JPS5974996A - 生体体液成分の測定法 - Google Patents
生体体液成分の測定法Info
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- JPS5974996A JPS5974996A JP18663382A JP18663382A JPS5974996A JP S5974996 A JPS5974996 A JP S5974996A JP 18663382 A JP18663382 A JP 18663382A JP 18663382 A JP18663382 A JP 18663382A JP S5974996 A JPS5974996 A JP S5974996A
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、公知の方法により生体体液成分を測定するに
際し、あらかじめ固定化ビリルビンオキシダーゼと生体
体液試料とを反応させたのちの体液試料を検液とするこ
とを特徴とする生体体液成分の測定法に関する。さらに
詳しくは、固定化ビリルビンオキシダーゼと生体体液試
料との反応により生体体液試料に含まれるビリルビンを
減少又は消失せしめ、ビリルビンの生体体液成分測定反
応に列する干渉を回避又は軽減することを特徴とする生
体体液成分の測定法である。本発明法において、生体体
液とは血清、尿などであり、又、測定される成分はグル
コース、コレステロール、尿酸、中性脂肪、遊離脂肪酸
、リン脂質、タレアチニン、クレアチンなどである。
際し、あらかじめ固定化ビリルビンオキシダーゼと生体
体液試料とを反応させたのちの体液試料を検液とするこ
とを特徴とする生体体液成分の測定法に関する。さらに
詳しくは、固定化ビリルビンオキシダーゼと生体体液試
料との反応により生体体液試料に含まれるビリルビンを
減少又は消失せしめ、ビリルビンの生体体液成分測定反
応に列する干渉を回避又は軽減することを特徴とする生
体体液成分の測定法である。本発明法において、生体体
液とは血清、尿などであり、又、測定される成分はグル
コース、コレステロール、尿酸、中性脂肪、遊離脂肪酸
、リン脂質、タレアチニン、クレアチンなどである。
近年、臨床化学分析における酵素的分析法の進歩はめざ
ましく、前述の各種生体体液成分の測定のためにグルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリ
カーゼ、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、コリンオ
キシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、
ザルコシンオキシダーゼなどの酸化酵素が広範に用いら
れている。これら酸化酵素を用いる方法では生成した過
酸化水素をパーオキシダーゼ−水素供与体系を用いる方
法で比色定量するのが雷であるが、この方法では、検液
中に存在する種々の還元物質、投与薬剤、生体色素など
により干渉を受りる。これら干渉物質のなかで、ビリル
ビンによる干渉機序については、 （１）ビリルビンの特異吸収（４６０ｎｍ付近）による
直接的影響 （２）ビリルビンがパーオキシダーゼの水素供与体とな
る （３）生成された呈色色素に直接的に作用して分解する などが言われている（臨床化学 第８巻、６３−７２ペ
ージ、１９７９年）。
ましく、前述の各種生体体液成分の測定のためにグルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリ
カーゼ、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、コリンオ
キシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、
ザルコシンオキシダーゼなどの酸化酵素が広範に用いら
れている。これら酸化酵素を用いる方法では生成した過
酸化水素をパーオキシダーゼ−水素供与体系を用いる方
法で比色定量するのが雷であるが、この方法では、検液
中に存在する種々の還元物質、投与薬剤、生体色素など
により干渉を受りる。これら干渉物質のなかで、ビリル
ビンによる干渉機序については、 （１）ビリルビンの特異吸収（４６０ｎｍ付近）による
直接的影響 （２）ビリルビンがパーオキシダーゼの水素供与体とな
る （３）生成された呈色色素に直接的に作用して分解する などが言われている（臨床化学 第８巻、６３−７２ペ
ージ、１９７９年）。
ビリルビンの血清中での濃度は、正當人では１■／ｄノ
以下であるが、病的には２０■／ｄ１に達することもあ
り、臨床検査上その影響は重大な問題である。
以下であるが、病的には２０■／ｄ１に達することもあ
り、臨床検査上その影響は重大な問題である。
これらの問題に関する公知技術としては、例えばフェロ
シアン化物、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ−鉄錯体又はピ
