CN103981247B

CN103981247B - 一种角蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN103981247B
Application number: CN201410241950.3A
Authority: CN
Inventors: 张春晖; 李侠; 贾伟; 王春青
Original assignee: Institute of Food Science and Technology of CAAS
Current assignee: Beijing Zhongnong taste detection technology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2034-06-03
Also published as: CN103981247A

Abstract

本发明公开了一种角蛋白的制备方法，包括如下步骤：步骤一，将含有角蛋白的原料投入到第一水溶液中碱解，并进行固液分离得到第一角蛋白固体；步骤二，将第一角蛋白固体投入到第二水溶液中，加入适量复合蛋白酶在温度48～52℃、pH8.0～9.0下进行酶解4～5h，然后灭活复合蛋白酶，再然后加入适量角蛋白酶进行在温度35～40℃下酶解2.5～3.5h，最后进行固液分离得到第二角蛋白固体；步骤三，先将第二角蛋白固体使用氧化剂进行避光氧化3.5～4.5h，然后进行固液分离得到第三角蛋白固体；步骤四，将第三角蛋白固体干燥至其含水量在5％～8％以下，干燥后的第三角蛋白固体即为所需制备的角蛋白。

Description

一种角蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种角蛋白的制备方法。

背景技术

动物的蹄角含有丰富的蛋白质(约含80％～85％)和钙、磷等矿物质，但是其中的角蛋白来源于外胚层分化，属于一种纤维性的硬蛋白，由于含有独特的性质，是一种潜在的蛋白质资源，但是角蛋白含有较多的双硫键，不易溶解，因此未能充分开发利用；同时我国畜牧业发展较快，每年猪、羊的产量居世界前列，其蹄角产量在百万吨以上，通常作为废弃物被扔掉，不仅造成资源的浪费，同时破坏了环境。

发明内容

本发明的目的之一是为制备角蛋白提供一种新的方法；

本发明的又一目的是提供一种角蛋白。

本发明提供的技术方案为：

一种角蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，碱解：先将含有角蛋白的原料投入到pH12.5～13.5的第一水溶液中碱解2～2.5h，然后进行固液分离得到第一角蛋白固体，这里碱解的作用是使原料溶胀、溶解，并能初步打开二硫键；

步骤二，酶解：先将所述第一角蛋白固体投入到第二水溶液中，加入重量为所述第一角蛋白固体0.3％～0.6％的复合蛋白酶进行第一步酶解，所述第一步酶解在温度48～52℃、pH8.0～9.0、和转速60～70rpm下进行4～5h，第一步酶解用于初步溶解处第一角蛋白固体中的蛋白然后灭活所述复合蛋白酶，再然后加入重量为所述第一角蛋白固体1.3％～3.0％的角蛋白酶进行第二步酶解，所述第二步酶解在温度35～40℃和转速60～70rpm下进行2.5～3.5h，最后静置20～25min，这里第二步酶解中角蛋白酶的用量、温度和作用时间保证了其可将角蛋白二硫键打开而又不将其降解为多肽，进行所述固液分离得到第二角蛋白固体；

步骤三，氧化：先将所述第二角蛋白固体使用氧化剂进行避光氧化3.5～4.5h，然后进行所述固液分离得到第三角蛋白固体；氧化的作用是将打开的二硫键氧化成磺酸基，进行避光氧化可防止二硫键的二次氧化，同时，可防止过氧化氢的分解，提高氧化效率；

