DE2748036A1 - Verfahren zur gewinnung von maltose- phosphorylase oder/und beta-phosphoglucose- mutase und verwendung derselben - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von maltose- phosphorylase oder/und beta-phosphoglucose- mutase und verwendung derselben

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Description

2748035
Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, Dipl-Phys. Dr. K. Fincke
Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber
Dr.-Ing.H.Liska
8 MÜNCHEN 86, DEN
POSTFACH 860 820
MDHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22
int. Nr. 2162
BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Sandhofer Straße 112-132, 6800 Mannheim-Waldhof
Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/und ß-Phosphoglucose-mutase und Verwendung derselben.
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27A803Q
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/und ß-Phosphoglucose-mutase aus Mikroorganismen und die Verwendung der so erhaltenen Enzyme.
Es ist bekannt, daß Maltose-phosphorylase in Neisseria meningitidis (J. Biol. Chem. T9£, 153 (1952)), in nichtidentifizierten Bierlactobacillen (Biochem. J. 7_8, 204 (1961)) und in Lactobacillus brevis IFO 3345 - ATCC 8287 (Agr. Biol. Chem. 37, 2813 (1973)) vorkommt und daraus gewonnen werden kann.
Das Vorkommen von ß-Phosphorglucose-mutase ist bekannt in Kaninchenmuskeln, Hefe und Neisseria meningitidis (J. Biol. Chem. 23(5, 2186 (1961)) sowie Lactobacillus brevis ATCC 8287.
Die beiden genannten Enzyme sind technisch von Interesse, da sie gemeinsam zur Bestimmung der Οζ-Amylase, einem diagnostisch sehr wichtigen Enzym, verwendet werden können. Diese Bestimmung basiert auf der Hydrolyse von Stärke durch die O(-Amylase unter Bildung von Maltose. So gebildete Maltose wird von der Maltosephosphorylase (MP) in Gegenwart von Phosphat in Glucose und ß-Glucose-1-phosphat gespalten, letzteres wird von der ß-Phosphoglucose-mutase (ßPGM) in oC-Glucose-6-phosphat umgewandelt, welches dann in bekannter Weise in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) NAD zu NADH reduziert und dabei selbst in 6-Phosphogluconat übergeht. So gebildetes NADH ist damit ein Maß für die oC-Amylaseaktivität.
Für klinische Tests mit kombinierten enzymatischen Reaktionen, in denen also mehrere Enzyme eingesetzt werden, spielt es eine entscheidende Rolle, ob die benötigten Enzyme leicht zugänglich sind und ohne große Mühe in eine für die Analyse geeignete Form gebracht werden können. Denn der Preis derartiger enzymatischer Bestimmungen wird im wesentlichen durch den Preis der hierfür verwendeten Enzyme bestimmt. Besonders günstig ist es dabei, wenn aus einem einzigen Ausgangsmaterial mehrere für einen bestimmten Test verwendete Enzyme gleichzeitig gewonnen werden können.
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Unter den bisher bekannten Ausgangsmaterialien kommen die beiden oben erwähnten Enzyme zwar in Neisseria meningitidis gemeinsam in einer Form vor, die ihre Anwendung in einem oC-Amylase-test ohne vorherige Trennung gestattet. Ein beträchtlicher Nachteil besteht jedoch darin, daß es sich dabei um einen äußerst gefährlichen und virulenten Mikroorganismus handelt, der nur mit größten Vorsichtsmaßnahmen als Quelle für industriell zu verwendende Enzyme verwendet werden kann. Außerdem sind die gefundenen Aktivitäten der genannten Enzyme in diesem Mikroorganismus unbefriedigend. Lactobacillus brevis ATCC 8287 enthält zusätzlich °f-Glucosidase, ein bei der Verwendung störendes Enzym, so daß hier eine Aufreinigung unumgänglich ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von MP und gegebenenfalls auch ß-PMG zu schaffen, welches die Verwendung des gefährlichen Neisseria meningitidis vermeidet und aus einem leicht zugänglichen harmlosen Ausgangsmaterial eine einfache Gewinnung der Enzyme gestattet. Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren der oben genannten Art zu schaffen, bei welchem ein Mikroorganismus verwendet wird, dessen Rohextrakt direkt für die ö< -Amylasebestimmung eingesetzt werden kann, da er ausreichend hohe Aktivitäten der Enzyme MP und ß-PMG enthält und keiner Aufreinigung bedarf.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/und ß-Phosphogluco-mutase aus Mikroorganismen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Lactobacillus brevis NCIB 8836, 8561, 8562, ATCC 8287, DSM 20054, Lactobacillus plantarum DSM 20174, 43, Lactobacillus reuteri DSM 20016, Lactobacillus fermentum DSM 20052, Streptococcus spec. DSM 1118, 1119, 1120 oder/und DSM 1121 verwendet wird.