リルビン特異性菌性酵素組成物を反応系に添加する方法
などが知られている（特公昭５５−２５８４０号公報、
特開昭５５−１３８６５６号公報、特開昭５５−２９７
１８号公報、特開昭５７−７１３９８号公報、特開昭５
４−１５１１９３号公報及びクリニカルケミスｌ−！Ｊ
−第２６巻、２２７−２３１ページ、１９８１年）。
シアン化物、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ−鉄錯体又はピ
リルビン特異性菌性酵素組成物を反応系に添加する方法
などが知られている（特公昭５５−２５８４０号公報、
特開昭５５−１３８６５６号公報、特開昭５５−２９７
１８号公報、特開昭５７−７１３９８号公報、特開昭５
４−１５１１９３号公報及びクリニカルケミスｌ−！Ｊ
−第２６巻、２２７−２３１ページ、１９８１年）。
しかし、これら従来の方法はいずれも欠点があり、十分
満足できる方法とはいえない。
満足できる方法とはいえない。
本発明者らは、」二連のような酸化酵素を用いた公知の
生体体液成分の測定において、同時又はあらかじめビリ
ルビンオキシダーゼを試料に作用させるときは、試料中
に含まれるビリルビンが酸化されてビリベルジンを経て
ほぼ無色の生成物に変化し、かつ、過酸化水素も生成し
ないためビリルビンによる干渉が回避されることを知っ
た。しかし、ビリルビンオキシダーゼを水溶性の状態で
使用することば、使い捨てとなるため経済的に不利であ
るし、又、ビリルビンオキシダーゼは測定試薬に含まれ
るフェノールに若干反応性があるためブランク値を上昇
させるという欠点がある。かかる欠点を改良するため本
発明者らは鋭意研究したところ、酵素ビリルビンオキシ
ダーゼを固定化して使用することにより、ビリルビンオ
キシダーゼの反復使用ならびに生体体液成分測定におけ
る反応系への混入防止ができることを見出し本発明を完
成した。
生体体液成分の測定において、同時又はあらかじめビリ
ルビンオキシダーゼを試料に作用させるときは、試料中
に含まれるビリルビンが酸化されてビリベルジンを経て
ほぼ無色の生成物に変化し、かつ、過酸化水素も生成し
ないためビリルビンによる干渉が回避されることを知っ
た。しかし、ビリルビンオキシダーゼを水溶性の状態で
使用することば、使い捨てとなるため経済的に不利であ
るし、又、ビリルビンオキシダーゼは測定試薬に含まれ
るフェノールに若干反応性があるためブランク値を上昇
させるという欠点がある。かかる欠点を改良するため本
発明者らは鋭意研究したところ、酵素ビリルビンオキシ
ダーゼを固定化して使用することにより、ビリルビンオ
キシダーゼの反復使用ならびに生体体液成分測定におけ
る反応系への混入防止ができることを見出し本発明を完
成した。
まず、本発明において用いる酵素ビリルビンオキシダー
ゼについて説明すると、本酵素の生産菌としてはミロセ
シウム（Ｍｙｒｏｔｌ＋ｅｃｉｕｍ ）属又はコプリナ
ス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属する菌株があげられる。
ゼについて説明すると、本酵素の生産菌としてはミロセ
シウム（Ｍｙｒｏｔｌ＋ｅｃｉｕｍ ）属又はコプリナ
ス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属に属する菌株があげられる。
具体的にはミロセシウム属菌としては、本発明者らが見
いだしたミロセシウム・ヘルカリア（Ｍｙｒ、ｖｅｒｒ
ｕｃａｒｉａ）門Ｔ−１，，ＦＥＲＭ−Ｐ ５９１８
（アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミ
ストリー （八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第
４５巻、２３Ｂ３−２３８４ページ（１９８１年）参照
〕のほか、ミロセシウム・ヘルカリア ＩＦＯ６１１３
，ミロセシウム・ヘルカリア ＩＰＯ６１３３，ミロセ
シウム・ベル力リア ＩＦＯ６３５１，ミロセシウム・
ヘルカリアＩＦＯ９０５６，ミロセシウム・チンクタム
（Ｍｙ乙ｃｉｎｃｔｕｍ ） ＩＦＯ９９５０＋ ミロ
セシウム・ロリダム（Ｍｙｒ、ｒｏｒｉｄｕｍ ） Ｉ
Ｐｏ ９５３１などの保存菌株があげられる。又、コプ
リナス属菌としては、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐ
ｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ ） ＩＦＯ８３７１
、コプリナス・ラゴピデス（Ｃｏｐ、Ｉａｇｏｐｉｄｅ
ｓ ） ＩＦＯ３０１２０なとの保存菌株があげられる
。
いだしたミロセシウム・ヘルカリア（Ｍｙｒ、ｖｅｒｒ
ｕｃａｒｉａ）門Ｔ−１，，ＦＥＲＭ−Ｐ ５９１８
（アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミ
ストリー （八ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）第
