CN107058461B - 一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法 - Google Patents

一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107058461B
CN107058461B CN201710220038.3A CN201710220038A CN107058461B CN 107058461 B CN107058461 B CN 107058461B CN 201710220038 A CN201710220038 A CN 201710220038A CN 107058461 B CN107058461 B CN 107058461B
Authority
CN
China
Prior art keywords
powder
lipase
grease
activity
substrate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710220038.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107058461A (zh
Inventor
彭必雨
罗凤香
张旭
黄偲
张春晓
高蒙初
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Publication of CN107058461A publication Critical patent/CN107058461A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107058461B publication Critical patent/CN107058461B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明提供了一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价的方法。该方法以动物皮为原料，制备富含油脂的皮粉底物；在水介质中，脂肪酶与皮粉吸附的油脂接触，催化皮粉内的油脂水解生成脂肪酸，在一定条件下反应后，同时用盐和酸终止酶反应，并使浴液中的脂肪酸盐转变成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附。用溶剂完全抽提皮粉中生成的脂肪酸，通过测定单位时间脂肪酸的产生量来对脂肪酶活力及性能进行表征。该方法可以在较宽pH范围测定脂肪酶的活力及对脂肪酶性能进行评价，所用底物和反应条件与动物皮处理过程中脂肪酶对皮内油脂作用的条件相近，测定结果对以动物皮为原料的制革、制裘、制胶和胶原提取等脂肪酶应用领域中的脂肪酶的选择和应用条件的优化更具有指导意义。

Description

一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价 方法
技术领域
本发明涉及脂肪酶活力的检测及性能评价方法，具体涉及富含油脂皮粉底物的制备方法和以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力检测和性能评价方法。
背景技术
油脂是动物皮的成分之一，猪皮和绵羊皮中的油脂含量高达10%-30%，而且，随着动物饲养条件的变化，动物皮中的油脂含量有增加的趋势。
以动物皮为原料的制革、制裘、制胶和胶原提取等工业过程中，动物皮中的油脂对处理过程和产品的质量有明显的负面影响，因此，在这些产品的生产、加工过程中需要除去动物皮内的油脂。动物皮脱脂的主要方法有溶剂法、皂化法、乳化法和酶法等。由于在动物皮处理加工过程中，考虑到胶原蛋白对酸、碱和高温等的耐受性，常用的化学脱脂的条件比较温和，皂化法的脱脂效果较差，溶剂脱脂和大量表面活性剂的使用会造成安全和污染问题，因此，酶法脱脂受到更大的关注。
动物皮的酶脱脂法主要选用脂肪酶，在较温和的条件下，酶催化皮内油脂水解而达到去除效果，因此，了解脂肪酶在动物皮处理条件下对皮内油脂催化水解性能至关重要。
