DE2635040A1 - Reaktiv fuer die hydrolyse eines fettsaeure-glyzerinesters sowie verfahren zur analyse einer einen fettsaeure- glyzerinester enthaltenden waessrigen fluessigkeit - Google Patents

Description

28. Juli 1976 /m

HYCEL, INC., 7920 Westpark Drive, Houston, Texas 77036, (V.St.A.)

Reaktiv für die Hydrolyse eines Fettsäure-Glyzerinesters sowie Verfahren zur Analyse einer einen Fettsäure-Glyzerinester enthaltenden wässrigen Flüssigkeit

Diese Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung von Triglyzeriden in wässrigen Flüssigkeiten und insbesondere eine Verbesserung der Hydrolyse darin enthaltener Fettsäure-Glyzerinester.

Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders für die Bestimmung von Triglyzeriden im Blutserum. Bei Triglyzeriden handelt es sich um Serumlipide, die mit Plasmaproteinen konjugiert sind, um Lipoproteine zu bilden. Die Triglyzeride unterscheiden sich von anderen Lipoproteinen, die Phospholipide, Cholesterin und Cholesterinester enthalten. Die Bestimmung von Serum-Triglyzeriden ist von großer diagnostischer Bedeutung. Zum Beispiel wird angenommen, daß erhöhte Serum-Triglyzerid-Spiegel mit der Bildung atherosklerotischer Verletzungen in dem Körper zusammenhängen.

Die klassische Triglyzeridmessung erfordert den Abbau der Triglyzerid-Lipoproteine und den Erhalt von Glyzerin. Das Messen der erzeugten Glyzerinmenge sichert ein Messen des Serum-Triglyzerids. Indikator-gekoppelte Reaktionen können

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weiterhin zur Gewährleistung einer Angabe der in einer Probe enthaltenen Glyzerinmenge verwandt werden. Die klassischen Methoden der Serum-Triglyzeridbestimmung erforderten eine chemische Hydrolyse für die Saponifi- ' kation. Bei diesen Methoden wird der lipide Teil des Serums unter Verwendung organischer Lösungsmittel extrahiert und die Phospholipiden entfernt, da sie bei Saponifikation auch freies Glyzerin abgeben. Diese Extraktion mußte mit einem phospholipiden Adsorbens oder mit einem Lösungsmittelsystem durchgeführt werden, mit dem bevorzugterweise Triglyzeride extrahiert wurden. Diese beiden Methoden waren verhältnismäßig lästig und eigneten sich nicht für eine Automatisierung. In letzter Zeit sind andere Methoden für eine Triglyzerid-Bestimmung entwikkelt worden. Bei einer Methode werden Serum-Triglyzeride in einem gekoppelten Enzymsystem, in dem das sich ergebende Glyzerin durch kinetische Messung der durch Glyzerin-Dehydrogenase und Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotiä katalysierten Reaktion quantifiziert wird, hydrolysiert. Für eine andere Reaktion, bei der Triglyzeride durch alkoholische Saponifikation zu Glyzerin hydrolisiert werden, werden enzymatische Reaktionen zur Sicherstellung einer Farbenkopplung zur Glyzerinbestimmung verwandt. Diese Methoden sind in den jeweiligen Zusammenfassungen Nr. 013 und 014 auf Seite 57 des Clinical Chemistry, Band 20, Nr. 7,1974, aufgezeichnet. Das amerikanische Patent 3.703.591 auf den Namen Bucolo et al vom 21. November 1972 betrifft eine Triglyzerid-Analyse, bei der Serum-Triglyzeride sowohl durch eine Lipase als auch eine Protease hydrolisiert werden und bei der enzymatische Kopplungsreaktionen zur Sicherstellung einer spektralfotometrischen Anzeige des in dem Ultraviolettspektrum erzeugten Glyzerins verwandt werden. Bei der verwandten Lipase handelt es sich um Rhizopus Delemar, die - zu Analysenzwekken - das Triglyzerid-Lipoprotein nicht ohne die Verwen-

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dung einer Protease angreift. Das amerikanische Patent 3.759.793 auf den Namen Stork et al vom 18. September 1973 betrifft auch die enzymatische Hydrolyse von Serum-Triglyzeriden in einer ultraviolett-spektralfotometrischen·Analyse.

Während die obigen Analysen eine für die erfolgreiche Verwirklichung der Analyse erforderliche Hydrolyse produzieiten, können die Kosten für die Durchführung einer Analyse aufgrund der Ausgaben für besondere erforderliche Enzyme äußerst hoch sein. Während für die Vorbereitung von Prüfstoffen und die Durchführung einer Analyse die Verwendung des einfachen Enzyms wünschenswert ist, kann sich ein in ausreichenden Mengen zur Verwirklichung einer vollständigen Hydrolyse eingesetztes einfaches Enzym als sehr kostspielig erweisen.