４５巻、２３Ｂ３−２３８４ページ（１９８１年）参照
〕のほか、ミロセシウム・ヘルカリア ＩＦＯ６１１３
，ミロセシウム・ヘルカリア ＩＰＯ６１３３，ミロセ
シウム・ベル力リア ＩＦＯ６３５１，ミロセシウム・
ヘルカリアＩＦＯ９０５６，ミロセシウム・チンクタム
（Ｍｙ乙ｃｉｎｃｔｕｍ ） ＩＦＯ９９５０＋ ミロ
セシウム・ロリダム（Ｍｙｒ、ｒｏｒｉｄｕｍ ） Ｉ
Ｐｏ ９５３１などの保存菌株があげられる。又、コプ
リナス属菌としては、コプリナス・シネレウス（Ｃｏｐ
ｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ ） ＩＦＯ８３７１
、コプリナス・ラゴピデス（Ｃｏｐ、Ｉａｇｏｐｉｄｅ
ｓ ） ＩＦＯ３０１２０なとの保存菌株があげられる
。
上記菌株を用いてビリルビンオキシダーゼを取得するに
は、常法により菌株を液体培養又は固体培養し、その培
養物から抽出、塩析、透析、イオン交換、ゲル濾過など
を行うことにより本酵素の精製標品が得られる。
は、常法により菌株を液体培養又は固体培養し、その培
養物から抽出、塩析、透析、イオン交換、ゲル濾過など
を行うことにより本酵素の精製標品が得られる。
以上のようにして得られたビリルビンオキシダーゼは、
ビリルビンに作用してビリベルジンを経てほぼ無色の生
成物に変化せしめる結果、ビリルビンの特異吸収（４６
０ｎｍ （ｊ近）が減少するとともに、その還元性がな
くなる。又、本酵素は過酸化水素を生成しない特徴を有
する。
ビリルビンに作用してビリベルジンを経てほぼ無色の生
成物に変化せしめる結果、ビリルビンの特異吸収（４６
０ｎｍ （ｊ近）が減少するとともに、その還元性がな
くなる。又、本酵素は過酸化水素を生成しない特徴を有
する。
本発明において、ビリルビンオキシダーゼを固定化する
方法は、特に限定されず、公知の方法を利用できる。例
えば、セルロース、デキストラン、アガロースなどの多
糖類誘導体、又はポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラ
ス、ポリスチレンなどの担体に共有結合法、イオン結合
法、物理的吸着法により酵素を結合させる方法、酵素ど
うしをグルタルアルデヒド、イソシアナート誘導体、ビ
スジアゾヘンジジン、 Ｎ、Ｎ”−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、又はＮ、Ｎ’−エチレンビスマレイ
ミドのような多官能性試薬を用いて架橋させる方法、ポ
リアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールケル、ケ
イ素樹脂、デンプンなどの高分子ゲルの格子の中に酵素
を包括する方法、ナイロン、ポリウレア、ポリスチレン
、コロジオンなどの半透膜性のポリマーの皮膜によって
酵素をマイクロ゛カプセル化する方法があげられる。こ
れらの方法のうり、本発明法に特に適するのはセルロー
ス、多孔性ガラス、ポリスチレンを担体としてこれに酵
素を結合させる方法である。
方法は、特に限定されず、公知の方法を利用できる。例
えば、セルロース、デキストラン、アガロースなどの多
糖類誘導体、又はポリアクリルアミドゲル、多孔性ガラ
ス、ポリスチレンなどの担体に共有結合法、イオン結合
法、物理的吸着法により酵素を結合させる方法、酵素ど
うしをグルタルアルデヒド、イソシアナート誘導体、ビ
スジアゾヘンジジン、 Ｎ、Ｎ”−ポリメチレンビスヨ
ードアセトアミド、又はＮ、Ｎ’−エチレンビスマレイ
ミドのような多官能性試薬を用いて架橋させる方法、ポ
リアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコールケル、ケ
イ素樹脂、デンプンなどの高分子ゲルの格子の中に酵素
を包括する方法、ナイロン、ポリウレア、ポリスチレン
、コロジオンなどの半透膜性のポリマーの皮膜によって
酵素をマイクロ゛カプセル化する方法があげられる。こ
れらの方法のうり、本発明法に特に適するのはセルロー
ス、多孔性ガラス、ポリスチレンを担体としてこれに酵
素を結合させる方法である。
上記のようにしてｆｌた固定化酵素を用いて生体体液成
分を測定するには、例えば、固定化酵素をカラムに詰め
そこへ血清などの試料を添加し、反応させたのち緩衝液
で熔出する。ポリスチレン試験管に酵素を固定化した場
合は試験管に試料を加えて反応さ−Ｕたのちの液をその
まま使用できる。
分を測定するには、例えば、固定化酵素をカラムに詰め
そこへ血清などの試料を添加し、反応させたのち緩衝液
で熔出する。ポリスチレン試験管に酵素を固定化した場
合は試験管に試料を加えて反応さ−Ｕたのちの液をその
まま使用できる。
このようにして得られた試料を検液として、前述の公知
のグルコース、コレステロールなどの測定操作を行い、
あらかじめ作成しておいた検量線と対比することにより
試料中の成分の濃度を求める。
のグルコース、コレステロールなどの測定操作を行い、
