DE2512585B2

DE2512585B2 - Verfahren, testloesung und analytisches element fuer die bestimmung des gesamt-cholesteringehaltes von cholesterin und cholesterinester enthaltenden mischungen

Info

Publication number: DE2512585B2
Application number: DE19752512585
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas Rochester; Risley Hugh Arthur Ontario; Snoke Roy Eugene Webster; N.Y. Goodhue (V.StA.)
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1974-03-25
Filing date: 1975-03-21
Publication date: 1978-02-02
Also published as: US3884764A; FR2266171A1; DE2512585C3; DE2512585A1; FR2266171B1; CA1054907A; JPS50137193A; GB1498462A; JPS5631958B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von komplexen, Cholesterin und Cholesterinester enthaltenden Mischungen auf enzymatischem Wege, bei dem man eine Probe der zu analysierenden Mischung unter Hydrolyse der Cholesterinester und Oxidation des Cholesterins mit einer wäßrigen, auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 abgepufferten Testlösung enthaltend:

(a) eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität,

(b) Cholesterin-Oxidase sowie gegebenenfalls

(c) eine oberflächenaktive Verbindung

in Kontakt bringt und die Gesamtmenge des Cholesterins in der Probe durch Messung der Menge mindestens

eines enzymatischen Abbauproduktes des Cholesterins ermittelt. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Testlösung und ein analytisches Element für die quantitative Analyse des Gesamt Cholesteringehaltes komplexer Cholesterin und Cholesterinesfir enthalten- > der Mischungen.

Bei der üblichsten klinischen Bestimmungsmethode des Cholesteringehaltes des Blutes wird das »Gesamtcholesterin« bestimmt. Der bei der Bestimmungsmethode ermittelte Wert ist dabei ein Maß für das im Serum m vorhandene Cholesterin, die vorhandenen Cholesterinester sowie andere Cholesterinabkömmlinge, die auf die angewandte Testmethode ansprechen, welche auf Reaktionen des »freien Cholesterins« beruht und bei der zunächst eine Überführung der Cholesterinester in das »freie« Cholesterin erforderlich ist.

Bei einer bekannten Methode der Cholesterinbestimmung wird das Serum mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, worauf der Extrakt mit alkoholischer KOH verseift und das freigesetzte Cholesferin isoliert 2u und bestimmt wird.

Die quantitative Ermittlung des freien Cholesterins kann danach in verschiedener Weise erfolgen, beispielsweise mit einem Filter-Photometer des aus der US-PS 30 001 905 bekannten Typs. >5

Bei dem pus der US-PS 34 79 15Λ bekannten Verfahren erfolgt eine Ausfällung des extrahierten Cholesterins mit Digitonin, eine Extraktion des Niederschlages und eine Bestimmung des Digitonins.

Das aus der US-PS 35 58 516 bekannte Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin beruht auf der Verwendung einer Lösung von Ferriperchlorat, einem Esterlösungsmittel und Schwefelsäure.

Nachteilig an den genannten Verfahren ist, daß sie vergleichsweise umständlich sind und die Verwendung hoch korrosiver Chemikalien erfordern.

Aus »Methods in Enzymology«, Band 1; »Eds. Academic Press«, N. Y., 1955, Seite 678 und »Biol. Chem.«, 206, (1S54), Seite 511 ist des weiteren die teilweise Reinigung eines Enzyms aus Nocardia cholesterolicum bekannt. Dieses als »Cholesterol-Dehydrogenase« bezeichnete Enzym wurde in ausreichender Weise für die Verwendung einer Cholesterinbestimmung, aufgrund der Messung des Absorptionsanstieges einer Lösung bei 240 nm aufgrund der Bildung von Cholest-4-en-3-on gereinigt.

In der DT-OS 22 46 695 wird des weiteren eine enzymatische Bestimmung von Cholesterin unter Verwendung eines »Cholesterol-Oxidase»-Enzyms, erhalten von Nocardia-Gattungen NRRL 56 35 und 56 36 vorgeschlagen. Bei dieser Bestimmungsmethode katalysiert das Oxidase-Enzym den Abbau des freien Cholesterins zu Cholestenon und Wasserstoffperoxid. Dieser Abbau bildet die Basis für eine enzyrpatische Bestimmung des Cholesteringehaltes. Ein solches Verfahren erfordert jedoch die Verseifung von Cholesterinestern mit konzentrierter KOH zu freiem Cholesterin, das dann in Gegenwart der Cholesterinoxidase oxidiert werden kann sowie die Verwendung verschiedener Lösungen. t>o

Aus der US-PS 37 03 591 ist es ferner bekannt, eine Kombination von Lipase- und Proteaseenzymen zur Hydrolyse von Triglyceriden zu Glyzerin zu verwenden. In dieser Patentschrift finden sich Angaben darüber, daß Cholesterinester des Blutserums durch das beschriebene System von Enzymen nicht hydrolysiert werden.

