IT8224763A1

IT8224763A1 - Procedimento per la misurazione quantitativa di posfatidil glicerina

Info

Publication number: IT8224763A1
Application number: IT1982A24763A
Authority: IT
Original assignee: Toyo Jozo Kk
Priority date: 1981-12-16
Filing date: 1982-12-15
Publication date: 1984-06-15
Also published as: IT1155384B; FR2518117B1; GB2111677A; FR2518117A1; GB2111677B; DE3246090C2; DE3246090A1; CA1201047A; IT8224763A0; JPS58107199A

Description

"PROCEDIMENTO PER LA MISURAZIONE QUANTITATIVA DI FOSFATIDIL GLICERINA".

RIASSUNTO

Un metodo per la misurazione quantitativa di fosfatidilglicerina in un liquido da esaminare, in particolare in un fluido corporeo come per e sempio fluido amniotico, secondo il quale si pu? misurare, in un "breve periodo di tempo, in modo semplice, opportuno e preciso, soltanto fosfatidil_ glicerina. Questo metodo consiste nel fare agire un enzima per esempio fosfolipasi D sulla fosfadidilglicerina nel liquido per liberare glicerina, che viene misurata quantitativamente, preferibilmente adottando un metodo tipo GK-GPO.

a DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un nuovo metodo per la misurazione quantitativa di fosfatidilglicerina.

Recentemente, il numero di morti tra i neonati di scarso peso corporeo ? diminuito a causa della migliorata cura dei neonati e simili. Tuttavia, la sindrome di difficolt? o carenza respiratoria (HDS) di un neonato nel periodo perinatale costituisce ancora un notevole problema e le morti dovute a; determinata sindrome costituiscono un'elevata percentuale delle morti. Si considera che la sindrome da carenza respiratoria avviene a causa della mancanza di tensioattivo polmonare. Questa sostanza ? importante per impedire una contrazione degli alveoli polmonari che si espandono immediatamente dopo la nascita. La mancanza di questo tensioattivo polmonare provoca una atelettasia nella respirazione e provoca l'insorgere della sindrome da difficolt? o carenza respiratoria. Di conseguenza, se si pu? per tempo valutare l'insorgere di una sindrome da carenza respiratoria, in modo che si possa iniziare per tempo la terapia del neonato, si pu? impedire 1' insorgere della sindrome da carenza respiratoria oppure la si pu? limitare a forme blande. Pertanto, la misurazione di questo tensioattivo polmonare ? necessaria.

I metodi sono classificati grossolanamente nel metodo per la mi surazione secondo il quale si utilizza la propriet? fisica di un tensioattivo polmonare e un metodo secondo il quale i componenti del tensioattivo polmonare vengono separati con metodo biochimico. Quest'ultimo metodo ? stato realizzato ottenendo il rapporto tra ciascun lipide, per esempio quel^ lo tra fosfatidii colina e sfingomielina, quello tra fosfatidilglicerina e fosfatidii inositolo oppure la misurazione quantitativa della dipalmitoil fosfatidii col ina mediante cromatografia su strato sottile J_ Am. J. Obstet. Gynecol., 44?: 109 (1971 ); Am. J. Obstet, Gynecol., 613 : 125 0976) ; Am. J. Obstet. Gynecol ., 894: 133 ( 1979) ; Obstet, & Gynecol., 295: 57 (1981 ) ; Am. J. Obstet, Gynecol., 697: 138 ( 1980) ; ecc._/.

Dai risultati di queste diverse indagini, si ? messo in evidenza recentemente che l'esistenza della fosfatidilglicerina ? un fattore importante per l'insorgere della sindrome da carenza respiratoria. Tuttavia, la misurazione quantitativa della fosfatidilglicerina era molto difficile poich? la sua quantit? esistente ? un decimo rispetto alla quantit? della fosfatidilcolina

Prima d? ora, come metodo per la misurazione quantitativa della fosfatidilglicerina, era noto il metodo di cromatografia su strato sottile nel (quale, dopo l'allontanamento di un componente cellulare mediante separazione centrifuga dal liquido amniotico, si estraggono i componenti lipidici dal surnatante, si separano i.componenti di questo e? stratto mediante cromatografia su strato sottile, si misura quantitativamente ciascun fosfolipide, si ottengono i rapporti tra i diversi fosfolipidi e si ottiene la quantit? di fosfatidilglicerina indirettamente dal valore di fosfolipidi totali ottenuto preliminarmente mediante la misurazione quantitativa del fosfato secondo il metodo di combustione ad umido / Ara. J, Obstet. Gynecol. , 613 : 125 ( 1976) ; Am . J. Obstet , Gynecol., 1079 : 135 (1979 ) ; Am . J. Obstet. Gynecol . , 899 : 133 ( 1979) ? Ara. J. Obstet. Gynecol,, 44?: 109 (1971)_/? oppure secondo il metodo per la misurazione quan titativa in cui si effettua la cromatografia in fase liquida ad alta velocit? j_ Journal of Chromatography, 277: 2230981)_/. Tuttavia, questo metodo di cromatografia su strato sottile presenta inconvenienti in quanto ejs so richiede da 2 a 3 giorni per l'estrazione dei componenti lipidici dal liquido amniotico, richiede operazioni complicate e, inoltre, ? necessario un riscaldamento ad una temperatura elevata per la rivelazione di macchie. Inoltre, detto metodo presenta inconvenienti per il fatto che esso ? un metodo indiretto per la misurazione, basato sui rapporti diquantit? relative tra macchie e fosfolipide totale e non si pu? effettuare il trattamento contemporaneo di molti campioni a causa della cromatografia su strato sottile.