あらかじめ作成しておいた検量線と対比することにより
試料中の成分の濃度を求める。
以」二のようにしてビリルビンオキシダーゼを固定化し
て用いた場合は、少なくとも３ケ月間は安定に保存でき
、かつ、繰り返しの使用が可能であった。又、本発明法
により、前述の生体体液成分の測定におけるビリルビン
の干渉を完全に防くことができた。
て用いた場合は、少なくとも３ケ月間は安定に保存でき
、かつ、繰り返しの使用が可能であった。又、本発明法
により、前述の生体体液成分の測定におけるビリルビン
の干渉を完全に防くことができた。
以下、試験例、実施例をもって本発明の詳細な説明する
が、説明中にあるビリルビンオキシダーゼの単位は次の
定義による。すなわち、エチレンジアミン四酢酸（１ｍ
Ｍ）を含む０．２ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４
） ２５０−にビリルビン（和光線素製） ５’ｍｇ
ｆｃ溶解し、この２ｍｅと酵素を３７℃で反応させ４４
０ｎｍの吸光度の減少を測定し、１分間に１マイクロモ
ルのビリルビンを酸化する酵素量を１単位とした。
が、説明中にあるビリルビンオキシダーゼの単位は次の
定義による。すなわち、エチレンジアミン四酢酸（１ｍ
Ｍ）を含む０．２ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，４
） ２５０−にビリルビン（和光線素製） ５’ｍｇ
ｆｃ溶解し、この２ｍｅと酵素を３７℃で反応させ４４
０ｎｍの吸光度の減少を測定し、１分間に１マイクロモ
ルのビリルビンを酸化する酵素量を１単位とした。
試験例１ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製 （１
１ シアン化臭素活性化セファロース４Ｂ （ＣＮＢｒ−ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ファル
マシア製） Ｉｇを１ｍＭ塩酸２００ｍｅに懸濁したの
ち、０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐｌ（８
，３、以下緩衝液Ａという）で十分洗浄し、これに緩衝
液入に熔解したビリルビンオキシダーゼ（４０ｕ／ｍｆ
ｆ） １ ｍｅを加え、ゆるやかに攪拌しなから４°Ｃ
１−晩装置した。その後緩ｉｈ液Ａ、 ０．２Ｍエタノ
ールアミン（ｐＨ８，３） 、緩衝液Ａ、０．５Ｍ食塩
を含む０．２Ｍ酢酸緩ｉＩｉ液（ｐＨ５，０５０，０５
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０、以下緩ｆｆｆｉｊ
液Ｂという）の順で洗浄して固定化ビリルビンオキシダ
ーゼを作成し、これをカラム（内径３ｍｍ Ｘ長さ１０
ｍｍ）に充填し固定化酵素カラムを得た。以上の操作に
よる酵素活性の収率は１５％であった。
１ シアン化臭素活性化セファロース４Ｂ （ＣＮＢｒ−ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ、ファル
マシア製） Ｉｇを１ｍＭ塩酸２００ｍｅに懸濁したの
ち、０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐｌ（８
，３、以下緩衝液Ａという）で十分洗浄し、これに緩衝
液入に熔解したビリルビンオキシダーゼ（４０ｕ／ｍｆ
ｆ） １ ｍｅを加え、ゆるやかに攪拌しなから４°Ｃ
１−晩装置した。その後緩ｉｈ液Ａ、 ０．２Ｍエタノ
ールアミン（ｐＨ８，３） 、緩衝液Ａ、０．５Ｍ食塩
を含む０．２Ｍ酢酸緩ｉＩｉ液（ｐＨ５，０５０，０５
Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０、以下緩ｆｆｆｉｊ
液Ｂという）の順で洗浄して固定化ビリルビンオキシダ
ーゼを作成し、これをカラム（内径３ｍｍ Ｘ長さ１０
ｍｍ）に充填し固定化酵素カラムを得た。以上の操作に
よる酵素活性の収率は１５％であった。
試験例２ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製 （２
） 酵素固定化担体としてエポキシ活性化セファロース４Ｂ
（Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ５ｅｐｔ＋ａｒ
ｏｓｅ ４Ｂ、ファルマシア製）を用い、試験例２と同
様に操作して固定化酵素カラムを得た。以上の操作によ
る酵素活性の収率は９％であった。
） 酵素固定化担体としてエポキシ活性化セファロース４Ｂ
（Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ５ｅｐｔ＋ａｒ
ｏｓｅ ４Ｂ、ファルマシア製）を用い、試験例２と同
様に操作して固定化酵素カラムを得た。以上の操作によ
る酵素活性の収率は９％であった。
試験例３ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製 （３
