CN102864197B

CN102864197B - 一种利用对虾加工下脚料生产低分子量胶原蛋白肽的方法

Info

Publication number: CN102864197B
Application number: CN201210307372.XA
Authority: CN
Inventors: 曹敏杰; 阮密密; 蔡秋凤
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2012-08-27
Filing date: 2012-08-27
Publication date: 2015-02-11
Anticipated expiration: 2032-08-27
Also published as: CN102864197A

Abstract

本发明涉及一种利用对虾加工下脚料生产低分子量胶原蛋白肽的方法。该方法包括：制备粗酶：将虾头经过处理后获得粗酶；制备粗胶原蛋白：从动物皮中获得粗胶原蛋白；酶解：将粗胶原蛋白与粗酶混合后进行酶解得到酶解液；酶解后处理：去除酶解液中的杂质和酶解不完全的蛋白质，得到酶解后的胶原蛋白肽溶液；还可以包括除去酶解后的胶原蛋白肽溶液中的水分的步骤。本发明充分利用了对虾加工下脚料，减轻了环境污染，简化了酶解过程，提高了对虾的附加值，降低生产成本。生产的低分子量胶原蛋白肽分子量在1000Da以下，可用于食品添加剂或化妆品使用。

Description

一种利用对虾加工下脚料生产低分子量胶原蛋白肽的方法

技术领域

本发明涉及一种胶原蛋白肽生产领域，更具体地，本发明涉及一种利用对虾加工下脚料生产低分子量胶原蛋白肽的方法。

背景技术

胶原蛋白是由三条多肽链组成的三股螺旋，相对分子量约为300 kDa。胶原蛋白肽是将动物胶原蛋白经蛋白酶水解后制成的，分子量小于10 kDa。胶原蛋白肽具有较高的消化吸收性，在机体中可促进骨骼的形成、增强低钙水平下骨胶原结构、提高骨强度，达到预防骨质疏松症的作用。特别是由于皮肤中胶原蛋白占70 %，胶原蛋白在皮肤美容方面具有特殊的功效。近年来，胶原蛋白肽在生物医药、食品、化妆品等领域得到了广泛的利用，其产业正在不断发展壮大。传统的胶原蛋白肽生产方法是以动物（猪、牛、鱼）皮或骨骼为原料，经酸碱处理、加热制成胶原蛋白。进一步通过添加商业酶（如胶原酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合酶、风味酶）等处理，分解胶原蛋白大分子制备胶原蛋白小肽。

由于传统的胶原蛋白小肽制备方法通常采用两种以上蛋白酶的酶解工艺，酶解温度在50 °C左右。为了提高酶解效果，需调整不同酶的工作pH值，生产工艺复杂、周期长，加上商业酶价格上涨，使胶原蛋白肽的生产成本不断增加。

据中国渔业年鉴报道，2010年，我国对虾产量达到83万吨，其中，南美白对虾（凡纳滨对虾）产量达61万吨。在对虾加工过程中，虾头作为去头冻对虾加工的废弃物约占整虾重量的20 %～30 %。这些下脚料一部分是经过简单的回收用于甲壳素生产或者作为动物饲料，或被丢弃，这不仅造成资源浪费，而且污染环境。实际上，虾头中含有丰富的蛋白酶，如能合理利用，可达到变废为宝的效果。

所以，利用虾头蛋白酶生产胶原蛋白肽方法的开发与利用具有现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶解时间短、能耗低的胶原蛋白肽生产方法。

为实现上述目的，提供以下具体技术方案：

生产低分子量胶原蛋白肽的方法，包括如下步骤：

制备粗酶：将虾头经过处理后获得粗酶；具体为将虾头中的消化腺取出，加入1：4 体积比的冰水混合后用组织捣碎机捣碎，经过滤、离心除杂质、活性炭脱色后获得粗酶；所述离心的转速可以为3000-5000 rpm；或直接取虾头，以1:2重量体积比W/V加冰水混合后用组织捣碎机捣碎，经过滤、离心除杂质、活性炭脱色后获得粗酶。