La Richiedente ha effettuato diversi studi riguardanti il metodo, mediante il quale, dal liquido contenente diversi componenti lipidici da esaminare, per esempio liquido amniotico, si pu? realizzare la misurazione quantitativa soltanto della fosfatidilglicerina in modo semplice, conveniente e preciso, in un "breve periodo di tempo.

Come risultato, la Richiedente ha trovato del tutto inaspettatamente che la fosfol?pasi D agisce sulla fosfatidilglicerina producendo gli cerina e acido fosfatidico e ha realizzato un metodo soddisfacente per la misurazione quantitativa soltanto della fosfatidilglicerina misurando quan titativamente questa glicerina prodotta dalla reazione e estratta.

Pi? preferibilmente, la Richiedente ha realizzato un metodo mediante il quale si pu? misurare quantitativamente in modo nettamente soddisfacente soltanto la fosfatidilglicerina facendo agire la fosfol?pasi D sul liquido da esaminare per produrre glicerina, quindi facendo agire la glicerinchinasi su questa glicerina in presenza di un donatore di fosfati per esempio adenosina trifosfato (ATP) , inoltre facendo agire la glicerofosfato ossidasi su detto .prodotto e, quindi, misurando la quantit? di ossigeno consumato oppure di perossido di idrogeno prodotto nella reazione.

La presente invenzione ? stata realizzata sulla base delle scoperte indicate sopra e si riferisce a un metodo per la misurazione quantitativa .di fosfatidilglicerina nel liquido da esaminare che consiste nel liberare glicerina mediante l?azione di un enzima che ha un ruolo di catalizzatore nella reazione per produrre glicerina e acido fosfatidico da fosfa tidilglicerina e acqua e, quindi, misurare quantitativamente la glicerina prodotta. Preferibilmente, la presente invenzione riguarda un metodo per la misurazione quantitativa di fosfatidilglicerina nel liquido da esaminare che comprende la combinazione dei seguenti procedimenti (a), (b), (c) e (d):

(a) Liberare glicerina facendo .agire la fosfolioasi I)sulla fosfatidilglicerina,

(b) produrre glicero-3-fosfato.facendo agire la glicerinchinasi sulla glicerina in presenza di un donatore di fosfato,

(c) fare agire la glicerofosfato-ossidasi sul glicero?3?fosfato e, quindi

(d)misurare la quantit? di ossigeno consumata oppure il perossido di idrogeno prodotto nella reazione,

Nella presente invenzione, ? vantaggioso preparare ciascun reagen te in una confezione regolata per la misurazione quantitativa e si pu? effettuare l'operazione di misurazione quantitativa a temperatura ambiente di circa 37?C e, inoltre, in un tempo di reazione molto breve. Inoltre, sulla base della presente invenzione, si pu? misurare accuratamente la fosfatidilglicerina fino a una concentrazione nettamente bassa e si pu? misurare direttamente il valore della fosfatidilglicerina realizzando cosi un notevole vantaggio. Inoltre, poich? si pu? effettuare la misurazione in modo semplice e conveniente, in un breve periodo di tempo, si possono misurare contemporaneamente molti campioni. Cos?, la presente invenzione realizza un metodo utile per la misurazione quantitativa della fosfatidilglicerina.

La figura 1 mostra la curva di taratura nell?Esempio 1 della pr?sente invenzione, la figura 2 mostra i risultati di una misurazione quantitativa della fosfatidilglicerina quando si son? usati diversi campio ni di componenti di fluido amniotico e la figura 3 mostra la curva di tara tura dell 'Esempio . 3 della presente invenzione .

Per primo, si pu? illustrare la fosfolipasi D come enzima che ha il ruolo di catalizzatore nella reazione tra fosfatidilglicerina e acqua per produrre glicerina e acido fosfatidico nella presente invenzione.