步骤四，干燥：将所述第三角蛋白固体进行干燥至其含水量在5％～8％以下，干燥后的第三角蛋白固体即为所需制备的角蛋白。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，所述固液分离的方法为使用150～100目的尼龙网过滤分离得到筛上物不溶于水的角蛋白固体，并使用清水冲洗角蛋白固体至其呈中性。这里的角蛋白固体指的是第一、第二、或第三角蛋白固体中的任意一种，使用固液分离的方法可以得到上述第一、第二、或第三角蛋白。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，还包括如下步骤：所述含有角蛋白的原料在所述碱解之前被预处理，所述预处理的步骤包括：首先将所述含有角蛋白的原料投入到重量为其2～4倍的第三水溶液中，在pH12.5～13.5和温度90～100℃下处理1.5～2h，然后排除所述第三水溶液，除去骨塞，使用清水清洗1～3次，再然后将所述含有角蛋白的原料在温度60～70℃下烘2～4h，最后将烘干后的所述含有角蛋白的原料破碎为粒径为0.180mm～0.425mm的颗粒。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，所述氧化中首先将所述第二角蛋白固体投入到重量为其2～4倍的第四水溶液中，然后调节所述第四水溶液pH至10～10.5，再然后加入体积占所述氧化中液体总体积的0.9％～1.2％的过氧化氢氧化剂，并搅拌均匀进行避光氧化，最后进行所述固液分离得到所述第三角蛋白固体。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，当需要调节溶液的pH＞7时，所述第一水溶液、所述第二水溶液、和所述第三水溶液均使用质量体积浓度为5％～7.5％的NaOH溶液调节，而所述第四水溶液使用质量体积浓度为30％Na₂CO₃调节。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，所述干燥步骤包括：先将所述第三角蛋白固体进行抽滤，然后进行蒸汽干燥，最后进行真空干燥，所述抽滤中的压力为-0.08～-0.10Mpa，每次抽滤20～25min后加入20kg纯化水继续抽滤，如此循环所述抽滤2～3次，抽滤可起到除去第三角蛋白固体中可能残存的水溶性试剂或可溶性杂蛋白等杂质的作用，同时抽滤可除去第三角蛋白固体中很大一部分水分；所述蒸汽干燥在温度85～95℃、蒸汽流速15～20kg/h下进行2.5～4h；所述真空干燥在温度为60～90℃和真空压力为0.02～0.08Mpa下进行，所述真空干燥时间以所述含水量而定。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，所述蒸汽干燥和所述真空干燥在多功能干燥器中完成。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，所述第一水溶液的重量为所述含有角蛋白的原料的2～4倍，所述第二水溶液的重量为所述第一角蛋白固体的3～9倍。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，所述酶解中灭活所述复合蛋白酶的方法为使用强酸调节所述第二水溶液的pH至1.5～2.5。

优选的是，所述的角蛋白的制备方法中，所述含有角蛋白的原料为羊角或猪蹄甲。

本发明的有益效果为：

本发明通过碱解、两步酶解和氧化步骤相结合的方法，提高了角蛋白的提取率，依照本发明的角蛋白的提取率在75％以上；

依照本发明的方法使用了两步酶解法，缩短了角蛋白的提取时间，同时提取到的角蛋白的稳定性较好；

依照本发明的方法使用废弃的羊角或猪蹄甲作为原料，实现了资源的再利用，减轻了环境污染，是一个前景广阔的环保措施，提高经济效益和生态效益；

依照本发明的方法制备的角蛋白可用于动物饲料添加剂、新的生物材料制备等多种用途中；

本发明为制备角蛋白提供一种新型方法，有效利用资源的同时保护了环境，产生较大的经济效益和生态效益。

附图说明

图1为本发明所述的角蛋白的制备方法的流程图；

图2为本发明所述的角蛋白中的氨基酸种类及其含量；

图3为通过本发明的方法制备的角蛋白样品的SDS-PAGE凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明中所用的复合蛋白酶购买白北京索莱宝科技有限公司，产品货号为：C8800；如无特别说明，其他试剂也均为通过商业途径可以购买到的常用试剂。

实施例1：

如图1所示，制备角蛋白的方法，包括如下步骤：

1)将清洗干净的羊角原料，投入反应罐中，添加重量为羊角的重量3倍的饮用水，使用质量体积浓度为5％的NaOH溶液调节至pH13.0，在100℃下煮沸2h后，排除碱液，用清水清洗3次，除去骨塞并于65℃下烘3h后粉碎，粉碎步骤中先采用粗碎机将羊角物料粉碎为粒径为6～10mm的颗粒，粗碎机的速度为350～400rpm，再采用万能粉碎机将羊角颗粒进一步粉碎，万能粉碎机的速度3000～3500rpm，然后过40目(筛孔尺寸：0.425mm)的筛网，收集筛下物即粒径小于或等于0.425mm的羊角粉。