Aus der DT-AS 22 24 132 ist es schließlich bereits bekannt, für die voll enzymatische Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von Cholesterin und Cholesterinester enthaltenden Mischungen ein Reagenz zu verwenden, das Cholesterinesterase, Choleslerinoxidase und eine oberflächenaktive Verbindung enthält und einen pH-Wert von 6 bis 8 aufweist.

Ein solches Reagenz eignet sich für die voll enzymatische Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von einfachen wäßrigen, nicht proteinösen Lösungen. Bei Verwendung des bekannten Reagenzes zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von komplexen Cholesterin und Cholesterinester enthaltenden Mischungen, wie beispielsweise von Blutserum, in dem die Cholesterinester in Form von Komplexen mit Plasma-Lipoproteinen gebunden sind, treten jedoch Schwierigkeiten auf. Es hat sich gezeigt, daß sich diese Ester-Lipoproteinkomplexe durch Cholesterinesterase allein nicht zufriedenstellend verseifen lassen. Infolgedessen lassen sich bei Verwendung des bekannten Reagenzes nicht ohne weiteres reproduzierbare Ergebnisse erhalten.

Aufgabe der Erfindung war es das aus der DT-AS 22 24 132 bekannte Verfahren und das bekannte Reagenz weiter zu verbessern, und zwar derart, daß auch die an Lipoproteine gebundenen Cholesterinester vollständig mit erfaßt werden.

Der Erfindung lag die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß dies durch Verwendung einer Testlösung ermöglicht wird, die zusätzlich eine Protease enthält.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von komplexen, Cholesterin und Cholesterinester enthaltenden Mischungen der eingangs beschriebenen Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Testlösung verwendet, die zusätzlich eine Protease enthält.

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren eine auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 abgepufferte Testlösung für die quantitative Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes komplexer Cholesterin und Cholesterinester enthaltender Mischungen mit:

(a) einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität,

(b) Cholesterin-Oxidase sowie gegebenenfalls

(c) einer oberflächenaktiven Verbindung,

die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zusätzlich eine Protease enthält.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein analytisches Element für die quantitative Analyse des Gesamt-Cholesteringehaltes komplexer Cholesterin und Cholesterinester enthaltender Mischungen bestehend aus einem saugfähigen Substrat, das mit dem Rückstand einer Lösung enthaltend:

(a) eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität,

(b) eine Protease,

(c) Cholesterin-Oxidase sowie gegebenenfalls

(d) eine oberflächenaktive Verbindung mit einem pH-Wert von 5,5 bis 8,5

getränkt ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren, die Testlösung und das analytische Element eignen sich in besonderer Weise zur Analyse bzw. Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes in komplexen Lösungen, wie z. B. Blutserum.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthält die wäßrige Testlösung zusätzlich ein Indikator-System für die quantitative Erfassung mindestens eines Cholesterin-Oxidationsproduktes.

Gegebenenfalls kann die Bereitung einer erfindungsgemäßen wäßrigen Test-Lösung auch ausgehend von einem trockenen Gemisch der Bestandteile erfoleen.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der wäßrigen Testlösung sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Im folgenden wird die Erfindung durch die Beschreibung allgemeiner und spezieller Beispiele sowie anhand der Zeichnungen näher erläutert. In der Zeichnung zeigt

Fig. I eine graphische Darstellung, die den Einfluß des Lösungs-pH-Wertes auf die enzymatische Cholesterin-Bestimmung gemäß der Erfindung veranschaulicht,

F i g. 2 eine Standard-Kurve für die Gesamtcholesterin-Bestimmung gemäß dem Verfahren der Erfindung und

Fig.3 ein Vergleich der Analysenergebnisse der Analyse von 20 menschlichen Blutserumproben, bestimmt mittels eines automatischen Meßgerätes (Technicon SMA 12/60) und nach dem Verfahren der Erfindung.

Die Erfindung ermöglicht somit eine Bestimmung des Gesamtcholesteringehaltes komplexer wäßriger Lösungen, beispielsweise Blutserum, auf enzymatischem Wege unter Verwendung einer einzigen Testlösung, welche bewirkt:

1. eine enzymatische Hydrolyse der vorhandenen Cholesterinester durch eine Mischung einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und einer Protease und

2. die Oxidation von freiem Cholesterin mit Cholesterin-Oxidase unter Freisetzen von Reaktionsprodukten, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid und Cholestenon, welche nach üblichen bekannten analytischen Methoden, beispielsweise photometrischen, fluorometrischen und enzymatischen Methoden quantitativ meßbar sind.