Ihrer Naturgemäß hydrolisieren oder zerstören Proteasen Protein. Die hier eingesetzten Enzyme sind Proteine. Somit sind Proteasen umfassende Lipasen weniger stabil. Demzufolge ist ihre Verwendung lästiger und kostspieliger. In der Spektralfotometrie sind die ultraviolette Untersuchungen beeinflussenden absorbierenden Substanzen zahlreicher als bei optischen Untersuchungen. UV-niessende Spektralfotometer sind teurer als jene, die in optischen Spektrum eingesetzt werden können.

Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist daher die Sicherstellung - in einer Methode zur Analyse von Fettsäure-Glyzerinestern in einer wässrigen Lösung, in der die Ester hydrolisiert sind - der Verbesserung, die daraus besteht, daß eine eine Rhizopus-Arrhizus-Lipase umfassende Lipase verwandt wird, und bei der die Menge der für die Hydrolyse notwendigen Rhizopus-Arrhizus-Lipase im Vergleich zur Menge der für eine alleinige Durchführung der

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Hydrolyse notwendigen Rhizopus-Arrhizus-Lipase reduziert werden kann.

Ein spezifisches Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Sicherstellung einer verbesserten Methode und L^pase für die Hydrolyse von Triglyzerid-Lipoprotein im Blutserum, bei der die Verbesserung die Verwendung einer Lipase umfaßt, die sich aus Rhizopus-Arrhizus-Lipase und Candida-Cylindracea-Lipase zusammensetzt.

Kurz gesagt wird gemäß vorliegender Erfindung eine Lipase sichergestellt, die aus Rhizopus-Arrhizus-Lipase und Candida-Cylindracea-Lipase besteht und die für die Hydrolyse von Fettsäure-Glyzerinestern zur Hydrolyse der Ester zum Zwecke der Produktion von freiem Glyzerin und Fettsäuren verwandt wird. Das Glyzerin wird auf herkömmliche Art gemessen.

Die vorliegende Erfindung eignet sich für viele Analysenformen; sie ist jedoch hauptsächlich auf die Hydrolyse von Glyzerid-Lipoproteinen im Serum im Laufe einer Triglyzerid-Analyse gerichtet. Eine der vielen Formen, die eine Triglyzerid-Analyse annehmen kann, ist folgende:

H₂C - OCOR_{1 H c} _ _0H R,COOH

l
HC- OCOR₂ Lipase ^. H C - OH + R₂

H₂C - OCOR- H₂C - OH R₃COOH

Das Glyzerin wird mittels Adenosintriphosphat (ATP) in Gegenwart von Glyzerokinase (GK) in Glyzerol-1-Phosphat phosphoryliert:

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H₂C - OH E₂C - OPO^

H C - OH + ATP GK H C - OH + ADP

> ι

- OH H₂C - OH

Das Glyzerol-1-Phosphat wird mittels Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) zu Dihydroxyazetonphosphat dehydriert. Diese Reaktion wird durch Glyzerol-Phosphat-Dehydrogenase (GPDH) katalysiert:

H₂C - OPO₄ H₂C -

H C - OH + NAD GPDH HC-O + NADH

₄ C-O +

- OH H₂C - OH

Das NADH reduziert das Violett von Iodonitrotetrazolium (INT) auf sein farbiges Formazan, mit Phenazin-Methosulfat (PMS) als Katalysator:

NADH + INT PMS NAD + INT - Formazan

Das INT-Pormazan wird spektralfotometrisch bei 505 nm gemes sen.

Man hat herausgefunden, daß es bequemer ist, die für die vorerwähnten Reaktionen erforderlichen Anteile in ein Triglyzeridenzymreaktiv, ein Triglyzerid-Pufferreaktiv, ein Triglyzerid-INT-Reaktiv und ein Triglyzerid-Verdünnungsreaktiv aufzuteilen. Diese Reaktive können wie folgt zusammengesetzt sein:

Triglyzeridenzymreaktiv

Reaktive Bestandteile (pro Deziliter): Rhizopus-Arrhizus-Lipase (in den unter dem Abschnitt "Beispiele" besprochenen Mengen) 25.000 Einheiten Glyzerin-Phosphat-Dehydrogenase (Kaninehenmuskel)

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36O Einheiten Glyzerokinase (C. niycoderma).