已报道的脂肪酶活力检测和性能评价的方法较多，使用的底物主要有三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄榄油，也有用乙酸对硝基苯酚酯和辛酸对硝基苯酚酯作为底物，其中，橄榄油是最常用的底物（如国标GB/T 23535-2009）。由于油脂与水不互溶，因此，通常用聚乙烯醇对油脂进行乳化，以改善底物的均匀性。反应结束后，通过测定脂肪酸的生成量来计算酶活力。测定反应体系中脂肪酸量的方法主要有滴定法和比色法。滴定法是直接在反应混合液中或将脂肪酸萃取出来后，通过碱滴定测定脂肪酸的量；比色法是用铜离子与脂肪酸显色，用分光光度法测定其含量。
上述的脂肪酶活力检测和性能评价方法中，选用的底物与动物皮中存在的油脂成分的种类和结构有较大的差别，检测的结果与脂肪酶对动物皮油脂的实际作用效果有一定的差异。以橄榄油或其他油脂类乳液作为底物，油脂在乳液中的分布及乳液粒子大小等受乳化方式、时间和乳化方法等因素的影响，这直接影响油脂与脂肪酶的接触程度，导致酶活力测定结果的稳定性较差。脂肪酶催化油脂水解的反应主要是油脂界面反应，乳液粒子表面包裹的表面活性剂和产物脂肪酸在油滴表面的富集会阻碍酶和油脂分子的接触，对酶的催化效率有负面影响。在乳液体系中直接进行碱滴定测定脂肪酸的量，反应体系的缓冲性会导致测定值的偏差，而且该方法不适合在碱性反应条件下脂肪酶活力的测定。用溶剂对乳液体系中的脂肪酸萃取后进行测定，由于溶剂的萃取效率的原因，存在测定结果偏低的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种脂肪酶活力测定和性能评价方法。本发明的基本特点是以富含油脂的皮粉为底物，测定结果对以动物皮为原料的制革、制裘、制胶和胶原提取等脂肪酶应用领域中的脂肪酶的选择和应用条件的优化更具有实际的指导意义。
本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为质量份数。
（1）富含油脂皮粉底物的制备
方法1：取油脂含量高的动物皮100份，充分水洗后，放入转鼓或振荡器中，加入100-500份水，在15-30℃下转动或振荡60-240min后，浸泡或间隙转动3-12h。换水，加50-100份水和蛋白酶进行脱毛，脱毛液中蛋白酶的酶活力为50-250U/mL，20-30℃下间歇转动3-24h，毛完全松动并去除后，将皮充分水洗，再经溶剂脱水-自然干燥或冷冻干燥后，剪成小块，并用粉碎机粉碎、过50-150目筛，得到油脂含量为5%-40%的皮粉底物。
在上述技术方案中，动物皮为油脂含量高的动物皮，油脂含量大于5%，如猪皮、绵羊皮和牛皮等，包括新鲜皮、盐腌或冷冻保存的皮等。
在上述技术方案中，脱毛用蛋白酶为来自于动、植物和/或微生物的蛋白酶中的至少一种，不含脂肪酶，脱毛液中蛋白酶的酶活力为50-250U/mL。
在上述技术方案中，制备过程中不使用酸、碱和表面活性剂，避免皮内油脂的水解和损失。
在上述技术方案中，皮块粉碎之前的溶剂法脱水中采用的溶剂为乙醇和丙酮中的至少一种。
在上述技术方案中，制备的富含油脂皮粉的细度为50-150目，油脂含量为5%-40%。
方法2：取按常规制革工艺制备的动物皮的二层（中间层）碱皮100份，按常规工艺脱灰后，放入转鼓或振荡器中，20-35℃下，加入30-100份水和0.5-2.0份脱钙剂，转动30-120min，对皮进行脱钙处理，将脱钙后的二层皮充分水洗，再经溶剂脱水-自然干燥或冷冻干燥后，剪成小块，并用粉碎机粉碎、过50-150目筛，得到皮粉；80-85℃下，以二氯甲烷为溶剂，抽提4-6h，得到完全脱脂皮粉；向脱脂皮粉中加入皮粉质量的10%-50%的油脂或油脂和脂肪酸的混合物，混合均匀后，将吸附油脂的皮粉充分水洗后晾干，再研磨，过50-150目筛，得到油脂含量为5%-40%的皮粉底物。
在上述技术方案中，原料为按常规制革工艺制备的各种动物皮的二层（中间层）碱皮。
在上述技术方案中，碱皮的脱灰采用常规的制革脱灰方法，如硫酸铵、氯化铵和商用脱灰剂脱灰。
在上述技术方案中，脱钙剂为EDTA钠盐、柠檬酸钠、乳酸钠中的至少一种。
在上述技术方案中，皮块粉碎之前的溶剂法脱水中采用的溶剂为乙醇和丙酮中的至少一种。
在上述技术方案中，脱脂皮粉吸附油脂和脂肪酸的混合物中的油脂为动、植物油脂，如猪油、牛油、绵羊油、菜籽油、橄榄油、棕榈油等中的至少一种；脂肪酸为8碳以上的脂肪酸，如油酸、棕榈酸、硬脂酸等的至少一种；油脂和脂肪酸以任意比例混合。制备的底物用于评价脂肪酶对不同油脂的作用性能及不同脂肪酸的种类和含量对脂肪酶作用的影响。
在上述技术方案中，制备的富含油脂皮粉的细度为50-150目，油脂含量为5%-40%。
