DE2919578A1

DE2919578A1 - Methylguanidin-zersetzendes enzym und verfahren zu dessen herstellung, sowie dessen verwendung zur bestimmung von methylguanidin

Info

Publication number: DE2919578A1
Application number: DE19792919578
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Mizusawa; Motoo Nakajima; Yoshio Sirokane
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1978-05-16
Filing date: 1979-05-15
Publication date: 1979-11-22
Also published as: DE2919578C2; US4247632A

Description

HOFFMANN · EITLE &. PARTNER

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMAN N . D IPL.-ING. W. LEH N

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE A (STERN HAUS) . D-8000 MÖNCH EN 81 · TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29619 (PATHE)

.3.2. 085 o/wa

KIKKOMAN SHOYU CO. LTD. NODA-SHI / JAPAN

Methylguanidin-zersetzendes Enzym und Verfahren zu dessen Herstellung, sowie dessen Verwendung zur Bestimmung von Methylguanidin

Die Erfindung betrifft ein neues Methylguanidin-zersetzendes Enzym. Sie betrifft insbesondere ein neues Methylguanidinzersetzendes Enzym, welches Methylguanidin in Methylamin und Harnstoff zersetzt, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms und die Verwendung des Enzyms.

Methylguanidin ist in Nahrungsmitteln, wie geräucherten Sardinen (Katsuo-bushi), Fleischextrakt und dergleichen in erheblichen Mengen enthalten. Angeblich soll Methylguanidin leicht durch Nitrosierung in Methylnitrosocyanamid im Magensaft

■808847/0837

in Gegenwart von Nitrit umgewandelt werden und das Methylnitrosocyanamid ist eine sehr mutagene Substanz. Manchmal ■ wird es sogar als karzinogen bezeichnet.

Obwohl Methylguanidin im Blut eines gesunden Menschen fast nicht nachweisbar ist, findet man es im Blut von Patienten mit chronischen Nierenleiden, so dass es eine Art eines urämischen Toxins ist, welches Urämie verursacht. Man weiss auch, dass die in vitro Toxizität von Methylguanidin LDH-Inhibierung_/ATPase-Inhibierung, die Inhibierung der oxidativen Phosphorylxerung, die Inhibierung des Plättchenfaktors 3 und dergleichen bewirkt (Ando et al, Saishin Igaku, 3J_, Nr. 9, Seiten 1695 bis 1706 (1976)).

Aufgrund der vorerwähnten Tatsachen haben die Erfinder gründliche Untersuchungen vorgenommen, um ein Verfahren zu finden, mittels dessen man Methylguanidin, das als Substanz bekannt ist, welche unerwünschte Wirkungen auf den Menschenkörper ausübt, in harmlose Substanzen umwandeln und entfernen kann. Als Ergebnis wurde gefunden, dass ein Bakterium von Genus Alcaligenes das aus Erde isoliert wird, ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym bildet, durch welches Methylguanidin in die harmlosen Verbindungen Methylamin und Harnstoff zersetzt wird und wobei diese Wirkung bisher nicht bekannt war. Es wurde auch festgestellt, dass man bei der Einwirkung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms auf eine Probe, die auf ihren Gehalt an Methylguanidin analysiert werden soll, die Menge des gebildeten Methylamins oder Harnstoffs gemessen werden kann, und dass man so Methylguanidin quantitativ auf sehr einfache Weise und innerhalb kurzer Zeit mit einer sehr hohen Empfindlichkeit analysieren kann und man gleichzeitig eine grosse Anzahl von Proben untersuchen kann. Die vorliegende Erfindung

909847/0837

beruht auf diesen Untersuchungen.

Erfxndungsgemäss wird (1) ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym gezeigt, das die Fähigkeit hat, Methylguanidin zu Methylamin und Harnstoff zu zersetzen und das einen optimalen pH-Bereich von 10,9 bis 12,3 und einen stabilen pH-Bereich von 5,0 bis 10,6 aufweist; (2) ein Verfahren zur Entfernung von Methylguanidin aus einer Probe, welche Methylguanidin enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Methylguanidin-zersetzende Enzym zu einer Probe gibt, welche Methylguanidin enthält und das Methylguanidin enzymatisch zersetzt; (3) ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Methylguanidin, das in einer Probe enthalten ist, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym mit einer Probe umsetzt, die auf ,ihren Gehalt an Methylguanidin analysiert wird, und dass man die Menge des bei der Umsetzung gebildeten Methylamins oder Harnstoffs misst, und (4) ein Verfahren zur Herstellung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Bakterium vom Genus Alcaligenes mit der Fähigkeit, ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym zu bilden, in einem Medium kultiviert und das gebildete Methylguanidin-zersetzende Enzym aus der Kulturmischung isoliert.

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues Methylguanidin-zersetzendes Enzym zu zeigen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Entfernen von Methylguanidin aus Methylguanidin enthaltenden Proben zu zeigen. Eine noch weitere Aufgabe ist es, ein neues Verfahren zur quantitativen Analyse von Methylguanidin in einer Methylguanidin enthaltenden Probe zu zeigen. Verbunden mit dieser Aufgabe

909847/0837

ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung eines Methylguanidin enthaltenden Enzyms zu zeigen. Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor.

In den Zeichnungen stellt

Fig. 1 eine grafische Darstellung dar, die den optimalen pH-Bereich des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms, das durch Kultivierung eines Stammes
Alcaligenes N-81 oder Alcaligenes N-243 hergestellt wurde, angibt, wobei die Messung durchgeführt wurde unter Verwendung von Metylguanidin als Substrat.

Fig. 2 (Standardkalibrierungskurve) ist eine grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und der O.D. Zahl, die bei der
Urease-Indophenol-Methode gemessen wird, und

Fig. 3 (Standardkalibrierungskurve) ist eine grafische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und der O.D. Zahl, gemessen nach der TNBS-Methode, angibt.

Fig. 4 A gibt das Fluss ig chromatograitim einer Lösung von Methylguanidinsulfat in 0,1 m Tris-Hydrochlorsäure-Puffer (vor der enzymatischen Reaktion)
an, wobei η das Peak von Methylguanidin ist.

Fig. 4B gibt das Flüssigchromatogramm eines enzymbehandelten Produktes an, das erhalten wurde durch Umsetzung

SCT984770837

eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit einer Lösung von Methylguanidinsulfat in 0,1 m Tris-hydrochlorsäure-Puffer (nach der enzymatischen Reaktion).

Fig. 5A ist ein Flüssigchromatogramm von Rinderextrakt (vor der enzymatischen Reaktion), worin η das Peak von Methylguanidin ist.

Fig. 5B ist ein Flüssigchromatogramm eines enzymbehandelten Produktes, das erhalten wurde durch Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit Rinderextrakt (nach der enzymatischen Reaktion), wobei η das Peak von Methylguanidin ist.

Fig. 6A ist das Flüssigchromatogramm eines Heisswasserextraktes von geräucherten Sardinen (vor der enzymatischen Reaktion), worin η das Peak von Methylguanidin ist.

Fig. 6B ist das Flüssigchromatogramm eines enzymbehandelten Produktes, das erhalten wurde durch Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit einem Heisswasserextrakt von■geräucherten Sardinen (nach der enzymatischen Reaktion).

Fig. 7 A ist das Flüssigchromatogramm des Serums eines urämischen Patienten (vor der enzymatischen Reaktion) , worin η das Peak von Methylguanidin ist.

Fig. 7B ist das Flüssigchromatogramm eines enzymbehandelten Produktes, das erhalten wurde durch Umsetzung

809847/0837

eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit einem Serum eines urämischen Patienten (nach der enzymatischen Reaktion.

Nachfolgend werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms gemäss der Erfindung beschrieben.

(1) Wirkung

Dieses Enzym zersetzt Methylguanidin in Methylamin und Harnstoff

erfindungsgemässes Enzym

J.

NH₀ C -"-NH-— CH₀ 7 CH₀ — NH₀ + H₀N— CO-NH₀

NH

(2) Substratspezifitat

Das Enzym zeigt keine Wirkung gegenüber Guanidoessigsäure (Glycocyamin) und Guanididobernsteinsäure.

(3) Optimaler pH-Bereich und stabiler pH-Bereich

Wie in Fig. 1 gezeigt wird, beträgt der optimale pH-Bereich 10,9 bis 12,3 und der stabile pH-Bereich 5,0 bis 10,6 bei

909847/083 7

der Umsetzung mit Methylguanidinsulfat als Substrat bei 30°C während 10 Minuten, wobei die folgenden Pufferlösungen in den folgenden pH-Bereichen verwendet wurden: pH 6,0 bis 7,0 : 0,1 m Zitronensäure-Pufferlösung; pH 7,0 bis 9,0: 0,1 m Veronal-Pufferlösung; pH 9,0 bis 11,0: 0,1 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung; pH 11,0 bis 13,5: 0,1 m Natriumcarbonat-Natriumhydroxid-Pufferlösung.