Questa fosfolipasi D era nota -come un enzima che ? un catalizzatore nella reazione per produrre 1 mole di acido.fosfatidico e di colina da ciascuna mole di lecitina e acqua. Poich? la sostanza pu? essere un cata? lizzatore nella reazione enzimatica indicata sopra, si pu? usare qualsiasi sostanza ottenuta mediante estrazione di cellule contenenti fosfolipasi D oppure si pu? usare un reagente costituito da un enzima posto in commercio, per esempio, un enzima originato da microorganismi ottenuto dalla coltura di un "batterio che produce fosfolipasi D che appartiene a un genere Strep? tomyces e Streptomyces hachijoensis ceppo A-1143 (PERM-P No. 1329); pubblicazione di brevetto giapponese esaminata n? 39918/1977, Streptomyces Chromofussus ceppo A?0848 (PERM?F No. 3519); pubblicazione di brevetto gia^ ponese non esaminata No..13^9 /7977_/, ecce, e reagenti costituiti da enzimi di fosfolipasi D posti in commercio.

La quantit? di fosfolipasi D da usare dovr? venire opportunamente modificata e regolata a seconda del tempo richiesto per la misurazione e a seconda della concentrazione di fosfatidilglicerina e non si deve porre ad essa alcuna limitazione. Per esempio, per una prova, si pu? usare fosfoli? pasi D usualmente in quantit? non inferiore a 0,1 unit?, preferibilmente in un&?quantit? di circa 1-10 unit?. Inoltre, si usa preferibilmente questa fo sfolipasi D dopo che essa ? stata sciolta in un tampone per esempio tampone Tris-HCl da debolmente acido a debolmente alcalino, tampone acido citrico, tampone acido borico, tampone PIPES-NaOH oppure tampone immidazolo e, se necessario, essa pu? essere regolata aggiungendo ad essa un tensioattivo non ionico per esempio Triton X?100 oppure albumina di siero. Successiva mente, la soluzione enzimatica contenente fosfolipasi D cos? regolata e il liquido da esaminare vengono mescolati e la glicerina e l'acido fosfa tidico vengono prodotti dalla fosfatidilglicerina nel liquido da esamina re con consumo di acqua. Il rapporto di miscelazione di entrambi i prodotti non ? particolarmente limitato e essi possono venire mescolati in corrispondenza di un rapporto tale che preferibilmente circa 1?10 unit? di fosfolipasi D siano contenute per una prova del liquido da esaminare. La temperatura di reazione pu? essere circa 37?C e il tempo di reazione pu? essere un tempo sufficiente per la liberazione di glicerina, usualmen te un tempo non inferiore a 5 minuti, preferibilmente non inferiore a 10 minuti. Successivamente, si misura quantitativamente la glicerina liberata dalla reazione. Da questo valore di misurazione quantitativa, si pu? ottenere il valore di fosfatidilglicerina nel liquido da esaminare.

Come metodi-per la misurazione quantitativa della glicerina, si possono adottare diversi metodi noti per la misurazione chimica quantitativa e si possono adottare i metodi nei quali si usano enzimi. Preferibil mente, un metodo enzimatico per la misurazione quantitativa, in cui una o pi? specie di enzimi il cui substrato ? glicerina viene fatta agire sulla glicerina e si misura quantitativamente il cambiamento rilevabile di azio ne enzimatica nella reazione, ? semplice e conveni?nte.

Per esempio, come metodo per la misurazione della glicerina, ? particolarmente semplice e conveniente il metodo tipo GK-GPO secondo il quale si producono glicero-3-fosfato e adenosina difosfato (ADP) mediante l'azione sulla glicerina in presenza di un donatore di fosfato per esempio adenosina trifosfato (ATP) e glicerinchinasi (GK), quindi si pone a contat to la glicerofosfato ossidasi (GPO) con il glicerin-3-fosfato in modo che l?ossigeno nel liquido di reazione venga consumato per produrre perossido di idrogeno.

In questo metodo tipo GK-GPO, la quantit? di ossigeno consumata nel liquido di reazione viene misurata con un elettrodo di ossigeno oppure la quantit? di perossido di idrogeno prodotta viene misurata con un elettrodo a perossido di idrogeno, come cambio elettrico. La quantit? di ossi^ geno oppure di perossido di idrogeno pu? anche venire misurata mediante un elettrodo enzimatico nel quale un elettrodo ad ossigeno oppure un elettrodo a perossido di idrogeno e un GPO immobilizzato vengono assemblati. Il GPO immobilizzato pu? essere sotto forma di membrane, fibre, granuli oppure tubi allo scopo di facilitare il fatto di avere l'enzima installato in corrispondenza della parte di rivelazione dell'elettrodo a ossigeno oppure del^ l'elettrodo a perossido di idrogeno. In questa forma di realizzazione, l?elettrodo pu? funzionare con una piccola quantit? di enzima. La fosfolipasi D oppure GK impiegata pu? anche venire immobilizzata in modo simile o in modo opportuno. Per la immobilizzazione, ? disponibile qualsiasi procedimento, per esempio, il metodo di inclusione polimerizzata nel quale si usa per esempio acrilammide; il metodo di immobilizzazione nel quale si usa un agente di reticolazione per la miscela con una proteina per esempio albumina; il metodo di inclusione nel quale si usa collageno oppure,fibroina; il metodo di legame covalente nel quale si usa collagene oppure fibroina; l'ad sorbimento su una resina polimera organica porosa oppure il legame covalente con una resina polimera organica porosa; il metodo di inclusione nel qua le si usa una resina fotoindurente oppure il metodo del legame covalente nel quale si usa un vetro aminato.