2)将步骤1)中所得羊角粉投入到重量为其6倍的pH13.0的NaOH水溶液中，温度升至100℃搅拌进行碱解，搅拌所需转速为60rpm，碱解2h后，采用120目(筛孔尺寸：0.425mm)尼龙网过滤排掉碱液得到筛上物第一角蛋白固体，后用清水将其洗至中性。

3)将步骤2)中所得第一角蛋白固体加入重量为其6倍的第二水溶液中，搅拌25min，转速为60rpm，NaOH调节第二水溶液pH到9.0，加入0.45％的复合蛋白酶，在温度为50℃，pH9.0的条件下酶解5h，加入HCl调节pH到2.0，降温至38℃，再加入1.3％的蛋白酶在温度为38℃，pH自然的条件下酶解3h后，静置20min后，采用120目尼龙网过滤分离得到筛上物第二角蛋白固体，并用清水将其洗至中性。

4)将步骤3)所得第二角蛋白固体加入重量其3倍的第三水溶液中，用30％Na₂CO₃调pH至10，并按第三水溶液体积的3％的量加入30％过氧化氢母液，搅拌避光氧化3h，氧化完毕后用120目滤网排放掉氧化液得到筛上物第三角蛋白固体，并用清水清洗3次。

5)将第三角蛋白固体通过抽滤装置在压力-0.08Mpa的条件下抽滤20min，然后撒入20kg纯化水，继续抽滤，如此循环2次。

6)将步骤5)所得的第三角蛋白固体在90℃和蒸汽流速为15kg/h下通过蒸汽干燥3h，然后启动真空干燥系统，保持压力为-0.05Mpa、温度在75℃下真空干燥至水分在6％以下，降温后出料。

7)将步骤6)中得到干燥后的第三角蛋白固体进行粉碎，粉碎操作所需速度1000rpm，时间1h；然后使用120目的尼龙网过筛除杂，收集筛下物即粒径小于或等于0.125mm的粉末即为所需制备的角蛋白。

上述方法得到的角蛋白提取率为75％，消化率高达85％以上，稳定性较好，通过氨基酸自动分析仪测定对氨基酸种类和相对含量进行分析，结果由图2可知，提取的角蛋白中氨基酸种类丰富，其中丙氨酸、半胱氨酸和甘氨酸含量较高，总量为38.12％，其次，天门冬氨含量也较高。提取的角蛋白中疏水氨基酸和亲水氨基酸含量分别为42.93％和57.07％，从表中可以看出疏水氨基酸的含量较高，这可能是角蛋白不易溶于水的原因之一。

如图3所示，从左到右的条带为：条带1-标准蛋白Marker，条带2和条带3均为通过本发明制备的角蛋白样品从图中可以看出，本发明制作的角蛋白样品的绝大多数产物是21kDa左右的蛋白。

依照本发明制得的角蛋白可以作为动物饲料添加剂，还可以制成生物膜用于新型生物材料。

实施例2：

一种角蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)预处理：

首先将含有角蛋白的原料猪蹄甲投入到重量为其4倍的第三水溶液中，使用质量体积浓度为7.5％的NaOH溶液调节第三水溶液的pH至13.5，在温度100℃下处理2h，然后排除第三水溶液，除去骨塞，使用清水清洗3次，再然后将猪蹄甲在温度70℃下烘4h，最后将烘干后的含有角蛋白的原料破碎，过80目(筛孔尺寸：0.180mm)尼龙网筛，收集筛下物即粒径小于或等于0.180mm的颗粒。

