JPS58107199A - ホスフアチジルグリセロ−ルの定量方法 - Google Patents
ホスフアチジルグリセロ−ルの定量方法Info
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- JPS58107199A JPS58107199A JP56203074A JP20307481A JPS58107199A JP S58107199 A JPS58107199 A JP S58107199A JP 56203074 A JP56203074 A JP 56203074A JP 20307481 A JP20307481 A JP 20307481A JP S58107199 A JPS58107199 A JP S58107199A
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- phosphatidylglycerol
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なホスファチジルグリセロールの定量法
ｅこ関する。
ｅこ関する。
近位新生児管理の向上等ｔこより低出生体重児の死亡例
は減少したが、周産期シこおける新生児呼吸窮迫症候群
（ＲＤＳ）は依然として大きな問題でありその死亡例の
多くの割合を占めている。ＲＤＳは肺表面活性物質の欠
乏ｅ？−よるとされ、この物質は出生直後ｅこふくらん
だ肺胞の縮少防止ｔこ重要である。この肺表面活性物質
の欠乏ｔこより呼吸時の無気肺が招来され、ＲＤＳの発
症をきたすものである。このためＲＤＳの発症を早期に
予測し、早く新生児の治療？ことりかかることができれ
ば、ＲＤＳ発症を防止でき、または峰症におさえること
ができるものである。従ってこの肺表面活性物質の測定
が必要となり、大別すれば現在、肺表面活性物質の物理
的な性質を利用して徂１定する方法や肺表面活性物質の
構成成分を生化学的（・こ解明する方法３こ分けられる
。この後者の方法においてはレシチンとスフィンゴミエ
リンの比率、ホスファチジルグリセロールと″ホスファ
チジルイノシトールの比率、ジパルミトイルホスファチ
ジルコリンの定量なとび）各々の脂質組成の比率を薄層
クロマトグラフィー（・こより求めること１こて行われ
ていた〔Ａｍ、Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ’ Ｇｙｎｅｃｏｌ
、、 ’ｌ’ＡＯ： ／ ０９ （／９７ ／ ）
、 Ａｍ、 Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏ
ｌ 、、 ６ ／ ３ ： ／２３、 （／９７乙）
、 Ａｍ 、 Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃ
ｏｌ、。
は減少したが、周産期シこおける新生児呼吸窮迫症候群
（ＲＤＳ）は依然として大きな問題でありその死亡例の
多くの割合を占めている。ＲＤＳは肺表面活性物質の欠
乏ｅ？−よるとされ、この物質は出生直後ｅこふくらん
だ肺胞の縮少防止ｔこ重要である。この肺表面活性物質
の欠乏ｔこより呼吸時の無気肺が招来され、ＲＤＳの発
症をきたすものである。このためＲＤＳの発症を早期に
予測し、早く新生児の治療？ことりかかることができれ
ば、ＲＤＳ発症を防止でき、または峰症におさえること
ができるものである。従ってこの肺表面活性物質の測定
が必要となり、大別すれば現在、肺表面活性物質の物理
的な性質を利用して徂１定する方法や肺表面活性物質の
構成成分を生化学的（・こ解明する方法３こ分けられる
。この後者の方法においてはレシチンとスフィンゴミエ
リンの比率、ホスファチジルグリセロールと″ホスファ
チジルイノシトールの比率、ジパルミトイルホスファチ
ジルコリンの定量なとび）各々の脂質組成の比率を薄層
クロマトグラフィー（・こより求めること１こて行われ
ていた〔Ａｍ、Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ’ Ｇｙｎｅｃｏｌ
、、 ’ｌ’ＡＯ： ／ ０９ （／９７ ／ ）
、 Ａｍ、 Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏ
ｌ 、、 ６ ／ ３ ： ／２３、 （／９７乙）
、 Ａｍ 、 Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃ
ｏｌ、。
ｇ ９１１ ： ／３３． （１９７９）、０ｂｓｔ
ｅｔ ＆Ｇｙｎｅｃｏｌ −＋ ２９５ ： ５７
＋ （’ ９ｇ ’ ） ＋ Ａｍ 。
ｅｔ ＆Ｇｙｎｅｃｏｌ −＋ ２９５ ： ５７
＋ （’ ９ｇ ’ ） ＋ Ａｍ 。
Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、 Ｇｙｎｏｃｏｌ、、４９７ ：
／ ３！？、 （／−９ｇ０）等〕。またこれらの
種々の検査の結果から、近ｍＲＤ８発症にホスファチジ
ルグリセロールの在否が重要な因（であると認められた
が、しかしホスファチジルグリセロールはレシチンの約
ＩＯか 分のｌ程度の少量し九存在しないためその定量は極めて
困難であった。！り従来よりホスファチジルグリセロー
ルの定量法としては、羊水を遠心分離して細胞成分を除
去後、その上清から脂質成分を抽出し、この抽出液中の
成分を薄層クロマトグラフィーにて分離した後、それぞ
れのリン脂質の定量を行ない、種々のリン脂質の比率を
求め、さらｔこあらかじめ湿式灰化法ｔこよるリン酸定
ｉ Ｂこより求めた全リン脂質値から間接的ｅこホスフ
ァチジルグリセロールを求める薄層クロマトグラフィー
法（、Ａｍ 、 Ｊ 、 ０ｂｓｔｅｔ 、 Ｇｙｎｅ
ｃｏｌ 、、 ｌ＋ ／ ３ ： ／ ２３゜５− （１９７ろ） 、 Ａｍ 、 Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ 、
Ｇｙｎｅｃｏｌ、、 ／ ０７９ ： Ｉ”ＬＳ、
（／ ９７９）、 Ａｍ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ。
／ ３！？、 （／−９ｇ０）等〕。またこれらの
種々の検査の結果から、近ｍＲＤ８発症にホスファチジ
ルグリセロールの在否が重要な因（であると認められた
が、しかしホスファチジルグリセロールはレシチンの約
ＩＯか 分のｌ程度の少量し九存在しないためその定量は極めて
困難であった。！り従来よりホスファチジルグリセロー
ルの定量法としては、羊水を遠心分離して細胞成分を除
去後、その上清から脂質成分を抽出し、この抽出液中の
成分を薄層クロマトグラフィーにて分離した後、それぞ
れのリン脂質の定量を行ない、種々のリン脂質の比率を
求め、さらｔこあらかじめ湿式灰化法ｔこよるリン酸定
ｉ Ｂこより求めた全リン脂質値から間接的ｅこホスフ
ァチジルグリセロールを求める薄層クロマトグラフィー
法（、Ａｍ 、 Ｊ 、 ０ｂｓｔｅｔ 、 Ｇｙｎｅ
ｃｏｌ 、、 ｌ＋ ／ ３ ： ／ ２３゜５− （１９７ろ） 、 Ａｍ 、 Ｊ、 ０ｂｓｔｅｔ 、
Ｇｙｎｅｃｏｌ、、 ／ ０７９ ： Ｉ”ＬＳ、
（／ ９７９）、 Ａｍ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ。
Ｇｙｎｅｃｏｌ、、ｇ ９９ ：／ ３３ （／
９７９）、Ａｍ。
９７９）、Ａｍ。
法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ、 ２７７ ： ２２３゜＜１９ｇ／Ｉ 〕が知
られている。しかしながら、この薄層クロマトグラフィ
ー法では、′羊水がら脂質成分の抽出のためシこ２〜３
日を要し、かつ煩雑な操作を必要とし、さらりこスポッ
ト検出の定め？こ高温加熱を要する欠点があり、さらＱ
？−またスポットからの相対量比と全リン脂質とによる
間接的な測定法で、かつ薄層クロマトグラフィーである
ことから多数の検体を同時処理し得ないなどの種々の欠
点があった。
ｈｙ、 ２７７ ： ２２３゜＜１９ｇ／Ｉ 〕が知
られている。しかしながら、この薄層クロマトグラフィ
ー法では、′羊水がら脂質成分の抽出のためシこ２〜３
日を要し、かつ煩雑な操作を必要とし、さらりこスポッ
ト検出の定め？こ高温加熱を要する欠点があり、さらＱ
？−またスポットからの相対量比と全リン脂質とによる
間接的な測定法で、かつ薄層クロマトグラフィーである
ことから多数の検体を同時処理し得ないなどの種々の欠
点があった。
本発明者らは、種々の脂質成分を含有する羊水等の被検
液からホスファチジルグリセロールのみをる 短時間で、簡便かつ正確に定量し得得方法ｔこついて種
々研究した結果、全く意外にもホスホリパーゼＤがホス
ファチジルグリセロールに作用してグ ６− リセロールおよびホスファチジン酸を生成せしめること
を知り、さらＱこ反応において生成、遊離されたこのグ
リセロールを定量することｅこより良好なホスファチジ
ルグリセロールのみの定量法を完成した。さらｅこ好ま
しくは、被検液ｅこホスホリパーゼＤを作用せしめて生
成したグリセロールをアテノシントリホスフエート （