Inoltre, come altro mezzo per.la misurazione quantitativa del per ossido di idrogeno, si pu? effettuare la misurazione quantitativa adottando metodi spettrofotometrici nei quali si usa un indicatore che viene prodotto dalla reazione con perossido di idrogeno. Come indicatore, usualmente si im piega un indicatore nel quale si pu? misurare quantitativamente il cambiamento mediante un metodo spettrofotometrico, per esempio, un reagente colo rimetrico in cui avviene un cambiamento di colore nell'intervallo della lu ce visibile, una composizione reagente fluorescente che provoca fluorescen za oppure una composizione reagente luminescente nhe ? luminescente per ef fetto di una irradiazione con raggi ultravioletti. Per esempio, come compo sizione reagente di colorimetria, si usa un materiale contenente una sostan za avente azione di perossidasi e un croniogeno. Come sostanza avente azione di perossidasi, usualmente si usa spesso la perossidasi originata da ra fano e, come croniogeno, usualmente si usa spesso la combinazione di un accett?re di elettroni e di un donatore di idrogeno. Inoltre, come accettore di elettroni, si usa per esempio 4-amminoantipirina, 2-idrazinobenzotiazolo, 3-metil-2-benzotiazolone idrazina,2-amminobenzotiazolo '*o simili. Come donatore di idrogeno, si usano per esempio, fenolo, 3-roetil-N-etil-N-(beta-idrossietil)anilina, 3,5-xilenolo, ?,?-dimetilanilina, N,N-dietilani lina o simili.

Cane substrati luminosi in una composizione di un reagente fluorescente oppure in una composizione di un reagente luminescente, si possono citare diversi substrati luminosi noti, per esempio, bis(2,4,6?tricloro fenol)ossalato, feniltioidantoina,acido omovaniglico? acido 4-idrossife nilacetico, vanillilammina ,.3-metossi-etilaminina, acido fioretico, ordenina, luminol monoanione, lucigenina e simili.-Se necessario, ciascuno di essi pu? venire usato insieme con un accettore di elettroni e/o con una sostanza a? vente azione di perossidasi per la misurazione quantitativa del perossido di idrogeno.

Non esiste una particolare limitazione riguardante la quantit? del reagente costituito da un enzima oppure del croniogeno usato. Per esempio, si pu? usare, per una prova, usualmente non meno di 0,01 unit?, preferibilmente 0,05-100 unit? di GK, usualmente non meno di 0,05 unit?, preferibilmente 0,1-200 unit? di GP0 e usualmente non meno di 0,05 unit? prefer?- . bilmente 0,1-500 unit? di perossidasi. Inoltre si pu? usare una soluzione regolata in modo che la concentrazione di un accettore di elettroni oppure di un donatore di idrogeno usualmente sia non inferiore a 0,1 minimali e una soluzione regolata in modo che la concentrazione di un donatore di fosfato per esempio ATP oppure citosina trifosfato sia non inferiore a 0,1 mmoli. Pi? preferibilmente, allo scopo di fare aumentare l'attivit? enzimatica di GK, si usa un sale idrosolubile per liberare ioni magnesio, per esempio, cloruro di magnesio e esso pu? venire sciolto in acqua distillata o in un tampone debolmente acido o debolmente alcalino.Si possono usare questi reagenti separatamente dalla soluzione enzimatica di fosfolipasi D indicata sopra oppure si possono mescolare con essa oppure inoltre, si possono formare questi reagenti in un laminato integrato applicandoli su carte da filtro, pellicole o simili.

Il metodo tipo GK-GPO per la misurazione quantitativa mostra una elevata sensibilit? nei confronti della glicerina prodotta nel liquido da esaminare e, poich? esso non viene influenzato dall'impurit? nel liquido da esaminare, esso ? un metodo eccelleirte mediante il quale si pu? effettua re una misurazione accurata.