） アミノ基を官能基としてもつ多孔性ガラスピース（和光
線素製） Ｉｇに１％グルタルアルデヒド（ｐＨ７，４
） １０ｍｅを加え、室温で３０分反応させたのち緩衝
液Ｂで十分洗浄し、これに緩挿ｉ液Ｂに熔解したビリル
ビンオキシダーゼ（４０ｕ／＋＋＋Ｉ！＞ ｌ ｍ（！
を加えてゆるやかに攪拌しながら４℃、−晩装置した。
） アミノ基を官能基としてもつ多孔性ガラスピース（和光
線素製） Ｉｇに１％グルタルアルデヒド（ｐＨ７，４
） １０ｍｅを加え、室温で３０分反応させたのち緩衝
液Ｂで十分洗浄し、これに緩挿ｉ液Ｂに熔解したビリル
ビンオキシダーゼ（４０ｕ／＋＋＋Ｉ！＞ ｌ ｍ（！
を加えてゆるやかに攪拌しながら４℃、−晩装置した。
その後試験例１に記載したと同様に、順に緩衝液で洗浄
を行い、最後に緩衝液Ｂで洗浄し固定化ビリルビンオキ
シダーゼを作成し、これを前記と同様のカラムに充填し
、固定化酵素カラムを得た。以上の操作による酵素活性
の収率は１２％であっ 〕こ。
を行い、最後に緩衝液Ｂで洗浄し固定化ビリルビンオキ
シダーゼを作成し、これを前記と同様のカラムに充填し
、固定化酵素カラムを得た。以上の操作による酵素活性
の収率は１２％であっ 〕こ。
試験例４ 固定化ビリルビンオキシダーゼの調製 （４
） ポリスチレン試験管（１３ｍｍＸ １００ｍｍ）にγ
−アミノプロピルトリエトキシシランを数滴滴下し試験
管内壁をコーティングし、水洗後さらに１％グルタルア
ルデヒド（ａｌｌ ７．４）を加えて内壁を処理した。
） ポリスチレン試験管（１３ｍｍＸ １００ｍｍ）にγ
−アミノプロピルトリエトキシシランを数滴滴下し試験
管内壁をコーティングし、水洗後さらに１％グルタルア
ルデヒド（ａｌｌ ７．４）を加えて内壁を処理した。
試験管を水洗後、緩衝液Ｂに熔解したビリルビンオキシ
ダーゼ（４ｕ／ｍｌり １ ｍｅを加えて、室温におい
て４時間、回転、振盪した。その後、試験例１に記載し
たと同様に、順に緩衝液で洗浄を行い、最後に緩衝液Ｂ
で洗浄し、固定化酵素試験管を得た。以上の操作による
酵素活性の収率は９％で あ っ ノこ。
ダーゼ（４ｕ／ｍｌり １ ｍｅを加えて、室温におい
て４時間、回転、振盪した。その後、試験例１に記載し
たと同様に、順に緩衝液で洗浄を行い、最後に緩衝液Ｂ
で洗浄し、固定化酵素試験管を得た。以上の操作による
酵素活性の収率は９％で あ っ ノこ。
実施例１ グルコースの測定
試験例１て調製した固定化酵素カラムにドデシル硫酸ナ
トリウム（０，１％）を含有する０、１旧・リス塩酸緩
衝液（ｐｌ＋ ８．０）を流し、カラムを平衡イ１した
。次いで試料として、５．１０．１５．２０ｍｇ／ ｄ
ｌのビリルビンを含むグルコース水溶液（２００ｍｇ／
ｄｌ ）各々５０）１（！を加えたのち、上記緩鍾ｊ
液を流し溶出液５００７１４’を得た。溶出液を検液と
して、この２００Ｉ司と公知のグルコース測定試薬であ
るグルコースオキシダーゼ（大野製薬製、１’７ ｕ／
ｍｅ＞ 、パーオキシダーゼ （ヘーリンガー製、０．
３ ｕ／ｍｅ） 、４−アミノアンチピリン（０，４
ｍＭ） 、フェノール（１５ｍＭ）を含む０．１ Ｍ−
燐酸緩衝液（ｐＨ７，５） ３ ｍｅを混合し３７°
Ｃｌ２Ｏ分反応させたのち、反応液の５０５ｎｍにおり
る吸光度を測定した。一方、比較として、固定化酵素処
理を行わないで各試料を１０倍に希釈した検波を用いて
、」１記と同様のグルコースの測定操作を行った。
トリウム（０，１％）を含有する０、１旧・リス塩酸緩
衝液（ｐｌ＋ ８．０）を流し、カラムを平衡イ１した
。次いで試料として、５．１０．１５．２０ｍｇ／ ｄ
ｌのビリルビンを含むグルコース水溶液（２００ｍｇ／
ｄｌ ）各々５０）１（！を加えたのち、上記緩鍾ｊ
液を流し溶出液５００７１４’を得た。溶出液を検液と
して、この２００Ｉ司と公知のグルコース測定試薬であ
るグルコースオキシダーゼ（大野製薬製、１’７ ｕ／
ｍｅ＞ 、パーオキシダーゼ （ヘーリンガー製、０．
３ ｕ／ｍｅ） 、４−アミノアンチピリン（０，４
ｍＭ） 、フェノール（１５ｍＭ）を含む０．１ Ｍ−
燐酸緩衝液（ｐＨ７，５） ３ ｍｅを混合し３７°
Ｃｌ２Ｏ分反応させたのち、反応液の５０５ｎｍにおり
る吸光度を測定した。一方、比較として、固定化酵素処
理を行わないで各試料を１０倍に希釈した検波を用いて
、」１記と同様のグルコースの測定操作を行った。
結果を第１図に示す。同図において（−〇−）は本実施
例の結果を、（−４−）は比較例をそれぞれ表す。本発
明の方法により、試料に共存するビリルビンの影響が無
視できることがわかった。
例の結果を、（−４−）は比較例をそれぞれ表す。本発
明の方法により、試料に共存するビリルビンの影響が無
視できることがわかった。
実施例２ 血清中のグルコースの測定
試験例１で調製した固定化酵素カラムを用い、ここへド
デシル硫酸ナトリウム（０，１％）を含有する０、１Ｍ
１−リス塩酸緩衝液（ｐｌ！ ８．０）を流し、カラム
を平衡化した。次いで血清試料５０越を加えたのち上記
緩衝液を流し溶出液５００＋ｉｎ！を得た。溶出液を検
