CN109187989B - 一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法 - Google Patents

一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及牛毛检测技术领域，公开了一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。本发明先采用酸性洗毛的工艺去除牛毛的油脂、杂质，将牛毛分组，然后利用排列组合的方法用不同蛋白酶对牛毛由外向内依次酶解，对于仅用过酸性蛋白酶酶解的牛毛用三(2‑羧乙基)膦特异地断裂二硫键，先用氨基酸分析对未断二硫键的各组牛毛进行氨基酸的测定，得到氨基酸在牛毛角蛋白中的径向分布，再对比断裂二硫键前后的组别，得到氨基酸键合折叠分布。本发明根据牛毛角蛋白中氨基酸分布具有不同层次的特点，采用排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，对氨基酸的破坏小，准确性高，特异性强，方法较为环保。

Description

一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法
技术领域
本发明涉及牛毛检测技术领域，尤其涉及一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。
背景技术
牛毛纤维从分子组成上看主要是由角蛋白组成。角蛋白是牛毛的主要成分，是可再生蛋白的重要来源，角蛋白具有很好的生物相容性，广泛的应用于生物医药行业;角蛋白是由多种氨基酸构成结构复杂的大分子物质，因此经水解后可得到种类繁多的氨基酸，可应用于饲料、食品、医药和保健品等行业。
牛毛是细长的实心圆柱体，呈卷曲状，纤维的组织结构分三层，即鳞片层、皮质层和髓质层。皮质层是牛毛纤维的主要组成部分，由许多角蛋白组成。细胞之间互相粘合，中间存在空隙。皮质层是决定牛毛纤维物理、机械和化学性质的主要部分。皮质层分为正皮质层和副皮质层两种。溶解牛毛提取角蛋白是解决资源短缺和资源浪费的重要手段。但是牛毛角蛋白的结构十分复杂，主要以a-螺旋、β-折叠形式存在，其中a-螺旋结构占角蛋白一半以上。
牛毛角蛋白大分子是由十八种氨基酸通过肽键连接构成多肽长链，同时在这些长链中，又含有氢键、二硫键、盐式键等多种键能使角蛋白具有稳定的空间结构。而其中，对牛毛角蛋白结构稳定做出最大贡献的是二硫键。这些复杂的化学结构为人们牛毛角蛋白的提取增加了无尽的困难，因此，解析牛毛角蛋白中氨基酸的分布，特别是二硫键稳定的键合折叠的氨基酸分布，就显得尤为重要。另外，解析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布，更有利于帮助我们推测蛋白质的高级结构。
但是现有技术中关于牛毛角蛋白中氨基酸分布的分析较少，仅有学者通过使用酸、碱溶液或各种蛋白酶对牛毛角蛋白进行不同程度（通过控制水解/酶解时间的长短来实现径向上的逐层侵蚀）的溶解，以得到残余的角蛋白纤维，再采用红外光谱、X射线衍射等技术分析角蛋白中氨基酸径向分布。但上述溶解方法容易损伤氨基酸，并且容易对角蛋白内层暂时不希望被水解的蛋白质造成误水解/酶解，从而造成分析结果不够准确。此外，上述方法还无法进行较详细的定量研究，难以应用到牛毛角蛋白的氨基酸分析中。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法。本发明根据牛毛角蛋白纤维径向上氨基酸分布的特点，通过排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，利用针对性极强的还原剂断裂二硫键，易于分析，特异性强，结果准确，条件温和，对氨基酸的破坏小。
本发明的具体技术方案为：一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，包括以下步骤：
1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干、
2）将烘干的样品在50-60℃下，以1:95-105的浴比加入至0.06-0.08wt%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6-6.5，煮25-35min，洗除油脂、杂质，重复一次、
3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，在40-50℃下干燥，得到烘干的牛毛。
本发明洗除油脂的过程，采用酸性洗毛的工艺，适合用于土壤含盐、碱较多的高原地带，土杂含量高的牛毛。土杂多为碱性，加入适量的醋酸，可以中和土杂的碱性，减小对牛毛角蛋白的损伤，同时更好地避免了碱性条件下，二硫键的易位。
4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量份的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min。
5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min。
本发明对于弱酸性条件下酶解的牛毛，用三(2-羧乙基)膦进行精确的二硫键断裂，形成断裂了二硫键的残余牛毛。弱酸性条件下酶解，避免了碱性条件下二硫键的易位。将保留原始二硫键位置的牛毛角蛋白断裂二硫键，和同样酶解条件下未断裂二硫键的组别进行对比，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、
7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、
8）将步骤7）酶解过的E组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理、
9）将F1、F2、G、H组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、
10）将步骤9）酶解过的G、H组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛、
11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理、
12）将I1、I2、J1、J2、K组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min、
13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
14）将步骤13）酶解过的K组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理。
通过排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，形成多组可以横向比较的对比组别，易于分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布，结果更准确。
15）对A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K组酶解后的残余牛毛进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余牛毛；
16）利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余牛毛进行氨基酸分析，对比A1、B1、C1、D1、E、F1、G、H、I1、J1、K，分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布；
17）在分析出牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下，对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、D1和D2、F1和F2、I1和I2、J1和J2，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