ＡＴＰ）などのリン酸供与体の存在下ｅこグリセロール
キナーゼを作用せしめ、さらｅこグリセロホスフェート
オキシダーゼを作用せしめ、次いで反応？こおいて消費
される酸素の量または生成される過酸化水素の量を測定
することｅこよりホスファチジルグリセロールのみを著
しく良好？こ定量し得る方法を完成した。本発明は上記
の知見に基づいて完成されたもので、被検ｉ中のホスフ
ァチジルグリセロールの定量ｅこおいて、ホスファチジ
ルグリセロールおよび水からグリセロールおよびホスフ
ァチジン酸を生成せしめる反応を触媒する酵素を作用せ
しめてグリセロールを遊離せしめ、次いで生成したグリ
セロールを水素することを特徴とするホスファチジルグ
リセロールの定量法で、好１しくけ被検液中のホスファ
チジルグリセロールの定量ｅこおいて、（ａ） ホス
ファチジルグリセロールｅこホスホリパーゼＤを作用せ
しめてグリセロールを遊離し、（ｂ） グリセロール
ｅこリン酸供与体の存在Ｔｌこグリセロールキナーゼを
作用せしめてグリセロ−３−リン酸と々し、 （ｃ）クリセロ−３−リン酸ｔこグリセロホスフェート
オキシダーゼを作用せしめ、 （ｄ）次イで反応Ｖこおいて消費される酸素の量または
生成される過酸化水素の量を測定する、（ａ）、（ｂ）
、（ｃ）、（ｄ）、 の工程の組合わせｅこより定量
することを特徴とするホスファチジルグリセロールの定
を整 法である。また本発明ンこおいては、各試薬を調製し之
定量用キットとなすことが良好で、！ｉた定量のための
操作は３７℃近辺の常温３こてなし得、かつ極めて簡便
な操作であり、さらｅこ要する反応時間も極めて短時間
ｔこでなし得るものである。さらＱこ本発明？こ基づけ
ば、ホスファチジルグリセロール濃度は著しく低薬度ま
で正確ｔこ側足し得るものテ、カつ直接ホスファチジル
グリセロール値を測定するもので極めて布片であり、ま
た、このようｅこ簡便かつ短時間（こなし得ることから
も多数検体の同時測定がなし得るものであって、ホスフ
ァチジルグリセロールの有用な定量法を提供するもので
ある まず、本発明ｅこおけるホスファチジルグリセロールお
よヒ水からグリセロールおよびホスファチジン酸を生成
する反応を触媒する酵素としては、ホスホリパーゼＤが
挙げられる。
液からホスファチジルグリセロールのみをる 短時間で、簡便かつ正確に定量し得得方法ｔこついて種
々研究した結果、全く意外にもホスホリパーゼＤがホス
ファチジルグリセロールに作用してグ ６− リセロールおよびホスファチジン酸を生成せしめること
を知り、さらＱこ反応において生成、遊離されたこのグ
リセロールを定量することｅこより良好なホスファチジ
ルグリセロールのみの定量法を完成した。さらｅこ好ま
しくは、被検液ｅこホスホリパーゼＤを作用せしめて生
成したグリセロールをアテノシントリホスフエート （
ＡＴＰ）などのリン酸供与体の存在下ｅこグリセロール
キナーゼを作用せしめ、さらｅこグリセロホスフェート
オキシダーゼを作用せしめ、次いで反応？こおいて消費
される酸素の量または生成される過酸化水素の量を測定
することｅこよりホスファチジルグリセロールのみを著
しく良好？こ定量し得る方法を完成した。本発明は上記
の知見に基づいて完成されたもので、被検ｉ中のホスフ
ァチジルグリセロールの定量ｅこおいて、ホスファチジ
ルグリセロールおよび水からグリセロールおよびホスフ
ァチジン酸を生成せしめる反応を触媒する酵素を作用せ
しめてグリセロールを遊離せしめ、次いで生成したグリ
セロールを水素することを特徴とするホスファチジルグ
リセロールの定量法で、好１しくけ被検液中のホスファ
チジルグリセロールの定量ｅこおいて、（ａ） ホス
ファチジルグリセロールｅこホスホリパーゼＤを作用せ
しめてグリセロールを遊離し、（ｂ） グリセロール
ｅこリン酸供与体の存在Ｔｌこグリセロールキナーゼを
作用せしめてグリセロ−３−リン酸と々し、 （ｃ）クリセロ−３−リン酸ｔこグリセロホスフェート
オキシダーゼを作用せしめ、 （ｄ）次イで反応Ｖこおいて消費される酸素の量または
生成される過酸化水素の量を測定する、（ａ）、（ｂ）
、（ｃ）、（ｄ）、 の工程の組合わせｅこより定量
することを特徴とするホスファチジルグリセロールの定
を整 法である。また本発明ンこおいては、各試薬を調製し之
定量用キットとなすことが良好で、！ｉた定量のための
操作は３７℃近辺の常温３こてなし得、かつ極めて簡便
な操作であり、さらｅこ要する反応時間も極めて短時間
ｔこでなし得るものである。さらＱこ本発明？こ基づけ
ば、ホスファチジルグリセロール濃度は著しく低薬度ま
で正確ｔこ側足し得るものテ、カつ直接ホスファチジル
グリセロール値を測定するもので極めて布片であり、ま
た、このようｅこ簡便かつ短時間（こなし得ることから
も多数検体の同時測定がなし得るものであって、ホスフ
ァチジルグリセロールの有用な定量法を提供するもので
ある まず、本発明ｅこおけるホスファチジルグリセロールお
よヒ水からグリセロールおよびホスファチジン酸を生成
する反応を触媒する酵素としては、ホスホリパーゼＤが
挙げられる。
このホスホリパーゼＤとしては、１モルのレシチンおよ
び水から１モルのホスファチジン酸およびコリンを生成
する反応を触媒する酵素として知られているもので、前
記酵素反応を触媒するものであればホスホリパーゼＤ含
有細胞から抽出採取したものでも、また市販の酵素試薬
であってもよく、例えばストレプトマイセス属に属する
ホスホリパーゼＤ生産菌の培養物から得られた酵素であ
る微生物由来の酵素〔ストレプトマイセス・）・チジョ
ウエンシスＡ−ｔｉ≠３株（ＦＥＲＭ−Ｐ應−タ
− ｌ″３２９）；特公昭５２〜３９９／ｇ号公報、ストレ
フトマイセス・クロモフスカスＡ−Ｏｆ≠ど素試薬が使
用できる。このホスホリパーゼＤの使用量としては、世
１１定時間やホスファチジルグリセロールの濃度におい
て適宜変更設計されるもので特？こ限定されるものでは
ない。例えばｌテスト当り、ホスホリパーゼＤは通常Ｏ
１単位以上あればよく、奸才しくは／−／ Ｑ単位程度
用いればよい。
び水から１モルのホスファチジン酸およびコリンを生成
する反応を触媒する酵素として知られているもので、前
記酵素反応を触媒するものであればホスホリパーゼＤ含
有細胞から抽出採取したものでも、また市販の酵素試薬
であってもよく、例えばストレプトマイセス属に属する
ホスホリパーゼＤ生産菌の培養物から得られた酵素であ
る微生物由来の酵素〔ストレプトマイセス・）・チジョ
ウエンシスＡ−ｔｉ≠３株（ＦＥＲＭ−Ｐ應−タ
− ｌ″３２９）；特公昭５２〜３９９／ｇ号公報、ストレ
フトマイセス・クロモフスカスＡ−Ｏｆ≠ど素試薬が使
用できる。このホスホリパーゼＤの使用量としては、世
１１定時間やホスファチジルグリセロールの濃度におい
て適宜変更設計されるもので特？こ限定されるものでは
ない。例えばｌテスト当り、ホスホリパーゼＤは通常Ｏ
１単位以上あればよく、奸才しくは／−／ Ｑ単位程度
用いればよい。
さらにこのホスホリパーゼＤは、好捷しくは、弱酸性〜
弱アルカリ性のトリス−Ｔ（ＣＩ緩衝液、クエン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、ピペス（ＰＩＦＥＳ）−ＮａＯＨ＆
：衝液、イミダゾール緩衝液等の煕撮液４ｖ；〜緩衝液
に溶解して用いればよ＜、寸た必要ｅこ応じてトリトン
Ｘ−１００等の非イオン界面活性剤や血清アルブミンを
加えて調整すればよい。次いでこのようｔこして調整し
たホスホリパーゼＤの酵素液と被検液とを混合して、被
検液中のホスファチジルグリセロールから水を消費して
、グリセ １０− ロールおよびホスファチジン酸を生成せしめるものであ
るが、両者の混合比率は特Ｃ・こ限定されるものでなく
、被検ｌ／テスト当りホスホリパーゼＤが好１しくはｉ
、ｉ０単位程度を含有する比率Ｑこて混合すればよく、
また反応温度としては好ましくは３７℃近辺でよく、さ
らｅこ反応時間はグリセロールが遊離されるｅこ充分外
時間であればよく、通常５分以上、好１しくは１０分間
以上である０次いで反応ｅこおいて遊離されたグリセロ
ールを定量することりこより、この定量値から被検液中
のホスファチジルグリセロールを求めるも１７）である
０さらｅここのグリセロールの定量法としては、公知の
種々の化学的定量法や酵素的定量法などの一１足手段が
利用できる。奸才しくは、グリセロールを基質とする酵
素の一種捷たはそれ以上を用いて作用せしめ、この酵素
作用ｅこおける反応中の検出できる変化を定量してなる
酵素的定量法が簡便である。例えば、グリセロールの測
定法としては、アゾンシントリホスフェート （ＡＴＰ
）などのリン酸供与体とグリセロールキナーゼ（ＧＫ）
との−１１− 存在下？こ作用せしめてグリセロ−３−リン酸およびア
テノシンジホスフエート （ＡＤＰ）となし、次いでグ
リセロ−３−リン酸ｔこグリ七ロホスフエートオキシダ
ーゼ（ＧＰＯ）を作用せしめて、反応液中の酸素を消費
し１、過酸化水素を生成せし７めるＧＫ−ＧＰＯ系定量
法が、特ｅこ簡便かつ良好である。
弱アルカリ性のトリス−Ｔ（ＣＩ緩衝液、クエン酸緩衝
液、ホウ酸緩衝液、ピペス（ＰＩＦＥＳ）−ＮａＯＨ＆
：衝液、イミダゾール緩衝液等の煕撮液４ｖ；〜緩衝液