Die dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrunde liegenden chemischen Reaktionen sind in dem folgenden Reaktionsschema zusammengestellt:

(1) Cholesterin-Fettsäure-Lipoprotein-Komplex + H₂O

Protease oberflächenaktive Verbindung

Lipase mit Esterase-Aktivität

freies Cholesterin + Fettsäure

oberflächenaktive Verbindung
(2) Cholesterin + O₂ * Cholestenon + H₂O₂

Cholesterin-Oxidase

OH

HO

(3) RNH₂ +

wobei

N-R

QH₅

R=N-N-CH₃ O=I J-CH,

Die Reaktionsgleichung (1) veranschaulicht das Freisetzen von freiem Cholesterin aus Serum-Lipoproleinkomplexen des Cholesterins und von Cholesterin-Estern. Gleichung (2) veranschaulicht die Cholesterin-Oxidasc-Reaktion. Reaktion (3) schließlich veranschaulicht eines der vielen möglichen Peroxidase-Farbstoffsysteme, welche zur Bestimmung der erzeugten H2O2-Menge angewandt werden können. Im Falle des angegebenen Reaktionsschemas erfolgt eine Oxidation von 4-Aminoantipyrin und Kupplung mit 1,7-Dihydroxynaphlhalin zu einer Verbindung mit einem Absorptionsmaximum bei 490 nm. Ein solches Farbsystem beispielsweise ist durch eine hohe Empfindlichkeit, gute Stabilität und ferner dadurch ausgezeichnet, daß andere Scriimkomponcntcn nicht störend wirken.

Im Blutserum ist ungefähr 75% des Gesamtcholestcrin.s in Form von Estern mit einer Folsäure vorhanden und sowohl das freie Cholesterin als mich das veresterte Cholesterin sind normalerweise mit l'lasmalipoproicin-

fraktionen komplex gebunden. Da Cholesterin-Oxidase nicht mit Cholesterinestern reagiert, muß notwendigerweise ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes dafür sorgen, daß sämtliches Steroid in freier und meßbarer Form vorliegt.

Erfindungsgemäß erfolgt der Abbau oder die Hydrolyse der Cholesterinester mittels einer Mischung von Enzymen, und zwar einer Lipase mit Esteraseaktivität und einer Protease. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß diese Enzymkombination die Cholesterinester in hoch wirksamer Weise verseift. Eine Anzahl von Lipascn mikrobiologischer Herkunft hydrolysieren Cholesterinester bis zu einem gewissen Grad. Zur Erzielung einer maximalen Wirksamkeit der Lipase ist es jedoch erforderlich, sie gemeinsam mit einer Protease zu verwenden.

Einer der überraschendsten Aspekte der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, daß Proteasen, die gewöhnlich Proteine abbauen, aus noch unerklärlichen

Gründen die Enzyme, die selbst Proteine sind, und die in den Testlösungen vorhanden sind, nicht angreifen oder zerstören.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können die verschiedensten Lipasen verwendet werden, <-, die pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein können, jedoch eine Esterase-Aklivität aufweisen müssen.

Eine Methode zur Ermittlung, ob eine Lipasc die erforderliche Esterase-Aktivität aufweist, besteht darin, eine bestimmte Menge (12O0 Einheiten/ml) der Lipasc in einer standardisierten Cholesteryllinoleatlösung bei einem pH-Wert von 7,0 zuzugeben, das Ganze zwei Stunden lang bei 37°C unter Stickstoff zu inkubieren und darin die Estermenge zu bestimmen, die in der Lösung danach noch vorhanden ist, und zwar nach der Hydroxylamin-Bestimmungsmethode von J. Vonhoeffmayr und R. Fried, veröffentlicht in Z. Klin. Chem. U. Klin. Biochem. 8 (1970), Seite 134.

Jede Lipase, die mehr als 25 mg/100 ml des Esters in einer standardisierten Lösung mit 200 mg Cholesteryllinoleat hydrolysiert, eignet sich in vorteilhafter Weise zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung.

Als besonders geeignete Lipasen haben sich mikrobiologische Lipasen (microbial lipases) erwiesen, beispielsweise die Lipase von Candida cylindracca, und Lipasen mit entsprechender oder ähnlicher Aktivität. Geeignete Lipasen sind im Handel erhältlich, beispielsweise Weizcnkeimlipasen, z. B. solche Weizenkeimlipascn, die von der US-Firma Miles Laboratories of Elkhart, Indiana, in den Handel gebracht werden oder jo die Lipase 3000, Hersteller Wilson Laboratories, Chicago, Illinois, USA oder Steapsin (die beiden zuletzt genannten Lipasen sind pancreatische Enzyme), Hersteller Sigma Chem. Co., St. Louis, Missouri, USA und Lipase M von Candida cylindracca, Hersteller Enzyme r, Development Corp., New York, New York, USA. Das zuletzt genannte Enzym führt zu einer quantitativen Hydrolyse von Serum-Cholesterinestern bei erhöhten Konzentrationen von Serumcholesterinestern in der Größenordnung von 10 Minuten bei 50⁰C. 4u

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können des weiteren die verschiedensten Proteasen verwendet werden, beispielsweise Chymotrypsin, Streptomyccs griseus-Protease (im Handel erhältlich unter der Handelsbezeichnung »Pronase«), Proteasen von 4i Aspergillus oryzae und Bacillus subtilis, Elastase, Papain und Bromclain. Auch können Mischungen derartiger Enzyme verwendet werden.