(4) Verfahren zum Messen der enzymatischen Aktivität

Eine Substratlösung mit einer Konzentration an Methylguanidinsulf at von i00ug/ml wird hergestellt, indem man Methylguanidinsulf at in einer 0,05 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 11,0) löst. Man lässt 0,8 ml der Substratlösung mit 0,2 ml der Enzymlösung 10 Minuten bei 30°C reagieren und dann wird die Umsetzung durch Zugabe von 1 ml 0,4 m-Lösung Trichloressigsäure abgebrochen. Hat sich ein Niederschlag gebildet, so wird der Niederschlag durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt. Man erhält so eine enzymatische Reaktionsflüssigkeit.

Eine Kontrolle wird hergestellt, indem man die vorgenannte Verfahrensweise wiederholt mit der Ausnahme, dass man anstelle der 0,2 ml einer Enzymlösung 0,2 nl einer 0,05 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 11,0) verwendet.

Dann werden jeweils 50 ul der enzymatischen Reaktionsflüssigkeit oder der Kontrolle mit 1,5 ml einer 0,1 mmol Lösung von Phenanthrachinon in Dimethylformamid und 0,25 ml einer 1 M wässrigen Lösung von Natriumhydroxid vermischt und bei Raumtemperatur 40 bis 50 Minuten umgesetzt und dann

9847/0837

gibt man 0,25 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure und 2,5 ml Wasser zu. Nachfolgend werden die relativen Fluoreszenzintensitäten der erhaltenen Reaktionsmischungen mit einem Fluorofotometer bei einer Anregungswellenlänge von 310 nm und einer Fluoreszenzwellenlänge von 3 90 nm gemessen. Die Abnahme des Methylguanidingehaltes wird aus dem Unterschied der Fluoreszenzintensitäten zwischen den einzelnen Reaktion smischungen der enzymatischen Reaktion und dem Kontrollversuch berechnet.

Bei der Bestimmung der Aktivität wird eine Menge des Enzyms, die ausreicht um 1 umol Methylguanidin pro Minute bei 30°C zu zersetzen, als eine Einheit bezeichnet.

(5) Optimaler Wirkungstemperaturbereich

Lässt man dieses Enzym 10 Minuten bei pH 10 einwirken, so liegt die optimale Wirkungstemperatur im Bereich von 20 bis

75°C. Die geeignetste Temeperatur ist der Temperaturbe-

o ο

reichen zwischen 55 und 60 C.

(.6) Inaktivierungs-pH und Temperaturbedingungen

(i) Inaktivierungs-pH-Bedingungen:

Dieses Enzym wird vollständig unterhalb pH3 und oberhalb pH 13 inaktiviert.

(ii) Inaktivierungstemperaturbedingungen:

Beim pH 10 wird das Enzym durch eine 30-minütige bei 60 C durchgeführte Wärmebehandlung vollständig inaktiviert.

009847/08 3 7

(7) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung

(i) Inhibierung:

a) Zugabe von Mercurichlorid oder Silbernitrat.

Die Restaktivität des Enzyms nach einer Behandlung bei 30 C bei pH 10 während 60 Minuten in Gegenwart von 1 mmol HgCl₂ oder AgNO., wird in Tabelle 1 gezeigt, wobei die Aktivität in Abwesenheit eines Inhibitors mit 100 angesetzt wird.

b) Zugabe von Kaliumcyanamid, Äthylendiamintetraessigsäure, Jod, Dithiothreitol oder 2-Mercaptoäthanol.

Die Restaktivität des Enzyms nach einer 6-stündigen Behandlung bei 3O⁰C und pH 9 in Gegenwart von 50 itimol.KCN, die Restaktivität des Enzyms nach einer 4-stündigen Behandlung bei 40 C bei pH 10 in Gegenwart von 100 mmol Äthylendiamintetraessigsäure, die Restaktivität des Enzyms nach einer Behandlung bei 40 C bei pH 7 während 1 Stunde in Gegenwart von 1 mmol J„ und die Restaktivität des Enzyms nach einer 1-stündigen Behandlung bei 30⁰C bei pH 9 in Gegenwart von 1 mmol Dithiothreitol oder 2-Mercaptoäthanol wird in Tabelle 1 gezeigt, wobei die Aktivität des Enzyms in Abwesenheit des Inhibitors mit 100 angesetzt wird.

- 13 00 9 8 47/0837

Tabelle 1

Zugegebener Inhibitor Konzentration an Restaktivität

Inhibitor (iranol) des Enzyms (%).

HgCl₂	1
^J2 Dithiothreitol	1 1
2-Mercaptoäthanol	1
KCN	50
Äthylendiamintetra essigsäure AaNO-,	100 1

0 0 0 0 0

0 1

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, wird das Enzym merklich durch HgCl₂/ J₂ _t Dithiothreitol/ 2-Mercaptoäthanol, KCN, Äthylendiamintetraessigsäure und AgNO-, inhibiert.

(ii) Aktivierung:

Es wurde kein das Enzym in besonderer Weise aktivierendes Reagenz ~gefunden.

(iii) Stabilisierung:

Das Enzym wird durch Zugabe von 10 % (V/W) Glyzerin stabilisiert.

(8) Reinigungsverfahren

Feuchte Bakterienzellen werden durch Zentrifugieren der Kulturmischung gesammelt. Nach dem Suspendieren der Bakterienzellen

809847/0837

in 0,05 m Veronal-Pufferlösung (pH 9,0) werden die Zellen durch ültraschallunterkühlung mit Eiswasser zerstört. Dann wird der Niederschlag durch Zentrifugieren gewonnen und die überstehende Flüssigkeit (rohe Enzymlösung) wird gesammelt.

Nach dem Aussalzen mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise, wobei sich ein Niederschlag bei einer 55 %-igen Sättigung bildet, wird durch Zentrifugieren die Abtrennung vorgenommen. Der Niederschlag wird in einer geringen Menge 0,01 m Tris-Hydrochlorsäure-Puffer (pH 8,0) gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch Durchleiten über eine Säule von Sephadex G-200, die zuvor mit einer 0,1 m Lösung Kaliumchlorid (KCl) in 0,01 m Tris-Hydrochlorsäure-Puffer (pH 8,0) ins Gleichgewicht eingestellt wurde, einer GeIfiltrationschromatografie unterworfen.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird über eine Säule einer zuvor mit der vorerwähnten 0,01 m Tris-Hydrochlorsäure-Puf ferlösung, enthaltend KCl, ins Gleichgewicht gebrachte Säule von DEAE-Sephacel gegeben und dann wird sie einer Ionenaustauschchromatografie unterworfen und zwar zuerst (bis das Volumen des Eluats 120 ml erreicht) mit der vorerwähnten, KCl enthaltenden, 0,1 m Tris-Hydrochlorsäure-Puf ferlösung, und dann durch Konzentrationsgradienteneluierung unter Verwendung von 0,2 bis 0,4 m KCl.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird auf eine mit Hydroxyappatit gefüllte Säule gegeben. Bis zu einem Eluierungsvolumen von 200 ml eluiert man mit der vorerwähnten 0,01 m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung, enthaltend KCl. Anschliessend eluiert man stufenweise mit einer Phosphatpufferlösung (pH 8,0) deren Konzentration stufenweise von 0,001 m

809847/0837

bis 0,005 m, 0,01 m, 0,03 m, 0,05 m und 0,07 m erhöht wird. Schliesslich eluiert man mit einer 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 8,0) und sammelt die aktive Fraktion des Enzyms.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird gegen entionisiertes Wasser dialysiert und dann gefriergetrocknet, wobei man ein gereinigtes Enzympulver erhält.

Eine elektrophoretische Messung unter Verwendung von PoIyacrylamidgel bestätigt dass das gereinigte Enzym elektrophoretisch einheitlich ist.

(9) Molekulargewicht

Das Enzym hat ein Molekulargewicht von etwa 225.000 + 9.000, gemessen nach der Methode von Hedrick and Smith (J. L. Hedrick and A. J. Smith: Archives of Biochemistry and Biophysics, 126, 155-164 (1968)).