に溶解して用いればよ＜、寸た必要ｅこ応じてトリトン
Ｘ−１００等の非イオン界面活性剤や血清アルブミンを
加えて調整すればよい。次いでこのようｔこして調整し
たホスホリパーゼＤの酵素液と被検液とを混合して、被
検液中のホスファチジルグリセロールから水を消費して
、グリセ １０− ロールおよびホスファチジン酸を生成せしめるものであ
るが、両者の混合比率は特Ｃ・こ限定されるものでなく
、被検ｌ／テスト当りホスホリパーゼＤが好１しくはｉ
、ｉ０単位程度を含有する比率Ｑこて混合すればよく、
また反応温度としては好ましくは３７℃近辺でよく、さ
らｅこ反応時間はグリセロールが遊離されるｅこ充分外
時間であればよく、通常５分以上、好１しくは１０分間
以上である０次いで反応ｅこおいて遊離されたグリセロ
ールを定量することりこより、この定量値から被検液中
のホスファチジルグリセロールを求めるも１７）である
０さらｅここのグリセロールの定量法としては、公知の
種々の化学的定量法や酵素的定量法などの一１足手段が
利用できる。奸才しくは、グリセロールを基質とする酵
素の一種捷たはそれ以上を用いて作用せしめ、この酵素
作用ｅこおける反応中の検出できる変化を定量してなる
酵素的定量法が簡便である。例えば、グリセロールの測
定法としては、アゾンシントリホスフェート （ＡＴＰ
）などのリン酸供与体とグリセロールキナーゼ（ＧＫ）
との−１１− 存在下？こ作用せしめてグリセロ−３−リン酸およびア
テノシンジホスフエート （ＡＤＰ）となし、次いでグ
リセロ−３−リン酸ｔこグリ七ロホスフエートオキシダ
ーゼ（ＧＰＯ）を作用せしめて、反応液中の酸素を消費
し１、過酸化水素を生成せし７めるＧＫ−ＧＰＯ系定量
法が、特ｅこ簡便かつ良好である。
さらしここのＧＫ−ＧＰＯ系定弼法ｔこおいては、反応
液中の消費される酸素の量を酸素電極ｅこて定量するか
、生成される過酸化水素の量を過酸化水素電極にて電気
的変化として定量するか、′！ｌ：′ｆｃはＧＰＯを公
知の固定化手段、例えばアクリルアミど ドで包括固定化する方法、アルブミンな丈の蛋白質と共
ンこ混合したのちｅこ蛋白質同志を架橋して固定化する
方法、コラーゲンやフィブロインなどｅこ包括するか、
またはこれを共有結合せしめて固定化する方法、多孔性
有機高分子樹脂に吸着１ｆｃは共有結合をごて固定化す
る方法、光硬化性樹脂を用いて包括固定化する方法、ア
ミン化ガラスを用いて共有結合にて固定化する方法など
の種々包括、−ｌ ２ ＝ 吸着、結合等の手段ｅこて固定化酵素となしてもよく、
その固定化酵素の形状としては酸素電極や過酸化水素電
極への絆み込みのための酵素電極用の形として使用に好
ましい膜状、繊維状、粒状またはチューブ状して力ロエ
し１、用いる電極の検知部？ここの固定化酵素を具備せ
しめた酵素電極として用いて電気的手段（こて定量して
なる有用な酵素の使用量を著しく少量ならしめたものと
して用いてもよい。また、用いるホスホリパーゼＤやＧ
Ｋｉ同様に、ｔｉは適宜に同時固定して用いてもよい。
液中の消費される酸素の量を酸素電極ｅこて定量するか
、生成される過酸化水素の量を過酸化水素電極にて電気
的変化として定量するか、′！ｌ：′ｆｃはＧＰＯを公
知の固定化手段、例えばアクリルアミど ドで包括固定化する方法、アルブミンな丈の蛋白質と共
ンこ混合したのちｅこ蛋白質同志を架橋して固定化する
方法、コラーゲンやフィブロインなどｅこ包括するか、
またはこれを共有結合せしめて固定化する方法、多孔性
有機高分子樹脂に吸着１ｆｃは共有結合をごて固定化す
る方法、光硬化性樹脂を用いて包括固定化する方法、ア
ミン化ガラスを用いて共有結合にて固定化する方法など
の種々包括、−ｌ ２ ＝ 吸着、結合等の手段ｅこて固定化酵素となしてもよく、
その固定化酵素の形状としては酸素電極や過酸化水素電
極への絆み込みのための酵素電極用の形として使用に好
ましい膜状、繊維状、粒状またはチューブ状して力ロエ
し１、用いる電極の検知部？ここの固定化酵素を具備せ
しめた酵素電極として用いて電気的手段（こて定量して
なる有用な酵素の使用量を著しく少量ならしめたものと
して用いてもよい。また、用いるホスホリパーゼＤやＧ
Ｋｉ同様に、ｔｉは適宜に同時固定して用いてもよい。
さらｔこ別の過酸化水素の量の定量手段としては過酸化
水素と反応して検出できる生成物を生成する指示薬組成
物を用いて分光学的手段ｔこより、定食してもよい。ま
たこの指示薬組成物としては、通常色調の変化を可視Ｐ
こで生ずる呈色薬組成物、紫外線照射により螢光を発す
る螢光薬組成物や発光する発光薬組成物である分光光学
的手段ｅこ工りその変化を定食し得る組成物が用いられ
る。例えば呈色薬組成物としては、ペルオキシダーゼ作
用物 を有する物質と染料前駆体との含有畜が用いられ一／２
−２− る。このペルオキシダーゼ作用を有する物質としては、
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが通常よく用いられ
、捷た染料前駆体としては、電子受容体とフェノール系
化合物の組合せが通常よく用いられる。さらＱこ電子受
容体としては、例えば≠−アミノアンチピリン、ノーヒ
ドラジノベンゾチアゾール、３−メチル−２−ベンゾチ
アゾロンヒドラチン、コーアミノベンゾチアゾール等が
用いられ、またフェノール系化合物としては例えばフェ
ノール、３−メチル−Ｎ−エチル−１１−（β−ヒドロ
キシエチル）アニリン、３．Ｓ−キシレノール、Ｎ、Ｎ
−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン等が用
いられる。
水素と反応して検出できる生成物を生成する指示薬組成
物を用いて分光学的手段ｔこより、定食してもよい。ま
たこの指示薬組成物としては、通常色調の変化を可視Ｐ
こで生ずる呈色薬組成物、紫外線照射により螢光を発す
る螢光薬組成物や発光する発光薬組成物である分光光学
的手段ｅこ工りその変化を定食し得る組成物が用いられ
る。例えば呈色薬組成物としては、ペルオキシダーゼ作
用物 を有する物質と染料前駆体との含有畜が用いられ一／２
−２− る。このペルオキシダーゼ作用を有する物質としては、
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが通常よく用いられ
、捷た染料前駆体としては、電子受容体とフェノール系
化合物の組合せが通常よく用いられる。さらＱこ電子受
容体としては、例えば≠−アミノアンチピリン、ノーヒ
ドラジノベンゾチアゾール、３−メチル−２−ベンゾチ
アゾロンヒドラチン、コーアミノベンゾチアゾール等が
用いられ、またフェノール系化合物としては例えばフェ
ノール、３−メチル−Ｎ−エチル−１１−（β−ヒドロ
キシエチル）アニリン、３．Ｓ−キシレノール、Ｎ、Ｎ
−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン等が用
いられる。
また、螢光薬組成物や発光薬組成物における発螢光基質
としては公知の種々のものが挙られ、例エバビスーＬ２
Ｉｌ乙、−トリクロロフェノール）オギザレイト、フェ
ニルチオヒダントイン、ホモノ（ニリン酸、≠−ヒドロ
キシフェニル酢酸、ノクニリルアミン、３−メトキシチ
ラミン、フロレチン酸、ホルデニン、ルミノールモノア
ニオン、ルシゲニ−ｌ ３ − ン等が挙られ、必要Ｐこ応じて電子受容体、ペルオキシ
ダーゼ作用を有する物質とともに用いて過酸化水素を定
量すればよい。
としては公知の種々のものが挙られ、例エバビスーＬ２
Ｉｌ乙、−トリクロロフェノール）オギザレイト、フェ
ニルチオヒダントイン、ホモノ（ニリン酸、≠−ヒドロ
キシフェニル酢酸、ノクニリルアミン、３−メトキシチ
ラミン、フロレチン酸、ホルデニン、ルミノールモノア
ニオン、ルシゲニ−ｌ ３ − ン等が挙られ、必要Ｐこ応じて電子受容体、ペルオキシ
ダーゼ作用を有する物質とともに用いて過酸化水素を定
量すればよい。
さらｔこ用いられる酵素試薬や染料前駆体の使用量とし
ては特シこ限定されるものではなく、例えばｌテスト当
りＧＫは通常０．０Ｉ単位以上、好ましくは００５〜１
００単位、ＧＰＯは通常Ｏ，ＯＳ単位以上、好ましくは
０．／−２００単位、ペルオキシダーゼは通常００５単
位以上、好捷しくはＯ７〜５００単位用いればよく、オ
た電子受容体やフェノール系化合物は通常０．１ｍＭ以
上の濃度、さ＋、１こＡＴＰやシトシントリホスフェー
ト等のリン酸供与体としては０．１ｍＭ以上の濃度ｅこ
調整した溶液を用いればよい。さらｔこ好捷しくは、Ｇ
Ｋの酵素活性を増強せしめるためにマグネシウムイオン
放出のための水溶性塩、例えば塩化マグネシウムを用い
、またこれらは蒸留水または弱酸性ないし弱アルカリ性
の緩衝液を用いて溶解せしめればよい。またこれらの試
薬は、先のホスホリパーゼＤの酵素液と別々（こ用いて
もよく、または混合し−ｌ≠ − て用いてもよく、さらＰここれらの試薬をＰＩ１１′！
ｌたはフィルム等？こ塗布してなる積層一体型となして
もよい。
ては特シこ限定されるものではなく、例えばｌテスト当
りＧＫは通常０．０Ｉ単位以上、好ましくは００５〜１
００単位、ＧＰＯは通常Ｏ，ＯＳ単位以上、好ましくは
０．／−２００単位、ペルオキシダーゼは通常００５単