Das durch die Einwirkung der Enzynimischung freigesetzte Cholesterin kann dann mittels des Cholcsterin-Oxidaseenzyms der Testlösung bestimmt werden, wobei bekannte Enzyme mit Cholcsterinoxidase-Aktivität, wie z.B. in der eingangs erwähnten DT-OS 22 46 695 sowie in der DT-OS 25 12 606 beschrieben, verwendet werden können. v,

Die Produkte der Cliolcsterinoxidation, nämlich Cholcstcnon und Wasserstoffperoxid, lassen sich quantitativ leicht ermitteln, und zwar entweder durch Messung der Absorption der Lösung bei 240 ηm unter Bestimmung der erzeugten Cholestciionkon/.entration oder wi durch Messung der Menge an Wasserstoffperoxid, die bei dem Cholcstcrin-Oxidationsprozcß anfällt.

Die Messung des Cholcslcnongchullcs kann dabei beispielsweise nach üblichen bekannten Methoden erfolgen. t'^r>

Die wäßrige Tcstlösung kann dafür zusätzlich zur Lipasc, Protease und Cholestcrm-Oxidase ein Farb-Indikatoi'system für die Ermittlung der Konzentration eines Produktes der Cholesterin-Oxidation enthalten. Das Farb-Indikatorsystem ist z. B. ein solches, durch das die Konzentration des bei der Oxidation entwickelten Wasserstoffperoxids festgestellt wird. Derartige H2O2-Farb-Indikatorsysteme sind bekannt.

Farb-Indikatorsysteme dieses Typs weisen in der Regel Peroxidase oder eine Peroxidase entsprechende oder ähnliche Substanz mit Pcroxidasen-Aktivilät auf sowie ein Substrat für Peroxidase, das einer Farbveränderung oder Farberzeugung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid unterliegt.

Andererseits kann das Indikatorsystem aus einer oder mehreren Substanzen bestehen, welche keiner oder keiner wesentlichen Farbänderung bei Oxidation in Gegenwart von H2O2 und Peroxidase unterliegen, welche jedoch in oxidierter Form mit einer farbbildenden Verbindung oder einer farbverändernden Substanz reagieren können, so daß eine quantitative Messung des Reaktionsablaufes möglich wird.

Schließlich ist es alternativ auch möglich, ein oder mehrere Produkte der Cholesterin-Oxidation abzutrennen und ihre Menge in einem gesonderten Arbeitsgang festzustellen.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung geeignete Peroxidasen sind Enzyme, welche eine Reaktion katalysieren, bei der Wasserstoffperoxyd eine andere Verbindung oxidiert. Die Peroxidasen bestehen im allgemeinen aus konjugierten Proteinen mit Eisenporphyrin. Peroxidasen kommen beispielsweise in Meerrettich, Kartoffeln, Feigenbaumsyrup und Rübenkraut vor (pflanzliche Peroxidasen); in der Milch (Lacto-Peroxidase) sowie in weißen Blutkörperchen (Verdo-Peroxidase). Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung können aber auch synthetische Peroxidasen verwendet werden. Geeignet sind des weiteren solche Substanzen, wie Hämin, mit Hämoglobin, Oxyhämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkalisches Hämatin, Häminderivate und andere Verbindungen, welche peroxidative oder peroxidasenähnliche Aktivität entfalten, nämlich die Fähigkeit zur Katalysierung der Oxidation einer Substanz mittels Wasserstoffperoxid und anderen Peroxiden. Die verschiedenen Peroxidasen enthalten vermutlich Hämatin.

Wesentlich ist, daß im Falle erfindungsgemäßer Testlösungen die Protease bei Durchführung des Analyseverfahrens, das in der Regel bis zu etwa 10 bis etwa 15 Minuten dauert, die Peroxidase nicht zerstört. Als Vorsichtsmaßnahmen gegen einen Proteaseabbau der anderen Komponenten der Lösung kann es jedoch vorteilhaft sein, die Lösungsbeslandteile vergleichsweise kurz vor Verwendung der Lösung zusammenzumischen oder andererseits die Protease von der Lösung fernzuhalten und diese erst kurz vor Durchführung des analytischen Bestimmungsverfahrens zuzusetzen. Da die Protease in der Lösung leicht löslich ist, bereitet der Zusatz der Protease kurz vor Verwendung der Lösung keine Schwierigkeiten.