Come GK usato per questo metodo tipo GK-GPO per la misurazione quan titativa, si pu? usare qualsiasi enzima purch? esso produca glicerol-3-fo sfato e ABP da glicerina e ATP, per esempio, enzimi originati dal fegato di ratto o di piccione J. Biol. Chem,, 211, 951 (1954) e Biochem. Z., 329, 320 (1957)^/? quelli originati da microorganismi che sono enzimi ottenuti dal mezzo di coltura di microorganismi che producono GK per esempio Candida mycoderma o Streptomyces canus A-24O8 (PERM-P No. 4977) [ Biochem. Z., 333, 471 (1961) , brevetto giapponese non esaminato numero di pubblicazione 162987/1980__/, eccetera, e altri posti in commercio.

Inoltre, come GPO, si pu? usare qualsiasi enzima purch? esso abbia il ruolo di catalizzatore nella reazione per produrre diidrossiacetonfosfato e perossido di idrogeno da glicero-3-fosfato e ossigeno, per esem pio, genere Streptococcus, genere Lactobacillus, genere Leuconostoc, batte ri che producono glicerofosfato ossidasi che appartengono al genere Pediococcus (brevetto giapponese non esaminato numero di pubblicazione 72892/1978), un enzima ottenuto dalla coltura di batteri che producono glicerofosfato ossidasi che appartengono al genere Aerococcus (ceppo Aerococcus viridans IFO 12219 e ceppo IFO 12317? brevetto giapponese non esaminato numero di pubblicazione 15746/1980) e enzimi posti in commercio.

Come altro metodo enzimatico per la misurazione quantitativa della glicerina, si fa agire la glicerinchinasi sulla glicerina in presenza di un donatore di fosfato per esempio ATP per produrre glicero?3-fosfato e ADP, quindi si fa agire la glicerofosfato deidrogenasi su questo glicero?3-fosfa to in presenza di nicotina adenina dinucleotide (NAD) per produrre diidros? siacetone e NAD ridotto e, quindi, si misura quantitativamente questo NAD ridotto',in modo che si pu? determinare la quantit? di glicerina. Quando si effettua la misurazione quantitativa di questo NAD ridotto, si pu? usare comunemente la misurazione dell'assorbimento a circa 340 nra oppure, dopo che si ? lasciato sviluppare colore usando un sale di tetrazolio idrosolubile, per esempio

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in presenza di diaforasi oppure in presenza di fenazina metosolfato, si pu? misurare il colore secondo le assorbanze usando speciali lunghezze d*onda di assorbimento.

Come metodo differente da quelli indicati sopra, si pu? illustra re un metodo per la misurazione quantitativa in cui si fa agire la glicerina-deidrogenasi sulla glicerina in presenza di NAD per produrre diidros siacetone e NAD ridotto e si misura quantitativamente questo NAD ridotto.

Inoltre, si pu? illustrare un metodo che ? basato su un procedi mento nel quale si fa agire la glicerinchinasi sulla glicerina in presenza di un donatore di fosfato per esempio ATP per produrre glicerofosfato e ADP, si lascia agire la piruvatochinasi su questo ADP in presenza di fosfo enolpiruvato per produrre acido piruvico e ATP e si misura quantitativamente questo acido piruvico. Come metodi per la misurazione quantitativa di questo acido piruvico, si usano metodi come per es.uno in cui si fa agire un derivato della idrazina^per esempio la 2,4-dinitrofenilidrazina, sull?acido piruvico per sviluppare colore e si misura il colore secondo l'assorbenza usando una lunghezza d?onda di circa 44? nm, un metodo secondo il quale si fa agire la lattato deidrogenasi sull'acido piruvico in presenza di NAD ridotto per produrre NAD ossidato e acido lattico e si misura la quantit? diminuita di NAD ridotto nel sistema di reazione adottando un metodo come per esempio la misurazione dell'assorbenza in corrispondenza di una lunghezza d'onda di circa 34? nm, un metodo secondo il quale si fa agire la piruvato ossidasi sull'acido piruvico e si misura la quantit? di ossigeno consumato oppure la quantit? di perossido di idrogeno nel sistema di reazione, come variazione elettrica^ un metodo secondo il quale si misura l'acido piruvi? co mediante analisi spettrofotometrica, usando una composizione diindicatore per il perossido di idrogeno.

Oltre-ai metodi indicati sopra, si pu? usare un metodo per la misurazione quantitativa della glicerina secondo il quale si fa agire la glicerina ossidasi sulla glicerina e si misura la quantit? di ossigeno consumato oppure la quantit? di perossido di idrogeno o di aldeide glicerica prodotta nel sistema di reazione.