位以上、好捷しくはＯ７〜５００単位用いればよく、オ
た電子受容体やフェノール系化合物は通常０．１ｍＭ以
上の濃度、さ＋、１こＡＴＰやシトシントリホスフェー
ト等のリン酸供与体としては０．１ｍＭ以上の濃度ｅこ
調整した溶液を用いればよい。さらｔこ好捷しくは、Ｇ
Ｋの酵素活性を増強せしめるためにマグネシウムイオン
放出のための水溶性塩、例えば塩化マグネシウムを用い
、またこれらは蒸留水または弱酸性ないし弱アルカリ性
の緩衝液を用いて溶解せしめればよい。またこれらの試
薬は、先のホスホリパーゼＤの酵素液と別々（こ用いて
もよく、または混合し−ｌ≠ − て用いてもよく、さらＰここれらの試薬をＰＩ１１′！
ｌたはフィルム等？こ塗布してなる積層一体型となして
もよい。
このようＱこしてなるＧＫ−ＧＰＯ系定量法は、被検液
中Ｖこ生成するグリセロールに対して感度も良く、また
破検液中の夾雑物の影響を受けることがないためｅこ正
確Ｑこ測定し得る優れた方法である。
中Ｖこ生成するグリセロールに対して感度も良く、また
破検液中の夾雑物の影響を受けることがないためｅこ正
確Ｑこ測定し得る優れた方法である。
またこのＧＫ−ＧＰＯ系定量法に用いられるＧＫとして
は、少々くともグリセロールとＡＴＰからグリセロ−３
−リン酸およびＡＤＰを生ずる酵素であればよ（、例え
ばネズミやハトの肝臓由来の酵素（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ 、、 、、２ ／］、９５／（／９５４’）
、Ｒｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、、 ３２９．３２０ （／９
５７）〕や、キャンシダ・ミコデルマやストレプトマイ
セス番キャヌス・Ａ−２≠Ｄｇ （ＦＥＲＭ−ＰＩ６
１．ｔ９７７＞ などの微生物のＧＫ含有培養物から得
られた酵素である微生物由来の酵素（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ
。
は、少々くともグリセロールとＡＴＰからグリセロ−３
−リン酸およびＡＤＰを生ずる酵素であればよ（、例え
ばネズミやハトの肝臓由来の酵素（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ 、、 、、２ ／］、９５／（／９５４’）
、Ｒｉｏｃｈｅｍ、Ｚ、、 ３２９．３２０ （／９
５７）〕や、キャンシダ・ミコデルマやストレプトマイ
セス番キャヌス・Ａ−２≠Ｄｇ （ＦＥＲＭ−ＰＩ６
１．ｔ９７７＞ などの微生物のＧＫ含有培養物から得
られた酵素である微生物由来の酵素（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ
。
Ｚ、、３３３、＃７””７ １１９６／） 、特開昭５
−ター／１，２９ｇ７号公報号公報上の他市販の酵素が
使用できる。
−ター／１，２９ｇ７号公報号公報上の他市販の酵素が
使用できる。
−ｌ ５ −
さらにＧＰＯとしては、グリセロ−３−リン酸と酸素か
らジヒドロキシアセトンリン酸およヒ過酸化水素を生成
する反応を触媒する酵素であればよく、例えばストレプ
トコツカス属、ラクトバシルス属、ロイコノストック属
、ペディオコッカス属ｔこ属するグリセロホスフェート
オキシダーゼ生産菌（特開昭５３−７２１９２号公報）
やアエロコツカス属に属するグリセロホスフェートオキ
シダーゼ生産菌（アエロコツカス・ビリダンスＩＦや市
販の酵素が使用できる。
らジヒドロキシアセトンリン酸およヒ過酸化水素を生成
する反応を触媒する酵素であればよく、例えばストレプ
トコツカス属、ラクトバシルス属、ロイコノストック属
、ペディオコッカス属ｔこ属するグリセロホスフェート
オキシダーゼ生産菌（特開昭５３−７２１９２号公報）
やアエロコツカス属に属するグリセロホスフェートオキ
シダーゼ生産菌（アエロコツカス・ビリダンスＩＦや市
販の酵素が使用できる。
また別のグリセロールの酵素的定量法としてはグリセロ
ール？こＡＴＰ等のリン酸供与体の存在下ｔこグリセロ
ールキナーゼを作用せしめ、グリセロ−３−リン酸およ
びＡＤＰを生成せしめ、次いでこのグリセロ−３−リン
酸にニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在
下１こグリセロリン酸デヒドロゲナーゼを作用せしめて
ジヒドロキシアセトンおよび還元型ＮＡＤを生成せしめ
、次い− １６ − でこの還元型ＮＡＤを定量してグリセロールの量を決定
すればよい。またこの還元型ＮＡＤの定量１こ当っては
、通常３１１０ｎｍ近辺の波長ンこよる吸す 光度群１定や、ジアホラーゼまたはフェ糞ジンメトー２
’Ｈ−テトラゾリウム会ブロマイド、２−（Ｐ−ヨード
フェニル）−３−（Ｐ−二トロフェニル）−５−フェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウム・クロライド、３．３’−（
３，３’−ジメトキシ−１Ｉ−≠′−ピフエニリレン）
−ヒス・Ｃ２−１ｐ−二トロフェニルーｊ−フェニル〜
２Ｈ−テトラゾリウム争クロライド〕 にトロテトラゾ
リウムブルー）や２６＝ジクロロフエノールインドフエ
ノールなどを用いて発色せしめ、その色調をその特異的
吸収波長？こよって吸光度測定すればよい。さらに別法
としては、グリセロリン酸 ルデヒドロゲナーゼを作用せしめ、ジヒドロキシアセト
ンおよび還元型ＮＡＤを生成せしめ、この還元型ＮＡＤ
を定量する手段が挙げられる。さら−ｌ ７ − ンこ捷タグリセロール（・こＡＴＰ等のリン酸供与体の
存在下ｅこグリセロールキナーゼを作用せしめてグリセ
ロリン酸およびＡＤＰを生成せし、めこのＡＤｐｔこ、
ホスホエノールピルビン酸の存在下ピルビン酸キナーゼ
を作用せしめて、ピルビン酸およびＡＴＰを生成せしめ
、このピルビン酸の定量に基く手段が挙げられる。また
このピルビン酸の定量等のヒドラジン化合物を作用せし
めて呈色鴬社め。
ール？こＡＴＰ等のリン酸供与体の存在下ｔこグリセロ
ールキナーゼを作用せしめ、グリセロ−３−リン酸およ
びＡＤＰを生成せしめ、次いでこのグリセロ−３−リン
酸にニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在
下１こグリセロリン酸デヒドロゲナーゼを作用せしめて
ジヒドロキシアセトンおよび還元型ＮＡＤを生成せしめ
、次い− １６ − でこの還元型ＮＡＤを定量してグリセロールの量を決定
すればよい。またこの還元型ＮＡＤの定量１こ当っては
、通常３１１０ｎｍ近辺の波長ンこよる吸す 光度群１定や、ジアホラーゼまたはフェ糞ジンメトー２
’Ｈ−テトラゾリウム会ブロマイド、２−（Ｐ−ヨード
フェニル）−３−（Ｐ−二トロフェニル）−５−フェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウム・クロライド、３．３’−（
３，３’−ジメトキシ−１Ｉ−≠′−ピフエニリレン）
−ヒス・Ｃ２−１ｐ−二トロフェニルーｊ−フェニル〜
２Ｈ−テトラゾリウム争クロライド〕 にトロテトラゾ
リウムブルー）や２６＝ジクロロフエノールインドフエ
ノールなどを用いて発色せしめ、その色調をその特異的
吸収波長？こよって吸光度測定すればよい。さらに別法
としては、グリセロリン酸 ルデヒドロゲナーゼを作用せしめ、ジヒドロキシアセト
ンおよび還元型ＮＡＤを生成せしめ、この還元型ＮＡＤ
を定量する手段が挙げられる。さら−ｌ ７ − ンこ捷タグリセロール（・こＡＴＰ等のリン酸供与体の
存在下ｅこグリセロールキナーゼを作用せしめてグリセ
ロリン酸およびＡＤＰを生成せし、めこのＡＤｐｔこ、
ホスホエノールピルビン酸の存在下ピルビン酸キナーゼ
を作用せしめて、ピルビン酸およびＡＴＰを生成せしめ
、このピルビン酸の定量に基く手段が挙げられる。また
このピルビン酸の定量等のヒドラジン化合物を作用せし
めて呈色鴬社め。
これを例えば４１１１０ ｎｍ近辺の波長ｔこて吸光度
を測定するか、ピルビン酸ｅこ還元型ＮＡＤの存在下ラ
クテートデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ＮＡＤおよ
び乳酸を生成せしめて反応系ｔこおける還元型ＮＡＤの
減少量を波長３≠Ｏｎｍ近辺ｅこて吸光度測定手段等ｔ
こて測定するか、またはピルビン酸Ｑこピルビン酸オキ
シダーゼを作用せしめて反応系Ｑこおいて消費される酸
素の量または過酸化水素の量を電気的変化として測定す
るか、または過酸化水素の指示薬組成物にて分光学的手
段ｔこて測定する手段等が用いられる。その他、グリセ
ロール−ｔｆ − ンこグリセロールオキシダーゼを作用せしめ、反応系ζ
・こおいて消費される酸素の量または生成される過酸化
水素の量、グリセルアルデヒドの量を定量することｔこ
よるグリセロールの定量方法を用いてもよい。
を測定するか、ピルビン酸ｅこ還元型ＮＡＤの存在下ラ
クテートデヒドロゲナーゼを作用せしめて、ＮＡＤおよ
び乳酸を生成せしめて反応系ｔこおける還元型ＮＡＤの
減少量を波長３≠Ｏｎｍ近辺ｅこて吸光度測定手段等ｔ
こて測定するか、またはピルビン酸Ｑこピルビン酸オキ
シダーゼを作用せしめて反応系Ｑこおいて消費される酸