与现有技术中只使用同一种水解方法、仅采用不同时长来控制对角蛋白纤维的腐蚀程度的方法相比，本发明人经过长期研究，根据牛毛其径向上具有不同的氨基酸分布，每腐蚀一层角蛋白纤维时选用不同的蛋白酶。其依据是：角蛋白纤维径向上不同部位，其氨基酸分布具有不同的特征，牛毛角蛋白中存在多层次结构，其表层无定形区的比例较高，里层结晶区的比例较高，具体外层、内层氨基酸的分布有待分析。本发明根据每一层氨基酸含量、种类的不同，选用具有不同作用位点的蛋白酶对该层进行酶解。利用每一种蛋白酶对不同氨基酸组成的蛋白质酶解能力的不同，使得在对角蛋白纤维的每一层进行酶解时，只会对目标层的蛋白质具有最好的酶解效果，而对于目标层内层的蛋白质的酶解效果较差。该方法能够取得的技术效果是，在对目标层进行酶解时能够使目标层彻底酶解残留少，同时对目标层内层的角蛋白的“误伤”程度较小，从而实现对目标层的“精准腐蚀”，最终提高后续氨基酸检测的准确性，进而分析其分布对牛毛性能的影响。
作为优选，步骤5）和步骤13）中，酶解反应具体为：将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组和将步骤12）酶解过的J1、J2组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度50-60℃，溶液pH 5-6，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1、J1组残余牛毛。
作为优选，步骤6）和步骤9）中，酶解反应具体为：将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组，以及F1、F2、G、H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度35-40℃，溶液pH =5.5-6.5，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1、F1组残余牛毛。
作为优选，步骤7）、步骤11）和步骤12）中，酶解反应具体为：将步骤6）酶解过的D1、D2、E组、步骤10）酶解过的H组和I1、I2、J1、J2、K组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度50-60℃，溶液pH= 5-6.5，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1、H、I1组残余牛毛。
作为优选，步骤8）、步骤10）和步骤14）中，酶解反应具体为：将步骤7）酶解过的E组、步骤9）酶解过的G、H组和步骤13）酶解过的H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度20-30℃，溶液pH=7.5-8，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛。
牛毛角蛋白中存在多层次结构，表层无定形区的比例较高，里层结晶区的比例较高，具体外层、内层氨基酸的分布有待分析，因此应选用不同蛋白酶尝试进行酶解。在众多蛋白酶中，木瓜蛋白酶溶液的作用位点为赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸，糜蛋白酶溶液的作用位点为酪氨酸、 色氨酸和苯丙氨酸，菠萝蛋白酶溶液的作用位点为丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸和甘氨酸，弹性蛋白酶溶液的作用位点为颉氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸。这四种蛋白酶的作用位点各有不同，所以选其对牛毛角蛋白纤维进行水解。
作为优选，步骤5）至步骤14）中，酶溶液为现配现用；同时用0.2-0.4wt%的苹果酸和0.1-0.15w% 苹果酸钠溶液调节溶液pH。
作为优选，步骤5）至步骤14）中，灭酶处理为：在90-100℃的烘箱中保温1-2h，使酶失活。
作为优选，步骤4）至步骤7）、步骤9）、步骤12）、步骤13）中，通氮气搅拌具体为向三口烧瓶中持续通入氮气，利用机械搅拌以180-220r/min的速度搅拌。
作为优选，步骤4）至步骤7）、步骤9）、步骤12）、步骤13）中，调节三(2-羧乙基)膦pH的方法为用苹果酸钠缓冲溶液调节三(2-羧乙基)膦pH=4-6。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
（1）本发明洗除油脂的过程，采用酸性洗毛的工艺，减小了对牛毛角蛋白的损伤，同时有效避免了碱性条件下，二硫键的易位。
（2）本发明根据牛毛角蛋白径向上具有多层次结构的特点，通过排列组合的多次酶解法对角蛋白进行溶解，条件温和，易于分析，结果准确。
（3）本发明中选用较多酸性蛋白酶，防止碱性条件下，二硫键的易位，并利用针对性极强的还原剂断裂二硫键，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布，特异性强，对氨基酸的破坏小。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，包括以下步骤：
1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干。
2）将烘干的样品在55℃下，以1:100的浴比加入0.07%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6.3，煮30min，洗除油脂、杂质，重复一次。
3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，放入45℃烘箱，得到干燥的牛毛。
4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量分的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在50℃下，以1:20的浴比在pH=5的0.75mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以200r/min的速度搅拌反应30min,然后在45℃下，以1:20的浴比在3owf%乙撑亚胺中反应30min。
5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度55℃，溶液pH 5.5，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在50℃下，以1:20的浴比在pH=5的0.75mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以200r/min的速度搅拌反应30min,然后在45℃下，以1:20的浴比在3owf%乙撑亚胺中反应30min。
6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度37℃，溶液pH 6，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在50℃下，以1:20的浴比在pH=5的0.75mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以200r/min的速度搅拌反应30min,然后在45℃下，以1:20的浴比在3owf%乙撑亚胺中反应30min。
7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度55℃，溶液pH 6，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在50℃下，以1:20的浴比在pH=5的0.75mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以200r/min的速度搅拌反应30min,然后在45℃下，以1:20的浴比在3owf%乙撑亚胺中反应30min。
8）将步骤7）酶解过的E组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度25℃，溶液pH7. 8，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理。
9）将F1、F2、G、H组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度37℃，溶液pH 6，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在50℃下，以1:20的浴比在pH=5的0.75mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以200r/min的速度搅拌反应30min,然后在45℃下，以1:20的浴比在3owf%乙撑亚胺中反应30min。