液として、この２００ｐ、ｔ！と公知のグルコース測定
試薬であるグルコースオキシダーゼ（大野製薬製、１７
ｕ／ｍｅ）、パーオキシダーゼ（ヘーリンガー製、０
．３ ｕ／ｍｅ） 、４−アミノアンチピリン（０，
４ｍＭ） 、フェノール（１５ｍＭ）を含む０．１Ｍ−
燐酸緩衝液（ｐＨ７，５） ３ｍｇを混合し、３７°Ｃ
ｌ２Ｏ分反応させたのち、反応液の５Ｑ５ｎｍにおける
吸光度を測定した。この吸光度を、あらかじめ標準グル
コース水溶液を検液として、」１記と同様に操作して作
成した検量綿と対比して本試料中のクルコース濃度を求
めたところ、９６．５ｍｇ／ｄｉであった。比較として
、固定化酵素処理をしていないＩｆｌｌ消試料全試料と
して同様に操作したところ、９０．６ｍｇ／ ｄｉであ
った。なお用いた血清試料中の総ビリルビン濃度は］、
２．５ｍｇ／ ｄＩ！であったが、本固定化酵素処理を
したことにより ２．２ｍｇ／ ｄｉ （１８％）に減
少した。
デシル硫酸ナトリウム（０，１％）を含有する０、１Ｍ
１−リス塩酸緩衝液（ｐｌ！ ８．０）を流し、カラム
を平衡化した。次いで血清試料５０越を加えたのち上記
緩衝液を流し溶出液５００＋ｉｎ！を得た。溶出液を検
液として、この２００ｐ、ｔ！と公知のグルコース測定
試薬であるグルコースオキシダーゼ（大野製薬製、１７
ｕ／ｍｅ）、パーオキシダーゼ（ヘーリンガー製、０
．３ ｕ／ｍｅ） 、４−アミノアンチピリン（０，
４ｍＭ） 、フェノール（１５ｍＭ）を含む０．１Ｍ−
燐酸緩衝液（ｐＨ７，５） ３ｍｇを混合し、３７°Ｃ
ｌ２Ｏ分反応させたのち、反応液の５Ｑ５ｎｍにおける
吸光度を測定した。この吸光度を、あらかじめ標準グル
コース水溶液を検液として、」１記と同様に操作して作
成した検量綿と対比して本試料中のクルコース濃度を求
めたところ、９６．５ｍｇ／ｄｉであった。比較として
、固定化酵素処理をしていないＩｆｌｌ消試料全試料と
して同様に操作したところ、９０．６ｍｇ／ ｄｉであ
った。なお用いた血清試料中の総ビリルビン濃度は］、
２．５ｍｇ／ ｄＩ！であったが、本固定化酵素処理を
したことにより ２．２ｍｇ／ ｄｉ （１８％）に減
少した。
また用いた固定化酵素カラムは少なくとも繰り返し５０
回の使用が可能であった。
回の使用が可能であった。
実施例３ １１１１清中のグルコースの測定試験例２で
調製した固定化酵素カラム及び実施例２で使用した血清
試料を用い、実施例２と同様に操作したところ、本面Ｆ
ｔ試料中のグルコース濃度は９６．４ｍＢ／ｌＵであっ
た。なお用いた血清試料中の総ビリルビン濃度は本固定
化酵素処理をしたことにより ２．５ｍｇ／ｄｌ（２０
％）に減少した。また用いた固定化酵素カラムは少なく
とも繰り返し５０回の使用が可能であった。
調製した固定化酵素カラム及び実施例２で使用した血清
試料を用い、実施例２と同様に操作したところ、本面Ｆ
ｔ試料中のグルコース濃度は９６．４ｍＢ／ｌＵであっ
た。なお用いた血清試料中の総ビリルビン濃度は本固定
化酵素処理をしたことにより ２．５ｍｇ／ｄｌ（２０
％）に減少した。また用いた固定化酵素カラムは少なく
とも繰り返し５０回の使用が可能であった。
実施例４ ＋ｒｎ漬中のグルコースの測定試験例３で
調製した固定化酵素カラム及び実施例２で使用した血清
試料を用い、実施例２と同様に操作したところ、本血清
試料中のグルコース濃度は９６．２ｍｇ／ｄｆであった
。なお用いた＋ｆ＋ｔ ・漬試料中の総ビリルビン濃度
は本固定化酵素処理をしたことにより２．５ｍｇ ／
ｄｉ （２０％）に減少した。また用いた固定化酵素カ
ラム−１よ少なくとも繰り返し５０回の使用が可能であ
った。
調製した固定化酵素カラム及び実施例２で使用した血清
試料を用い、実施例２と同様に操作したところ、本血清
試料中のグルコース濃度は９６．２ｍｇ／ｄｆであった
。なお用いた＋ｆ＋ｔ ・漬試料中の総ビリルビン濃度
は本固定化酵素処理をしたことにより２．５ｍｇ ／
ｄｉ （２０％）に減少した。また用いた固定化酵素カ
ラム−１よ少なくとも繰り返し５０回の使用が可能であ
った。
実施例５ 血清中のグルコースの測定
試験例４で調製した、酵素を固定化したボリスヂレン試
験管に実施例２で用いたと同じ血清試１５０メ司と０．
１Ｍ−燐酸緩衝液（ｐＨ７，５） ０．５ ｍｌ、を入
れ、室温で５分間振盪した。ここで得られた試料を検液
として実施例２と同様に操作したところ、本血清試料中
のグルコース濃度は９６．２ｍｇ／ ｄｌであった。
験管に実施例２で用いたと同じ血清試１５０メ司と０．
１Ｍ−燐酸緩衝液（ｐＨ７，５） ０．５ ｍｌ、を入
れ、室温で５分間振盪した。ここで得られた試料を検液
として実施例２と同様に操作したところ、本血清試料中
のグルコース濃度は９６．２ｍｇ／ ｄｌであった。
なお用いた血清試料中の総ビリルビン濃度は本固定化酵
素処理をしたことにより２．９ｍｇ Ｚｄｉ （２３％
）に減少した。また用いた固定化酵素試験管は少なくと
も繰り返し５０回の使用が可能であった。
素処理をしたことにより２．９ｍｇ Ｚｄｉ （２３％
