjonspotensial som er egnet til å bestemme hydrogenperoxyd i nærvær av bestanddelen med peroxydativ aktivitet. Slike indikatorer innbefatter o-tolidin, syringaldazin, vanillinazin, kombinasjonen av fenol og 4-aminoantipyrin, 2,7-diaminofluorid, benzidin og derivater av benzidin slik som o-dianisidin.

Når et kjemisk system med kolesterolesterhydrolaseaktivitet er innbefattet for å bestemme total kolesterol, er pH-området fortrinnsvis mellom 5 og 8 med optimum ved 6,6 når enzymkole-sterolesterhydrolase anvendes. Ethvert buffermateriale kan anvendes så lenge kriteriet for det hensiktsmessige pH-området opp-fylles og effektiviteten av testpreparatet ved bestemmelse av fri kolesterol eller total kolesterol ikke svekkes vesentlig.

Et overflateaktivt middel istand til å løse hovedsakelig alt av den fri kolesterol tilstede i væskeprøven innbefattes fortrinnsvis i testpreparatet for bestemmelse av fri kolesterol da fri kolesterol bare er svakt løselig i visse væsker slik som vandige løsninger. Når kolesterolesterhydrolase og en galle-kofaktor derfor er innbefattet for å bestemme total kolesterol, er et overflateaktivt middel ikke nødvendig da galleko-faktoren i seg selv virker som et løsende middel. Således vil bruk av kolesterolesterhydrolase og dets galle-kofaktor eliminere alt behov for et løsende middel for fri kolesterol, hvilket forenkler testpreparatet. Overflateaktive midler som kan anvendes innbefatter både ioniske og ikke-ioniske overflateaktive midler og forskjellige andre vaskemidler (detergents) som er velkjent som løsende midler. Gallestensalter er spesielt nyttige. De overflateaktive midler som virker både som løsende midler for fri kolesterol og som ko-faktorer for kolesterolesterhydrolase innbefatter cholin, glycocholin-, taurocholin- og taurodeoxycholinsyrer og deres salter. Natriumsaltene av disse forbindelser er spesielt nyttige.

Den angitte metode for bestemmelse av total kolesterol be-står hovedsakelig i at den væskeprøve som skal testes bringes i kontakt med det hensiktsmessige testpreparat beskrevet her, og at den resulterende respons observeres. Responsen er fortrinnsvis en farverespons eller en farveforandring som erholdes ved bruk av de indikatormaterialer som er beskrevet tidligere. Det hensiktsmessige testpreparat kan bringes i kontakt med væske-prøven på forskjellige måter, innbefattet å blande væskeprøven med en løsning, slik som en vandig løsning som inneholder testpreparatet. Testpreparatet kan også foreligge i tørr tilstand, slik som i lyofilisert tilstand, og tilsettes direkte til væske-prøven eller rehydratiseres før blanding. Det taes i betraktning at testpreparatet kan inkorporeres i en bærer, slik som ved im-pregnering av adsorberende puter, under dannelse av en testanordning. En slik testanordning kan dyppes i væskeprøven for å bringe testpreparatet i kontakt med væskeprøven.

Det foretrekkes at reaksjonen mellom komponentene i testpreparatet og væskeprøven tillates å forløpe i en tilstrekkelig tid for å påskynde utviklingen av en tilstrekkelig kolorimetrisk respons for pålitelige og følsomme resultater. Denne inkubasjon kan variere fra så kort tid som ca. 1 minutt til en lengre periode slik som over natten. Ved bruk av de foretrukne midler for bestemmelse av hydrogenperoxyd, er inkubasjonen vanligvis mellom 1/2 time og 1 time ved en temperatur mellom 0 og 50°C, fortrinnsvis ca. 37°C. Tilsetning av en sur bestanddel slik som svovelsyre til testpreparatet og væskeprøveblandingen er funnet å øke farveutviklingen ved bruk av det foretrukne test<p>reparat.

Semi-kvantitative resultater tilveiebringes hvor responsen observeres visuelt og sammenlignes med et standard farvekart som illustrerer responser utviklet ved bruk av kjente konsentrasjoner av fri eller total kolesterol. Kvantitative resultater tilveiebringes ved bruk av spektrofotometriske eller refleksjonsanord-ninger for bestemmelse av den respons som da sammenlignes med en standard kurve.