素の量または過酸化水素の量を電気的変化として測定す
るか、または過酸化水素の指示薬組成物にて分光学的手
段ｔこて測定する手段等が用いられる。その他、グリセ
ロール−ｔｆ − ンこグリセロールオキシダーゼを作用せしめ、反応系ζ
・こおいて消費される酸素の量または生成される過酸化
水素の量、グリセルアルデヒドの量を定量することｔこ
よるグリセロールの定量方法を用いてもよい。
さらにこれらの各酵素や試薬等は、市販のものを用いる
ことが簡便であり、各使用量としては適宜設計すればよ
く、また必要に応じて界面活性剤、安定化剤を使用して
もよい。
ことが簡便であり、各使用量としては適宜設計すればよ
く、また必要に応じて界面活性剤、安定化剤を使用して
もよい。
さらｔこ本発明ｅｒ−おいて対象とする被検液としては
ホスファチジルグリセロールを含有する試料であればよ
（、例えば採取された羊水などの体液が挙げられる。
ホスファチジルグリセロールを含有する試料であればよ
（、例えば採取された羊水などの体液が挙げられる。
また羊水を被検液とする場合ｅこは、ホスファチジルグ
リセロールの含有区分を採取し、て甲いることが好１し
く、例えば採取し７た羊水５〜６ｍｌをクロロホルム−
メタノール（２：ｌ）の１５〜Ｉｆｍｅで抽出し、２０
θ゛θｒｐｍ ｔこて遠心して、クロロホルム層を採取
し、窒素ガス中ｅこて蒸発乾固せしめて全脂質画分を得
る。次いでこの全脂質を１％ １９− ）＋Ｊ）ｙＸ−ｉｏｒ）の一定量溶液ｔこ溶解した後、
ホスホリパーゼＤの酵素液および例えば前述のＧＫ−Ｇ
ＰＯ系定量法に基く各酵素とその他の試薬を順次または
同時ｅこ作用せしめればよく、この際被検液と酵素試薬
等の溶液との使用比率は特ｔこ限定されるものではなく
、通常被検液Ｑ、 Ｑ ／ ｍ１４〜１ｍＩＶ＆こ対し
酵素試薬等の溶液Ｑ、 ／〜３ ｍｌ３程度が甲いられ
る。また反応条件としては３７℃近辺で行うことが好ま
しく、反応時間としては、反応が十分性われる適宜な時
間を選択すればよく通常５分以上、打着しくはｌＯ分以
上反応せしめる。また反応媒体としては、水または各試
薬等の溶媒としての弱酸性ないし弱アルカリ性の緩衝液
が甲いられる０ このようｔこして被検液を定量せしめるととぐこより、
極めて短時間でかつホスファチジルグリセロールを直接
的に定量し得、捷たホスファチジルグリセロール値、２
． Ｏｎｍｏｌｅｓ 、即ち羊水ｊ〜１． ｍｌ！使用
の際のホスファチジルグリセロール値約０．０３ ｍ９
Ａまで測定可能と々す、ＲＤＳ発症のためのクー ２
０ − リテイカル・レベルである０、 ２ ｍｇ／ｄｌのホス
ファチジルグリセロール値に比べて極めて低濃度１で定
量し得るもので、さらｔこ煩雑な操作を必要としない常
温での操作がなし得る良好な定量法である。
リセロールの含有区分を採取し、て甲いることが好１し
く、例えば採取し７た羊水５〜６ｍｌをクロロホルム−
メタノール（２：ｌ）の１５〜Ｉｆｍｅで抽出し、２０
θ゛θｒｐｍ ｔこて遠心して、クロロホルム層を採取
し、窒素ガス中ｅこて蒸発乾固せしめて全脂質画分を得
る。次いでこの全脂質を１％ １９− ）＋Ｊ）ｙＸ−ｉｏｒ）の一定量溶液ｔこ溶解した後、
ホスホリパーゼＤの酵素液および例えば前述のＧＫ−Ｇ
ＰＯ系定量法に基く各酵素とその他の試薬を順次または
同時ｅこ作用せしめればよく、この際被検液と酵素試薬
等の溶液との使用比率は特ｔこ限定されるものではなく
、通常被検液Ｑ、 Ｑ ／ ｍ１４〜１ｍＩＶ＆こ対し
酵素試薬等の溶液Ｑ、 ／〜３ ｍｌ３程度が甲いられ
る。また反応条件としては３７℃近辺で行うことが好ま
しく、反応時間としては、反応が十分性われる適宜な時
間を選択すればよく通常５分以上、打着しくはｌＯ分以
上反応せしめる。また反応媒体としては、水または各試
薬等の溶媒としての弱酸性ないし弱アルカリ性の緩衝液
が甲いられる０ このようｔこして被検液を定量せしめるととぐこより、
極めて短時間でかつホスファチジルグリセロールを直接
的に定量し得、捷たホスファチジルグリセロール値、２
． Ｏｎｍｏｌｅｓ 、即ち羊水ｊ〜１． ｍｌ！使用
の際のホスファチジルグリセロール値約０．０３ ｍ９
Ａまで測定可能と々す、ＲＤＳ発症のためのクー ２
０ − リテイカル・レベルである０、 ２ ｍｇ／ｄｌのホス
ファチジルグリセロール値に比べて極めて低濃度１で定
量し得るもので、さらｔこ煩雑な操作を必要としない常
温での操作がなし得る良好な定量法である。
！た本発明の後述実施例ｅこおいて甲いられるホスホリ
パーゼＤ、ＧＫおよびＧＰ’Ｏの各酵素の活性測定法と
しては特ｔこ限定されるものではなく、例示すれば次の
通りである。
パーゼＤ、ＧＫおよびＧＰ’Ｏの各酵素の活性測定法と
しては特ｔこ限定されるものではなく、例示すれば次の
通りである。
（ａ３ ホスホリパーゼＤ活性測定法≠係卵黄ホスフ
ァチジルエタノールアミン溶液Ｏ１罰に０．０５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７５）Ｑ、ｆｍ１３，１％トリドア
Ｘ−／ ００，０．３ｍｌ、水０゜３ ｍｌ、 ／ Ｏ
ｍＭｃａｃ６２ 水溶液９２ｍ１を混合し、音波処理
にＩＱ分かかる。これにエチルエーテル０２ Ｍｇ ト
酵素溶液Ｑ、 ／ ｒａｇを加え、３７℃、２０分間反
応後、２０％トリクロロ酢酸Ｑ、 ３ ｍｌを加えて反
応を止める。反応液をエチルエーテルｔｍｌで２回洗浄
し、水層／ Ｍｌに０．２ Ｎクエン酸塩緩衝液（１）
Ｈ！ｉ ０ ） ０．３ ｍｌを加え、２％Ｓ ｎｃ
６２水溶液Ｑ、／ｍｅと２％ニンヒドリン溶液１ｍｅを
加え、１６６℃、 ２１− １５分間加熱して遊離したエタノールアミ）ヒンヒドリ
ン反応ｅこより発色させ、０Ｄ５７θｍμの吸光度を測
定し、１分間ｅこｌμｇのエタノールアミンを遊離する
酵素活性をｌ単位（Ｕ、）とする〇（ｂ）ＧＫ活性測定
法 ０２Ｍ１−リス−塩酸緩衝ｉｔ！（ｐＨ７０） ０．
ｕ ｍ１４０、 ／ ＭグリセＩ’ −／”
０．０３ｍ１／ Ｏｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ
Ｑ、 ｔ ｍｌｉ Ｏｍ Ｍ
ＭｇＣｊｈ □、 ｉ ｍｔ
ｒＯ，２５％ニトロテトラゾリウムブルー Ｑ、 ／
ｍｌｌ飴牛血清アルブミン Ｏ７≠ｍ１３
／ Ｏｍ Ｍ Ｎ Ａ Ｄ Ｏ
，ｔ ｍｌ！００５％フェナジンメトサルフェート０．
Ｏｔ ｍｔｒグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ（ベー
リンガー社製：２ｍｇ／ｍ１．ろＳＵ／ｍｇ
Ｓμｌ上記各組成を有する反応液／ ＭＥを、３７℃で
ｊ分間予加温し、これｔＵＧＫ含有液ｊＯμｌ（１０ｍ
Ｍグリセロール含有１０ｍＭＩＪン酸緩衝液、ｐＩ−Ｉ
希 ７５シこで適宜希釈）を加えて３７℃、１０分間反応せ
しめ、次いで０．７ ＮＨＣｌを加えて反応を停止 ２
２− せしめた後、その呈色を波長Ｓ５０ｎｍｌｔこて測定し
て、その吸光度（Ａ５５ｏｎｍ）を求める。ＧＫｌ単位
は、１分間１μｍｏｌｅのグリセロ−３−リン酸を生成
する活性とした。なお活性の計算式は次の如くである。
ァチジルエタノールアミン溶液Ｏ１罰に０．０５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７５）Ｑ、ｆｍ１３，１％トリドア
Ｘ−／ ００，０．３ｍｌ、水０゜３ ｍｌ、 ／ Ｏ
ｍＭｃａｃ６２ 水溶液９２ｍ１を混合し、音波処理
にＩＱ分かかる。これにエチルエーテル０２ Ｍｇ ト
酵素溶液Ｑ、 ／ ｒａｇを加え、３７℃、２０分間反
応後、２０％トリクロロ酢酸Ｑ、 ３ ｍｌを加えて反
応を止める。反応液をエチルエーテルｔｍｌで２回洗浄
し、水層／ Ｍｌに０．２ Ｎクエン酸塩緩衝液（１）
Ｈ！ｉ ０ ） ０．３ ｍｌを加え、２％Ｓ ｎｃ
６２水溶液Ｑ、／ｍｅと２％ニンヒドリン溶液１ｍｅを
加え、１６６℃、 ２１− １５分間加熱して遊離したエタノールアミ）ヒンヒドリ
ン反応ｅこより発色させ、０Ｄ５７θｍμの吸光度を測
定し、１分間ｅこｌμｇのエタノールアミンを遊離する
酵素活性をｌ単位（Ｕ、）とする〇（ｂ）ＧＫ活性測定
法 ０２Ｍ１−リス−塩酸緩衝ｉｔ！（ｐＨ７０） ０．
ｕ ｍ１４０、 ／ ＭグリセＩ’ −／”
０．０３ｍ１／ Ｏｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ
Ｑ、 ｔ ｍｌｉ Ｏｍ Ｍ
ＭｇＣｊｈ □、 ｉ ｍｔ
ｒＯ，２５％ニトロテトラゾリウムブルー Ｑ、 ／
ｍｌｌ飴牛血清アルブミン Ｏ７≠ｍ１３
／ Ｏｍ Ｍ Ｎ Ａ Ｄ Ｏ
，ｔ ｍｌ！００５％フェナジンメトサルフェート０．
Ｏｔ ｍｔｒグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ（ベー
リンガー社製：２ｍｇ／ｍ１．ろＳＵ／ｍｇ
Ｓμｌ上記各組成を有する反応液／ ＭＥを、３７℃で
ｊ分間予加温し、これｔＵＧＫ含有液ｊＯμｌ（１０ｍ
Ｍグリセロール含有１０ｍＭＩＪン酸緩衝液、ｐＩ−Ｉ
希 ７５シこで適宜希釈）を加えて３７℃、１０分間反応せ
しめ、次いで０．７ ＮＨＣｌを加えて反応を停止 ２
２− せしめた後、その呈色を波長Ｓ５０ｎｍｌｔこて測定し
て、その吸光度（Ａ５５ｏｎｍ）を求める。ＧＫｌ単位