（2）脂肪酶活力的测定和性能评价方法
包括以下步骤
步骤1：准确称取制备的富含油脂皮粉底物3-5g，加入烧杯或三角瓶中，加入皮粉质量20倍的缓冲液，放入振荡器中，在20-30℃下振荡浸水1-5h，至皮粉完全润湿。
步骤2：将待测脂肪酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，并稀释至适当的倍数。将已完全润湿的皮粉底物和酶溶液在恒温振荡器中预热至设定的温度，取待测酶溶液1mL，振荡下加入底物浴液中，酶的加入量为底物浴液中脂肪酶活力浓度为5-10U/mL。在设定温度下振荡反应一定时间后，立即加入的适量氯化钠或其他中性盐、0-10mL的6mol/mL盐酸或其他相当酸度的酸溶液，使反应浴液中盐的浓度达到6%（w/v）以上，pH至2.0以下，继续震荡5min，终止酶反应，并使浴液中的脂肪酸盐转变成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附。
步骤3：用滤布过滤出反应液中的皮粉，将皮粉收集，自然晾干或在真空烘箱内干燥（40-50℃）。再次用粉碎机将干燥后的皮粉打散。准确称量2-4g干燥后皮粉，在索氏抽提器中， 80-85℃下，以二氯甲烷为溶剂，回流4-6h，抽提皮粉中的油脂。蒸干抽提瓶中的二氯甲烷溶剂后，向抽提瓶中加入预先中和过的中性乙醚-95%乙醇混合溶剂（2:1，v/v），溶解抽提物，再加入2~3滴酚酞指示剂，然后用KOH标准溶液进行滴定，测定出皮粉内油脂抽提物中脂肪酸的量。
步骤4：空白对照样：在步骤2中用相同体积的缓冲液代替酶溶液，称取的皮粉质量和酶反应实验的量一致，其他操作相同。
步骤5：脂肪酶活力的计算：
脂肪酶活力定义：1g固体酶，一定条件下（一定的温度和pH值），水解脂肪每分钟产生1μmol脂肪酸，即为1个活力单位，以u/g表示。
脂肪酶活力计算公式：
X = (V-V0) ×C×W1×n×1000/( W2×t)
式中：
X—样品的酶活力，u/g；
V—滴定样品时消耗的KOH标准溶液的体积，mL；
V0—滴定空白时消耗的KOH标准溶液的体积，mL；
C—KOH标准溶液浓度，mol/L
W1—称取的富含油脂皮粉底物的质量，g；
W2—酶处理后抽提皮粉的质量，g；
n—酶样品的稀释倍数；
t—反应时间，min；
1000—mmol转化为μmol的系数。
在上述技术方案中，用富含油脂的皮粉作为底物，反应介质为缓冲剂的水溶液，不含乳化剂，脂肪酶直接与皮粉内吸附的油脂接触、反应。
在上述技术方案中，使用的缓冲液为根据脂肪酶活力测定和性能评价的需要，选择为pH值在2-13之间的任何pH值的任何缓冲液。
在上述技术方案中，反应液中脂肪酶的加入量为使反应浴液中脂肪酶的活力浓度达到5-10U/mL。
在上述技术方案中，根据脂肪酶活力测定和性能评价的需要，反应温度为5-60℃之间的任何温度。
在上述技术方案中，根据脂肪酶活力测定和性能评价的需要，反应时间为20-120min。
在上述技术方案中，终止酶反应，并使浴液中的脂肪酸盐转变成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附中使用的中性盐为氯化钠或硫酸钠中的一种，盐的加入量为使浴液中盐的浓度达到6%（w/v）以上；使用的酸为盐酸、硫酸、甲酸、乙酸或三氯乙酸中的至少一种，使用量为调节浴液pH值在2以下。
在上述技术方案中，酶反应后，将皮粉中的油脂和脂肪酸用二氯甲烷完全抽提，并用中性乙醚-95%乙醇混合溶剂（2:1，v/v）溶解抽提物，然后用KOH标准溶液进行滴定，测定出皮粉内油脂抽提物中脂肪酸的产生量。
本发明优点的如下。
（1）以富含油脂的皮粉为底物，底物中的油脂成分和动物皮中的成分一致，反应条件与动物皮处理过程中脂肪酶对皮内油脂作用的条件相近，测定结果对以动物皮为原料的制革、制裘、制胶和胶原提取等脂肪酶应用领域中的脂肪酶的选择和应用条件的优化具有指导意义。
（2）底物的针对性强。按底物制备方法1，由不同种类动物皮制备的富含油脂皮粉底物用于以相应种类的动物皮为原料的制革、制裘、制胶和胶原提取等脂肪酶应用领域中的脂肪酶活力测定和性能的评价；按底物制备方法2，吸附不同种类油脂或油脂和脂肪酸混合物的皮粉底物用于评价脂肪酶对不同油脂的作用性能及不同脂肪酸的种类和含量对脂肪酶作用的影响。