Når testpreparatet innbefatter proteiner slik som enzymer

i det katalytiske kjemiske system, er det nødvendig at testpreparatet er hovedsakelig fritt for proteolytisk aktivitet, dvs.

fri for bestanddeler istand til å aktivere nedbrytning av proteiner. Hvis proteolytisk aktivitet er tilstede ødelegges proteinene hvorved deres medvirkning i den katalytiske aktivitet forringes. Enzymkofaktoren for kolesterolesterhydrolase beskytter dette

enzym fra proteolytisk nedbrytning i tillegg til dets funksjon i den katalytiske aktivitet av det kjemiske system. Kolesteroloxydase og peroxydase er ikke slik beskyttet. Når testpreparatet

således innbefatter disse bestanddeler, må en proteolytisk aktivitet ikke foreligge. En kombinasjon av ekstrahert kolesterolesterhydrolase med slike proteiner som kolesteroloxydase og peroxydase krever en metode for fremstilling av et ekstrakt inneholdende kolesterolesterhydrolase som er hovedsakelig fri for proteolytisk aktivitet.

En slik metode omfatter f.eks.

kombinering av en bestanddel inneholdende kolesterolesterhydrolaseaktivitet og en første vandig væske som kan omfatte et uorganisk salt i løsning, separering av den resulterende væske og faste fase, hvoretter væskefasen føres gjennom en kolonne inneholdende en adsorbent som har en adsorbentaktiv diethylaminoethyldel, og en annen vandig væske omfattende en uorganisk salt-løsning føres gjennom kolonnen, hvilken uorganiske saltløsning er istand til å eluere kolesterolesterhydrolase fra kolonnen. Det er funnet at ved en hensiktsmessig uorganisk saltkonsentrasjon har kolesterolesterhydrolase en større affinitet for adsorbenter med diethylaminoethyldeler enn forbindelser med proteolytisk aktivitet. En foretrukket adsorbent er diethylaminoethylcellulose, selv om diethylaminoethyldelen kan bindes til et skjelett eller bærerdel forskjellig fra cellulose. Andre bærerdeler kan innbefatte forskjellige derivater av cellulose osv.

Den første vandige væske kan eller kan ikke innbefatte et uorganisk salt i løsning. Både den første og den andre vandige væske innbefatter fortrinnsvis en buffer for å opprettholde pH-omgivelsene for kolesterolesterhydrolase slik at den ikke virker ødeleggende på dets katalytiske aktivitet. pH på bufferen er fortrinnsvis mellom 5 og 8, med et optimum ved pH 6,6. Det foretrekkes ennvidere at det uorganiske salt i seg selv utviser en slik bufferfunksjon. Spesielt nyttige første og andre væsker er kaliumfosfatløsninger med en konsentrasjon opp til 0,05M for første væske oa mellom 0,1 5M og 1 ,0M for andre væske. Uorganiske saltløsninger med ionestyrker ekvivalent til kaliumfosfatløs-ninger innen de angitte områder kan også omfatte den første og andre vandige væske. Eksempler på uorganiske saltbuffere som kan anvendes innbefatter acetat, citrat, tartrat, og fthalat-buffere. En spesiell nyttig fremgangsmåte er beskrevet i eksempel 3. Det foretrekkes også at både den første og den andre væske også omfatter en bestanddel istand til å beskytte kolesterolesterhydrolase fra proteolytisk aktivitet, slik som cholin-, glycocholin-, taurocholin- og taurodeoxycholinsyrer og deres salter. En bakterieinhibitor kan også innbefattes i den første og andre vandige væske for å forhindre forstyrrende bakterievekst. En spesielt nyttig bakterieinhibitor er natriumazid.

Væskeprøver som kan analyseres ved bruk av foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis vandige løsninger hvor de foretrukne reagensmidler for bestemmelse av hydrogenperoxyd anvendes. Slike væskeprøver omfatter kroppsvæsker slik som serum, urin, plasma, osv., såvel som andre løsninger inneholdende total kolesterol slik som dem som fremstilles i laboratorier eller ved industrielle prosesser.