）に減少した。また用いた固定化酵素試験管は少なくと
も繰り返し５０回の使用が可能であった。
実施例６ 血清中の総コレステロールの測定実施例２に
記載したと同様の操作により、血清試料を固定化酵素処
理して得た検液２００ノＪｆと公知の総コレステロール
測定試薬であるコレステロールエステラーゼ（大野製薬
製、ｌｕ／ｍｌ’）、コレステ１コールオキシダーセ（
同、２ｕ／ｍｅ） 、パーオキシダーゼ（ヘーリンガー
製、６ｕ／ｍｅ） 、４−ア嵐ノアンチピリン（０，４
ｍＭ） 、フェノール（１５ｍＭ）、トリトン 液（ｐＨ ７．５） ３ ｍｅを混合し、３７°Ｃ、２
０分反応さーＵたのち、反応液の５０５ｎｍにお（）る
吸光度を測定した。この吸光度と、あらかしめ標準コレ
ステロール水溶液を検液として、」１記と同様に操作し
て作成した検量線とを対比して本試料中のコレステロー
ル濃度を求めたところ、１６３ ｍｇ／ ｄＲであった
。
記載したと同様の操作により、血清試料を固定化酵素処
理して得た検液２００ノＪｆと公知の総コレステロール
測定試薬であるコレステロールエステラーゼ（大野製薬
製、ｌｕ／ｍｌ’）、コレステ１コールオキシダーセ（
同、２ｕ／ｍｅ） 、パーオキシダーゼ（ヘーリンガー
製、６ｕ／ｍｅ） 、４−ア嵐ノアンチピリン（０，４
ｍＭ） 、フェノール（１５ｍＭ）、トリトン 液（ｐＨ ７．５） ３ ｍｅを混合し、３７°Ｃ、２
０分反応さーＵたのち、反応液の５０５ｎｍにお（）る
吸光度を測定した。この吸光度と、あらかしめ標準コレ
ステロール水溶液を検液として、」１記と同様に操作し
て作成した検量線とを対比して本試料中のコレステロー
ル濃度を求めたところ、１６３ ｍｇ／ ｄＲであった
。
比較として、固定化酵素処理をしていない血清試料を検
波として同様に操作したところ１４５ ｍｇ／ ｄｌで
あった。なお用いた血清試料中の総ビリルビン濃度は１
５．２ｍｇ／ａ！ｆであったが、本固定化酵素処理をし
たことにより２．１ｍｇ ／ ｄｌ （１４％）に減少
した。
波として同様に操作したところ１４５ ｍｇ／ ｄｌで
あった。なお用いた血清試料中の総ビリルビン濃度は１
５．２ｍｇ／ａ！ｆであったが、本固定化酵素処理をし
たことにより２．１ｍｇ ／ ｄｌ （１４％）に減少
した。
実施例７ 血清中の中性脂肪の測定
実施例２に記載したと同様の操作により、血清試料を固
定化酵素処理して得た検液２００ｐＥと公知の中性脂肪
の測定試薬であるリボプロティンリパーゼ（大野製薬製
、２００ｕ／ ｍ（！ ） 、グリセロールキナーゼ（
同、０．３ｕ／ｍｅ） 、グリセロール−３−リン酸オ
キシダーセ（同、４ｕ／ｍｌり 、パーオキシダーセ（
ベーリンガー製、２ｕ／ｍ［り 、４−アミノアンヂピ
リン（０．４ｍＭ ） 、フェノール（１５ｍＭ） 、
ΔＴ ＋’）（０．８ｍＭ ） 、ｌ□すＩ− ７ Ｘ
−１００ （０．１ ％）を含む０、１Ｍ− トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ ７．５） ３ ｍＱを混合し３７°
Ｃ１２０分反応させたのち、反応液の５０５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。この吸光度と、あらがしめ標準ト
リオレイン溶液を検液として、上記と同様に操作して作
成した検量線とを対比して本試料中の中性脂肪濃度を求
めたところ、１〜リオレインとして７８．０ｍｇ／ ｔ
Ｕであった。比較として、固定化酵素処理をしていない
血清試料を検液とし゛ζ同様に操作したところ、６８．
６ｍｇ／ｄ１であった。なお用いた血清試料中の総ビリ
ルビン濃度は１４．２ｍｇ／ｄｉであったが、本固定化
酵素処理をしたことにより２、４ ｍｇ／ｄｉ （１７
％）に減少シタ。
定化酵素処理して得た検液２００ｐＥと公知の中性脂肪
の測定試薬であるリボプロティンリパーゼ（大野製薬製
、２００ｕ／ ｍ（！ ） 、グリセロールキナーゼ（
同、０．３ｕ／ｍｅ） 、グリセロール−３−リン酸オ
キシダーセ（同、４ｕ／ｍｌり 、パーオキシダーセ（
ベーリンガー製、２ｕ／ｍ［り 、４−アミノアンヂピ
リン（０．４ｍＭ ） 、フェノール（１５ｍＭ） 、
ΔＴ ＋’）（０．８ｍＭ ） 、ｌ□すＩ− ７ Ｘ
−１００ （０．１ ％）を含む０、１Ｍ− トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ ７．５） ３ ｍＱを混合し３７°
Ｃ１２０分反応させたのち、反応液の５０５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。この吸光度と、あらがしめ標準ト
リオレイン溶液を検液として、上記と同様に操作して作
成した検量線とを対比して本試料中の中性脂肪濃度を求
めたところ、１〜リオレインとして７８．０ｍｇ／ ｔ
Ｕであった。比較として、固定化酵素処理をしていない
血清試料を検液とし゛ζ同様に操作したところ、６８．
６ｍｇ／ｄ１であった。なお用いた血清試料中の総ビリ
ルビン濃度は１４．２ｍｇ／ｄｉであったが、本固定化