2)碱解：先将步骤1)中得到的粒径小于或等于0.180mm的猪蹄甲颗粒投入到pH113.5的第一水溶液中碱解2.5h，其中使用质量体积浓度为7.5％的NaOH溶液调节第一水溶液的pH，所述第一水溶液的重量为猪蹄甲颗粒的4倍，然后使用150筛上物的尼龙网过滤分离得到第一角蛋白固体，并使用清水冲洗第一角蛋白固体至其呈中性。。

3)酶解：先将第一角蛋白固体投入到第二水溶液中，第二水溶液的重量为第一角蛋白固体的9倍，用质量体积浓度为7.5％的NaOH溶液调节第二水溶液的pH至9.0，加入重量为第一角蛋白固体0.6％的复合蛋白酶进行第一步酶解，第一步酶解在温度48℃、pH9.0、和转速70rpm下进行5h，然后使用强酸调节第二水溶液的pH为2.5灭活复合蛋白酶，再然后加入重量为第一角蛋白固体3.0％的角蛋白酶进行第二步酶解，第二步酶解在温度35℃和转速70rpm下进行3.5h，最后静置22min，使用150筛上物的尼龙网过滤分离得到第二角蛋白固体，并使用清水冲洗第二角蛋白固体至其呈中性。

4)氧化：首先将第二角蛋白固体投入到重量为其4倍的第四水溶液中，然后使用质量体积浓度为30％Na₂CO₃调节第四水溶液pH至10.5，再然后加入体积占氧化中液体总体积的4％的30％的过氧化氢母液，并搅拌均匀进行避光氧化3.5h，最后使用150目的尼龙网过滤分离得到筛上物第三角蛋白固体，并使用清水冲洗第三角蛋白固体至其呈中性；

5)干燥：先将所述第三角蛋白固体进行抽滤，然后进行蒸汽干燥，最后进行真空干燥，蒸汽干燥和真空干燥在多功能干燥器中完成。所述抽滤中的压力为-0.09Mpa，每次抽滤22min后加入20kg纯化水继续抽滤，如此循环所述抽滤2次；所述蒸汽干燥在温度95℃、蒸汽流速20kg/h下进行4h；所述真空干燥在温度为90℃和真空压力为0.08Mpa下进行，所述真空干燥时间以使含水量在5％以下而定。

6)将步骤5)中得到干燥后的第三角蛋白固体进行粉碎，粉碎操作所需速度1500rpm，时间0.5h；然后使用150目(筛孔尺寸：0.100mm)的尼龙网过筛除杂，收集筛下物即粒径小于或等于0.1001mm的粉末即为所需制备的角蛋白。

实施例3：

一种角蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)预处理：

首先将含有角蛋白的原料猪蹄甲投入到重量为其2.5倍的第三水溶液中，使用质量体积浓度为6％的NaOH溶液调节第三水溶液的pH至13.1，在温度93℃下处理1.8h，然后排除第三水溶液，除去骨塞，使用清水清洗2次，再然后将猪蹄甲在温度65℃下烘3h，最后将烘干后的含有角蛋白的原料破，使用60目(筛孔尺寸：0.250mm)的尼龙网过滤，收集筛下物即粒径小于或等于0.250mm的颗粒。

2)碱解：先将粒径小于或等于0.250mm的猪蹄甲颗粒投入到pH13.2的第一水溶液中碱解2.2h，其中使用质量体积浓度为6％的NaOH溶液调节第一水溶液的pH，所述第一水溶液的重量为猪蹄甲颗粒的3.5倍，然后使用130目的尼龙网过滤分离得到筛上物第一角蛋白固体，并使用清水冲洗第一角蛋白固体至其呈中性。。