Per ci? che riguarda questi enzimi, questi reagenti e simili, ? semplice e opportuno usare quelli posti in commercio e si pu? opportunamente stabilire la quantit? da usare. Inoltre, se necessario, si pu? usare un tensioattivo oppure uno stabilizzante

Come liquido da esaminare, che ? l'oggetto della presente invenzione, si pu? citare qualsiasi campione purch?il liquido contenga,fosfatidilglicerina, per esempio, fluidi corporei come fluido amniotico campionato Quando il fluido amniotico ? il liquido da esaminare, ? preferibile usare il campione ottenuto dalla zona contenente fosfatidilglicerina, per esempio, si estraggono 5-6 mi di fluido amniotico liquido con 15-18 mi di cloroformio-metanolo (2:1), si raccoglie lo strato cloroformico mediante centrifugazione a 2000 giri/minuto e lo si evapora a secco sotto azoto gassoso per ottenere il lipide totale.Successivamente, dopo che questo li. pide totale si ? sciolto in una quantit? definita di soluzione al'1% di Triton X-100, si pu? fare agire una soluzione enzimatica di fosfolipasi D e, per esempio, ciascun enzima basato sul metodo per la misurazione quanti^ tativa di GK-GPO indicato sopra e altri reagenti sul lipide totale, successivamente oppure contemporaneamente. In questo caso, non esiste alcuna particolare limitazione per ci? che riguarda il rapporto di impiego del li quido da esaminare rispetto al reagente enzimatico e simili e usualmente si usano circa 0,1?3 mi del reagente enzimatico o simili per 0,01 mi ? 1mi del liquido da esaminare. Come condizione di reazione, ? preferibile effettuare la reazione a circa 37?C e, come tempo di reazione, si pu? scegliere un tempo di qualsiasi lunghezza purch? la reazione sia completamente terminata;usualmente, si fa proseguire la reazione per non meno di 5 minuti, preferibilmente per non meno di 10 minuti. Inoltre, come mezzo di reazione, si usa .acqua oppure un tampone debolmente acido fino a debolmente alca lino come solvente di ciascun reagente e simili.

Cosi,mediante la misurazione quantitativa del liquido da esaminare, si pu? misurare la fosfatidilglicerina direttamente e quantitativamen te in un tempo molto "breve e si pu? misurare una quantit? di fosfatidilgli. cerina piccola per esempio 2,0 n moli, ossia una quantit? di fosfatidilgli^ cerina di 0,03 mg/dl quando si usano 5?6 mi di liquido amniotico. Ci? significa che si pu? misurare la quantit? di fosfatidilglicerina in una con centrazione estremamente "bassa paragonabile al valore di 0,2 mg/l che ? il valore critico perch? si possa misurare l'insorgere della sindrome da carenza respiratoria. Inoltre, non ? necessaria alcuna operazione complicata e si pu? effettuare l'operazione alla temperatura ambiente.Di conse? guenza, questo ? un buon metodo per la misurazione quantitativa.

Inoltre, non esiste alcuna particolare limitazione relativa al metodo per la misurazione di ciascuna attivit? di fosfolipasi D, 0K e GPO usata negli esempi pratici riportati qui di seguito nella presente invenzio ne e si possono illustrare i seguenti metodi :

(a) Metodo per la misurazione dell'attivit? di fosfolipasi D.

A 0,1 mi di una soluzione di fosfatidiletanolamminadi rossod'uovo al 4% si aggiungono e si mescolano 0,8 mi di tampone tris?acido cloridrico 0,05 M (pH 7,5) 0,3 ml di Triton X-100 all'1%, 0,3 mi di acqua e 0,2 mi di una soluzione acquosa 10 mM di CaCl2 e si sottopone la miscela ad un trat tomento con ultrasuoni per 10 minuti. Si aggiungono alla miscela 0,2 mi di etiletere e 0,1 mi di soluzione di enzima. Si lascia reagire la miscela a 37?C per 20 minuti e si sospende la reazione mediante aggiunta di 0,3 mi di acido tricloroacetico al 20/, Si lava il liquido di reazione due volte con 4 mi di etiletere, si aggiungono 0,5 mi di tampone citrato 0,2 N (pH 5,0) a 1 mi dello strato acquoso, si aggiungono ad esso 0,1mi di soluzione acquosa al 2% di SnCl2 e 2 mi di soluzione di minidrina al 2%, si riscalda la miscela a 100?C per 15 minuti per estrarre la etanolammina, che viene la sciata sviluppare colore mediante la reazione con minidrina-e si misura la assorbenza a OD 570 m ?. L'attivit? dell?enzima che estrae un microgrammo di etanolammina per minuto ? definita come 1 unit? (U).

^ (b) Metodo per la misurazione dell'attivit? di GK.