任选地，所述的粗酶也可经部分纯化或完全纯化。

任选地，所述虾头可以是新鲜虾头；也可以是冻存的虾头；

任选地，所述虾头可以是含有消化酶的任何虾头，可以包括南美白对虾、中国对虾、斑节对虾、墨吉对虾、日本对虾、刀额新对虾的虾头等等；

制备粗胶原蛋白：从动物皮中获得粗胶原蛋白；具体为将经酸碱预处理的动物皮加入缓冲液中，用组织捣碎机充分捣碎，获得粗胶原蛋白；

任选地，所述动物皮比较广泛，可以是猪皮、牛皮、鱼皮；

任选地，所述动物皮是经过处理的动物皮；具体为经过酸碱处理的动物皮；优选为用3倍体积的含1 % H₂0₂的0.05 mol/L NaOH浸泡12 h，用清水漂洗至中性，再加3倍体积的0.05 mol/L HCl浸泡2 h；

用1 mol/L NaOH将粗胶原溶液pH调节至8.0；

酶解：将粗胶原蛋白与粗酶混合后进行酶解得到酶解液；所述酶解步骤为将胶原蛋白与粗酶混合后在20-40 °C下酶解6-10 h；

任选地，所述胶原蛋白与粗酶以100:1-25:1体积比混合。

酶解后处理：去除酶解液中的杂质和酶解不完全的蛋白质，得到酶解后的胶原蛋白肽溶液。所述酶解后处理中去除酶解液中的杂质和酶解不完全的蛋白质的方法采用的是传统的方法。比如用绢布和或离心过滤方法，用绢布过滤去除杂质和残渣、离心过滤去除酶解不完全的蛋白质和其他杂质。

本发明的技术方案还可以包括除去酶解后的胶原蛋白肽溶液中的水分步骤的方法。可以采用纳滤膜方法浓缩和或喷雾干燥方法即可得到液态或粉状小分子胶原蛋白肽成品。

本发明技术方案所制得的粗酶可直接使用或添加5 %海藻糖后冷冻于-18 °C以下冰箱保存备用。

本发明还保护根据上述方法所得到的胶原蛋白肽。

本发明还保护根据上述方法所得到的胶原蛋白肽的用途。

由于来源于对虾消化腺的酶种类多、活力高，本发明制备的胶原蛋白肽分子量在1000 Da以下。

虾头中的消化酶不仅对蛋白质有很强的降解能力，即使在10 °C的低温条件下还有最适酶活性的60 %，而且耐盐性也比较好。此外，酶的最适温度低，还可以在较低的工作温度下制备低分子量胶原蛋白肽。

本发明实施例利用粗提的来源于虾头的消化酶可有效降解罗非鱼的胶原蛋白，制得的胶原蛋白肽分子量集中在1000 Da以下，能够获得品质优良的胶原蛋白小肽制品，可用于食品添加剂或化妆品使用，满足市场需求。

对虾消化腺中含丰富的酶类（如丝氨酸蛋白酶、氨肽酶等），且在低温下有高活力。由于本发明利用虾头消化酶对胶原蛋白质进行水解，在弱碱性（pH 7.0-9.0）和较低温度（20-40 °C）下酶解，不仅可以使胶原蛋白水解生成小分子肽，避免在酸性pH条件下酶解导致的不锈钢容器中重金属的溶出，还可以有效降低能耗。在酶解过程中，大分子量胶原蛋白在内切酶和外切酶的联合作用下不断分解生成小分子肽和游离氨基酸，会促使酶解液pH逐渐呈酸性，因此，需在pH 7.0-9.0的反应体系中进行反应。本发明不需要两种以上商业酶的酶解工艺，工艺流程简单。酶解温度在20-40 °C，能耗低。产品分子量在1000 Da以下。因此，本发明具有以下优点：

1、本发明充分利用对虾加工下脚料虾头中的消化腺，一方面可以减少对虾加工过程产生的下脚料对环境污染，另一方面可以提高对虾的附加值，降低了生产成本。

2、本发明只利用对虾消化腺酶，而传统酶解方法需要2种以上商业酶，因此简化了酶解工艺过程。

3、本方法采用了低温（20-40 °C）酶解方法，较传统的酶解温度（50 °C）低，有效降低了能耗，符合节能减排的理念，而且低温还可以提高胶原蛋白的酶解速度，保证产品质量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽的高效液相色谱（HPLC）分析图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明进行解释。需要说明的是，下列实施例仅仅是说明性的，并不以任何方式限制本发明。另外，下列实施例中所采用的所有仪器、材料等均为市售可得的，如在下列实施例中没有明确指出的操作，可以通过本领域技术人员常规的操作方法进行。