Andere Substanzen, die selbst keine Enzyme sind, jedoch peroxidasenartige oder pcroxidasegleichc Aktivität aufweisen, sind beispielsweise Eiscnsulfocyanat. F.iscntannat, Fcrro-fcrrocyanid, C'hromisalzc, /. B. KaIiumchromisulfat, absorbiert von Kieselsäuregel und dergleichen. Diese Substanzen sind verwendbar, haben sich jedoch als nicht so vorteilhaft wie Peroxidasen erwiesen.

l'arbbiklcndc Substrate von Peroxidase und Peroxidase gleichen oder Peroxidase ähnlichen Substanzen, welche zu einer l'arbbildung in Gegenwart von

Wasserstoffperoxid und Peroxidase führen und welche erfindungsgemäß als Indikatoren verwendbar sind, sind beispielsweise:

1. Monoamine, z. B. Anilin und Anilinderivate, ortho-Toluidin, para-Toluidin und dergleichen;

2. Diamine, z. B. ortho-Phenylendiamin; N,N'-Dimethyl-para-phenylendiamin; Ν,Ν'-Diäthylphenylendiamin; Benzidin (welches zu einer blauen oder braunen Färbung führt), Dianisidin (welches zu einem grünen oder braunen Farbumschlag führt) und dergleichen;

3. Phenole, wie beispielsweise Phenol selbst (das <ui einer gelben Verfärbung führt), Thymol, ortho-, meta- und para-Kresole (die zu grünlichgelben, rosaroten bzw. milchigen Suspensionen führen), «-Naphthol (das zur Erzeugung eines purpurroten Farbtones führt), /J-Naphthol (das zur Erzeugung eines weißen Niederschlages führt) und dergleichen;

4. Polyphenole, z. B. Brenzkatechin, Guaiacol (welches zu einem orangen Farbton führt), Orcinol, Pyrogallol (das zu einem rötlichen oder gelben Farbton führt), ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl und Phloroglucinol;

5. Aromatische Säuren, z. B. Salicylsäure und 2,3-Dihydroxybenzoesäure sowie Gallussäuren;

6. Leucofarbstoffe, z. B. Leucomalachitgrün (zur Erzeugung von Malachitgrün) und Leucophenolphthalein (das vorzugsweise in einem alkalischen Medium verwendet wird);

7. Farbstoffe, wie beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol;

8. Verschiedene biologische Stoffe, z. B. die Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin (das zu einer orangerötlichen Färbung führt) und Tryptophan;

9. Andere Substanzen, wie beispielsweise Gummi guaiac, Guaiaconsäure, Kalium- und Natriumjodide sowie andere in Wasser lösliche Jodide und Bilirubin (das zu einem grünlichen Farbton führt) und

K). spezielle Farbstoffe, wie beispielsweise 2,2'-Azindi(3-äthyl-benz()-thiazolin-(6)-sulfonsäure) und 3,3'-Diaminobenzidin.

Ein lndikatorsystem, das in einer erfindungsgemäßen Testlösung vorhanden sein kann, besteht z. B. außer der Peroxidase aus einer Farbsloffkupplungskombination, d. h. einem Paar von Verbindungen, von denen eine in ihrem oxidierten Zusu.nd mit der anderen Verbindung reagiert, und /war unter Erzeugung einer quantitativ erfaßbaren Verfärbung der Lösung. Besonders geeignete farbslofferzeugcndc Kombinationen sind beispielsweise 1,7-Dihydroxynaphthalin als Kuppler und 4-Aininoantipyrin als oxidierbare Verbindung.

Andererseits kann beispielsweise als Indikator, der hei Oxidation einer Farbveränderiiiig unterliegt, in geeigneter Weise 4-Methoxy-l-naphthalin verwendet werden.

/weckinäßigerweise ist eine wäßrige eriiiulungsgemäße Testlösung auf einen pH-Wert von 6,^r> bis 7,1) abgepul'fert. Der Einfluß des pH-Wertes und der l'iil'feisiibstiiii/ wird durch F ig. I deutlich. Die graphische Darstellung der Vollständigkeit der Reaktion bei verschiedenen pH-Werten zeigt ein maximales Plateau bei pll-Werlen zwischen 6,5 und 7,0. Ein vollständiger Reaklionsahlauf kann des weiteren durch die verwendete Piiffersubslanz etwas beeinflußt werden. So wird beispielsweise bei einem pH-Wert von 7,0 mit Kaliumphosphat der maximale Wert für den Gesamteholesteringehalt erreicht. Geeignete Puffer sind lerner beispielsweise Dimethylglutarat, das HCl-SaIz von Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris-HCI) und

N-2-Hydroxyäthyl-piperizin-N'-2-äthansulfonsäure
) (HEPES). Andere geeignete Puffersubstanzen sind beispielsweise Imidazo!, Cacodylat, ferner Piperazin-N,N'-bis(2-äthansulfonsäure) (PIPES); 2-(N-Morpholino)äthansulfonsäure (MES) sowie N,N-Bis(2-hydroxyäthyl)-2-aminoäthansulfonsäure (BES).
in Zweckmäßigerweise wird die erfindungsgemäße Testlösung jedoch mit einem Phosphat-Puffer abgepuffert.