は、１分間１μｍｏｌｅのグリセロ−３−リン酸を生成
する活性とした。なお活性の計算式は次の如くである。
（ｅ）ＧＰＯ活性測定法
０．２Ｍトｖス塩酸緩衝液（ｐ Ｈｇ、 ０ ）
０．２ ｍｌペルオキシダーゼ（０，５ｍｆ／ｍｅ、
ＩＩ ３ Ｕ／ｍｇ） ０． ｔ ｍｌＯ，３（Ｗ／
Ｖ） ４４−アミノアンチピリ７ Ｑ、１ｍ１ｌＯ
，／ Ｍ Ｄ Ｌ−グリセロ−３−リン酸 Ｑ、 ／
ｍ１０２％（Ｖ／Ｖ）Ｎ、Ｎ−ジＪ ｆ ／ｌ／ ７
＝ ＩＪ ｙ Ｑ、 ２ｍ１Ｖ蒸留水
Ｑ、 ３ ｍｌ上記組成の反応液／
、 Ｑ ｍ１３を小試験管ｅこ取り、３分間３７℃で予
備加温し、これｅこ２θμ４の酵素液を添加して１０分
間反応せしめ、次いでこれｅこ０２５％（Ｗ／Ｖ）ラウ
リルベンゼンスルホン酸ナトリウム２． Ｑ ｍｌを加
えて反応を停止し、これを５６５ ｎｍ の波長でその
吸光度を測定する。
０．２ ｍｌペルオキシダーゼ（０，５ｍｆ／ｍｅ、
ＩＩ ３ Ｕ／ｍｇ） ０． ｔ ｍｌＯ，３（Ｗ／
Ｖ） ４４−アミノアンチピリ７ Ｑ、１ｍ１ｌＯ
，／ Ｍ Ｄ Ｌ−グリセロ−３−リン酸 Ｑ、 ／
ｍ１０２％（Ｖ／Ｖ）Ｎ、Ｎ−ジＪ ｆ ／ｌ／ ７
＝ ＩＪ ｙ Ｑ、 ２ｍ１Ｖ蒸留水
Ｑ、 ３ ｍｌ上記組成の反応液／
、 Ｑ ｍ１３を小試験管ｅこ取り、３分間３７℃で予
備加温し、これｅこ２θμ４の酵素液を添加して１０分
間反応せしめ、次いでこれｅこ０２５％（Ｗ／Ｖ）ラウ
リルベンゼンスルホン酸ナトリウム２． Ｑ ｍｌを加
えて反応を停止し、これを５６５ ｎｍ の波長でその
吸光度を測定する。
２３−
酵素活性の算出は次式ｅこ従う
（ただし、△ＡはｊＡ！ｒｎｒｎ＆こおける７０分間で
の吸光値を示す） 次いで本発明の実施例を挙げて具体的ンこ述べるが、本
発明はこれちｔこよって何ら限定されるものではない。
の吸光値を示す） 次いで本発明の実施例を挙げて具体的ンこ述べるが、本
発明はこれちｔこよって何ら限定されるものではない。
実施例 ｌ
〔検量線の作成〕
下記の組成を有する溶液を調整した。
（１）ホスファチジルグリセロール含有液：１％トリト
ンＸ−１００含有のホスファチジルグリセｏ −／ｌ／
／、 Ｑμｍｏｌｅｓ／ Ｉｌｌ ヲ作Ｈした（ホス
ファチジルグリセロールの濃度はリン酸定量法ｅこて決
定した。） （２） Ｃａ −緩衝液反応媒体： ０、 ／ Ｍ ｌ−リ、＜ −Ｈ（６緩衝液（’９Ｈｇ
）ｇ、Ｏｍｔ：’ ＭＣａＣ１２０，２ｍｌ 蒸留水 ／ど１−２≠ − 計 ／Ｑｍ１３ （３）ホスホリパーゼＤ酵素液： ３３Ｕ／ｍｌｉのホスホリパーゼＤ Ｉｏ、６ｍ’；／
／ｍｌ）含有トリス’ ２ ／、 ／ ｙｎｇ、牛血清
アルブミンｓ ｏ、 。
ンＸ−１００含有のホスファチジルグリセｏ −／ｌ／
／、 Ｑμｍｏｌｅｓ／ Ｉｌｌ ヲ作Ｈした（ホス
ファチジルグリセロールの濃度はリン酸定量法ｅこて決
定した。） （２） Ｃａ −緩衝液反応媒体： ０、 ／ Ｍ ｌ−リ、＜ −Ｈ（６緩衝液（’９Ｈｇ
）ｇ、Ｏｍｔ：’ ＭＣａＣ１２０，２ｍｌ 蒸留水 ／ど１−２≠ − 計 ／Ｑｍ１３ （３）ホスホリパーゼＤ酵素液： ３３Ｕ／ｍｌｉのホスホリパーゼＤ Ｉｏ、６ｍ’；／
／ｍｌ）含有トリス’ ２ ／、 ／ ｙｎｇ、牛血清
アルブミンｓ ｏ、 。
ｍｙ、２０％トリトンＸ−’／ ００ノ０．３ｍｌ！オ
ヨＵ水含有１．）θ″′ｐ′ｐ溶液ど） （４’）ｇＯｍＭＥＤＴＡ （５） ４’ Ｏｒｎ Ｍ ＭｇＣＪ？２／ ／乙Ｏ
ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ溶液＝０．２ ＭＡ Ｔ Ｐ ／、
Ｏｍｌ、 ０．５ ＭＭｇｃ（！２０． ／ ＯＮお
よび蒸留水Ｑ、 ７５ ｍ１３を加えてｉ、ｘｓｍｉと
した。
ヨＵ水含有１．）θ″′ｐ′ｐ溶液ど） （４’）ｇＯｍＭＥＤＴＡ （５） ４’ Ｏｒｎ Ｍ ＭｇＣＪ？２／ ／乙Ｏ
ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ溶液＝０．２ ＭＡ Ｔ Ｐ ／、
Ｏｍｌ、 ０．５ ＭＭｇｃ（！２０． ／ ＯＮお
よび蒸留水Ｑ、 ７５ ｍ１３を加えてｉ、ｘｓｍｉと
した。
（４）ＧＫ酵素液
２ ｍｙ ／ ｍｅ （Ｄ Ｇ Ｋ含有／ ＯｍＭ）
リスーＨＣ１緩衝液（ｐＨど） （７） Ｇ Ｐ Ｏ＃素液 ３■／ ｍｌのＧＰＯ含有牛血清アルブミンｉｏｍｙ、
（Ｎ Ｈ４）２ Ｂｏａ Ｓ ６０．７５ ”ｆ、０．
／Ｍトリスー：［（Ｃ６緩衝Ｗ／、 Ｏｍｌ （ｐ Ｈ
ｇ ）および蒸留水９ｍｌ含有ＧＰＯ酵素液／Ｑｍｌを
調整した。
リスーＨＣ１緩衝液（ｐＨど） （７） Ｇ Ｐ Ｏ＃素液 ３■／ ｍｌのＧＰＯ含有牛血清アルブミンｉｏｍｙ、
（Ｎ Ｈ４）２ Ｂｏａ Ｓ ６０．７５ ”ｆ、０．
／Ｍトリスー：［（Ｃ６緩衝Ｗ／、 Ｏｍｌ （ｐ Ｈ
ｇ ）および蒸留水９ｍｌ含有ＧＰＯ酵素液／Ｑｍｌを
調整した。
（ど）ＧＰＯ含有指示薬組成液：
≠−アミノアンチピリン ０．２１１ ｍｌ
−，２！； − フェノール水溶液（１０ｍｆｌ／ｍ１４） （ｙｌ
乙ｍｌ！トリトンＸ−１００（／、２．５−ダｘ）ｏ、
ｇｒａトリス−Ｈ（７緩衝液（０，３；Ｍ、 ｐＨｇ
） ／６ｍｌペルオキシダーゼ（９０Ｕ／ｍｌ蒸留水１
０．ｇｍｌＧＰＯ酵素液（３ｍｆｌ／ｍ１ＧＰｏ）
０．１ｍｌ蒸留水
ｌｊ６成計 ２９ｍ１３ 次いで、上記のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）含
有液のＱ ｒｎｌ 〜Ｑ、 ／ Ｑ ｒｄノ各々ヲ用イ
、これｅこ１％トリＩ・７Ｘ−／ＤＯを加えて全Ｊｉｌ
Ｑ、 ／ ＱＭＥとなし、さらｅこＣａ −緩衝液
Ｑ、 ／ ｍｌを加えて３７℃ｅこで５分間予備加温し
た後、これにホスホリパーゼＤ酵素液ｏ、 ｏ ｓ ｍ
ｉを加えて３７℃ｌＯ分間反応せしめり。反応後Ａ Ｏ
ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｏ，０１Ａ ｍｌ：を加えた
後、ＩＡ Ｏｍ ＭｇＣ（ｈ ／ ／乙ＯｍＭＡＴＰ溶
液０．０７５ｍ１４およびＧＫ酵素液０．０３ ｍｌを
刀口えて３７℃、１０分間反応せしめた。次いで反応後
これに、ＧＰＯ含有指示薬組成液／、Ｑｍｌを加えて３
７℃で２０分間反応せしめ、次いで反応によって産出さ
れた色素の呈色を波長３；００℃ｍｒこて吸−２６− 光度（ＯＤ５ｏｏ）測定した。
−，２！； − フェノール水溶液（１０ｍｆｌ／ｍ１４） （ｙｌ
乙ｍｌ！トリトンＸ−１００（／、２．５−ダｘ）ｏ、
ｇｒａトリス−Ｈ（７緩衝液（０，３；Ｍ、 ｐＨｇ
） ／６ｍｌペルオキシダーゼ（９０Ｕ／ｍｌ蒸留水１
０．ｇｍｌＧＰＯ酵素液（３ｍｆｌ／ｍ１ＧＰｏ）
０．１ｍｌ蒸留水
ｌｊ６成計 ２９ｍ１３ 次いで、上記のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）含
有液のＱ ｒｎｌ 〜Ｑ、 ／ Ｑ ｒｄノ各々ヲ用イ
、これｅこ１％トリＩ・７Ｘ−／ＤＯを加えて全Ｊｉｌ
Ｑ、 ／ ＱＭＥとなし、さらｅこＣａ −緩衝液
Ｑ、 ／ ｍｌを加えて３７℃ｅこで５分間予備加温し
た後、これにホスホリパーゼＤ酵素液ｏ、 ｏ ｓ ｍ
ｉを加えて３７℃ｌＯ分間反応せしめり。反応後Ａ Ｏ
ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ Ｏ，０１Ａ ｍｌ：を加えた
後、ＩＡ Ｏｍ ＭｇＣ（ｈ ／ ／乙ＯｍＭＡＴＰ溶
液０．０７５ｍ１４およびＧＫ酵素液０．０３ ｍｌを
刀口えて３７℃、１０分間反応せしめた。次いで反応後
これに、ＧＰＯ含有指示薬組成液／、Ｑｍｌを加えて３
７℃で２０分間反応せしめ、次いで反応によって産出さ
れた色素の呈色を波長３；００℃ｍｒこて吸−２６− 光度（ＯＤ５ｏｏ）測定した。
その結果、第１図に示す通りで、ＰＣ含有液０００５ｍ
ｅ（ＰＧ含有量５ ｎ ｍｏｌｅｓ ）からＱ、１ｍ１
ｌｊｐＧ含有量／ ００ ｎ ｍｏｌｅｓ ）の範囲で
良好な直線性が得られた。
ｅ（ＰＧ含有量５ ｎ ｍｏｌｅｓ ）からＱ、１ｍ１
ｌｊｐＧ含有量／ ００ ｎ ｍｏｌｅｓ ）の範囲で
良好な直線性が得られた。
さら？ここの第１図から、ＰＧ含有量２ ｎ ｍｏｌｅ
ｓからでも直線性が得られるものであり、きわめて鋭敏
であった。
ｓからでも直線性が得られるものであり、きわめて鋭敏
であった。
実施例 ！
採取した羊水５〜乙ｍＩＶをクロロホルム−メタノール
Ｍ！：／）の１ｇｍ１！ｐこ溶解して２００Ｏｒｐｍで
遠心し、次いで３層しこ分離したクロロホルム層を採取
し、窒素ガス中で蒸発乾固せしめてトータル脂質分を得
た。次いでこれをクロロホルム０１ｍ１ ｆこ溶解して
シリカゲルカラム（０３グ）ｅこチャージし、クロロホ
ルム−メタノール（／９：／）１０ｍｌを流して中性脂
肪を除去し、さらｔこクロロホルム−メタノール（，２
： ／）／ □ｍｌを流してホスファチジルグリセロー
ル含有区分を回収し、次いで溶媒を除去し、／％トＩＪ
トンｘ−ｉｏｏｏ、ｉ−２７＝ ｍｅに溶解して被検液とした。さらｔここの被検液ｅこ
Ｃａ”−緩衝液Ｏ１成を加えて３７℃（こて５分間予備
加温した後、これ（こホスホリパーゼＤ酵素液ＯＱ５ｍ
ｌを加えて３７℃、７０分間反応せしめた。
Ｍ！：／）の１ｇｍ１！ｐこ溶解して２００Ｏｒｐｍで