实施例1

1、粗酶的制备：取新鲜的南美白对虾（凡纳滨对虾）虾头1.5 kg置于冰上，收集消化腺得180 g，加入720 mL冰冷蒸馏水，进行组织捣碎，经绢布过滤、4000 rpm离心除杂质、活性炭脱色后获得粗酶 650 mL；

2、酶解：取100 g新鲜鱼皮，用300 mL 0.05 mol/L NaOH(含1 % H₂O₂)浸泡12 h，清水漂洗至中性，沥干水，再加300 mL 0.05 mol/L HCl浸泡2 h，制得350 g酸碱处理后的鱼皮粗胶原蛋白，37 °C水浴放置1 h后，用组织捣碎机充分破碎，加入8.7 mL 1 mol/L NaOH，将pH调制7.96，加入上述制备的粗酶 5 mL，37 °C下反应8 h，反应过程中每30 min搅拌一次；

3、酶解后处理：将酶解液经5000 rpm离心，双层绢布过滤，除去残渣，得到小分子量胶原蛋白肽溶液，利用高效液相色谱检测胶原肽的分子量分布。反应结束后，胶原蛋白被分解为小分子量的肽段，分子量集中分布在1000 Da以下。

实施例2

1、粗酶的制备：取新鲜的南美白对虾（凡纳滨对虾）虾头2 kg置于冰上，收集消化腺得250 g，加入1000 mL冰冷的自来水，组织捣碎机捣碎后经绢布过滤、5000 rpm离心除杂质、活性炭脱色后获得粗酶900 mL；

2、酶解：取143 g鱼皮，用429 mL 0.05 mol/L NaOH(含1 % H₂O₂)浸泡12 h，清水漂洗至中性，沥干水，再加429 mL 0.05 mol/L HCl浸泡2 h，制得500 g酸碱处理后的鱼皮胶原蛋白，加入12.5 mL 1 mol/L NaOH，37 °C水浴放置1 h后，进行组织捣碎，此时溶液粘度较小，且不透明，pH为7.92。加入20 mL上述制备的粗酶，在37 °C下反应7 h，反应过程中每30 min搅拌一次，反应停止后反应体系上层有少量漂浮物，溶液呈半透明状态；

3、酶解后处理：将酶解液经双层绢布过滤、5000 rpm离心，除去残渣，得到的即为小分子量胶原蛋白肽的溶液，测定胶原肽的分子量分布。

实施例3

1、粗酶的制备：取-20 °C冻存约15天的南美白对虾（凡纳滨对虾）虾头500 g，室温解冻后加入1000 mL冰冷的蒸馏水，组织捣碎机捣碎、经绢布过滤、5000 rpm离心除杂质、活性炭脱色后获得粗酶约 900 mL；

2、酶解：取冷冻罗非鱼皮，室温解冻后称取858 g，用2574 mL 0.05 mol/L NaOH(含1 % H₂O₂)浸泡12 h，清水漂洗至中性，沥干水，再加2574 mL 0.05 mol/L HCl浸泡2 h，制得酸碱处理后的罗非鱼皮粗胶原蛋白3 kg并直接加入10 L酶解罐中。调节酶解罐温度为37 °C，放置2 h后胶原蛋白呈粘度较低的液体状。加入1 mol /L NaOH调pH至8.0，加入上述制备的粗酶液40 mL，充分搅拌均匀并在该温度下继续反应8 h，反应过程中持续搅拌，使酶解反应均匀而迅速；

3、酶解后处理：将酶解后的胶原蛋白经绢布过滤去渣、用纳滤膜去除水分，喷雾干燥后即得到小分子胶原蛋白肽，测定胶原肽的分子量分布。

实施例4

1、粗酶的制备：取新鲜的南美白对虾（凡纳滨对虾）虾头1 kg，加入1 kg碎冰，搅拌均匀后用绞肉机绞碎，再加入1000 mL冰水搅拌均匀，经双层绢布过滤除杂质、活性炭脱色后获得粗酶 1800 mL；