Triglyzerid-Pufferreaktiv

Reaktive Bestandteile (&/V): 0,06% Magnesiumchlorid

0,13% ATP 1,31% NAD.

Candida-Cylindraeea-Lipaseeinheiten (in den im Abschnitt "Beispiele" besprochenen Mengen) Nicht reaktionsfähige Bestandteile: Phosphatpuffer

Stabilisatoren Bakteriostatische Mittel

Triglyzerid-INT-Reaktiv

Reaktive Bestandteile (G/v): 0,03$ INT

0,005% PMS

Triglyzerid-Verdünnungsreaktiv
HCl 0,1N

BEISPIELE

Die im Vorhergehenden beschriebene Analyse wurde unter Verwendung unterschiedlicher Anteile der beiden Lipasen durchgeführt. In der ersten Gruppe von Beispielen wurde die Menge der Rhizopus-Arrhizus-Lipasen auf 40 Einheiten pro Prüfung festgesetzt; eine Prüfung, bei der 50 ul pro 0,05nil menschlichen Serums analysiert wurden. "Bezugsmittel" bzw. "Bezugshoch" bezieht sich auf normale und erhöhte Bezugskontrollstandardseren mit Triglyzeridspiegeln von 140 mg/dl bzw. 5^4 mg/dl. Die folgenden Extinktionen wurden erzielt:

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BEISPIEL	Candida-Cylindracea Einheiten pro Prüfung	Extinktion Bezugsmittel Bezugshoch	0,586
I	4,2	0,171	0,645
II	8,4	0,189	0,676
III	16,8	0,197	0,673
IV	42	0,201	0,677
V	63	0,201

Auf der Grundlage einer Kurvenanpassung der vorerwähnten Daten wurde die Konzentration von Candida Cylindracea hei 22 Einheiten pro Prüfung optimiert, hei einem hevorzugten Bereich von 16 his 40 Einheiten pro Test. Dieser "bevorzugte Bereich hasiert darauf, daß eine im wesentlichen vollständige Hydrolyse hei mehr als 16 Einheiten pro Prüfung erzielt wird und daß mehr als 40 Einheiten pro Prüfung unnötig kostspielig sind.

In den folgenden Beispielen wurde das ohen heschriehene Verfahren hefolgt, und die Konzentration von Candida Cylindracea wurde auf 22 Einheiten pro Prüfung festgesetzt. In den folgenden Beispielen wurden Bezugsstandardkontrollseren, auf die als "Bezugsmittel" und "Bezugshoch" Bezug genommen wird, mit normalen und erhöhten Triglyzeridspiegeln von 140 mg/dl hzw. 564 mg/dl henutzt. Die Extinktionen waren wie folgt:

BEISPIEL RHIZOPUS-ARRHIZUS-EINHEITEN EXTINKTION

PRO PRÜFUNG BEZUGSMITTEL BEZUGSHOCH

VI 10

VII 20

VIII 38,3

IX 48,3

X 67,6

Auf der Grundlage einer Kurvenanpassung wurde die Konzentration von Rhizopus Arrhizus hei 35 Einheiten pro Prüfung op-

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0,111	0,625
0,138	0,710
0,180	0,738
0,191	0,744
0,194	0,743

timiert, bei einem bevorzugten Bereich von 30 bis 50 Einheiten pro Prüfung. Dieser Bereich basiert auf einer ausreichend vollständigen Hydrolyse am niedrigeren Ende und der Vermeidung unnötiger Kosten am hohen Ende.

Eine gewisse Beachtung ist der Bezeichnung "internationale Einheit" zu schenken, obgleich diese Beachtung gewöhnlich in den Patentdokumenten vernachlässigt wird.

Im vorliegenden Sinne wird eine internationale Einheit von Enzymaktivität durch die pro Milligramm Protein pro Minute in dem Enzym unter P_rüfungsbedingungen gebildeten Mikromole des Produkts definiert. Somit können internationale Einheiten in verschiedenen Prüfungen der gleichen Lipasemenge in Gewicht oder Volumen unterschiedlich sein. Zum Beispiel wurde eine Menge der von der Boehringer Mannheim Gesellschaft erzeugten und mit 66.000 Einheiten/Ml etikettierten Rhizopus-Arrhizus-Lipase in den Labors, in denen die obigen Prüfungen durchgeführt wurden, mit 58.000 Einheiten/ml enthaltend analysiert. Umrechnungsfaktoren, die unterschiedliche Testbedingungen wie z.B. die Gegenwart anderer Enzyme oder einen unterschiedlichen pH-Wert berücksichtigen, lassen sich leicht erstellen.