Bisher hatte man kein Enzym gefunden, das in der Lage war, Methylguanidin in Methylamin und Harnstoff zu zersetzen. Daher ist das Methylguanidin-zersetzende Enzym gemäss der Erfindung ein neues Enzym. Werden Methylguanidin enthaltende Getränke und Nahrungsmittel, die eine schädliche Wirkung auf den menschlichen Körper ausüben, mit diesem Enzym behandelt, so kann das Methylguanidin leicht in harmlose Substanzen zersetzt und entfernt werden und dadurch kann die Sicherheit von Getränken und Nahrungsmitteln durch diese Enzymbehandlung in erheblichem Masse erhöht werden. Darüber hinaus ist es möglich, mittels dieses Enzyms neue Anwendungen

80 9847/0837

zu entwickeln, wie ein Reagenz zur Behandlung von Urämie oder als biochemische Mittel. Die Erfindung ist deshalb wirtschaftlich und technisch von erheblichem Interesse.

Nachfolgend wird das Verfahren zum Entfernen von Methylguanidin aus Methylguanidin enthaltenden Proben beschrieben, bei dem man das vorerwähnte Methylguanidin-zersetzende Enzym einer Methylguanidin enthaltenden Probe zugibt und das Methylguanidin enzymatisch zersetzt.

Zunächst wird die Vorbehandlung der Methylguanidin enthaltenden Probe, die vorgenommen wird vor der Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit der Methylguanidin enthaltenden Probe, erläutert.

Als zu untersuchende Methylguanidin enthaltende Probe kann jede Substanz verwendet werden, die Methylguanidin enthält. Beispiele hierfür sind Extrakte von Hühner-, Rinder-, Walfisch-, Schweine- und Fischfleisch und dergleichen, Nahrungsmittel wie geräucherte Sardinen (Katsuo-bushi), geräucherte Makrelen (Saba-bushi), geräucherter Hering (Urume-bushi) und dergleichen und das Blut von urämischen Patienten.

Von den vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Substanzen werden Fleischextrakte entweder direkt oder nach Verdünnen auf eine geeignete Konzentration mit einem Lösungsmittel, wie es bei der Lebensmittelverarbeitung verwendet wird, z.B. Wasser, Alkohol, Wasser-Alkohol-Mischungen, Emulsionen, Würzlösungen oder dergleichen, behandelt. Geräucherte Fische werden z.B. in Form von Extrakten behandelt, die man erhält indem man geräucherte Fische entweder direkt oder nach Pulverisieren oder Zerkleinern in üblichen Pulverisierungsvorrichtungen oder Zerkleinerungsvorrichtungen, und falls

609847/0837

erforderlich nach Homogenisieren in üblichen Homogenisatoren und dergleichen, mit kaltem Wasser, warmem Wasser oder dergleichen extrahiert.

Blut wird entweder so wie es ist oder nach Verdünnen auf eine geeignete Konzentration mit einer physiologischen Kochsalzlösung verwendet.

Der pH der vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Substanzen muss nicht eingestellt werden. Vorzugsweise wird er jedoch auf 5 bis 12 und insbesondere 6 bis 10 im Falle der vorerwähnten Fleischextrakte oder Nahrungsmittel, wie geräucherte Fische, und auf 7,2 bis 7,6 und insbesondere etwa 7,4 im Falle von Blut durch geeignete pH-anpassende Reagentien, wie Chlorwasserstoffsäure, Natriumhydroxid oder dergleichen eingestellt.

Bei der Behandlung der vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Substanzen wird die Menge des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms in geeigneter Weise eingestellt unter Berücksichtigung des Methylguanidingehaltes in der Methylguanidin enthaltenden Substanz und der Umsetzungsbedingungen.

Die Temperatur, bei welcher eine Methylguanidin enthaltende Substanz durch Methylguanidin-zersetzendes Enzym zersetzt wird, beträgt 80 C oder weniger und vorzugsweise 20 bis 60°C im Falle von Fleischextrakt oder Nahrungsmitteln, wie geräucherten Fischen, und sie beträgt 50°C oder weniger, und vorzugsweise 35 bis 40⁰C im Falle von Blut. Bei diesen Temperaturen lässt man die Methylguanidin enthaltenden Substanzen stehen oder rührt eine ausreichende Zeit, während der sie einer enzymatischen Reaktion unterliegen und harmlose enzymatische Zersetzungsprodukte ergeben.

909847/0837

Nach der Zersetzung von Methylguanidin und Entfernung aus einer Methylguanidin enthaltenden Substanz ist es, sofern erforderlich, zulässig, das Enzym durch abschliessende Massnahmen, wie Erhitzen, Abtrennen oder Entfernen zu inaktivieren und dann den pH des Produktes mit Chlorwasserstoff säure, Natriumhydroxid oder dergleichen auf einen geeigneten Wert einzustellen.

Schliesslich wird das bei der enzymatischen Reaktion verwendete Lösungsmittel in üblicher Weise abgetrennt und entfernt, sofern dies erforderlich ist.

Wie gezeigt, kann Methylguanidin vollständig aus Methylguanidin enthaltenden Nahrungsmitteln abgetrennt und entfernt werden und dadurch kann die Sicherheit des Nahrungsmittels in erheblichem Masse erhöht werden. Weiterhin ist es auch möglich, das im Blut von urämischen Patienten enthaltene Methylguanidin, das auf den menschlichen Körper einen schädlichen Einfluss ausübt, zu zersetzen und es vollständig aus dem Blut zu entfernen.

Nachfolgend wird ein Verfahren zur quantitativen Analyse von in einer Probe enthaltenem Methylguanidin durch Umsetzung des vorerwähnten Methylguanidin enthaltenden Enzyms mit der auf Methylguanidin zu analysierenden Probe und Messen der durch diese umsetzung gebildeten Menge an Methylamin oder Harnstoff gezeigt.

Die Substanz, die quantitativ auf Methylguanidin untersucht werden soll, kann jede Substanz sein, sofern sie Methylguanidin enthält. Beispiele für solche Substanzen sind Fleischextrakte, Nahrungsmittel, wie geräucherte Fische,

809847/0837

Blut, Sera, Urine und dergleichen.

Beim Analysieren von Methylguanidin in geräucherten Fischen verwendet man z.B. einen Extrakt der erhältlich ist_f indem man die geräucherten Fische mit kaltem Wasser, heissem Wasser und dergleichen entweder direkt extrahiert oder nachdem man sie pulverisiert oder zerkleinert hat mittels eines Pulverisators oder eines Serkleinerungsgerätes mit anschliessendem, sofern erforderlich, Homogenisieren mittels eines Homogenisators und dergleichen.

Der pH der vorerwähnten Proben muss nicht eingestellt werden. Vorzugsweise wird er jedoch auf pH 5 bis 12 und insbesondere pH 9 bis 11 durch geeignete pH-anpassende Mittel, wie Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder dergleichen eingestellt.

Die vorerwähnten Proben werden für die quantitative Analyse entweder direkt oder nach Verdünnen auf eine geeignete Konzentration mit Wasser, einer Pufferlösung und dergleichen verwendet.

Dann lässt man ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym mit der wie vorher angegeben vorbereiteten Probe zur Zersetzung von Methylguanidin in Methylamin und Harnstoff reagieren.

Lässt man eine auf Methylguanidin zu analysierende Probe mit Methylguanidin-zersetzendem Enzym reagieren, so wird die Menge des zugegebenen Enzyms entsprechend variiert unter Berücksichtigung des Methylguanidingehaltes der auf Methylguanidin zu analysierenden Probe und der Umsetzungsbedingungen.

09847/0837

Die Temperatur, bei welcher die Probe mit dem Methylguanidin-zersetzenden Enzym zersetzt wird beträgt 80 C oder weniger und vorzugsweise 20 bis 60 C. Bei dieser Temperatur gibt man das Enzym zu der Probe und die Mischung lässt man dann stehen oder man rührt sie während einer ausreichenden Zeit während die enzymatische Reaktion stattfindet und Methylguanidin wird zu Methylamin und Harnstoff enzymatisch gespalten.

Anschliessend kann man den Gehalt an Methylamin oder Harnstoff in dem enzymatischen Zersetzungsprodukt der vorerwähnten Verfahrensweise bestimmen.

Enthält eine mit Methylguanidin-zersetzendem Enzym umzusetzende Probe schon vorher Methylamin, Harnstoff oder analoge Produkte, so wird der Anfangsgehalt der vorher gemessen wurde von dem Gehalt an Methylamin oder Harnstoff, der nach der vorerwähnten enzymatischen Zersetzungsreaktion gemessen wurde, abgezogen.