überraschenderweise hat sich gezeigt, daß in den oben aufgeführten Mikroorganismen die beiden genannten Enzyme in hoher
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Aktivität enthalten sind und leicht daraus gewonnen werden können. Dabei ist es möglich, sowohl die beiden einzelnen Enzyme in getrennter Form zu gewinnen, indem man sie nach den üblichen Methoden der Enzymanreicherung aus den Extrakten dieser Mikroorganismen isoliert und reinigt, beispielsweise durch Entfernung von Verunreinigungen mittels Polyäthyleniminfällung, fraktionierte Fällung mit Salzen, wie Ammoniumsulfat, Behandlung mit Adsorbentien und Austauscherchromatographie, insbesondere an schwach basischen Austauschern auf Basis von vernetzten» Dextran oder von Cellulose.
Für die Verwendung zur o(-Amylasebestimmung kann jedoch direkt der Rohextrakt der genannten Mikroorganismen verwendet werden. Dazu werden die Mikroorganismen nach üblichen physikalischen Methoden, beispielsweise mit Ultraschall, durch die Hochdruckdispersion, Zerreiben oder dergleichen aufgeschlossen, unlösliche Fragmente abgetrennt und der klare überstand als solcher oder in gefriergetrockneter Form zur Bestimmung der 0( -Amylase eingesetzt. Wahlweise lassen sich diese Rohextrakte auch noch einer weiteren Reinigung unterziehen. Da für die Verwendung zur oC-Amylasebestimmung eine Trennung der beiden Enzyme vermieden werden soll, erfolgt die Weiterreinigung vorzugsweise unter Anwendung eines Tests, bei welchem die Gesamtaktivität beider Enzyme nach jedem Reinigungsschritt bestimmt wird, indem man einen geeigneten Puffer sowie Maltose, NADP und G6PDH zusetzt und die Bildung von NADPH mißt. Vorzugsweise werden dabei die Enzyme MP und ß-PMG durch Zusatz von G<-Glucose-1,6-di-
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phosphat und Mn -ionen, beispielsweise in Form von Mangansulfat oder einem anderen organischen oder anorganischen Mangansalz, aktiviert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von Maltosephosphorylase oder/und ß-Phosphogluco-mutase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, als Rohextrakt oder in angereicherter Form zur Bestimmung der °C-Amyla-
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se, gegebenenfalls unter Zusatz von O(-Glucose-1,6-diphosphat
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oder/und Mn -ionen.