（3）采用油脂分布均匀的皮粉为底物，反应介质为缓冲剂的水溶液，不含乳化剂，脂肪酶直接与皮粉内吸附的油脂接触、反应，克服了以乳化橄榄油等为底物的脂肪酶催化油脂水解反应中，乳化剂、乳液粒子大小及均匀性等对酶与油脂分子有效接触的影响，结果更准确。
（4）适合的测定pH值范围更广，能在pH2-13范围内对脂肪酶的活力进行测定和性能评价。
（5）酶反应结束后，用中性盐和酸终止酶反应，并使浴液中的脂肪酸盐（碱性条件下反应）转变成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附；对生成的脂肪酸完全抽提后，再测定其量，克服了在反应液中直接滴定存在偏差的问题，保证了结果的准确性。
附图说明
图1是三种脂肪酶活力-pH曲线1（皮粉底物，40℃）。
图2是三种脂肪酶-pH活力曲线2 （乳化橄榄油底物，40℃）。
图3油脂中脂肪酸的含量对脂肪酶活力的影响（皮粉底物，pH7.5，40℃）。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
实施例1：脂肪酶活力的测定
（1）底物的制备（方法1）
取猪盐湿皮颈部皮块100g，放入转鼓中，加入水300g，常温下转20分钟，排水，重复3次。再加入水300g，5℃下转动120分钟后，间歇转动，每1h转动5min，共12小时，排水。重新加入水100g，1398蛋白酶（活力50000u/g）0.3g，在28℃下转动120分钟后，间歇转动，每30min转动5min，共24小时，毛完全松动、脱落后排水。再加入水300g，常温下转20分钟，排水，重复3次。取出脱毛后的猪皮，在-10℃下冷冻24小时，再放入冷冻干燥机中至完全干燥。将冻干后的猪皮剪成2×2cm大小的小皮块，并用粉碎机粉碎，过50和150目筛，得到富含油脂的皮粉底物。随机称取4份3g左右皮粉，用二氯甲烷抽提油脂，测定皮粉中的油脂含量、酸值及皂化值，结果见表1。
表1 猪皮皮粉底物的基本参数
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1可以看出，制备的猪皮皮中油脂含量为23.67%，皮粉中的油脂含量和主要指标的均匀性好，可确保实验结果的可重复性。
（2）脂肪酶活力测定（pH7.5）
（I）试剂准备
磷酸盐缓冲液：用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制pH 7.5，浓度为0.05mol/mL的缓冲液。
酶液：用缓冲液将脂肪酶溶解并稀释至适当的倍数。
KOH-乙醇标准溶液：按国标法GB/T601-2002中4.24进行配制。
（II）测定过程
准确称取猪制备的猪皮皮粉约5.00g于250mL锥形瓶中，加入pH7.5的磷酸盐缓冲液100mL，放入水浴振荡器中，在温度40℃下振荡2h，皮粉完全润湿，同时将待测酶溶液在相同温度下预热5min。精确吸取待测酶溶液1.00mL加入皮粉浴液中，并在40℃下振荡反应30min后，立即加入10g NaCl和5mL浓度为 6mol/mL的HCl溶液，浴液pH快速调至2.0以下，继续振荡5min，用滤布过滤，将皮粉收集，在真空烘箱内完全干燥（40-50℃）。
准确称量完全干燥后的酶处理皮粉约3.00g，在索氏抽提器中，80-85℃下，以二氯甲烷为溶剂，回流4-6h，抽提皮粉中的油脂。蒸干抽提瓶中的二氯甲烷溶剂后，向抽提瓶中加入预先中和过的中性乙醚-95%乙醇混合溶剂（2:1，v/v），溶解抽提物，再加入2~3滴酚酞指示剂，然后用KOH标准溶液进行滴定至微红，记录消耗的KOH标准溶液体积。
（III）空白实验
在步骤（2）中用相同体积的缓冲液替代待测酶溶液，称取的皮粉质量和酶反应实验的量一致，其他操作相同。
（IV）酶活力的计算
脂肪酶活力定义：1g固体酶，一定条件下（一定的温度和pH值）水解脂肪，每分钟产生1μmol脂肪酸，即为1个活力单位，以u/g表示。
脂肪酶活力计算公式：
X = (V-V0) ×C×W1×n×1000/( W2×t)
把称取的富含油脂皮粉底物的质量，酶处理后抽提皮粉的质量，酶样品的稀释倍数和反应时间等数值代入上述公式，得到脂肪酶的活力值。
（V）测定结果
三种商业脂肪酶的活力测定结果见表2。脂肪酶LKT 来自山东隆科特酶制剂有限公司，脂肪酶MG来自诺维信生物有限公司，脂肪酶YN来自云南爱科特酶制剂有限公司。
表2 三种商业脂肪酶的活力测定结果(u/g，pH7.5，40℃)
Figure 144833DEST_PATH_IMAGE002