Zur Bestimmung von Methylamin können alle hierzu geeigneten Verfahren angewendet werden. Dazu gehören beispielsweise (1) ein Verfahren, bei dem man Methylamin mit einer alkalischen, wässrigen Lösung von T.N.B.S. (Natrium-2,4,6-trinitrobenzolsulfonat) umsetzt und colorimetrisch bei 420 nm bestimmt (T.N.B.S. Verfahren von T. Okuyama et al: J. Biochem. 47, 454 (1960), (2) ein Verfahren, bei dem man Methylamin mit Ninhydrinreagenz in einer Zitronensäure-Pufferlösung (pH 5) bei erhöhter Temperatur umsetzt und dann bei 570 nm colorimetrisch bestimmt (E. Yemm et al: Analyst, £0, 209 (1955); und (3) ein Verfahren, bei dem man ein primäres Amin mit o-Phthalaldehyd umsetzt und die Intensität der Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm und einer

9 09847/0837

Fluoreszenzwellenlänge von 4 55 nm bestimmt (M. Roth: Anal. Chem. _4_3, 880 (1971)).

Zur Bestimmung von Harnstoff kann man alle hierfür geeigneten Verfahren anwenden. Dazu gehören beispielsweise (1) ein Verfahren bei dem Harnstoff mit Urease zu Ammoniak und Kohlendioxid zersetzt wird, worauf man dann den Ammoniak durch die Berthelot-Reaktion (IndophenolReaktion) colorimetrisch bestimmt ( Urease-Indophenol-Methode (R. L. Searcy und F. M. Cor: Clin. Chem. Acta, £, 810 (1963)); (2) das Verfahren, bei dem man Harnstoff mit Urease zu Ammoniak und Kohlendioxid zersetzt und dann den Ammoniak colorimetrisch mit Nessler-Reagenz (Urease-Nessler-Methode) bestimmt (M. Saito, T. Uchida, E. Suzuki: Rinsho Kensa, 8, 878 (1964)); und (3) ein Verfahren, bei dem man Harnstoff in Gegenwart von Diacetylmonoxim in einer sauren Lösung unter Ausbildung einer gelben Farbe erhitzt und dann die gelbe Farbe colorimetrisch bestimmt (Fearon-Methode) (W. R. Fearon: Biochem. J. 33/ 902 (1939)) .

Als nächstes ist es erforderlich, die Beziehung zwischen der Menge an Methylamin oder Harnstoff und dem O.D. Wert zu bestimmen und eine Kalibrierungskurve auf Basis dieser Beziehung herzustellen. Daher wurden die folgenden Versuche zur Untersuchung der Beziehung zwischen der Menge an Methy!guanidin in Proben und dem O.D. Wert durchgeführt.

Versuchsbeispiel 1

Bestimmung von Harnstoff nach der Urease-Indophenol-Methode

909847/0837

I. Herstellung des Reagens

(1) Methylguanidin-zersetzende Enzymlösung:

2 1 eines Mediums (pH 7,2) aus 1,0 % (W/V) Glyzerin, 0,2 % (W/V) Methylguanidinsulfat, 0,1 % (W/V) Dinatriumphosphat, 0,1 % (W/V) Magnesiumsulfat, 0,05 % (W/V) Hefeextrakt, 0,01 % (W/V) Eisen(II)sulfat, 0,01 % (W/V) Manganchlorid und Wasser wurden in einem Kultivierungsgefäss eines kleinen Fermentationsgefässes (hergestellt von Iwashiya) eingefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Das Medium wurde mit 20 ml einer Keimkultur von Alcaligenes N-243 (FERM-P Nr. 4369, ATCC 31370), das zuvor 48 Stunden in einem Medium (pH 7,2) der gleichen Zusammensetzung wie oben kultiviert worden war, inokuliert. Dann wurde es einer belüfteten Tauchkultur während 48 Stunden bei 30°C unterworfen.

Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wurde zentrifugiert, wobei man 17g feuchte Bakterienzellen erhielt und diese Zellen wurden in 50 ml einer 0,05 m Veronal-Pufferlösung (pH 9,0) suspendiert und dann durch einen Ultraschallzerkleinerer (hergestellt von der Bronson Co.) 10 Minuten unter Eiskühlung zerstört.

Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und 48 ml einer überstehenden Flüssigkeit (rohe Enzymlösung) (Enzymaktivität: 43,3 Einheiten/ml) wurden gewonnen.

Die rohe Enzymlösung wurde mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise ausgesalzen. Die erhaltene Niederschlagsfraktion wurde in 25 ml Wasser gelöst und gegen 0,05 m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0) Dialysiert, wobei man eine

909847/0837

Methylguanidin-zersetzende Enzymlösung (Enzymaktivität: 60/5 Einheiten/ml) erhielt.

(2) Reagens A (Urease-Pufferlösung):

40 mg Urease (Typ IX, hergestellt von Sigma Co.) und 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz (EDTA-2Na) wurden in 20 ml einer 50 mmol Phosphatpufferiösung (pH 6,5) gelöst.

(3) Reagens B (Phenol-Reagens):

5,0 g Phenol und 25 mg Natriumnitroprussid wurden in destilliertem Wasser gelöst und das Volumen wurde auf 500 ml eingestellt.

(4) Reagens C (Alkali-hypochlorid-Reagens):

2,5 g Natriumhydroxid und 2,5 ml einer Natrium-hypochloridlösung mit einer effektiven Chlorkonzentration von 5 %, wurden in destilliertem Wasser gelöst und das Volumen wurde auf 500 ml eingestellt.

II. Bestimmung des aus Methy!guanidin gebildeten Harnstoffs

Methylguanidinsulfat wurde in 0,05 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferiösung (pH 10,0) in einer solchen Menge

909847/0837

gelöst, dass die Konzentration an Methylguanidin 0, 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 bzw. 0,10 Mikromol betrug. Jeweils 90ul der so erhaltenen Lösung wurden gründlich mit 10ul des vorerwähnten Methylguanidin-zersetzenden Enzyms vermischt und die Misch
ren gelassen.

und die Mischung wurde 30 Minuten bei 37 C stehen und reagie-

Dann wurden 10OuI einer 0,2 m Phosphatpufferlösung und 200ul des Reagens A zu dem so erhaltenen enzymatischen Reaktionsprodukt gegeben. Die entstehende Mischung wurde gründlich gerührt und dann unter stehen.lassen bei 37 C während 20 Minuten umgesetzt.

Zu dem Reaktionsprodukt wurden 5 ml Reagens B und 5 ml Reagens C gegeben. Die Mischung wurde unmittelbar darauf kräftig gerührt und dann 15 Minuten bei 37 C stehen gelassen und dann wurde die Farbe mit einem Colorimeter bei 625 nm bestimmt.

Die Blindprobe wurde bewertet, indem man das vorerwähnte Verfahren wiederholte, mit der Ausnahme, dass 1OuI der vorerwähnten Methylguanidin-zersetzenden Enzymlösung in einem siedenden Wasserbad bei 100°C 5 Minuten lang behandelt wurde und darauf zu 90ul einer 0,05 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) gegeben wurde und die erhaltene Mischung wurde gründlich gerührt und 30 Minuten bei 37 C unter Stehenlassen umgesetzt.

Der Wert der Blindprobe wurde von den O.D. Werten bei allen Mischungen abgezogen. Die Beziehung zwischen den O.D. Werten nach dem Abziehen der Menge von Methylguanidin wird in Fig.2 gezeigt. Fig. 2 zeigt deutlich, dass eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und dem O.D.Wert

9098A7/0837

- 25 -

nach dem Abzug vorliegt, so dass man diese Beziehung befriedigend als Standard-Eichkurve verwenden kann.

Versuchsbeispiel 2

Bestimmung von Methylamin nach der T.N.B.S.-Methode

Methylguanidinsulfat wurde in 0,1 m Natriumcarbonat-Bicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) gelöst, so dass die Menge an Methylguanidinsulfat 0, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 bzw. 0,3 Mikromol betrug. Jeweils 900ul der so erhaltenen Lösung wurden gleichmässig mit 10OuI der gleichen in Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Enzymlösung vermischt. Die erhaltene Mischung ι
Stehenlassen umgesetzt.

Die erhaltene Mischung wurde 30 Minuten bei 37 C unter

Zu dem so erhaltenen enzymatischen Reaktionsprodukt wurden 2 ml einer 0,1 m Borax-Natriumhydroxid-Pufferlösung (pH 9,6) zum Abbrechen der enzymatischen Reaktion gegeben. Dann wurde 1 ml einer 0,4 %-igen wässrigen Lösung von T.N.B.S. zugegeben und die erhaltene Mischung wurde gründlich gerührt und dann genau 23 Minuten bei 37°C umgesetzt und dann wurde die Farbe colorimetrisch bei 420 nm bestimmt.