So enthält beispielsweise eine wäßrige Lösung eines Gesamtvolumens von 100 ml:

¹' etwa 2000 bis etwa 3000 Einheiten einer Lipase mit Cholesterin-Esteraseaktivität,

etwa 50 bis etwa 75 Einheiten Protease von B. subtilis und 0,5 bis etwa 1,5 Einheiten Cholesterin-Oxidase,
wobei die Lösung mit einem Phosphatpuffer, z. B. Kaliumphosphat, auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 abgepuffert ist.

Die Testlösung kann ferner eine oberflächenaktive Verbindung enthalten, vorzugsweise in Konzentrati-

_>"> onen von etwa 0,05 bis etwa 05 Gew.-%. Der Typ der oberflächenaktiven Verbindung ist nicht kritisch. Besonders geeignete oberflächenaktive Verbindungen zur Herstellung einer Testlösung sind Deoxycholat und ganz allgemein nichtionogene oberflächenaktive Ver-

Bindungen, beispielsweise Octylphenoxypolyäthanole (im Handel beispielsweise erhältlich unter der Handelsbezeichnung Triton, Hersteller Rohm & Haas Company, insbesondere Triton X-IOO), ferner (P-Nonylphenoxy)-glyzerine und Polyäthylenglykole.

r> Die angegebenen Einheiten von Lipase-, Protease und Peroxidase-Enzymen sind dabei wie folgt definiert:

I Einheit Lipase entspricht der Enzymmenge, die 1 μ-Mol Fettsäure pro Minute aus einer Triglyzeridmischung, z. B. Olivenöl, bei einem pH-Wert von 7,0 bei 37" C erzeugt.

1 Einheit Protease entspricht der Enzymmenge, welche Casein unter Erzeugung eines Farbäquivalentes entsprechend 1 μ-Mol Tyrosin pro Minute bei einem pH-Wert von 7,5 bei 37"C hydrolysiert.
⁴' I Einheit Peroxidase entspricht der Enzymmenge, die I μ-Mol Peroxid in einer Minute bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37"C oxidiert.

Enthält die Testlösung zusätzlich Farbindikatoren

ίο oder farbbildendc Komponenten, z. B. des beschriebenen Typs, so enthält die Lösung zweckmäßigerweise Peroxidase in einer Konzentration von etwa 3 bis etwa 6 Einheiten pro ml Lösung, ^überzeugende Komponenten in einer solchen Konzentration, daß genügend

r, oxidierbare Verbindung erzeugt wird, sowie gegebenenfalls Farbkuppler in solcher Konzentralion, daß eine l'aibsioffbildung möglich ist.

Die /eilspanne, die für die Durchführung einer Analyse benötigt wird, kann verschieden sein, und hängt

wi von der Konzentration an freiem und veresierlem Cholesterin in der Probe ab. Ganz allgemein jedoch hat sich gezeigt, daß die Zeildauer einer Bestimmung, d. h. die Zeitdauer, die sich die /\\ untersuchende Probe mit der Testlösung in Koniakt befindet, mindestens IO

μ Minuten beansprucht.

Die Kontaktdauer zwischen der zu untersuchenden Probe und der Lösung vor Durchführung der eigentlichen Bestimmung wird des weiteren etwas von der

angewandten Temperatur beeinflußt. Bei Anwendung erhöhter Temperaturen, von beispielsweise 60 bis 70⁰C, sowie unter sorgfältig gesteuerten Druckbedingungen, welche die Verdampfung des Wasserstoffperoxides inhibieren, kann die Bestimmung jedoch auch in einer kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden. Vorzugsweise werden Probe und Testlösung bei einer Temperatur von 25 bis 50°C miteinander in Kontakt gebracht.

Die zur Herstellung einer erfindungsgemäßen wäßriger Testlösung benötigten Bestandteile, d. h. die Enzyme und andere Bestandteile, können in fester Form abgepackt und verwendet werden. Dies bedeutet, daß sogenannte trockene Ansätze für die Bereitung einer erfindungsgemäßen wäßrigen Testlösung verwendet werden können, welche lyophilisierte Lipase, Protease, Cholesterin-Oxidase und gegebenenfalls eine oberflächenaktive Verbindung enthalten, sowie eine Puffersubstanz in solchen Verhältnissen, daß derartige trockene Ansätze nur noch in einer vorbestimmten Wassermenge gelöst zu werden brauchen, um eine erfindungsgemäße Testlösung zu liefern. Derartige trockene Ansätze können des weiteren gegebenenfalls lyophilisierte Peroxidase und/oder die trockenen Komponenten des Indikatorsystems in geeigneten Verhältnissen enthalten.