10）将步骤9）酶解过的G、H组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度25℃，溶液pH7.8，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛。
11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理。
12）将I1、I2、J1、J2、K组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度55℃，溶液pH 6，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在50℃下，以1:20的浴比在pH=5的0.75mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以200r/min的速度搅拌反应30min,然后在45℃下，以1:20的浴比在3owf%乙撑亚胺中反应30min。
13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度55℃，溶液pH 5.5，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在50℃下，以1:20的浴比在pH=5的0.75mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以200r/min的速度搅拌反应30min,然后在45℃下，以1:20的浴比在3owf%乙撑亚胺中反应30min。
14）将步骤13）酶解过的K组以1:40的浴比放入预先配制好的1.5g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度25℃，溶液pH7.8，反应6.5h；反应完成后，对酶进行灭活处理。
15）对A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K组残余牛毛进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余牛毛。
16）利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余牛毛进行氨基酸分析，对比A1、B1、C1、D1、E、F1、G、H、I1、J1、K，分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布。
17）在分析出牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下，对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、D1和D2、F1和F2、I1和I2、J1和J2，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
其中，步骤5）至步骤14）中的酶溶液需要现配现用；同时需要用0.3%的苹果酸和0.13% 苹果酸钠溶液调节溶液pH。灭酶处理为：在95℃的烘箱中保温1.5h，使酶失活。
其中，调节三(2-羧乙基)膦pH的方法为用苹果酸钠缓冲溶液调节三(2-羧乙基)膦至pH=5。
实施例2
1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干。
2）将烘干的样品在50℃下，以1:95的浴比加入0.06%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6，煮25min，洗除油脂、杂质，重复一次。
3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，放入40℃烘箱，得到干燥的牛毛。
4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量分的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45℃下，以1:18的浴比在pH=4的0.7mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以180r/min的速度搅拌反应25min,然后在40℃下，以1:19的浴比在2owf%乙撑亚胺中反应25min。
5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度50℃，溶液pH 5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在45℃下，以1:18的浴比在pH=4的0.7mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以180r/min的速度搅拌反应25min,然后在40℃下，以1:19的浴比在2owf%乙撑亚胺中反应25min。
6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度35℃，溶液pH 5.5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在45℃下，以1:18的浴比在pH=4的0.7mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以180r/min的速度搅拌反应25min,然后在40℃下，以1:19的浴比在2owf%乙撑亚胺中反应25min。
7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度50℃，溶液pH 5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在45℃下，以1:18的浴比在pH=4的0.7mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以180r/min的速度搅拌反应25min,然后在40℃下，以1:19的浴比在2owf%乙撑亚胺中反应25min。
8）将步骤7）酶解过的E组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度20℃，溶液pH7. 5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理。
9）将F1、F2、G、H组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度35℃，溶液pH 5.5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在45℃下，以1:18的浴比在pH=4的0.7mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以180r/min的速度搅拌反应25min,然后在40℃下，以1:19的浴比在2owf%乙撑亚胺中反应25min。
10）将步骤9）酶解过的G、H组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度20℃，溶液pH7.5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛。
11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理。
12）将I1、I2、J1、J2、K组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度50℃，溶液pH 5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在45℃下，以1:18的浴比在pH=4的0.7mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以180r/min的速度搅拌反应25min,然后在40℃下，以1:19的浴比在2owf%乙撑亚胺中反应25min。