Diese Farbbildungsreaktion wurde mit einem automatischen Analysator (Typ AC-60 von der Pye Unican Co., Ltd.) durchgeführt.

Die Blindprobe wurde gemessen indem man das vorerwähnte

909847/0837

Verfahren wiederholte rait der Ausnahme, dass 10OuI der gleichen Methylguanidin-zersetzenden Enzymlösung wie in Beispiel 1 5 Minuten auf einem siedenden Wasserbad bei 100⁰C behandelt wurde und dann gleichmässig mit 900 ul einer 0,1 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) vermischt wurde, worauf die Mischung dann 30 Minuten bei 37°C unter Stehenlassen umgesetzt wurde.

Der Wert für die Blindprobe wurde vom O.D.Wert der jeweiligen Mischung abgezogen. Die Beziehung zwischen dem O.D.Wert nach dem Abzug und der Menge von Methylguanidin wird in Fig. 3 gezeigt. Fig. 3 zeigt deutlich, dass eine lineare Beziehung zwischen der Menge an Methylguanidin und dem O.D.Wert nach dem Abzug besteht, so dass man diese Beziehung befriedigend als Standard-Eichkurve verwenden kann.

Wenn der in der vorerwähnten Weise bestimmte O.D.Wert für Methylguanidin oder der O.D.Wert für Harnstoff in eine Standard-Eichkurve eingesetzt wird, die auf Methylamin beruht oder in eine Standard-Eichkurve, die auf Harnstoff beruht, kann man die Menge an Methylguanidin in der Probe bestimmen.

Die Erfindung ist wirtschaftlich und technisch sehr wertvoll, weil man gegenüber bekannten Verfahren ein sehr einfaches Verfahren hat und weil die Zeit, die zur Messung einer Probe erforderlich ist, gegenüber dem Stand der Technik erheblich verkürzt wird. Die Verfahrensweise ist vorteilhaft, weil sie sehr empfindlich ist und weil man eine grosse Anzahl von Proben gleichzeitig untersuchen kann.

Nachfolgend wird ein konkretes Verfahren zur Herstellung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms gemäss der Erfindung beschrieben.

909847/0837

Als Bakterien, die erfindungsgemäss verwendet werden können, kommen alle Bakterien in Frage, die zum Genus Alcaligenes gehören und die Fähigkeit haben ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym zu bilden. Auch Varianten- oder Mutantanstämme dieser Bakterien können verwendet werden. Beispiele für Bakterien vom Genus Alcaligenes mit der Fähigkeit ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym zu bilden, sind Alcaligenes N-81 und Alcaligenes N-243.

Alcaligenes N-81 und Alcaligenes N-243 sind Bakterien, die von den Erfindern neu aus Bodenproben isoliert wurden. Ihre bakteriologischen Eigenschaften werden nachfolgend beschrieben. Die meisten der bakteriologischen Eigenschaften sind gemessen worden aufgrund der im Manual of Microbiological Methods (1959, McGraw-Hill Book Co.) beschriebenen Methoden.

Bakteriologische Eigenschaften von Alcaligenes N-81

(a) Morphologie:

Mikroskopische Untersuchung (kultiviert in einem Boullion-Agarmedium während 48 Stunden bei 30⁰C):

1. Form und Grosse der Zellen: kurze Stäbchen mit einer Grosse von 1-2 χ 0,5 um .

2. Polymorphismus der Zelle: Es wird kein PoIymorphismus festgestellt.

3. Motilität: Beweglich mittels einer oder mehrerer peritrizioser Geiseln.

90 9847/0837

4. Sporen: keine Sporenbildung

5. Gramfärbung: negativ

6. Säureresistenz: negativ

(b) Wachstum in verschiedenen Medien:

1. Boullion-Agar-Plattenkultur: Kreisförmige Kolonien rait einem Durchmesser von 1 bis 2 mm werden bei 48-stündiger Kultivierung bei 30⁰C gebildet. Die Oberfläche ist flach und hat konvexe runde hervorstehende Stellen. Die Peripherie ist rund. Die Kolonien erscheinen gelblich glänzend.

2. Boullion-Agar-Schrägkultür: Zeigt ein fadenförmiges mittleres Wachstum bei 48-stündiger Kultivierung bei 30⁰C. Die Oberfläche ist flach und gelblich glänzend.

3. Boullion-Tauchkultur: Beim 48-stündigen Stehen der Kultur bei 30⁰C wird

mit Sedimenten gebildet.

der Kultur bei 30 C wird eine geringe Trübung

4. Boullion-Gelatine-Stichkultur (step culture): Bei 42-tägigem Stehen bei 20 C wächst es etwa 1 cm von der Oberfläche des Mediums ohne Verflüssigung von Gelatine.

5. Lakmus-Milchkultur: Bei 14-tägigem Stehen bei 30°C wird das Medium etwa
lierung der Lakmus-Milch.

30 C wird das Medium etwa alkalisch ohne Koagu-

9 09847/0837

(c) Physiologische Eigenschaften

1. Reduktion von Nitraten: beobachtet

2. Denitrifizierungsreaktion: geringfügig

3. MR-Test:"negativ

4. VP-Test: negativ

5. Bildung von Indol: nicht beobachtet

6. Bildung von Wasserstoffsulfid: nicht beobachtet

7. Hydrolyse von Stärke: nicht-beobachtet

8. Verwendung von Zitronensäure: beobachtet (Anwendung des Christensen-Mediums)

9. Anorganische Stickstoffquellen: verwendet (Nitrate, Ammoniumsalze)

10. Bildung von Pigmenten: nicht beobachtet

11. Urease: positiv

12. Katalase: negativ

13. Bereich der Wachstumsbedingungen: Temperatur: 15-4O°C

pH: 6-10

14. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerobisch

15. O-F-Test (Hugh Leifson-Methode): negativ

16. Verwendung von Kohlenstoffquellen: Kohlenstoff quellen, wie L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Pructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glyzerin, Stärke und dergleichen werden verbraucht. Es bildet sich weder eine Säure noch ein Gas.

Alcaligenes N-81 ist beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Japan als FERM-P Nr. 4368 und beim American Type Culture Collection als ATCC 31369 hinterlegt worden.

909847/08 3 7

Bakteriologische Eigenschaften von Alcaligenes N-2.43

(a) Morphologie:

Mikroskopbeobachtung (kultiviert in einem Boullion-Agarmedium bei 30°C während 48 Stunden)

1. Form und Grosse der Zellen: kurze Stäbchen mit einer Grosse von 1-2 χ 0,5 mm

2. Polymorphismus der Zelle: Kein Polymorphismus beobachtet.

3. Motilität: Beweglich mittels einer oder mehrerer peritrizioser Geiseln.

4. Sporen: keine Sporenbildung

5. Gramfärbung: negativ

6. Säureresistenz: negativ

(b) Wachstum in verschiedenen Medien:

1. Boullion-Agar-Plattenkultur: Beim 48-stündigen Kultivieren bei 30⁰C bilden sich kreisförmige Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm. Die Oberfläche ist flach und hat konvexe runde hervorstehende Stellen. Die Peripherie ist kreisförmig. Alle Kolonien haben einen gelblichen Glanz.

2. Boullion-Agar-Schrägkultür: Beim 48-stündigen

909847/0837

Kultivieren bei 30 C erfolgt fadenförmiges Wachstum. Die Oberfläche ist flach mit einem gelblichen Glanz.

3. Boullion-Tauchkultur: Bei einer bei 30⁰C während 48 Stunden stehenden Kultur bildet sich eine schwache Trübung mit Sedimenten.

4. Boullion-Gelatine-Stichkultur: Bei 42-stündigem Stehen bei 20 C findet ein Wachstum bis zu etwa 1 cm von der Oberfläche des Mediums statt ohne Verflüssigung von Gelatine.