Soll eine Testlösung unter Verwendung von Deoxycholat hergestellt werden, d. h. einer besonders geeigneten oberflächenaktiven Verbindung, so empfiehlt es sich, die übrigen trockenen Komponenten des trockenen Ansatzes, ohne die oberflächenaktive Verbindung abzupacken, da lediglich die Salze von Deoxycholat im Normalzustand feste Verbindungen sind. Bei der Herstellung einer Testlösung mit Deoxycholat als oberflächenaktiver Verbindung empfiehlt es sich daher, die oberflächenaktive Verbindung zum Zeitpunkt der von Zusammenmischung der trockenen Komponenten mit J5 dem Wasser zuzusetzen. Gegebenenfalls kann auch zu diesem Zeitpunkt erst die Puffersubstanz zugesetzt werden.

Wie bereits dargelegt, ist überraschend, daß bei einer erfindungsgemäßen Testlösung die Protease die anderen proteinösen Komponenten der Mischung im Verlaufe der Bestimmung nicht zerstört. Insbesondere ist kein wesentlicher Effekt der Protease bei Lösungen erkennbar, welche in der Kälte aufbewahrt wurden, beispielsweise bei 0 bis 5°C, z. B. nach 8 Stunden. Als zweckmäßig hat es sich daher erwiesen, die Lösungen nach ihrer Herstellung im Kalten aufzubewahren oder aber die Komponenten bis kurz vor ihrer Verwendung im trockenen Zustand aufzubewahren, um die Erzielung optimaler Ergebnisse zu gewährleisten.

Kommt es nicht auf optimale Ergebnisse an, sondern vielmehr nur auf qualitative Daten, so ist es auch möglich, die wäßrige Testlösung durch Aufsaugen in ein poröses oder saugfähiges Substrat einzuführen, beispielsweise ein Filterpapier, so daß nach dem Trocknen y, desselben ein imprägniertes analytisches Element erhalten wird, welches zur Durchführung qualitativer und gegebenenfalls halb quantitativer analytischer Bestimmungsmethoden geeignet ist.

Die folgenden speziellen Beispiele sollen die Erfin- w) dung noch näher erläutern.

Beispiel 1

Es wurde eine abgepufferte Tcstlösung hergestellt aus: b^r)

2400 Einheiten Lipase M (Hefelipasc, Hersteller Enzyme Development Corp.),
66 Einheiten Protease aus B. subtilis,

406 Einheiten Peroxidase (aus Meerrettich),
0,65 Einheiten Cholesterin-Oxidase,
3,4 ml Triton X-100 (verwendet in Form einer 10gew.-%igen Lösung von oberflächenaktiver Verbindung in mg zu Volumen Wasser in ml,
40 μ-Mole 4-Aminoantipyrin,
22 μ-Mole, 1,7-Dihydroxy-naphthaIin und
96 ml 50-mM-Phosphatpuffer,
pH-Wert = 7,0.

Die Lösung wurde verwendet, um den effektiven Bereich der Bestimmungsmethode aufzuzeigen.

Wie sich aus F i g. 2 ergibt, wurden lineare Ergebnisse mit der Standard-Testlösung (Validate) mit 8,5 bis 340,0 μg Cholesterin erhalten. Die Reaktionsdauer nahm dabei mit der Konzentration des Cholesterins in der Standardlösung zu, jedoch war die Reaktion der 170μg Cholesterin enthaltenden Probe innerhalb von 15 Minuten beendet.

Beispiel 2

Menschliches Blutserum, das auf seinen Gesamtcholesteringehalt mittels eines automatischen Analysiergerätes vom Typ Technicon SMA 12/60 Auto Analyzer untersucht worden war, wurde zur Bestimmung des Cholesteringehaltes nach der enzymatischen Methode der Erfindung verwendet. Dazu wurde eine Testlösung der in Beispiel 1 beschriebenen Zusammensetzung verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig.3 dargestellt. Aus Fig.3 ergibt sich eine ausgezeichnete Übereinstimmung der Cholesteringehalte, die nach den beiden verschiedenen Methoden ermittelt wurden. Eine statistische Analyse dieser Daten ergibt einen Correlationskoeffizienten von 0,987 und eine lineare Regression

y= 0,957 χ+2,9.