Un millilitro della miscela di reazione, ciascuna miscela avendo una composizione indicata sopra, viene sottoposto a pre-incubazione a 37?C per 5 minuti. Si aggiungo 50 microlitri di una soluzione contenente GK (tam pone fosfato 10 mM contenente 10 mM di glicerina, opportunamente diluita a pH 7,5)? Si lascia reagire la miscela a 37?C per 10 minuti. Quindi, dopo che la reazione ? stata interrotta mediante l?aggiunta di HCl 0,1N, si misura il colore sviluppato ad una lunghezza d'onda.di 550 m e si ottiene cosi il valore dell'assorbanza (A 550 nm')? Si definisce una unit? di GK come l'attivit? per produrre 1 microinole di glicero?3-fosfato per minuto.

L'equazione per il calcolo ? la seguente:

0,05 x 10

(c) Metodo per la misurs.zione dell'attivit? di GPO.

Si introduce un millilitro della miscela di reazione avente la com posizione indicata sopra in un piccolo tubo da saggio -e si sottopone a preincubazione a 37?C per 3 minuti. Si aggiungono 20 microlitri di soluzione en zimatica e si lascia reagire la miscela per 10 minuti. Quindi, si arresta la reazione mediante aggiunta di 2,0 mi di laurilbenzensolfonato di sodio al 0,29$ (PA) e si misura il valore di assorbenza del prodotto ad una lunghezza d'onda di 5^5 m ?

Si calcola l'attivit? dell'enzima secondo la seguente equazione:

in cui indica il valore dell'assorbanza per 10 minuti ad una lunghezza d'onda di 565 nm.

Qui di seguito, si illustra la realizzazione della presente invenzione con esempi pratici. Tuttavia, la presente invenzione non ? in alcun modo limitatada essi.

Esempio 1

Prepartizione di una curva di taratura

Si ? preparata una soluzione avente la seguente composizione. (1) Soluzione contenente fosfatidilglicerina:

Si ? preparata una soluzione di fosfatidilglicerina (l,0 micromole/mi)contenente 1,0% di Triton X-100 (si ? determinata la concentrazione di fosfatidilglicerina secondo il metodo per la misurazione quantitativa del fosfato).

(3) Soluzione di enzima fosfolipasi D :

100 midiuna soluzione (pH8) costituitada 121,1mgdi Triscontenente -fosfolipasi D a 35 u/ml (0,6 mg/ml), 50,0 mg di albumina di siero di mucca, 0,5 mi di Triton X-100 al 20% e acqua.

(4) 60 mM EDTA

(5) Soluzione di MgCl240 mM,contenente 160 mM di ATP:

Si sono mescolati 1,0 mi di ATP 0,2 M, 0,10 mi di MgCl20,5 M e 0,15 mi di acqua distillata in modo da ottenere 1,25 ml della soluzione.

(6) Soluzione di enzima GK:

Tampone tris-HCl 10 mM contenente 2 mg/ml di GK (pH 8).

(7) Soluzione di enzima GP0:

Si sono preparati 10 ml di soluzione di enzima GP0 costituita da 10 mg di albumina di siero di mucca contenente 3 mg/ml di GPO, 560,75 rag di , 1,0 mi di tampone (pH 8) e 9 mi di acqua distillata

(8) Composizione del liquido indicatore contenente GPO:

A ciascuno di 0 ml ? 0,10 mi della soluzione contenente fosfatidilglicerina (PG) indicata sopra si ? aggiunto 1$ di Triton X-100 in mede che la quantit? totale fosse di 0,10 mi, A (questa miscela si sono quindi aggiunti 0,1 mi di tampone Dopo avere preriscaldato la miscela a 37?C per 5 minuti, si sono aggiunti ad essa 0,05 mi di soluzione di enzima f?sfolipasi D e si ? lasciata reagire la miscela a 37?C per 10 minuti. Dopo la reazione, si sono aggiunti 0,04 m.l di EDTA 60 mM e inoltre 0,075 mi di soluzione di 40 mM contenente ATP 160 mM e 0,03 mi di soluzi? ne di enzima GK. Si ? lasciata reagire la miscela a 37?C per 10 minuti. Dopo la reazione, si sono aggiunti 1,0 mi della composizione di indicatore liquido contenente GPO e si ? lasciata reagire questa miscela a 37?C per 20 minuti. Quindi, si ? misurataJ.'assorbanza dovuta al colore sviluppato dalla reazione ad una lunghezza d?onda di 500 nm (OD 50 I risultati sono indicati nella figura 1. Si ? ottenuta una sod disfacente tendenza ad una relazione lineareinun intervallo compreso punto di 0,005 ral di soluzione contenente PG (contenuto in PG di 5 n moli) e quello di 0,1 mi (contenuto in PG di 100 n moli).

Inoltre, da questa figura 1, si pu? pt-tenere la tendenza ad unarela zione .lineare quando il contenuto in PG supera 2 n moli e la sensibilit? ? molto netta.