13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度50℃，溶液pH 5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在45℃下，以1:18的浴比在pH=4的0.7mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以180r/min的速度搅拌反应25min,然后在40℃下，以1:19的浴比在2owf%乙撑亚胺中反应25min。
14）将步骤13）酶解过的K组以1:38的浴比放入预先配制好的1g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度20℃，溶液pH7.5，反应6h；反应完成后，对酶进行灭活处理。
15）对A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K组残余牛毛进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余牛毛。
16）利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余牛毛进行氨基酸分析，对比A1、B1、C1、D1、E、F1、G、H、I1、J1、K，分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布。
17）在分析出牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下，对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、D1和D2、F1和F2、I1和I2、J1和J2，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
其中，步骤5）至步骤14）中的酶溶液需要现配现用；同时需要用0.2%的苹果酸和0.1% 苹果酸钠溶液调节溶液pH。灭酶处理为：在90℃的烘箱中保温1h，使酶失活。
其中，调节三(2-羧乙基)膦pH的方法为用苹果酸钠缓冲溶液调节三(2-羧乙基)膦至pH=4。
实施例3
1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干。
2）将烘干的样品在60℃下，以1:105的浴比加入0.08%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6.5，煮35min，洗除油脂、杂质，重复一次。
3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，放入50℃烘箱，得到干燥的牛毛。
4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量分的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在55℃下，以1:22的浴比在pH=6的0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以220r/min的速度搅拌反应35min,然后在50℃下，以1:21的浴比在4owf%乙撑亚胺中反应35min。
5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度60℃，溶液pH 6，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在55℃下，以1:22的浴比在pH=6的0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以220r/min的速度搅拌反应35min,然后在50℃下，以1:21的浴比在4owf%乙撑亚胺中反应35min。
6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度40℃，溶液pH 6.5，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在55℃下，以1:22的浴比在pH=6的0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以220r/min的速度搅拌反应35min,然后在50℃下，以1:21的浴比在4owf%乙撑亚胺中反应35min。
7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度60℃，溶液pH 6.5，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在55℃下，以1:22的浴比在pH=6的0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以220r/min的速度搅拌反应35min,然后在50℃下，以1:21的浴比在4owf%乙撑亚胺中反应35min。
8）将步骤7）酶解过的E组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度30℃，溶液pH8，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理。
9）将F1、F2、G、H组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度40℃，溶液pH 6.5，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在55℃下，以1:22的浴比在pH=6的0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以220r/min的速度搅拌反应35min,然后在50℃下，以1:21的浴比在4owf%乙撑亚胺中反应35min。
10）将步骤9）酶解过的G、H组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度30℃，溶液pH8，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛。
11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理。
12）将I1、I2、J1、J2、K组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度60℃，溶液pH 6.5，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在55℃下，以1:22的浴比在pH=6的0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以220r/min的速度搅拌反应35min,然后在50℃下，以1:21的浴比在4owf%乙撑亚胺中反应35min。
13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度60℃，溶液pH 6，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在55℃下，以1:22的浴比在pH=6的0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气,并以220r/min的速度搅拌反应35min,然后在50℃下，以1:21的浴比在4owf%乙撑亚胺中反应35min。
14）将步骤13）酶解过的K组以1:42的浴比放入预先配制好的2g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度30℃，溶液pH8，反应7h；反应完成后，对酶进行灭活处理。
15）对A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K组残余牛毛进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余牛毛。
16）利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余牛毛进行氨基酸分析，对比A1、B1、C1、D1、E、F1、G、H、I1、J1、K，分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布。