2、酶解：取1144 g鱼皮，用3432 mL 0.05 mol/L NaOH(含1 % H₂O₂)浸泡12 h，清水漂洗至中性，沥干水，再加3432 mL 0.05 mol/L HCl浸泡2 h，制得酸碱处理后的罗非鱼皮胶原蛋白4 kg并直接加入10 L酶解罐中，调节酶解罐温度为37 °C，加入1 mol/L NaOH调pH至8.0，2 h后胶原蛋白呈粘度较小的液体状，加入上述制备的粗酶液100 mL，充分搅拌均匀并在该温度下继续反应8 h，反应过程中持续搅拌，使酶解反应均匀而迅速；

3、酶解后处理：将酶解后的胶原蛋白经绢布过滤去渣、用纳滤膜去除水分，喷雾干燥后即得到小分子胶原蛋白肽。对制备的胶原蛋白肽的分子量进行了测定，结果如图1所示，酶解后的胶原肽分子量集中在1000 Da以下，其中分子量在500-180 Da之间的肽段占到56.41 %。罗非鱼胶原蛋白肽的分子量分布及所占比例如表1，制得的胶原蛋白小肽分子量集中在1000 Da以下。

表1罗非鱼胶原蛋白肽的分子量分布及所占比例

分子量范围（Da）	峰面积百分比（%，λ220nm）	数均分子量	重均分子量
				>10000	3.30	16204	17116
10000～5000	0.70	7451	7725
				5000～2000	0.41	3056	3276
2000～1000	0.59	1269	1330
				1000～500	4.42	633	660
500～180	56.41	234	246

综上所述，利用粗提的来源于虾头的消化酶可有效降解罗非鱼的胶原蛋白，制得的胶原蛋白肽分子量集中在180-500 Da，能够获得品质优良的胶原蛋白小肽制品，满足市场需求。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种利用对虾加工下脚料生产低分子量胶原蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备粗酶：将虾头经过处理后获得粗酶；

制备粗胶原蛋白：从动物皮中获得粗胶原蛋白；

酶解：将粗胶原蛋白与粗酶混合后进行酶解得到酶解液；

酶解后处理：去除酶解液中的杂质和酶解不完全的蛋白质，得到酶解后的胶原蛋白肽溶液；

所述制备粗酶的步骤为，将虾头中的消化腺取出，加入1：4重量体积比W/V的冰水混合后用组织捣碎机捣碎，经过滤、离心除杂质、活性炭脱色后获得粗酶；或直接取虾头，以1:2重量体积比W/V加冰水混合后用组织捣碎机捣碎，经过滤、离心除杂质、活性炭脱色后获得粗酶；

所述制备粗胶原蛋白的步骤为将猪皮、牛皮或鱼皮用3倍体积的含1 % H₂0₂的0.05 mol/L NaOH浸泡12 h，用清水漂洗至中性，再加3倍体积的0.05 mol/L HCl浸泡2 h，用组织捣碎机充分捣碎，用1 mol/L NaOH将粗胶原溶液pH调节至8.0；获得粗胶原蛋白；

所述酶解步骤为将粗胶原蛋白与粗酶混合后在20-40 °C下酶解6-10 h；所述酶解步骤中所述胶原蛋白与粗酶以100:1-25:1体积比混合；

所述酶解后处理中去除酶解液中的杂质和酶解不完全的蛋白质的方法为用绢布和或离心过滤方法。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，还可以包括除去酶解后的胶原蛋白肽溶液中的水分的步骤。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于，所述除去酶解后的胶原蛋白肽溶液中的水分采用的是用纳滤膜方法和或喷雾干燥方法。

4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述制备粗酶的步骤中所述的粗酶也可经部分纯化或完全纯化；所述离心的转速为3000-5000 rpm；

所述虾头是新鲜虾头或冻存的虾头。

5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述虾头包括南美白对虾、中国对虾、斑节对虾、墨吉对虾、日本对虾、刀额新对虾的虾头。

6.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述制得的粗酶可直接使用或添加5 %海藻糖后冷冻于-18 °C以下冰箱保存备用。

7.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述制得的粗酶可直接使用或添加5 %海藻糖后冷冻于-18 °C以下冰箱保存备用。