Esempio 2

In 18 mi di cloroformio-metanolo (2:1) si sono sciolti 5-6 mi del fluido amniotico campionato. Si ? trattata la soluzione mediante centrifugazione a 2000 giri/minuto* Da tre strati separati si ? prelevato lo strato cloroforraico che e stato evaporato a secco sotto azoto gassoso ottenendo cos? il lipide totale. Successivamente, questo ? stato sciolto in 0,1 mi di cloroformio e la soluzione ? stata introdotta in una colonna di gel di silice (0,3 g) in cui il grasso neutro ? stato allontanato lasciando fluire 10 mi di cloroformio-metanolo (19:l) e la frazione contenente fosfatidilglicerina ? stata isolata facendo fluire 10 mi di cloroformio-metanolo (2:1), Successivamente, il solvente ? stato allontanato e il residuo ? stato sciolto in 0,1mi di Triton X?100 all'1% per prepara re il liquido da esaminare. Inoltre, si sono aggiunti 0,1 mi di tampone Ca a questo liquido da esaminare e si ? preriscaldata la miscela a 37?C per 5 minuti. Quindi, si sono aggiunti 0,05 ml di soluzione di enzima fosfolipasi D e si ? lasciata reagire la miscela a 37?C per 10 minuti. Dopo la reazione, si sono aggiunti 0,04 di EDTA 60 mM dopo di che si sono aggiunti 0,075 mi eli soluzione di MgCl240 mM contenente ATP 160 mM e 0,03 mi di soluzione di enzima GK e si ? lasciata reagire la miscela a 37?C per 10 minuti. Quindi, terminata la reazione, si sono aggiunti 1,0 mi della composizione indicatore liquida contenente GPO e si ? lasciata-reagire la miscela a 37?C per 20 minuti. Si ? misurata l'assorbanza dovuta al colore sviluppato dalla sostanza colorata prodotta dalla reazione-ad una lunghezza d'onda di 500 nm e si ? ottenuto il contenuto di PG (mg/dl) nel flujl do amniotico campionato^dalla curva di taratura, I risultati sono indicati nella figura 2, Nella figura 2, X indica caso di morte, 0 indica un caso di insorgenza della sindrome da carenza respiratoria, ? indica un caso di insorgenza di una debole sindrome da carenza respiratoria e 9 indica nessun caso di insorgenza di sindrome da carenza respiratoria.

Esempio 3

Claims

RIVENDICAZIONI

1- Procedimento per la misurazione quantitativa di fosfatidilglicerina in un liquido da esaminare che consiste nel fare reagire un enzima sulla fosfatidilglicerina per liberare la glicerina e, quindi,misurare quantitativamente la glicerina ottenuta.

2 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendicazione 1 in cui l?enzima ? un enzima che ha il ruolo di catalizzatore nella reazione per produrre glicerina e acido fosfatidico da fosfatidilglicerina e acqua.

3 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendicazione 2 in cui l?enzima che ha il ruolo di catalizzatore nella reazione per produrre glicerina e acido fosfatidico da fosfatidilglicerina e acqua ? fosfolipasi D.

4 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendica zione 1 in cui il liquido da esaminare ? un fluido corporeo, 5 - Procedimento per la misurazione quantitativa di fosfatidilglicerina in un liquido da esaminare che comprende la combinazione dei seguenti procedimenti (a), (b), (c) e (d):

(a) Liberare glicerina facendo agire fosfolipasi D su fosfatidilglicerinaf

(b) produrre glicero-3-fosfato facendo agire glicerolchinasi su glicerina in presenza di un donatore di fosfato,

(c) far reagire glicerofosfato ossidasisulglicero-3-fosfato, e quindi

(d)misurare la quantit? di ossigeno consumato o di perossido di idrogeno prodotto nella reazione,

6 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendica zione 5 in cui il donatore di fosfato ? adenosina trifosfato.

7 - Procedimento per la misurazione (quantitativa secondo la rivendica zione 5 in cui, nella misurazione quantitativa del perossido di idrogeno, l'indicatore ? una composizione che reagisce con perossido di idrogeno per produrre un prodotto che pu? venire rilevato,

8 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendicazione 7 in cui la composizione di indicatore?un prod?tto che contiene una sostanza avente una azione di perossidasi e un croniogeno.

9 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendicazione 8 in cui il cromogeno ? 4-amminoantipirina e fenolo.

10 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendicazione 8 in cui il cromogeno ? 4-amminoantipirina?e 3-metil-N~etil-Ii-(betaidrossietil )anilina.

11 - Procedimento per la misurazione quantitativa secondo la rivendicazione 9 in cui la misurazione ? costituita da una misurazione di assorbenza ad una lunghezza d'onda di circa 500 nm.

12 - Procedimento per la misurazion? quantitativa secondo la rivendicazione 10 in cui la misurazione ? costituita da?una misurazione di assor benza ad una.lunghezza d'onda di circa 550 nm.