Testpreparatet kan foreligge i form av en løsning slik som en vandig løsning, et tørret eller lyofilisert pulver, eller kan være inkorporert i en bærerdel i tørr tilstand. Komponentene kan også lagres separat og kombineres ved bruk. Egnede bærere er istand til å absorbere væskeprøven som skal testes og innbefatter sugende papir, bomull, polymere puter, porøse plaster osv. Det tørre testpreparat kan impregneres i bæreren, belegges på bæreren, bindes kjemisk til bæreren, omsluttes fysikalsk innen bæreren, eller en hvilken som helst kombinasjon av disse, osv. Bærer-delen kan også være forbundet med eller på annen måte tilkoblet en holder eller annen bærer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et middel for bestemmelse av total kolesterol som er enkel og hurtig i forhold til de tidligere kjente midler. Det er spesielt godt egnet for klinisk bruk av personell med en minimal teknisk kunnskap og utgjør en spore til å øke antallet kolesterolbestemmelser som ønskes bestemt av legene. Det er spesielt overraskende å finne et brukbart forsøkssystem så komplekst som det som representeres ved de foretrukne midler for bestemmelse av total kolesterol. I sin foretrukne utførelsesform omfatter disse midler enzymene kolesteroloxydase, kolesterolesterhydrolase og peroxydase, en enzym-kofaktor og et oxydasjons-reduksjonsindikatormateriall, likevel krever ikke dette system komplisert kontroll av forsøks-betingelsene for å gi kvantitative resultater.

Foreliggende oppfinnelse illustreres ytterliger ved de etter-

følgende eksempler.

Eksempel 1

Dannelsen av hydrogenperoxyd ved at en væskeprøve inneholdende fri kolesterol bringes i kontakt med et testpreparat ifølge oppfinnelsen beskrives i det etterfølgende.

Et cellefritt ekstrakt av kolesteroloxydase fra Mycobacterium rubrum ble erholdt ved bruk av den fremgangsmåte som er beskrevet av Stadtman i Methods in Enzymology, Vol. 1, ed. Colowick og Kaplan, Academic Press (New York 1955), side 678 - 81. Det ble fremstilt tre løsninger med følgende bestanddeler:

En enhet av kolesteroloxydaseenzymaktivitet er definert

her som den mengde som er i stand til å katalysere oxydasjonen av ett mikromol kolesterol til ett mikromol^^-kolesten-3-on og ett mikromol hydrogenperoxyd pr. time. En enhet av kolesterolester-hydrolaseenzymaktiviteten er her definert som den mengde som er i stand til å katalysere hydrolysen av ett mikromol kolesterololeat pr. time. Peroxydase/o-dianisidinløsningene inneholdt ett mg peroxydase/ml og var mettet med hensyn til o-dianisidin • 2 HC1. Disse løsninger ble inkubert ved 37°C i 1 time etter å ha blitt

spylt med molekylært oxygen. Etter inkubering ble 1 ml 65%-ig P^SO^ tilsatt til hver løsning. Løsningene ble filtrert og ab-sorpsjon ved 540 nm ble bestemt. Kontrolløsningen og den den kokte enzymblindprøve ga optiske tettheter på hhv. 0,080 og 0,020. Enzymkolesterolløsningen ga en optisk tetthet på 0,540 hvilket bekrefter produksjonen av hydrogenperoxyd som bestemt gjennom oxydasjon av o-dianisidin.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer bruk av testpreparatet og fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av både fri og total kolesterol.

Følgende reagenser ble fremstilt:

Kolesterolesterhydrolase - 32 enheter/ml, 9,4 mg protein/ ml i 0,1M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6),

0,28 % natriumtaurokolat og 0,01 % NaN^

Kolesteroloxydase - 4 enheter/ml, 16 ml protein/ml i

0,1M kaliumfosfatbuffer (pH 7,0) og

0,01 % NaN3

Peroxydaseløsning - 0,1 mg/ml, i 0,1M kaliumfosfatbuffer

(pH 7,0) og 0,01 % NaN3

o-dianisidin - 1 mg/ml i 90 % ethylenglycolmonomethylether Buffer - 0,1M kaliumf osf atbuf f er (pH 6,6), 0,28 % natr.ium = taurokolat og 0,01 % NaN^

Serum - Serachol<*>standardisert serum nr. 1560031.