3)酶解：先将第一角蛋白固体投入到第二水溶液中，第二水溶液的重量为第一角蛋白固体的5倍，用质量体积浓度为6％的NaOH溶液调节第二水溶液的pH至8.5，加入重量为第一角蛋白固体0.5％的复合蛋白酶进行第一步酶解，第一步酶解在温度49℃、pH8.5、和转速65rpm下进行4.5h，然后使用强酸调节第二水溶液的pH为2.0灭活复合蛋白酶，再然后加入重量为第一角蛋白固体2％的角蛋白酶进行第二步酶解，第二步酶解在温度40℃和转速65rpm下进行3.2h，最后静置24min，使用130目的尼龙网过滤分离得到筛上物第二角蛋白固体，并使用清水冲洗第二角蛋白固体至其呈中性。

4)氧化：首先将第二角蛋白固体投入到重量为其2.5倍的第四水溶液中，然后使用质量体积浓度为30％Na2CO3调节第四水溶液pH至10.3，再然后加入体积占氧化中液体总体积的1.0％的过氧化氢氧化剂，并搅拌均匀进行避光氧化4.5h，最后使用130目的尼龙网过滤分离得到筛上物第三角蛋白固体，并使用清水冲洗第三角蛋白固体至其呈中性；

5)干燥：先将所述第三角蛋白固体进行抽滤，然后进行蒸汽干燥，最后进行真空干燥，蒸汽干燥和真空干燥在多功能干燥器中完成。所述抽滤中的压力为-0.09Mpa，每次抽滤23min后加入20kg纯化水继续抽滤，如此循环所述抽滤2次；所述蒸汽干燥在温度89℃、蒸汽流速17kg/h下进行3.5h；所述真空干燥在温度为80℃和真空压力为0.05Mpa下进行，所述真空干燥时间以使含水量在5％～8％以下而定。

6)将步骤5)中得到干燥后的第三角蛋白固体进行粉碎，粉碎操作所需速度1300rpm，时间0.8h；然后使用130目(筛孔尺寸：0.113mm)的尼龙网过筛除杂，收集筛下物即粒径小于或等于0.113mm的粉末即为所需制备的角蛋白。

实施例4：

一种角蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)预处理：

首先将含有角蛋白的原料猪蹄甲投入到重量为其2倍的第三水溶液中，使用质量体积浓度为5％的NaOH溶液调节第三水溶液的pH至12.5，在温度90℃下处理1.5h，然后排除第三水溶液，除去骨塞，使用清水清洗1次，再然后将猪蹄甲在温度60℃下烘4h，最后将烘干后的含有角蛋白的原料破碎，使用40目的尼龙网过滤，收集筛下物即即粒径小于或等于0.425mm的猪蹄甲颗粒。

2)碱解：先将粒径粒径小于或等于0.425mm的猪蹄甲颗粒投入到pH12.5的第一水溶液中碱解2h，其中使用质量体积浓度为5％的NaOH溶液调节第一水溶液的pH，所述第一水溶液的重量为猪蹄甲颗粒的2倍，然后使用100目的尼龙网过滤分离得到第一角蛋白固体，并使用清水冲洗第一角蛋白固体至其呈中性。

3)酶解：先将第一角蛋白固体投入到第二水溶液中，第二水溶液的重量为第一角蛋白固体的3倍，用质量体积浓度为5％的NaOH溶液调节第二水溶液的pH至8.0，加入重量为第一角蛋白固体0.3％的复合蛋白酶进行第一步酶解，第一步酶解在温度52℃、pH8.0、和转速60rpm下进行4h，然后使用强酸调节第二水溶液的pH为1.5灭活复合蛋白酶，再然后加入重量为第一角蛋白固体1.3％的角蛋白酶进行第二步酶解，第二步酶解在温度30℃和转速60rpm下进行2.5h，最后静置20min，使用100目(筛孔尺寸：0.150mm)的尼龙网过滤分离得到筛上物第二角蛋白固体，并使用清水冲洗第二角蛋白固体至其呈中性。

4)氧化：首先将第二角蛋白固体投入到重量为其2倍的第四水溶液中，然后使用质量体积浓度为30％Na₂CO₃调节第四水溶液pH至10，再然后加入体积占氧化中液体总体积的0.9％的过氧化氢氧化剂，并搅拌均匀进行避光氧化3.8h，最后使用100目的尼龙网过滤分离得到筛上物第三角蛋白固体，并使用清水冲洗第三角蛋白固体至其呈中性；