Die Erfindung ermöglicht es, die beiden genannten Enzyme in wesentlich einfacherer und billigerer Weise zu gewinnen, und zwar insbesondere in einer Form, in der sie direkt ohne vorherige Trennung zur Bestimmung der oC -Amylase eingesetzt werden können. Die Durchführung einer derartigen Bestimmung wird dadurch wesentlich vereinfacht und erleichtert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1
Die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen wurden auf einem 1 % Maltose enthaltenden Medium nach Kamogawa (Agr. Biol. Chem. T7/ 2813 (1973)) gezüchtet und danach durch Hochdruckdispersion aufgeschlossen. Nach Abzentrifugieren der unlöslichen Teile wurde der erhaltene Rohextrakt direkt auf seine Eignung zur o(-Amylasebestiiranung nach folgendem Schema eingesetzt:
Stärke + H2O *-AmYlase > Maltose
Maltose + PO. ——> Glucose + ß-Glucose-1-phosphat
ß-Glucose-1-phosphat — ^ Glucose-6-phosphat
Glucose-6-phosphat - NAD+ 6-phosphogluconat + NADH +H+
Zur Feststellung der Eignung der Rohextrakte wurde folgender Testansatz verwendet:
3,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer + o( -Glucose-1,6-diphosphat (c = 0,05), pH 6,5
0,1 ml MnSO4 1 %
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1,0 ml 0,2 M Maltose (Merck, für biochemische Zwecke) 0,5 ml Rohextrakt
Inkubation: 1 Stunde bei 37°C Stopp: 1 ml Probe - 3 Minuten/1000C; dann Zentrifugation
0,25 ml Oberstand in folgende Bestimmung einsetzen: modifizierter OC-Glucose-6-phosphat-test: 2,54 ml 0,3 M TRA-Puffer, pH 7,6 0,1 ml O,1 M MgCl2 0,1 ml NADP (c = 10) 0,2 5 ml überstand
Start:
0,01 ml G6PDH (c ■ 1) T = 25°; Messung von
Die erhaltenen Ergebnisse zeigt nachstehende Tabelle:
Stamm NCIB 8836 Δε (NADPH) '
Lactob. brevis DSM 20174 0,850
Lactob. plantarum DSM 20016 0,675
Lactob. reuteri NCIB 8561 0,252
Lactob. brevis NCIB 8562 0,150
Lactob. brevis DSM 43 0,1OO
Lactob. plantarum DSM 1118 0,090
Streptococcus spec. DSM 1119 0,210
Streptococcus spec. DSM 1120 0,125
Streptococcus spec. DSM .1.1.2.1. 0,115
Streptococcus spec. 0,110
Δε korreliert direkt mit der MP/ß-PGM-Aktivität
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Beispiel 2
Es wurde ein Reagens verwendet, das nachstehende Zusammensetzung aufwies:
Phosphatpuffer 20 mM; pH 6,5
NAD 2 mM
Maltotetraose 10 mM
lösliche Stärke -
Glucose-1,6-diphosphat Spuren
Rohextrakt aus Lactob. plan-
tarum DSM 20174 auf Maltose-
phosphorylase		 3 U/ml
und
ß-Phosphoglucomutase 1 U/ml
G6PDH (Leuconostoc mesent.)
gelöst in Wasser		 9 U/ml
Die erhaltene Lösung wurde bei 3O°C inkubiert, mit der Probelösung versetzt und in einem Photometer nach 5-minütiger Vorinkubation die Extinktionsdifferenz bei Hg 334 nm über 5 min gemessen. Für 2,0 ml Reagens und 0,10 ml Probe ergibt sich folgende Berechnungsformel für die Aktivität der o^-Amylase in der Probe:
U/l = Δ E/min χ =ΔΕ/πΰη χ 1699
Bei Einsatz von fünf verschiedenen Humanseren wurden mit dem obigen Reagens folgende Werte gefunden:
Serum O<-Amylase
1 23,5 U/l
2 88 U/l
3 100 U/l
4 120 U/l
5 146 U/l
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Claims (2)

V- Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/ und ß-Phosphoglucomutase aus Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß Lactobacillus brevis DSM 20054, NCIB 8836, 8561, 8562, Lactobacillus plantarum DSM 20174 und 43, Lactobacillus reuteri DSM 2ΟΟ16, Lactobacillus fermentum DSM 20052, Streptococcus spec. DSM 1118, DSM 1119, DSM 1120 oder/und DSM 1121 verwendet wird.
2. Verwendung von nach Anspruch 1 erhaltener Maltosephosphorylase und ß-Phosphoglucomutase als Rohextrakt oder in angereicherter Form ohne Trennung zur Bestimmung der 0<-Amylase, gegebenenfalls unter Zusatz von C(-Glucose-1,6-di-
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phosphat oder/und Mangan -ionen.
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