17）在分析出牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下，对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、D1和D2、F1和F2、I1和I2、J1和J2，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
其中，步骤5）至步骤14）中的酶溶液需要现配现用；同时需要用0.4%的苹果酸和0.15% 苹果酸钠溶液调节溶液pH。灭酶处理为：在100℃的烘箱中保温2h，使酶失活。
其中，调节三(2-羧乙基)膦pH的方法为用苹果酸钠缓冲溶液调节三(2-羧乙基)膦至pH=6。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）称取牛毛作为样品，用去离子水反复搓洗，去除表面杂质，烘干；
2）将烘干的样品在50-60℃下，以1:95-105的浴比加入至0.06-0.08wt%月桂醇聚氧乙烯醚溶液中，用醋酸调节pH至6-6.5，煮25-35min，洗除油脂、杂质，重复一次；
3）洗除油脂之后，将样品用去离子水冲洗干净，在40-50℃下干燥，得到烘干的牛毛；
4）将步骤3）烘干的牛毛分成A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K等质量份的组别，其中A1组作为对照组，不做任何处理；将A2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
5）将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1组残余牛毛；将B2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
6）将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1组残余牛毛；将C2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
7）将步骤6）酶解过的D1、D2、E组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1组残余牛毛；将D2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
8）将步骤7）酶解过的E组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；
9）将F1、F2、G、H组浸入到糜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留F1组残余牛毛；将F2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
10）将步骤9）酶解过的G、H组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛；
11）将步骤10）酶解过的H组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；
12）将I1、I2、J1、J2、K组浸入到菠萝蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留I1组残余牛毛；将I2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
13）将步骤12）酶解过的J1、J2、K组浸入到木瓜蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理，保留J1组残余牛毛；将J2放入三口烧瓶中，在45-55℃下，以1:18-22的浴比在pH=4-6的0.7-0.8mol/L 三(2-羧乙基)膦中，通氮气搅拌反应25-35min，然后在40-50℃下，以1:19-21的浴比在2-4owf%乙撑亚胺中反应25-35min；
14）将步骤13）酶解过的K组浸入到弹性蛋白酶溶液中进行酶解，反应完成后，对酶进行灭活处理；
15）对B1、B2、C1、C2、D1、D2、E、F1、F2、G、H、I1、I2、J1、J2、K组酶解后的残余牛毛进行过滤和洗涤处理，得到在径向上具有不同程度溶蚀的残余牛毛；
16）利用全自动氨基酸分析仪对以上各组残余牛毛进行氨基酸分析，对比A1、B1、C1、D1、E、F1、G、H、I1、J1、K，分析牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布；
17）在分析出牛毛角蛋白中氨基酸的径向分布的前提下，对比A1和A2、B1和B2、C1和C2、D1和D2、F1和F2、I1和I2、J1和J2，分析牛毛角蛋白中氨基酸的键合折叠分布。
2.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤5）和步骤13）中，酶解反应具体为：将B1、B2、C1、C2、D1、D2、E组和将步骤12）酶解过的J1、J2组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的木瓜蛋白酶溶液中，控制反应温度50-60℃，溶液pH=5-6，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留B1、J1组残余牛毛。
3.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤6）和步骤9）中，酶解反应具体为：将步骤5）酶解过的C1、C2、D1、D2、E组，以及F1、F2、G、H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的糜蛋白酶溶液中，控制反应温度35-40℃，溶液pH=5.5-6.5，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留C1、 F1组残余牛毛。
4.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤7）、步骤11）和步骤12）中，酶解反应具体为：将步骤6）酶解过的D1、D2、E组、步骤10）酶解过的H组和I1、I2、J1、J2、K组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的菠萝蛋白酶溶液中，控制反应温度50-60℃，溶液pH=5-6.5，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留D1、H、I1组残余牛毛。
5.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤8）、步骤10）和步骤14）中，酶解反应具体为：将步骤7）酶解过的E组、步骤9）酶解过的G、H组和步骤13）酶解过的H组以1:38-42的浴比放入预先配制好的1-2g/L的弹性蛋白酶溶液中，控制反应温度20-30℃，溶液pH=7.5-8，反应6-7h；反应完成后，对酶进行灭活处理，保留G组残余牛毛。
6.如权利要求1-5之一所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤5）至步骤14）中，酶溶液为现配现用；同时用0.2-0.4wt%的苹果酸和0.1-0.15w% 苹果酸钠溶液调节溶液pH。
7.如权利要求1-5之一所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤5）至步骤14）中，灭酶处理为：在90-100℃的烘箱中保温1-2h，使酶失活。
8.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤4）至步骤7）、步骤9）、步骤12）、步骤13）中，通氮气搅拌具体为向三口烧瓶中持续通入氮气，利用机械搅拌以180-220r/min的速度搅拌。
9.如权利要求1所述的一种分析牛毛角蛋白中氨基酸键合折叠分布的方法，其特征在于，步骤4）至步骤7）、步骤9）、步骤12）、步骤13）中，调节三(2-羧乙基)膦pH的方法为用苹果酸钠缓冲溶液调节三(2-羧乙基)膦pH=4-6。
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