酵素処理をしたことにより２、４ ｍｇ／ｄｉ （１７
％）に減少シタ。
第１図はクルコースの測定におけるビリルビンの影響を
表す図であり、図中＜−０−＞は本発明法の結果を、＜
−＊−）は比較例をそれぞれ表す。 特許出願人 天野製薬株式会社 尤１図 ０ １ ０ ２０
３（１ビリルビン濃度（ｍｇ／旧） 特許出鴫人 太野製薬株式会社
表す図であり、図中＜−０−＞は本発明法の結果を、＜
−＊−）は比較例をそれぞれ表す。 特許出願人 天野製薬株式会社 尤１図 ０ １ ０ ２０
３（１ビリルビン濃度（ｍｇ／旧） 特許出鴫人 太野製薬株式会社
Claims (1)
- 生体体液中の成分を測定する方法において生体体液試料
を固定化ビリルビンオキシダーゼに作用せしめたのちの
試料を検波とすることを特徴とする生体体液成分の測定
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18663382A JPH0229318B2 (ja) | 1982-10-22 | 1982-10-22 | Seitaitaiekiseibunnosokuteiho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18663382A JPH0229318B2 (ja) | 1982-10-22 | 1982-10-22 | Seitaitaiekiseibunnosokuteiho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974996A true JPS5974996A (ja) | 1984-04-27 |
| JPH0229318B2 JPH0229318B2 (ja) | 1990-06-28 |
Family
ID=16191991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18663382A Expired - Lifetime JPH0229318B2 (ja) | 1982-10-22 | 1982-10-22 | Seitaitaiekiseibunnosokuteiho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0229318B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
| JPH01108997A (ja) * | 1987-09-29 | 1989-04-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法 |
| US4927767A (en) * | 1987-11-19 | 1990-05-22 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for the detection of diseases associated with the metabolic abnormality of L-fucose |
-
1982
- 1982-10-22 JP JP18663382A patent/JPH0229318B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6315168A (ja) * | 1986-06-21 | 1988-01-22 | ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血液又は血液から誘導された試料中の血清フルクトサミン含量を特異的に測定する際に蛋白質基質効果を回避するための方法及び製剤 |
| JPH01108997A (ja) * | 1987-09-29 | 1989-04-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | 血液又は血液から導出した試料中の血清のフルクトスアミン含量を特異的に測定する方法及び試薬、及び非特異的還元作用を有するか、又は／及び溷濁を惹起する試料成分を除去する方法 |
| JPH0365760B2 (ja) * | 1987-09-29 | 1991-10-14 | ||
| US4927767A (en) * | 1987-11-19 | 1990-05-22 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Method for the detection of diseases associated with the metabolic abnormality of L-fucose |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0229318B2 (ja) | 1990-06-28 |
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