遠心し、次いで３層しこ分離したクロロホルム層を採取
し、窒素ガス中で蒸発乾固せしめてトータル脂質分を得
た。次いでこれをクロロホルム０１ｍ１ ｆこ溶解して
シリカゲルカラム（０３グ）ｅこチャージし、クロロホ
ルム−メタノール（／９：／）１０ｍｌを流して中性脂
肪を除去し、さらｔこクロロホルム−メタノール（，２
： ／）／ □ｍｌを流してホスファチジルグリセロー
ル含有区分を回収し、次いで溶媒を除去し、／％トＩＪ
トンｘ−ｉｏｏｏ、ｉ−２７＝ ｍｅに溶解して被検液とした。さらｔここの被検液ｅこ
Ｃａ”−緩衝液Ｏ１成を加えて３７℃（こて５分間予備
加温した後、これ（こホスホリパーゼＤ酵素液ＯＱ５ｍ
ｌを加えて３７℃、７０分間反応せしめた。
反応後乙ＯｍＭ ＥＤＴＡ００１Ａｍ１３を加えた後グ
Ｏｍ ＭＭｇＣ１２２／ ／ ＡＭ Ａ Ｔ Ｐ溶液０
．０７５ ｍｌ！およびＧＫ＃素液０．０３ ｍ１３を
加えて３７℃、１０分間反応せしめた。次いで反応後こ
れｔこ、ＧＰＯ含有指示薬組成液／、 Ｏｍｌを加えて
３７℃で２０分間反応せしめ、次いで反応によって産出
された色素の量 呈色を波長ＳＯＯｎｍにて吸光度測定し、検査線から採
取した羊水中のＰＣ含有量（１層ｇ／ｄ１）を求めた。
Ｏｍ ＭＭｇＣ１２２／ ／ ＡＭ Ａ Ｔ Ｐ溶液０
．０７５ ｍｌ！およびＧＫ＃素液０．０３ ｍ１３を
加えて３７℃、１０分間反応せしめた。次いで反応後こ
れｔこ、ＧＰＯ含有指示薬組成液／、 Ｏｍｌを加えて
３７℃で２０分間反応せしめ、次いで反応によって産出
された色素の量 呈色を波長ＳＯＯｎｍにて吸光度測定し、検査線から採
取した羊水中のＰＣ含有量（１層ｇ／ｄ１）を求めた。
その結果、第２図ｔこ示す通りであった。また第２図中
、Ｘは死亡例、○はＲＤＳ全８発、△は弱いＲ８Ｄ８層
例、Ｏは非ＲＤＳ例との結果を示すものである。
、Ｘは死亡例、○はＲＤＳ全８発、△は弱いＲ８Ｄ８層
例、Ｏは非ＲＤＳ例との結果を示すものである。
実施例 ３
０２Ｍトリス−Ｈ（ｌ緩衝液（ＰＨ７５） ０．２ｍｌ
／ ＯｍＭ ＣａＭ２ ０．２ｍ
ｌ／ Ｏｍ Ｍ Ｍｇｅｔ？２０．２ ｍｅ ２ｇ − １Ｏ％ ト リ ト ７Ｘ−１０００，０５ｍ１ｉ／
ＯｍＭ ＡＴ Ｐ
０．２ｍ１４２０ Ｕ／ｍｌホスホリパーゼＤ 、
５ＵＡｎｌ Ｇ Ｋおよび！； ＯＵ／ｍｅ Ｇ Ｐ
Ｏ含有液 Ｑ、 ／ ｍｅＩＩ ５
（Ｊ ／ ｍ！４ペルオキシダーゼ Ｑ、
／ ｒｎｌｏ、３％≠−アミノアンチピリン Ｑ
２ｍ１３０３％３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリン Ｑ、 ２ｍｌ蒸
留水 ｏ、 ｓ ｓ ｍｅ計
、：ｌ、Ｑ ｍｅ 上記の組成を有するホスファチジルグリセロール定量用
反応組成物、ｌ、 Ｑ ｍｅを調整し、これｔこ各種の
ＰＧ含有液たる被検液ｊＯμＩＰＧ含有２０ｎｍｏｌｊ
ｓ −／ ００ ｎ ｍｏｌｅｓ ）を加えて、３７℃
で７５分間反応せしめ、次いで反応後産出される色素の
呈色を辣長！ｒ！；０ｎｒｎｔコて吸光度（ＯＤｓｓｏ
）測定した。
／ ＯｍＭ ＣａＭ２ ０．２ｍ
ｌ／ Ｏｍ Ｍ Ｍｇｅｔ？２０．２ ｍｅ ２ｇ − １Ｏ％ ト リ ト ７Ｘ−１０００，０５ｍ１ｉ／
ＯｍＭ ＡＴ Ｐ
０．２ｍ１４２０ Ｕ／ｍｌホスホリパーゼＤ 、
５ＵＡｎｌ Ｇ Ｋおよび！； ＯＵ／ｍｅ Ｇ Ｐ
Ｏ含有液 Ｑ、 ／ ｍｅＩＩ ５
（Ｊ ／ ｍ！４ペルオキシダーゼ Ｑ、
／ ｒｎｌｏ、３％≠−アミノアンチピリン Ｑ
２ｍ１３０３％３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリン Ｑ、 ２ｍｌ蒸
留水 ｏ、 ｓ ｓ ｍｅ計
、：ｌ、Ｑ ｍｅ 上記の組成を有するホスファチジルグリセロール定量用
反応組成物、ｌ、 Ｑ ｍｅを調整し、これｔこ各種の
ＰＧ含有液たる被検液ｊＯμＩＰＧ含有２０ｎｍｏｌｊ
ｓ −／ ００ ｎ ｍｏｌｅｓ ）を加えて、３７℃
で７５分間反応せしめ、次いで反応後産出される色素の
呈色を辣長！ｒ！；０ｎｒｎｔコて吸光度（ＯＤｓｓｏ
）測定した。
その結果、第３図ｔこ示す通りで、被検液中のＰＧ含有
量Ｅこ対して良好な直線性を示す検量線が得られた。
量Ｅこ対して良好な直線性を示す検量線が得られた。
−ｌタ −
第１図は本発明の実施例１における検量線を示し、第２
図は種々の採取された羊水成分を用いたホスファチジル
グリセロールの定量結果を示し、第３図は本発明の実施
例３しこおける検量線を示す特許出願人 東洋醸造株
式会社 代表者 伊東富士馬 第 ノ 図 ＰＧ番浩靭馳雉（ｍ１〕 −３０− 第え図 ２８３０３２３４３６１４０４２ Ｗｅｅｋｓ ｏｆ ｇｅｓｔａｔ１ｏｎ第３図 ０ ２０ ４０ ６０
８０ １００ｐ Ｇ ４咄９＞ （ｎ ｍ
ｏｌｅｓ ）手続補正書 昭和Ｓり年７０月 ４ 日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 −：パ ＼ ／１事件の表示 昭和５４年特許願第、２０３０７ケ号 、２１発明の名称 ホスファチジルグリセロールの定量２込３１補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 静岡糸口］方郡大仁町三福６３２の／自 発 ５１補正の対象 ｉＢｉｏｃｈｅｍ、 Ｚ、 、 Ｊと訂正する。 明細書第、２／頁第１１１．行の「音波処理」を訂正す
る。 明細書第、２６頁第１３行の「グＯｍＭｇＣ１２Ｊを「
グθｍＭＭｇＣ１゜」と訂正する。 明細書第２ｇ頁第Ｓ行〜乙行の［グＯｍＭ ＭｇＣｌ２
２Ｊを「りＯｍＭ ＭｇＣｌ。」と訂正する。 −コー
図は種々の採取された羊水成分を用いたホスファチジル
グリセロールの定量結果を示し、第３図は本発明の実施
例３しこおける検量線を示す特許出願人 東洋醸造株
式会社 代表者 伊東富士馬 第 ノ 図 ＰＧ番浩靭馳雉（ｍ１〕 −３０− 第え図 ２８３０３２３４３６１４０４２ Ｗｅｅｋｓ ｏｆ ｇｅｓｔａｔ１ｏｎ第３図 ０ ２０ ４０ ６０
８０ １００ｐ Ｇ ４咄９＞ （ｎ ｍ
ｏｌｅｓ ）手続補正書 昭和Ｓり年７０月 ４ 日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 −：パ ＼ ／１事件の表示 昭和５４年特許願第、２０３０７ケ号 、２１発明の名称 ホスファチジルグリセロールの定量２込３１補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 静岡糸口］方郡大仁町三福６３２の／自 発 ５１補正の対象 ｉＢｉｏｃｈｅｍ、 Ｚ、 、 Ｊと訂正する。 明細書第、２／頁第１１１．行の「音波処理」を訂正す
る。 明細書第、２６頁第１３行の「グＯｍＭｇＣ１２Ｊを「
グθｍＭＭｇＣ１゜」と訂正する。 明細書第２ｇ頁第Ｓ行〜乙行の［グＯｍＭ ＭｇＣｌ２
２Ｊを「りＯｍＭ ＭｇＣｌ。」と訂正する。 −コー
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）被検液中のホスファチジルグリセロールの定量Ｑ
こおいて、ホスファチジルグリセロールおよび水からグ
リセロールおよびホスファチジン酸を生成せしめる反応
を触媒する酵素を作用せしめてグリセロールを遊離せし
め、次いで生成したグリセロールを定量することを特徴
とするホスファチジルグリセロールの定量法。 （２） ホスファチジルグリセロールおよび水からグ
リセロールおよびホスファチジン酸を生成せしめる反応
を触媒する酵素がホスホリパーゼＤである特許請求の範
囲第１項記載の定量法。 （己） 被検液が、体液である特許請求の範囲第１項
または第２項記載の定量法０ （４）被検液中のホスファチジルグリセロールの定量ｅ
こおいて （ａ） ホスファチジルグリセロールｅこホスホリパ
ーゼＤを作用せしめてグリセロールを遊離し、 （ｂ） グリセロールｔこリン酸供与体の存在下ｅこ
グリセロールキナーゼを作用せしめてグリセロ−３−リ
ン酸となし、 （ｃ） クリセロ−３−リン酸ｅこグリセロホス７エ
ートオキシダーゼを作用せしめ、 （ｄ） 次いで反応ｅこおいて消費される酸素の量−
Ｐたは生成される過酸化水素の量を測定する、 工 上記の各（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）、（ｄ）海程の組合せ
？こより定量してなる特許請求の範囲第１項、第２項、
または第３項記載の定量法。 （５） リン酸供与体が、アテノシントリホスフエー
トである特許請求の範囲第≠項記載の定量法。 （６） 過酸化水素の量の測定において、過酸化水素
と反応して検出できる生成物を生成する指示薬組成物を
用いる特許請求の範囲第ψ項捷たは第５項記載の定量法
。 （７） 指示薬組成物がペルオキシダーゼ作用を有す
る物質と染料前駆体、含有物である特許請求の範囲第６
項記載の定量法。 （８） 染料前駆体が、≠−アミノアンチピリンと請 フェノールである特許請求の範囲Ｆ７項記載の定量法。 （９） 染料前駆体が≠−アミノアンチピリンと３−
メチル−Ｎ−エチル−Ｎ −（β−ヒドロギシエチル）
アニリンである特許請求の範囲第７項記載の定量法。 （１ｎ） １ｌｌｌｌ定において１．！；００ｎｍ近辺