Es wird bemerkt, daß die Menge der in der vorliegenden Lipase erforderlichen Rhizopus-Arrhizus-Lipase beträchtlich geringer als die in einer nur aus Rhizopus Arrhizus bestehenden Lipase erforderlichen Menge ist. Man weiß nicht, warum dieses so ist, und die folgende Theorie kann nicht für die vorliegende Erfindung bindend sein. Man glaubt jedoch, daß die Rhizopus-Arrhizus-Lipase die Alpha- und Alpha-Primär-Stellungen des Triglyzerid-Lipoproteins und die Candida-Cylindracea-Lipase die Beta-Stellungen darauf angreift.

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Die Bezeichnung Triglyzerid wird in dieser Beschreibung in ihrem generischen Sinne in der klinischen Chemie benutzt. Mono- und Diglyzeride können auch hydrolysiert werden. T_riglyzeride bilden jedoch die vorherrschende Form von Fettsäure-Glyzeroestern im Serum. Die vorliegende Erfindung ist eine Verbesserung der Hydrolyse triglyzerider Lipoproteine. Es ist nicht beabsichtigt, die E_rfindung durch die Verwendung besonderer Farbenkopplungsreaktionsbestandteile zu begrenzen. Die Verbesserung stellt die Hydrolyse von Triglyzerid-Lipoproteinen sicher, während sie die Kosten einer Analyse durch eine Reduzierung der erforderlichen Rhizopus-Arrhizus-Lipasemenge verringert. Die erwähnten sowie andere Schriften werden jenen, die im Fach bewandert sind, dazu dienen, viele andere Ausführungsarten der vorliegenden Erfindung, die in dieser Beschreibung nicht spezifisch erwähnt worden sind, zu erdenken.

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Claims (10)

Patentansprüche

1. Reaktiv für die Hydrolyse eines Fettsäure-Glyzerinesters im Laufe einer Bestimmung des Gehalts des Esters in einer wässrigen Flüssigkeit, und eine Lipase umfassend, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipase aus einer Mischung von Rhizopus-Arrhizus-Lipase und Candida-Cylindracea-Lipase besteht.

2. Reaktiv nach Anspruch 1, zur Bestimmung des Triglyzerids im Serum, dadurch gekennzeichnet, daß 30 his 50 Rhizopus-Arrhizus-Lipaseeinheiten für die Analyse von 0,05 ml Serum vorgesehen sind.

3. Reaktiv nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß 16 bis 40 Candida-Cylindracea-Lipaseeinheiten pro 0,05 ml Serum vorgesehen sind.

4. Reaktivkombination zur Bildung eines Reaktive für

die Hydrolyse eines Fettsäure-Glyzerinesters im Laufe einer Bestimmung des Gehalts dieses Esters in einer wässrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Enzymreaktiv, das sich aus Rhizopus-Arrhizus-Lipase, Katalysatoren, Stabilisator und einem Candida-Cylindracea-Lipase enthaltenden Pufferreaktiv zusammensetzt, besteht.

5. Reaktivkombination nach Anspruch 4, zur Analyse einer Serum enthaltenden wässrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß 16 bis 40 Einheiten von Candida-Cylindracea-Lipase pro 0,05 ml des Serums vorgesehen sind.

6. Reaktivkombination nach Anspruch 4 oder 5_f dadurch gekennzeichnet, daß 30 bis 50 Einheiten von Rhizopus-Arrhizus-Lipase pro 0,05 ml des Serums vorgesehen sind.

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7. Verfahren zur Analyse einer einen Fettsäure-Glyzerinester enthaltenden wässrigen Flüssigkeit, wobei dieses Verfahren eine Hydrolyse des Esters zur Erzeugung von Glyzerin und freien Fettsäuren mit Lipase umfaßt und die Menge des erzeugten Glyzerins bestimmt, gekennzeichnet durch eine Hydrolyse des Esters mit einer aus Rhizopus-Arrhizus-Lipase und Candida-Cylindracea-Lipase bestehenden Lipase.

8. Verfahren nach Anspruch 7, zur Analyse der Serum enthaltenden wässrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß 1-6 bis 40 Einheiten von Candida-Cylindracea-Lipase pro 0,05 ml der wässrigen Flüssigkeit vorgesehen sind.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 zur Analyse einer Serum enthaltenden wässrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß 30 bis 50 Einheiten Rhizopus-Arrhizus-Lipase für 0,05 ml des Serums vorgesehen sind.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die wässrige Flüssigkeit und die Lipase 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert werden.

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