5. Lacmus-Milch-Kultur: Beim 14-tägigen Stehen bei 30°C wird das Medium etw Lacmus-Milch zu koagulieren.

bei 30°C wird das Medium etwas alkalisch ohne

(c) Physiologische Eigenschaften:

1. Reduktion von Nitraten: beobachtet

2. Denitrifizierungsreaktion: etwas beobachtet

3. MR-Test: negativ

4. VP-Test: negativ

5. Bildung von Indol: nicht beobachtet

6. Bildung von Wasserstoffsulfid: nicht beobachtet

7. Stärkehydrolyse: nicht beobachtet

8. Verwendung von Zitronensäure: beobachtet (Christensen-Medium wurde verwendet)

9. Anorganische Stickstoffquellen: verwendet (Nitrate und Ammoniumsalze)

10. Bildung von Pigmenten: nicht beobachtet

11. Urease: positiv

809847/0837

12. Katalase: negativ

13. Bereich der Wachstumsbedingungen: Temperatur: 15-4O°C

pH: 6,5-9,0

14. Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerobisch

15. O-F-Test (Hugh Leifson-Methode): negativ

16. Verwendung von Kohlenstoffquellen: Kohlenstoff quellen, wie L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glyzerin, Stärke und dergleichen werden verwendet. Es bildet sich dabei weder Säure noch ein Gas.

Alcaligenes N-243 ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Sciene and Technology, Japan als FERM-P Nr. 4369 und beim American Type Culture Collection (ATCC) als ATCC 31370 hinterlegt worden.

Vergleicht man die vorerwähnten charakteristischen bakteriologischen Eigenschaften von Alcaligenes N-81 und Alcaligenes N-243 mit der Klassifizierung gemäss Bergey's Mannual of Determination Bacteriology, 7. Ausgabe (1957) und 8. Ausgabe (1974), so kann man feststellen, dass diese beiden Bakterien zum Genus Alcaligenes gehören, weil sie hinsichtlich der Gramfärbung negativ sind, mittels peritriziöser Geiseln beweglich sind, Lakmus-Milch etwas alkalisch machen und kurze aerobische Bazillen sind.

Weiterhin werden diese beiden Bakterienstämme als analog zu Alcaligenes faecalis angesehen, weil sie Nitrate und

909847/0837

Ammoniumsalze als einzige anorganische Stickstoffquellen verwenden, während sie keine Indole bilden und weil sie verschiedene Kohlenstoffquellen ohne Bildung von Säuren oder Gasen verwenden. Jedoch sind diese beiden Bakterienstämme unterschiedlich von Alcaligenes faecalis darin, dass sie Urease bilden und dass sie Harnstoff hydrolysieren. Sie sind deshalb neue Stämme und gehören zum Genus Alcaligenes.

Bei der Herstellung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms unter Verwendung der erfindungsgemässen Bakterien können übliche Festkulturen angewendet werden. Vorteilhafter ist es jedoch, Flüssigkulturen anzuwenden.

Als gemäss der Erfindung verwendetes Kulturmedium können solche verwendet werden, wie sie zur Kultivierung von Bakterien vom Genus Alcaligenes verwendet werden. Ein bevorzugtes Medium erhält man z.B. indem man wenigstens eine Art eines anorganischen Salzes, wie Mangansulfat, Manganchlorid, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Eisen(II)sulfat, Eisen(III)-sulfat. Eisen(Ilchlorid), Eisen(III)chlorid, Phosphate und dergleichen zu wenigstens einer Art einer organischen oder anorganischen Stickstoffquelle, wie Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maismeische, Sojabohnenmeische, Weizenkleie, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und dergleichen zugibt und, erforderlichenfalls, eine geeignete Kohlenstoffquelle, wie Zucker, ein Vitamin und dergleichen, zugibt.

Gibt man das Hydrochlorid oder Sulfat von Methylguanidin zu dem vorerwähnten Kulturmedium in einer Menge von etwa 0,01 % (W/V) oder mehr und vorzugsweise von 0,1 bis 1,0 % (W/V), bezogen auf die Gesamtmenge des Mediums, so kann die Ausbeute an Methylguanidin-zersetzendem Enzym erheblich erhöht werden.

909847/0837

Der Anfangs-pH-Wert des Mediums wird auf 6,5 bis 9,0 eingestellt. Die Temperatur bei der Kultivierung beträgt 25 bis 37°C und vorzugsweise etwa 30 C. Die Dauer der Kultivierung betragt 10 Stunden oder mehr. Vorzugsweise wird die Kultivierung aerobisch in einem flüssigen Medium unter Anwendung einer belüfteten Tauchkultur, Schüttelkultur oder dergleichen durchgeführt.

Nach Beendigung der Kultivierung wird das Methylguanidinzersetzende Enzym aus dem Kulturmedium gesammelt und hierfür kann man übliche Verfahren zum Sammeln von Enzymen anwenden.

Da das erfindungsgemässe Enzym ein solches ist, das hauptsächlich in den Bakterienzellen vorkommt, ist es bevorzugt, die Bakterienzellen aus dem Kulturmedium durch Filtrieren, Zentrifugieren und dergleichen abzutrennen und dann das Enzym aus den Bakterienzellen zu gewinnen. Obwohl man die Bakterienzellen so wie sie sind verwenden kann, ist es mehr bevorzugt, sie nach Zerstörung durch irgendein Zerstörungsverfahren, wie Ultraschall, eine französische Presse, eine Dyno-Mühle oder dergleichen, zu zerstören, oder die Bakterienzellwände durch ein die Zellwände löslich machendes Enzym, wie Lysocym, aufzulösen.

Die erwähnten Bakterienzellen oder deren Zerstörungsprodukte oder die Produkte, die:'man durch Auflösung der Zellwandungen erhält, werden dann mit Wasser, einer Pufferlösung oder einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert. Das Extrakt kann so, wie es ist, als rohe Enzymlösung verwendet werden. Sonst wird ein rohes Enzympulver aus dem Extrakt durch eine geeignete Verfahrensweise, wie Gefriertrocknung, Ausfällen mit Alkohol, Ausfällen mit Aceton oder

- 35 909847/0837

dergleichen hergestellt. Um eine gereinigte Zubereitung
des Enzyms aus der vorerwähnten rohen Enzymlösung oder dem rohen Enzympulver zu erhalten, können verschiedene Verfahren angewendet werden, wie Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex oder Biogel, eine Adsorptions-Eluierungs-Methode unter Verwendung von Ionenaustauschern, elektrophoretische Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamidgel, eine Adsorptions-Eluierungs-Methode unter Verwendung
von Hydroxyappatit, eine Sedimentierungsmethode, wie
Sucrose-Dichtegradienten-Zentrifugierung, Affinitatschromatografie und Fraktionierungsverfahren unter Verwendung
von Molekularsieben, Membranen, Hohlfädenmembranen und dergleichen oder einer Kombination solcher Verfahren, und auf diese Weise erhält man gereinigte Enzymproben.

In den nachfolgenden Beispielen, die nicht begrenzend
auszulegen sind, wird die Erfindung beschrieben.

Beispiel 1

2 1 eins Kulturmediums (pH 7,2) aus 1,0% (W/V) Glyzerin, 0,2 (W/V) Methylguanidinsulfat, 0,1 % (W/V) Dinatriumphosphat, 0,1 % (W/V) Magnesiumsulfat, 0,05 % (W/V) Hefeextrakt, 0,01 % (W/V) Eisen(II)sulfat, 0,01 % (W/V) Manganchlorid und Wasser wurden in einen gerührten kleinen Fermentator (hergestellt von der Iwashiya Co.) gefüllt und in einem Autoklaven sterilisiert. Das Ganze wurde dann mit 20 ml einer Keimbakterienlösung, hergestellt durch Kultivierung von Alcaligenes N-243 (FERM-P Nr. 4396, ATCC 31370) in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie vorher angegeben (pH 7,2) während 48
Stunden inokuliert und dann einer belüfteten Tauchkultur bei

909847/0837

30°C während 48 Stunden unterworfen.

Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde abzentrifugiert, wobei man 17g feuchter Bakterienzellen erhielt. Diese Zellen wurden in üblicher Weise zerstört und dann zentrifugiert, wobei man 85 ml einer rohen Enzymlösung (Enzymaktivität: 27 Einheiten/ml) als überstehende Flüssigkeit erhielt.

Die rohe Enzymlösung wurde in üblicher Weise mit Ammoniumsulfat ausgesalzen. Der bei einer 55 %-igen Sättigung gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und einer GeIfiltrationschromatografie unterworfen, indem man ihn über eine mit Sephadex G 200 gefüllte Säule gab, die vorher mit einer geringen Menge einer Lösung von HCl (0,1 m) in 0,01 m Tris-hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0) ins Gleichgewicht gebracht worden war.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird über eine mit DEAE-Sephacel gefüllte Säule, die vorher mit der gleichen Lösung von KCl in Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung wie vorstehend erwähnt, ins Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben und einer Ionenaustauschchromatografie unterworfen unter Verwendung der gleichen KCl-Lösung in Tris-Hydrochlorsäure-Puf ferlösung wie vorher angegeben, bis die Menge des Eluats 120 ml erreicht hatte und anschliessend durch die Konzentrationsgradienten-Eluierungsmethode bei einer Kaliumchloridkonzentration von 0,2 bis 0,4 m.