の波長ｅこて吸光度測定してなる特許請求の範囲第に項
記載の定量法。 （１１）測定ｅこおいて、３３０ ｎｍ近辺の波長ｔこ
で吸光度測定してなる特許請求の範囲第り項記載の定量
法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56203074A JPS58107199A (ja) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | ホスフアチジルグリセロ−ルの定量方法 |
| GB08233333A GB2111677B (en) | 1981-12-16 | 1982-11-23 | Method for quantitative measurement of phosphatidyl glycerol |
| CA000416607A CA1201047A (en) | 1981-12-16 | 1982-11-29 | Method for quantitative measurement of phosphatidyl glycerol |
| FR8220269A FR2518117B1 (fr) | 1981-12-16 | 1982-12-03 | Procede de mesure quantitative du phosphatidylglycerol |
| DE19823246090 DE3246090A1 (de) | 1981-12-16 | 1982-12-13 | Verfahren zur quantitativen bestimmung von phosphatidyl-glycerin |
| IT24763/82A IT1155384B (it) | 1981-12-16 | 1982-12-15 | Procedimento per la misurazione quantitativa di fosfatidil glicerina |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56203074A JPS58107199A (ja) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | ホスフアチジルグリセロ−ルの定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58107199A true JPS58107199A (ja) | 1983-06-25 |
Family
ID=16467912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56203074A Pending JPS58107199A (ja) | 1981-12-16 | 1981-12-16 | ホスフアチジルグリセロ−ルの定量方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58107199A (ja) |
| CA (1) | CA1201047A (ja) |
| DE (1) | DE3246090A1 (ja) |
| FR (1) | FR2518117B1 (ja) |
| GB (1) | GB2111677B (ja) |
| IT (1) | IT1155384B (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3211347A1 (de) * | 1982-03-27 | 1983-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur enzymatischen bestimmung von phosphatidylglycerin |
| JPS59140900A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な酵素的高感度測定法 |
| JPS62215398A (ja) * | 1986-01-06 | 1987-09-22 | アイソラブ，インク． | 医療診断用指示要素として羊水中のホスフアチジルグリセロ−ルの量を測定する方法とそのキツト |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55111800A (en) * | 1979-02-20 | 1980-08-28 | Toyo Jozo Co Ltd | Kit for analysis of lipid component |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1515195A (en) * | 1975-08-05 | 1978-06-21 | Hycel Inc | Triglyceride assay |
| JPS604716B2 (ja) * | 1976-04-26 | 1985-02-06 | 東洋醸造株式会社 | 新規なコリンオキシダーゼおよびその製法 |
| JPS5324888A (en) * | 1976-08-19 | 1978-03-08 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Composition for quantitating fats containing phosphorus |
| US4241178A (en) * | 1978-01-06 | 1980-12-23 | Eastman Kodak Company | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides |
| DE2938737A1 (de) * | 1978-09-26 | 1980-04-03 | Toyo Jozo Kk | Vorrichtung und verfahren zur gleichzeitigen analytischen bestimmung von mehreren komponenten in einer probe mittels enzymatischer analyse |
| SU831129A1 (ru) * | 1979-07-24 | 1981-05-23 | Дальневосточный Государственный Уни-Верситет | Способ получени фосфатидилглицерина |
| JPS5889199A (ja) * | 1981-11-20 | 1983-05-27 | Toyo Jozo Co Ltd | ホスフアチジルグリセロ−ルの定量法 |
| JPS5898096A (ja) * | 1981-12-07 | 1983-06-10 | Toyo Jozo Co Ltd | エタノ−ルアミン含有液の定量法 |
-
1981
- 1981-12-16 JP JP56203074A patent/JPS58107199A/ja active Pending
-
1982
- 1982-11-23 GB GB08233333A patent/GB2111677B/en not_active Expired
- 1982-11-29 CA CA000416607A patent/CA1201047A/en not_active Expired
- 1982-12-03 FR FR8220269A patent/FR2518117B1/fr not_active Expired
- 1982-12-13 DE DE19823246090 patent/DE3246090A1/de active Granted
- 1982-12-15 IT IT24763/82A patent/IT1155384B/it active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55111800A (en) * | 1979-02-20 | 1980-08-28 | Toyo Jozo Co Ltd | Kit for analysis of lipid component |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2111677A (en) | 1983-07-06 |
| FR2518117A1 (fr) | 1983-06-17 |
| DE3246090C2 (ja) | 1991-10-10 |
| GB2111677B (en) | 1985-01-16 |
| IT8224763A1 (it) | 1984-06-15 |
| CA1201047A (en) | 1986-02-25 |
| DE3246090A1 (de) | 1984-02-16 |
| IT1155384B (it) | 1987-01-28 |
| IT8224763A0 (it) | 1982-12-15 |
| FR2518117B1 (fr) | 1986-10-10 |
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