由表2可以看出，两种方法测定的脂肪酶活力的结果有一定的差异，用本发明方法，酶催化反应中酶和底物的接触性更好，产物脂肪酸的量测定更准确，因此测得的结果比国标法高，与制革过程中脂肪酶的实际作用效果更接近，而且精度更高。
实施例2： pH值对脂肪酶活力的影响
底物的制备同实施例1中底物的制备。
制备不同pH值的系列缓冲溶液。测定过程中，只是加入的缓冲溶液不同，其他操作和实施例1中的操作相同。
根据三种商业脂肪酶在不同pH值下测定的酶活力值，绘制pH值-酶相对活力曲线见图1。按国标法，以乳化橄榄油为底物的测定结果见图2。
比较图1和图2可以看出，本发明的方法对三种脂肪酶的pH-活力影响的评价结果与国标法相比有较大的差异，特别是用本发明方法评价，发现脂肪酶MG和LKT有两个活力峰，即在pH10左右，出现了第二个高活力峰，与实际的应用情况相吻合，而国标法的评价结果显示，三种脂肪酶在pH10-11几乎不显示活力。因此，本发明方法的评价结果更具实际意义。
实施例3：脂肪酸的浓度对脂肪酶活力的影响
（I）底物的制备（方法2）
取按常规制革工艺制备的黄牛皮二层（中间层）碱皮500g，按常规工艺脱灰后，放入转鼓，20-35℃下，加入250g水和1.5g EDTA二钠（脱钙剂），转动60min，对皮进行脱钙处理，将脱钙后的二层皮充分水洗，滴干皮表面水，再用1000g乙醇浸泡24h，重复3次后，自然晾干。剪成小块，并用粉碎机粉碎、过50-150目筛，得到皮粉；80-85℃下，以二氯甲烷为溶剂，抽提6h，得到完全脱脂皮粉。
称取脱脂皮粉20g，加入2.5g 以不同比例混合的橄榄油和油酸的混合物，混合均匀后，将吸附油脂的皮粉放入三角瓶中，加入200g水，30℃下振荡30min，倒掉水，重复水洗5次，充分水洗后晾干，再研磨，过50-150目筛，得到含量油脂和脂肪酸的系列皮粉底物。
称取3g左右皮粉，用用二氯甲烷抽提油脂，测定皮粉油脂中脂肪酸的量，结果见表3。
表3 制备的系列皮粉底物中的油酸的量
Figure DEST_PATH_IMAGE003
以表3中的6种制备的皮粉为底物，测定过程中，只是皮粉不同，其他操作和实施例1中的操作相同。
根据三种商业脂肪酶在不同pH值下测定的酶活力值，绘制油脂中脂肪酸含量-酶相对活力曲线见图3。
图3表明，本发明方法能对脂肪酸对脂肪酶作用的产物抑制性能进行有效的表征，测定的结果表明，当油脂中的脂肪酸的量达到500μmol/g时，脂肪酶的作用明显受到抑制，三种酶中脂肪酸对MG酶的抑制作用更大，测定的结果和实际应用情况一致。

Claims (9)

1.一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，所述方法包括以下的富含油脂皮粉底物的制备方法1或方法2，以及利用所述方法制备而成的底物进行脂肪酶活力的测定及性能评价方法；所用材料按照质量份计；
（1）富含油脂皮粉底物的制备：
方法1：取动物皮100份，充分水洗后，放入转鼓或振荡器中，加入100-500份水，在15-30℃下转动或振荡60-240min后，浸泡或间隙转动3-12h；换水，加50-100份水和蛋白酶进行脱毛，脱毛液中蛋白酶的酶活力为50-250U/mL，20-30℃下间歇转动3-24h，毛完全松动并去除后，将皮充分水洗，再经溶剂脱水-自然干燥或冷冻干燥后，剪成小块，并用粉碎机粉碎、过50-150目筛，得到油脂含量为5%-40%的皮粉底物；
方法2：取按常规制革工艺制备的动物皮的二层碱皮100份，按常规工艺脱灰后，放入转鼓或振荡器中，20-35℃下，加入30-100份水和0 .5-2 .0份脱钙剂，脱钙剂为EDTA钠盐、柠檬酸钠、乳酸钠中的至少一种，转动30-120min，对皮进行脱钙处理，将脱钙后的二层皮充分水洗，再经溶剂脱水-自然干燥或冷冻干燥后，剪成小块，并用粉碎机粉碎、过50-150目筛，得到皮粉；在索氏抽提器中， 80-85℃下，以二氯甲烷为溶剂，抽提4-6h，抽提出皮粉中的油脂，得到完全脱脂皮粉；向脱脂皮粉中加入皮粉质量的10%-50%的油脂或油脂和脂肪酸的混合物，混合均匀后，将吸附油脂的皮粉充分水洗后晾干，再研磨，过50-150目筛，得到油脂含量为5%-40%的皮粉底物；
（2）脂肪酶活力的测定和性能评价方法，包括以下步骤：
步骤1：准确称取制备的富含油脂皮粉底物3-5g，加入烧杯或三角瓶中，加入皮粉质量20倍的缓冲液，放入振荡器中，20-30℃下振荡1-5h，至皮粉完全润湿；