Disse reagenser ble blandet som følger:

<*> Det anvendte serum var et standardisert serum inneholdende 346 mg/100 ml total kolesterol og 74 mg/100 ml fritt kolesterol. De fire løsninger ble deretter inkubert ved 37°C i 1 time hvoretter de optiske tettheter (OD) ved 450 nm ble funnet som følger:

Analyse av dataene viser at ved subtrahering av blindprøvene fra både det fri og totale kolesterol ble det erholdt et forhold på 0,233 mellom fri kolesterol og total kolesterol. Dette ligger nær opptil det kjente forhold på 0,214 i det standardiserte serum.

Eksempel 3

Dette eksempel angir fremstilling av ekstrahert kolesterolesterhydrolase som er hovedsakelig fritt for proteolytisk aktivitet. En løsning av 10 g kommersielt pancreatin "4XNF" (fremstilt ved fremgangsmåten ifølge National formulary XIII American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 1970) i 100 ml 0,05M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocholat og 0,01 % NaN3 ble omrørt ved romtemperatur i ca. 30 minutter. 1 ml av denne pancreatinsuspensjon ble blandet med 2 ml av 0,05M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocnolat og 0,01 % NaN^ og analysert på enzymatisk aktivitet sem beskrevet i eksempel 4.

Det gjenværende volum av suspensjonen ble delt i fire like volumer og senterifugert i 30 minutter ved 15000 omdr./min og 4°c. De overliggende væsker ble kombinert og 0,1 ml av dette bufferek-strakt ble blandet med 9,9 ml 0,1M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocholat og 0,01 % NaN^. Dette fortynnede ekstrakt ble analysert på protein ved bruk av metoden som er beskrevet i Methods in Enzymology, Vol. III, ed. Colowick og Kaplan, Academic Press (New York, 1957) side 451 - 454. Også 0,1 ml av bufferekstraktet ble blandet med 0,2 ml 0,1M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocholat og 0,01 % NaN^ og analysert

på en enzymatisk aktivitet som beskrevet i eksempel 4.

"DE-52" (DEAE-cellulose) ble vasket i 0,05M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocholat og 0,01 % NaN^ og tilsatt som en velling til en 5 cm x 90 cm kolonne under dannelse av et 1 liters skiktvolum med et 200 ml volum av bufferen gjenværende på toppen av skiktet. Det hele 4 liters volum av fosfatbuffer-ekstraktet ble deretter tilsatt til kolonnen, etterfulgt av 50 ml av en første eluerende buffer på 0,05M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocholat, 0,01 % NaN^ og 0,01M mercaptoethanol.

En annen eluerende buffer ble deretter kontinuerlig tilsatt be-stående av 0,2M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 natriumtauro-cholat, 0,01 % NaN^ og 0,01M mercaptoethanol. Kolonneavløpet ble oppsamlet i 22 ml fraksjoner som ble analysert på enzymatisk aktivitet ved bruk av den fremgangsmåte som etterfølger dette eksempel og analysert på protein som ovenfor. Resultatene er angitt i den etterfølgende tabell og i kurven som illustrert i den medfølgende tegning.

De utløpsfraksjoner som inneholdt kolesterolesterhydrolase ble kombinert og volumet konsentrert til ca. 100 ml på en "UM-10" ultrafiltreringsmembran og ble deretter dialysert mot 100 volumer 0,05M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocholat og 0,01 % NaN^ ved 4°C over natten med én bufferforandring.

Utløpsfraksjonene med 0,2M kaliumfosfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurocholat, 0,01 % NaN^ og 0,01M mercaptoethanol ble funnet å inneholde ingen proteolytisk aktivitet fra hverken trypsin eller chymotrypsin.