Die so erhaltene aktive Fraktion wurde auf einer mit Hydroxyappatit gefüllten Säule adsorbiert. Unter Verwendung einer 0,3 m Lösung von KCl in 0,01 m Tris-Hydrochlorsäure-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 200 ml erreichte, einer 0,01 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats

Ö09847/0837

350 ml erreichte, einer0,05 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8/0) bis die Menge des Eluats 500 ml erreichte, einer0,01 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 650 ml erreichte, einer0,03 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis die Menge des Eluats 840 ml erreichte, einer0,05 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) bis es 990 ml erreichte, einer0,07 m Phosphat-Pufferlösung bis es 1120 ml erreichte und einer0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) wurde anschliessend eine aktive Fraktion des Enzyms gewonnen.

Die so erhaltene aktive Fraktion wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei man 5 mg des reinen Pulvers des Enzyms (Enzymaktivität: 46 Einheiten/ mg) erhielt.

Beispiel 2

10 ml eines Kulturmediums (pH 7,2) aus 1/0 % (W/V) Glyzerin, 0,4 % (W/V) Methylguanidinsulfat, 0,1 % (W/V) Dinatriumphosphat, 0,1 % (W/V) Magnesiumsulfat, 0,05 % (W/V) Hefeextrakt, 0,01 % (W/V) Eisen(II)sulfat, 0,01 % (W/V) Manganchlorid und Wasser wurden in ein grosses Reagenzglas gegeben und in einem Autoklaven sterilisiert. Diese Lösung wurde mit einer Platinspatelspitzenmenge Alcaligenes N-81 (FERM-P Nr. 4368,ATCC 31369) aus einer vorhandenen Schrägkultur inokuliert und einer Schüttelkultur während 72 Stunden bei 30 C in einem Reagenzglasrüttler (hergestellt von der Iwashiya Co.) unterworfen.

Die erhaltene Kulturflüssigkeit wurde abzentrifugiert und

$09847/0837

die Bakterienzellen wurden gesammelt. Die Zellen wurden in 4 ml einer 0,05 m Veronal-Pufferlösung (pH 9,0) suspendiert und dann 10 Minuten durch einen Ultraschallzersetzer (hergestellt von der Bronson Co.) unter Eiskühlung zerstört. Dann wurde der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt wobei man 3,8 ml einer rohen Enzymlösung (Enzymaktivität: 0,252 Einheiten/ml) als überstehende Flüssigkeit erhielt.

Beispiel 3

Zersetzungsversuch von Methylguanidin Versuchsverfahren:

Die gemäss Beispiel 2 erhaltene rohe Enzymlösung wurde mit Ammoniumsulfat in üblicher Weise ausgesalzen und dann in Wasser gelöst, wobei man eine wässrige Lösung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms (67,2 Einheiten/ml) erhielt.

50ul dieser wässrigen Lösung wurden zu 0,95 ml einer Lösung von Methylguanidinsulfat in 0,1 m Tris-Hydrochlorsäure Pufferlösung mit einer Methylguanidinsulfat-Konzentration von 834 ug/dl (berechnete Konzentration von Methylguanidin: 500 ug/dl) gegeben. Die Mischung wurde gründlich gerührt und dann 60 Minuten unter Stehenlassen enzymatisch bei 37°C umgesetzt. Die Menge an Methylguanidin vor und nach der enzymatischen Reaktion wurde nach der nachfolgend beschriebenen Verfahrensweise bestimmt. Fig. 4A zeigt das Flüssigchromatogramm einer Probe vor der enzymatischen Reaktion und Fig. 4B zeigt das Flüssigchromatogramm nach der Reaktion.

909847/0837

Die zu analysierenden Proben wurden hergestellt indem man 10OuI einer 0,6-in Perchlorsäure zu 100ul jeder Probe gab, die Mischung mit 8000 üpm während 10 Minuten in üblicher Weise zentrifugierte und dann 100ul einer 0,5 η Lösung von Natriumhydroxid in 50 %-igem Methanol zu lOOiil der deproteinisierten überstehenden Flüssigkeit gab.

Die Analyse von Methylguanidin wurde nach der auf Seite 79 der Synopsis des 3. Symposiums über analytische Chemie von biologischen Komponenten (14. Oktober 1977, veröffentlicht von der Japanese Pharmacological Society) durchgeführt mit der Ausnahme, dass anstelle der 0,15 m Acetat-Pufferlösung eine 0,5 η Natriumhydroxidlösung in 50 %-igem Methanol verwendet wurde, dass anstelle der 1 η Lösung von Natriumhydroxid in 50 %-igem Äthanol eine 1 η wässrige Lösung von Natriumhydroxid verwendet wurde und dass die 1 mmol äthanolische Lösung von 9,10-Phenanthrachinon durch eine 0,2 mmol Lösung von 9,1O-Phenanthrachinon in Dimethylformamid ersetzt wurde.

Ergebnis der Messung:

Wie in dem Flüssigchromatogramm der Fig. 4A und 4B gezeigt wird, wurde ein Methylguanidin-Peak M bei einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe festgestellt, die durch Auflösen von Methylguanidinsulfat in O,1 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung hergestellt worden war, und zwar vor der Umsetzung mit dem Methylguanidin-zersetzenden Enzym (Fig. 4A) während man kein Methylguanidin-Peak nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe feststellte, nachdem die Umsetzung mit dem Enzym stattgefunden hat (Fig. 4B). Dies zeigt, dass das

909847/0837

Methylguanidin zersetzt und vollständig durch Umsetzung mit dem Methylguanidin-zersetzenden Enzym in einer Lösung, die hergestellt wurde durch Auflösen von Methylguanidinsulfat, in einer 0,1 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung, zersetzt und entfernt werden kann.

Beispiel 4

Prüfverfahren:

1 g Rindfleischextrakt wurde mit Wasser verdünnt und der pH wurde mit Natriumhydroxid auf 1O,O eingestellt und das Gesamtvolumen wurde auf 10 ml mit Wasser eingestellt.

Zu 0,95 ml dieser wässrigen Lösung von "Rindfleischextrakt wurden 50 ul einer wässrigen Lösung von Methylguanidin-ζersetzendem Enzym gemäss Beispiel 3 (67,2 Einheiten/ml) gegeben. Die Mischung wurde gründlich gerührt und dann enzymatisch bei 40°C 20 Minuten unter Stehenlassen umgesetzt. Die Mengen an Methylguanidin vor und nach der Umsetzung wurden nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. Fig. 5Λ zeigt das Flüssigchromatogramm vor der enzymatischen Umsetzung und Fig. 5B zeigt das Flüssigchromatogramm nach der Umsetzung.

Ergebnis der Messung:

Wie in den Flussigchromatogrammen in den Fig. 5A und 5B gezeigt wird, wurde ein Methylguanidin-Peak M nach einer

909847/0837

Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe vor der umsetzung rni't Methylguanidin-zersetzendem Enzym (Fig. 5A) gefunden, während kein Methylguanidin-Peak nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe nach der Umsetzung mit dem Enzym (Fig. 5B) gefunden wurde. Dies zeigt, dass man Methylguanidin zersetzen und vollständig entfernen kann durch Umsetzung des Methylguanidinzersetzenden Enzyms mit Rinderextrakt.

Beispiel 5

Prüfverfahren:

25 g geräucherte Sardinen wurden mit einem üblichen Zerkleinerungsgerät zerkleinert, mit 100 ml heissem Wasser von 60⁰C vermischt und 5 Minuten mit einem Homogenisator homogenisiert. Das homogenisierte Produkt wurde unter Rühren Minuten bei 50°C extrahiert und der Extraktionsrückstand wurde abgesaugt, wobei man ein Heisswasserextrakt von geräucherten Sardinen (pH 6,1) erhielt.

Dann wurde der Extrakt mit 1 ml einer wässrigen Lösung des in Beispiel 3 verwendeten Methylguanidin-zersetzenden Enzyms vermischt und 18 Stunden bei 5°C unter Stehenlassen enzymatisch umgesetzt. Die Mengen an Methylguanidin vor und nach der Umsetzung wurden nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. Fig. 6A zeigt das Flüssigchromatograinm vor der enzymatischen Umsetzung und Fig. 6B zeigt das Flüssigchromatograinm nach der Umsetzung.