步骤2：将待测脂肪酶的样品用相应的缓冲溶液溶解，并稀释至适当的倍数；将已完全润湿的皮粉底物和酶溶液在恒温振荡器中预热至设定的温度，取待测酶溶液1mL，振荡下加入底物浴液中，酶的加入量为底物浴液中脂肪酶活力浓度为5-10U/mL；在设定温度下振荡反应，加入氯化钠或其他中性盐、0-10mL的6mol/mL盐酸或其他相当酸度的酸溶液，使反应浴液中盐的浓度达到6%，w/v以上，pH至2 .0以下，继续震荡5min，终止酶反应；
步骤3：用滤布过滤出反应液中的皮粉，将皮粉收集，自然晾干或在真空烘箱内干燥，再次用粉碎机将干燥后的皮粉打散；准确称量2-4g干燥后的皮粉，在索氏抽提器中，80-85℃下，以二氯甲烷为溶剂，抽提皮粉中的油脂4-6h；蒸干抽提瓶中的二氯甲烷溶剂后，向抽提瓶中加入预先中和过的中性乙醚-95%乙醇混合溶剂，溶解抽提物，再加入2-3滴酚酞指示剂，然后用KOH标准溶液进行滴定，准确记录消耗的KOH标准溶液体积；
步骤4：空白对照样：在步骤2中用相同体积的缓冲液代替酶溶液，称取的皮粉质量和酶反应实验的量一致，其他操作相同；
步骤5：脂肪酶活力的计算：
脂肪酶活力定义：1g固体酶，一定条件下水解脂肪，每分钟产生1μmol脂肪酸，即为1个活力单位，以u/g表示；
脂肪酶活力计算公式：
X = (V-V0) ×C×W1×n×1000/( W2×t)
式中：
X—样品的酶活力，u/g；
V—滴定样品时消耗的KOH标准溶液的体积，mL；
V0—滴定空白时消耗的KOH标准溶液的体积，mL；
C—KOH标准溶液浓度，mol/L
W1—称取的富含油脂皮粉底物的质量，g；
W2—酶处理后抽提皮粉的质量，g；
n—酶样品的稀释倍数；
t—反应时间，min；
1000—mmol转化为μmol的系数。
2.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，以动物皮为原料的皮粉底物制备过程中，采用蛋白酶脱毛方法，蛋白酶制剂中不含脂肪酶，为来自于动、植物和/或微生物的蛋白酶中的至少一种；制备过程中不使用酸、碱和表面活性剂。
3.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，脱脂皮粉吸附油脂和脂肪酸的混合物中的油脂为动物油脂和/或植物油脂；脂肪酸为8碳以上的脂肪酸。
4.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，皮块粉碎之前的脱水采用溶剂脱水或冷冻干燥的方法；溶剂脱水中采用的溶剂为乙醇和丙酮中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，使用的缓冲液为pH值在2-13之间的任何pH值的任何缓冲液。
6.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，反应液中脂肪酶活力浓度为5-10U/mL。
7.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，反应温度为5-60℃。
8.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，反应时间为20-120min。
9.根据权利要求1所述的以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法，其特征在于，同时加入中性盐和酸终止酶反应；使用的中性盐为氯化钠、氯化钾或硫酸钠中的一种；使用的酸为盐酸、硫酸、甲酸、乙酸或三氯乙酸中的至少一种。
CN201710220038.3A 2016-12-06 2017-04-06 一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法 Active CN107058461B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2016111112014 2016-12-06
CN201611111201 2016-12-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107058461A CN107058461A (zh) 2017-08-18
CN107058461B true CN107058461B (zh) 2020-12-22

Family