Eksempel 4

Det etterfølgende angir fremstilling av kolesterololeatsub-sterat for bruk ved bestemmelse av kolesterolesterhydrolaseaktivitet og forsøksprosedyren.

a. Substratfremstilling

10 mg kolesterololeat og 18 mg DL-lecithin ble løst i 1 ml ethylether i et homogeniseringsrør utstyrt med et teflon plunger-stempel. 6 ml 0,1M kaliumofsfatbuffer (pH 6,6), 0,28 % natriumtaurokolat og 0,01 % NaN^ ble deretter tilsatt og blandingen ble homogenisert ved bruk av plungerstemplet i 5 minutter. Etheren ble deretter fjernet ved å holde røret under varmt rennende vann med leilighetsvis aktivering av plungerstemplet i løpet av en 15 minutters periode. Løsningen ble avkjølt i et isbad og underkastet ultralydbehandling i 15 minutter ved bruk av en "Sonifier" cellesprenger Model W140 og en "Sonifier" omdanner Model L. Løs-ningen ble deretter sentrifugert ved 2500 omdr./min. i 15 minutter og det uløselige materiale ble fjernet.

b. Forsøksprosedyre

25 mikroliter av enzymløsningen ble tilsatt til 1 ml av substratløsningen på forhånd oppvarmet til 37°C og inkubert ved 37°C i 10 minutter. 4 ml av Bloors løsningemiddel (75 % ethylalkohol: 25 % ethylether) ble tilsatt og løsningen ble sentrifugert ved 2 000 omdr./min. i 10 minutter. 1 ml av den overliggende væske ble blandet med 1 ml av en 1,0 % digitoninløsning i 50 % ethylalkohol: 50 % vann. Bunnfallet fikk koagulere i løpet av 12 timer og løsninger ble deretter sentrifugert ved 2500 omdr./ min i 15 minutter. Bunnfallet ble vasket med 4 ml aceton og på nytt sentrifugert. Dette bunnfallet ble tørekt i en svak strøm av luft ved romtemperatur og 3 ml 0,1 % FeCI^ * Gf^O i iseddik ble tilsatt for å oppløse bunnfallet. 2 ml konsentrert t^SO^

ble tilsatt sakte under dannelse av to lag som hurtig ble blandet og den optiske tetthet ble målt ved 560 nm. Disse verdier ble deretter dividert med den optiske tetthet til en prøve inneholdende en kjent mengde fri kolesterol underkastet den samme for-søksprosedyre. For å oppnå resultater uttrykt i enheter/ml som definert her, ble kvotientene deretter multiplisert med tid og fortynningsfaktorer for å gi resultater uttrykt i mikromol kolesterol pr. ml pr. time. Spesifikt ble 0,1 mikromol fri kolesterol underkastet den ovenfor angitte prosedyre ved bruk av 2,5 ml av

den overliggende væske som ga en optisk tetthet på 1,248. Da forsøkstiden var 10 minutter og det anvendte volum var 25 mikroliter, var tiden og fortynningsfaktoren hhv. 6 og 40 og kolesterolesterhydrolaseaktiviteten ble beregnet som følger:

Claims

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av totalt kolesterol i en biologisk væskeprøve ved først å omdanne kolesterolester til fri kolesterol ved omsetning med kolesterolesterhydrolase, karakterisert ved at kolesterol omsettes ved pH 5-8 og i nærvær av oxygen med kolesteroloxydase til kolestenon og hydrogenperoxyd, og at kolesterolmengden avleses på kjent måte, enten ved å bestemme mengden av dannet hydrogenperoxyd ved hjelp av en fargereaksjon, eller ved å bestemme mengden av dannet kolestenon spektrofotometrisk.

2. Preparat for anvendelse ved bestemmelse av totalt kolesterol i en biologisk væskeprøve, inneholdende kolesterolesterhydrolase for å omdanne kolesterolestere til fri kolesterol, karakterisert ved at det dessuten inneholder kolesteroloxydase for å omdanne fri kolesterol ved pH 5-8 og i nærvær av oxygen til kolestenon og hydrogenperoxyd, og indikatoranordninger for bestemmelse av, på kjent måte, enten mengden av dannet hydrogenperoxyd eller mengden av dannet kolestenon, fortrinnsvis inkorporert i en bærer.