809847/0837

Ergebnisse der Messung:

Wie aus dem Flussigchromatogramm der Fig. 6A und 6B ersichtlich wird, wurde ein Methylguanidin-Peak M nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe des Heisswasserextraktes von geräucherten Sardinen gefunden, bevor diese mit Methylguanidin-zersetzendem Enzym umgesetzt worden waren (Fig. 6A), während kein Methylguanidin nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in der Probe nach der Umsetzung mit dem Enzym (Fig. 6B) gefunden wurde. Dies zeigt, dass man Methylguanidin durch Umsetzung eines Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit einem Heisswasserextrakt von geräucherten Sardinen zersetzen und vollständig entfernen kann.

Beispiel 6

Herstellung von fixiertem Enzym:

Die wässrige Lösung des gemäss Beispiel 3 erhaltenen Enzyms wurde bei 4°C gegen eine 0,1 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0), enthaltend 0,5 m Natriumchlorid, dialysiert, wobei man eine Enzymlösung mit einer Enzymaktivität von 63,8 Einheiten/ml erhielt. Zu 10 ml dieser Lösung wurde 1 g aktivierte CH-Sepharose 4B (Träger, hergestellt von Pharmacia Co., Ltd.) angequollen mit 0,001 m Chlorwasserstoffsäure, gegeben.

Die Mischung wurde bei 20°C 2 Stunden unter schwachem Rühren umgesetzt und dabei kombinierte sich das Methylguanidin-zersetzende

- 43 -

Ö098A7/0837

Enzym mit dem Träger. Das erhaltene Produkt wurde mit der gleichen Pufferlösung wie vorher gewaschen, in einer 1 m Lösung von Äthanolamin (pH 8,0) suspendiert und 2 Stunden bei 25°C stehen gelassen und dann auf einem Glasfilter filtriert.

Das beim Filtrieren gesammelte Produkt wurde mit 0,1 m Acetat-Pufferlösung (pH 6,2) gewaschen und anschliessend mit einer 0,1 m Tris-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 7,4), wobei man ein fixiertes Enzym (212 Einheiten/g) erhielt.

Prüfverfahren:

0,2 g des obigen fixierten Enzyms wurden zu 1 ml Serum eines urämischen Patienten (Methylguanidin-Konzentration 196 ng/dl; pH 7,4) gegeben und die Mischung wurde dann enzymatisch bei 37°C während 30 Minuten unter schwachem Rühren umgesetzt. Die enzymatische Umsetzung wurde durch Abfiltrieren des fixierten Enzyms abgebrochen.

Die Menge an Methylguanidin vor und nach der enzymatischen Umsetzung wurde nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren gemessen. Fig. 7A zeigt das Flüssigchromatogramm vor der enzymatischen Umsetzung und Fig. 7B zeigt das Flüssigchromatogramm nach der Umsetzung.

Ergebnisse der Messung:

Aus den Flussigchromatogrammen von Fig. 7A und 7B wird ersichtlich, dass man ein Methylguanidin-Peak M nach einer Eluierungszeit von 12 Minuten und 10 Sekunden in dem Serum

Ö098A7/0837

des urämischen Patienten vor dessen Umsetzung mit dem Methylguanidin-zersetzenden Enzym findet (Fig. 7A) während kein Methylguanidin-Peak nach einer Eluierungszeit von Minuten und 10 Sekunden in der Probe gefunden wurde, die mit dem Enzym umgesetzt worden war (Fig. 7B). Dies zeigt, dass man durch Umsetzung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms mit dem Serum eines urämischen Patienten Methylguanidin zersetzen und vollständig entfernen kann.

Beispiel 7

1 g Rindfleischextrakt (hergestellt von Difco Co.) wurde mit 1 ml einer 1 η Natriumhydroxidlösung vermischt und dazu wurde noch eine 0,05 m Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Pufferlösung (pH 10,0) zum vollständigen Auflösen des Rinderextraktes gegeben. Das Gesamtvolumen wurde mit der Pufferlösung auf 10 ml eingestellt.

0,9 ml der so erhaltenen Lösung wurden gründlich mit 100ul der in Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Methylguanidinzersetzenden Enzymlösung vermischt und die erhaltene Mischung Wurde unter Stehenlassen 30 Minuten bei 37°C umgesetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch gründlich mit 200 ul einer 1 η Phosphorsäure und 0,8 ml einer O,05 m Phosphat-Pufferlösung (pH 6,6) vermischt. Nach der im Beispiel 1 erwähnten Urease-Indophenol-Methode wurden 200ul Reagens A zu 200 ul der vorerwähnten Mischung gegeben und dann wurde diese in der gleichen Weise wie im Versuchsbeispiel 1 beschrieben und behandelt, um den O.D.Wert zu messen. Der O.D.Wert wurde mit 0,898 bestimmt.

809847/0837

2913578

Die Blindprobe wurde gemessen indem man das vorerwähnte Verfahren wiederholte, mit der Ausnahme, dass 100ul der Methylguanidin-zersetzenden Enzymlösung verwendet wurden, die vorher 5 Minuten auf einem siedenden Wasserbad mit 100⁰C behandelt worden waren. Der O.D.Wert der Blindprobe betrug 0,774.

Dann wurde die Menge an Methylguanidin bestimmt, indem man den Rest-O.D.-Wert, erhalten nach Abzug des Blind-O.D.-Wertes von dem gefundenen O.D.Wert mit der Standardkalibrierungskurve, erhalten gemäss Versuchsbeispiel 1, verglich. Dabei wurde festgestellt, dass 200 ul des. Rindfleischextraktes 0,011 Mikromol Methylguanidin enthielten μηα dass der Gehalt an Methylguanidin 89,3 ug/1 g Rindfleischextrakt betrug.

00)9847/0837

Leerseite

Claims

HOFFMANN · EITLE &. PAKTNER DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · DIPL.-ING. W.EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · Dl PL.-ING. W. LEHN DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 (STERN HAUS) · D-8000 MO NCHEN 81 · TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E) . 32 085 o/wa KIKKOMAN SHOYU CO. LTD., NODA-SHI / JAPAN Methylguanidin-zersetzendes Enzym und Verfahren zu dessen Herstellung, sowie dessen Verwendung zur Bestimmung von Methylguanidin PATENTANSPRÜCHE

1. Ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym.

2. Methylguanidin-zersetzendes Enzym gemäss Anspruch 1 mit der Fähigkeit Methylguanidin in Metylamin und Harnstoff zu zersetzen mit einem optimalen pH-Bereich von 10,9 bis 12,3 und einem stabilen pH-Bereich von 5,0 bis 10,6.

3. Verfahren zum Entfernen von Methylguanidin aus Methylguanidin enthaltenden Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man das Methylguanidin-zersetzende Enzym zu der Methylguanidin enthaltenden Probe gibt und das Methylguanidin enzymatisch zersetzt.

909847/0837

4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Methylguanidin enthaltende Probe ein Extrakt von Hühner-, Rinder-, Walfisch-, Schweine- und/oder Fischfleisch, geräucherten Sardinen, Makrelen oder Hering, oder dem Blut von urämischen Patienten ist.

5. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass die enzymatische Zersetzung bei einer Ti
führt wird.

bei einer Temperatur von 80 C oder niedriger durchge-

6. Verfahren zur quantitativen Analyse von Methylguanidinproben, dadurch gekennzeichnet , dass man das Methylguanidin enthaltende Enzym von Anspruch mit der auf Methylguanidin zu analysierenden Probe umsetzt und die Menge an bei der Umsetzung gebildetem Methylamin oder Harnstoff misst.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus Fleischextrakten, geräucherten Fischen, Blut, Serum und/oder Urin stammt.

8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass die enzymatische Zersetzung bei e

wird.

bei einer Temperatur von 80 C oder darunter durchgeführt

9. Verfahren zur Herstellung des Methylguanidin-zersetzenden Enzyms gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bakterium vom Genus Alcaligenes mit

909347/0837

der Fähigkeit, ein Methylguanidin-zersetzendes Enzym zu bilden, kultiviert und aus der Kulturmischung das gebildete Methylguanidin-zersetzende Enzym sammelt.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass die Kultivierung in einem 0,01 % (W/V) oder mehr, bezogen auf die gesamte Menge des Mediums, Methylguanidinsulfat oder -hydrochlorid enthaltendem Medium durchgeführt wird.

11. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass die Kultivierung bei einer Temperatur von 25 bis 37°C während 10 Stunden oder mehr in einer Flüssigkultur durchgeführt wird.

12. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass das zum Genus AlcaIigenes gehörende Bakterium Alcaligenes N-81 (ATCC 31369, FERM-P Nr. 4368) oder Alcaligenes N-243 (ATCC 31370, FERM-P Nr. 4369) ist.

909847/0837