Beispiel 3

Um die Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens zu veranschaulichen, wurden drei Seren lOmal nach der in Beispiel 1 angegebenen Methode analysiert. Die Ergebnisse diersr Analysen sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Tabelle

Ergebnisse von Mehrfachbestimmungen

mit 3 Serumproben

	Serumprobe	Nr.	3
	1	2
mg/dl			273
	121	211	234
	176	227	227
	206	241	230
	H6	261	208
	170	269	208
	168	247	282
	176	258	287
	190	240	216
	192	237	299
	168		246
Mittelwert, mg/dl	171	243	35
Standard-Abweichung,	20	18
mg/dl			14
Koeffizient der	11	7
Veränderung in %

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes von komplexen. Cholesterin und Cholesterinester enthaltenden Mischungen auf enzymatischem Wege, bei dem man eine Probe der zu analysierenden Mischung unter Hydrolyse der Cholesterinester und Oxidation des Cholesterins mit einer wäßrigen, auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 abgepufferten Testlösung enthaltend:

(a) eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität,

(b) Cholesterin-Oxidase sowie gegebenenfalls

(c) eine oberflächenaktive Verbindung

in Kontakt bringt und die Gesamtmenge des Cholesterins in der Probe durch Messung der Menge mindestens eines enzymatischen Abbauproduktes des Cholesterins ermittelt, dauurch gekennzeichnet, daß man eine Testlösung verwendet, die zusätzlich eine Protease enthält.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe der zu analysierenden Mischung mindestens 10 Minuten bei einer Temperatur von 25 bis 50° C mit der Restlösung in Kontakt bringt.

3. Wäßrige, auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 abgepufferte Testlösung für die quantitative Bestimmung des Gesamt-Cholesteringehaltes komplexer Cholesterin und Cholesterinester enthaltender Mischungen mit

(a) einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität,

(b) Cholesterin-Oxidase sowie gegebenenfalls

(c) einer oberflächenaktiven Verbindung,
dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich eine Protease enthält.

4. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 abgepuffert ist.

5. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung enthält.

6. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lipase verwendet wird, von welcher 50 mg mindestens etwa 25 mg/100 ml des Cholesteryllinoleates hydrolysieren, das in 5 ml einer Standardlösung enthaltend 200 mg Cholesteryllinoleat, 5 ml Äthyläther, 100 ml Wassei und 430 mg Natriumcholat, abgepuffert auf einen pH-Wert von 7,0 mit einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung während einer Inkubationsdauer von zwei Stunden bei 37°C unter Stickstoff enthalten ist.

7. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine von Mikroorganismen stammende Lipase enthält.

8. Wäßrige Testlösung nach einem der Ansprüche 3, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Weizenkeimlipase, eine pancreatische Lipase oder die Lipase von Candida cyclindracca verwendet.

9. Wäßrige Testlösung nach einem der Ansprüche

3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipase in Konzentrationen von 10 bis 50 Einheiten pro ml Lösung verwendet.

10. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Cholesterin-Oxidase in einer Konzentration von 0,002 bis 0,05 Einheiten pro b5 ml Lösung enthält.

11. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Protease in einer Konzentration von 0,5 bis 2,0 Einheiten pro ml enthält.

12. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Protease Chymotrypsin, Papain, Bromelain, Streptomyces griseus-Protease, Elastase, Bacillus subtilis-Protease oder Aspergillus oryzae-Protease enthält.

13. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Phosphat-Puffer abgepuffert ist.

14. Wäßrige Testlösung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Kaliumphosphat-Puffer abgepuffert ist.

15. Wäßrige Testlösung nach einem der Ansprüche 3 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Indikatorsystem für die quantitative Erfassung mindestens eines Cholesterin-Oxidationsproduktes enthält.

16. Wäßrige Testlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie enthält:

(a) 10 bis 50 Einheiten einer Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität pro ml;

(b) 0,5 bis 2,0 Einheiten einer Protease pro ml;

(c) 0,002 bis 0,5 Einheiten einer Cholesterin-Oxidase pro ml sowie

(d) gegebenenfalls 0,05 bis 0,5 Gew-% einer oberflächenaktiven Verbindung und daß

(e) die Lösung auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 dbgepuffert ist.

17. Trockenes Gemisch für die Bereitung einer wäßrigen Testlösung nach einem der Ansprüche 3 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

(a) eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität,

(b) eine Protease,

(c) Cholesterin-Oxidase sowie gegebenenfalls

(d) eine oberflächenaktive Verbindung und/oder eine Puffersubstanz und/oder ein Indikatorsystem.

18. Analytisches Element für die quantitative Analyse des Gesamt-Cholesteringehaltes komplexer Cholesterin und Cholesterinester enthaltender Mischungen, bestehend aus einem saugfähigen Substrat, das mit dem Rückstand einer Lösung enthaltend:

(a) eine Lipase mit Cholesterin-Esterase Aktivität,

(b) eine Protease,

(c) Cholesterin-Oxidase sowie gegebenenfalls

(d) eine oberflächenaktive Verbindung und/oder eine Puffersubstanz und/oder ein Indikatorsystem

getränkt ist.