5)干燥：先将所述第三角蛋白固体进行抽滤，然后进行蒸汽干燥，最后进行真空干燥，蒸汽干燥和真空干燥在多功能干燥器中完成。所述抽滤中的压力为-0.10Mpa，每次抽滤25min后加入20kg纯化水继续抽滤，如此循环所述抽滤3次；所述蒸汽干燥在温度85℃、蒸汽流速15kg/h下进行2.5h；所述真空干燥在温度为60℃和真空压力为0.02Mpa下进行，所述真空干燥时间以使含水量在8％以下而定。

6)将步骤5)中得到干燥后的第三角蛋白固体进行粉碎，粉碎操作所需速度1000rpm，时间1h；然后使用100目的尼龙网过筛除杂，收集筛下物即粒径小于或等于0.150mm的粉末即为所需制备的角蛋白。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种角蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，碱解：先将含有角蛋白的原料投入到pH12.5～13.5的第一水溶液中碱解2～2.5h，然后进行固液分离得到第一角蛋白固体；

步骤二，酶解：先将所述第一角蛋白固体投入到第二水溶液中，加入重量为所述第一角蛋白固体0.3％～0.6％的复合蛋白酶进行第一步酶解，所述第一步酶解在温度48～52℃、pH8.0～9.0、和转速60～70rpm下进行4～5h，然后灭活所述复合蛋白酶，再然后加入重量为所述第一角蛋白固体1.3％～3.0％的角蛋白酶进行第二步酶解，所述第二步酶解在温度35～40℃和转速60～70rpm下进行2.5～3.5h，最后静置20～25min，进行所述固液分离得到第二角蛋白固体；

步骤三，氧化：先将所述第二角蛋白固体使用氧化剂进行避光氧化3.5～4.5h，然后进行所述固液分离得到第三角蛋白固体；

2.如权利要求1所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，所述固液分离的方法为使用150～100目的尼龙网过滤分离得到筛上物角蛋白固体，并使用清水冲洗角蛋白固体至其呈中性。

3.如权利要求2所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，所述氧化中首先将所述第二角蛋白固体投入到重量为其2～4倍的第四水溶液中，然后调节所述第四水溶液pH至10～10.5，再然后加入体积占所述氧化中液体总体积的0.9％～1.2％的过氧化氢氧化剂，并搅拌均匀进行避光氧化，最后进行所述固液分离得到所述第三角蛋白固体。

4.如权利要求3所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，当需要调节溶液的pH＞7时，所述第一水溶液、所述第二水溶液均使用质量体积浓度为5％～7.5％的NaOH溶液调节，而所述第四水溶液使用质量体积浓度为30％Na₂CO₃调节。

5.如权利要求1或2或4任一项所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，所述干燥步骤包括：先将所述第三角蛋白固体进行抽滤，然后进行蒸汽干燥，最后进行真空干燥，所述抽滤中的压力为-0.08～-0.10Mpa，每次抽滤20～25min后加入20kg纯化水继续抽滤，如此循环所述抽滤2～3次；所述蒸汽干燥在温度85～95℃、蒸汽流速15～20kg/h下进行2.5～4h；所述真空干燥在温度为60～90℃和真空压力为0.02～0.08Mpa下进行，所述真空干燥时间以所述含水量而定。

6.如权利要求5所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，所述蒸汽干燥和所述真空干燥在多功能干燥器中完成。

7.如权利要求1所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，所述第一水溶液的重量为所述含有角蛋白的原料的2～4倍，所述第二水溶液的重量为所述第一角蛋白固体的3～9倍。

8.如权利要求1所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，所述酶解中灭活所述复合蛋白酶的方法为使用强酸调节所述第二水溶液的pH至1.5～2.5。

9.如权利要求1或2任一项所述的角蛋白的制备方法，其特征在于，所述含有角蛋白的原料为羊角或猪蹄甲。