ID=59602177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710220038.3A Active CN107058461B (zh) 2016-12-06 2017-04-06 一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107058461B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108845133B (zh) * 2018-03-27 2021-12-14 四川大学 一种蛋白酶对铬鞣胶原蛋白纤维的催化水解性能评价方法
CN109381490A (zh) * 2018-11-29 2019-02-26 四川金岁方药业有限公司 一种刺猬皮粉及其制备方法
CN111172233B (zh) * 2020-02-07 2023-04-11 四川大学 一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法
CN114032623B (zh) * 2022-01-10 2022-03-29 天新福（北京）医疗器材股份有限公司 一种高产率胶原海绵的制备工艺

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3884764A (en) * 1974-03-25 1975-05-20 Eastman Kodak Co Method and composition for blood serum cholesterol analysis

Also Published As

Publication number Publication date
CN107058461A (zh) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107058461B (zh) 一种以富含油脂皮粉为底物的脂肪酶活力测定和性能评价方法
CN109650946B (zh) 一种利用废弃羽毛生产氨基酸液肥的生物制方法
Ozgunay et al. Characterization of Leather Industry Wastes.
CN103981247B (zh) 一种角蛋白的制备方法
CN104711379A (zh) 一种用于消除牛皮皮革粒面伤害的酶脱毛方法
CN102229973A (zh) 油松花粉小肽的提取方法
CN112457781A (zh) 采用酶解提取制革废弃皮屑中明胶的方法
CN105603133A (zh) 一种原料皮脱毛方法
CN102703619B (zh) 一种节能环保型的水貂皮鞣制方法
CN107455549A (zh) 一种表面活性剂辅助酶法提取豆渣中蛋白的方法
Girelli et al. Use of lipase immobilized on celluse support for cleaning aged oil layers
CN105418802A (zh) 一种利用有机酸结合蛋白酶从虾头虾壳中提取甲壳素的方法
CN109797258B (zh) 牛皮皮革的加工工艺及其用于牛皮的脱脂剂
CN103235079B (zh) 一种畜禽表皮中松香酸含量的分析方法
CN103789462A (zh) 制革用复合酶浸水剂
CN102134618A (zh) 一种不含硫化物残留的牛皮皮革及其低温酶脱毛制造工艺
CN105087733A (zh) 一种鳗鱼头生产高不饱和脂肪酸鱼油的方法
CN101103125A (zh) 对用于鞣革的生毛皮进行调理的产品、生毛皮调理方法和之后的鞣革方法
CN102864197B (zh) 一种利用对虾加工下脚料生产低分子量胶原蛋白肽的方法
CN103875999A (zh) 棉籽饼粕的膨化脱毒方法
CN112724243A (zh) 一种利用腌制原皮生产牛皮明胶的方法
CN111172233B (zh) 一种以含蛋白多糖复合物皮粉为底物的糖苷酶活力测定和性能评价方法
CN106222325A (zh) 一种制革中酶脱毛循环利用工艺
CN108912244A (zh) 从蟹壳中一步脱钙、脱蛋白、脱脂肪提取甲壳素的方法
CN108887588A (zh) 一种利用酶法制备羊骨粉的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant