DE2748036C2 - Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/und β-Phosphoglucose-mutase und Verwendung derselben - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/und β-Phosphoglucose-mutase und Verwendung derselbenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/undjß-Phosphoglucosemutase
aus Mikroorganismen und die Verwendung der so erhaltenen Enzyme.
Es ist bekannt, daß Maltose-phosphorylase in Neisseria meningitidis (J. Biol. Chem. 199, 153 (1952)), in
nichtidentifizierten Bierlactobacillen (Biochem. J. 78,204 (1961)) und in Lactobacillus brevis IFO 3345 = ATCC
8287 (Agr. Biol. Chem. 37, 2813 (1973)) vorkommt und daraus gewonnen werden kann.
Das Vorkommen von jß-Phosphorglucose-mutase ist bekannt in Kaninchenmuskeln, Hefe und Neisseria
meningitidis (J. Biol. Chem. 236, 2186 (1961)) sowie Lactobacillus brevis ATCC 8287.
Die beiden genannten Enzyme sind technisch von Interesse, da sie gemeinsam zur Bestimmung der
a-Amylase, einem diagnostisch sehr wichtigen Enzym, verwendet werden können. Diese Bestimmung basiert
auf der Hydrolyse von Stärke durch die e-Amylase unter Bildung von Maltose. So gebildete Maltose wird von
der Maltose-phosphorylase (MP) in Gegenwart von Phosphat in Glucose undjS-Glucose-1-phosphat gespalten,
letzteres wird von der ^-Phosphoglucose-mutase (/?PGM) in a-Glucose-6-phosphat umgewandelt, welches
dann in bekannter Weise in Gegenwart von Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) NAD zu NADH
teduziert und dabei selbst in 6-Phosphogluconat übergeht. So gebildetes NADH ist damit ein Maß für die
a-Amylaseaktivität.
30- Für klinische Tests mit kombinierten enzymatischen Reaktionen, in denen also mehrere Enzyme eingesetzt
werden, spielt es eine entscheidende Rolle, ob die benötigten Enzyme leicht zugänglich sind und ohne große
Mühe in eine für die Analyse geeignete Form gebracht werden können. Denn der Preis derartiger enzymatischer
Bestimmungen wird im wesentlichen durch den Preis der hierfür verwendeten Enzyme bestimmt. Besonders
günstig ist es dabei, wenn aus einem einzigen Ausgangsmaterial mehrere für einen bestimmten Test
verwendete Enzyme gleichzeitig gewonnen werden können.
Unter den bisher bekannten Ausgangsmaterialien kommen die beiden oben erwähnten Enzyme zwar in
Neisseria meningitidis gemeinsam in einer Form vor, die ihre Anwendung in einem a-Amylase-Test ohne
vorherige Trennung gestattet. Ein beträchtlicher Nachteil besteht jedoch darin, daß es sich dabei um einen
äußerst gefährlichen und virulenten Mikroorganismus handelt, der nur mit größten Vorsichtsmaßnahmen
als Quelle für industriell zu verwendende Enzyme verwendet werden kann. Außerdem sind die gefundenen
Aktivitäten der genannten Enzyme in diesem Mikroorganismus unbefriedigend. Lactobacillus brevis ATCC
8287 enthält zusätzlich a-Glucosidase, ein bei der Verwendung störendes Enzym, so daß hier eine Aufreinigung
unumgänglich ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von MP und gegebenenfalls auchjS-PMG zu schaffen, welches die Verwendung des gefährlichen Neisseria meningitidis vermeidet und aus einem leicht zugänglichen harmlosen Ausgangsmaterial eine einfache Gewinnung der Enzyme gestattet. Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren der oben genannten Art zu schaffen, bei welchem ein Mikroorganismus verwendet wird, dessen Rohextrakt direkt für die a-Amylasebestimmung eingesetzt werden kann, da er ausreichend hohe Aktivitäten der Enzyme MP und.,S-PMG enthält und keiner Aufreinigung bedarf.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von MP und gegebenenfalls auchjS-PMG zu schaffen, welches die Verwendung des gefährlichen Neisseria meningitidis vermeidet und aus einem leicht zugänglichen harmlosen Ausgangsmaterial eine einfache Gewinnung der Enzyme gestattet. Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren der oben genannten Art zu schaffen, bei welchem ein Mikroorganismus verwendet wird, dessen Rohextrakt direkt für die a-Amylasebestimmung eingesetzt werden kann, da er ausreichend hohe Aktivitäten der Enzyme MP und.,S-PMG enthält und keiner Aufreinigung bedarf.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase
oder/und jö-Phosphogluco-mutase aus Mikroorganismen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß als Mikroorganismus
Lactobacillus brevis DSM 1267, DSM 1268, DSM 1269, DSM 20 054, Lactobacillus plantarum
DSM 20 174, 43, Lactobacillus reuteri DSM 20 016, Lactobacillus fermentum DSM 20 052, Streptococcus
spec. DSM 1118, 1119, 1120 oder/und DSM 1121 verwendet wird.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß in den oben aufgeführten Mikroorganismen die beiden genannten
Enzyme in hoher Aktivität enthalten sind und leicht daraus gewonnen werden können. Dabei ist es möglich,
sowohl die beiden einzelnen Enzyme in getrennter Form zu gewinnen, indem man sie nach den üblichen
Methoden der Enzymanreicherung aus den Extrakten dieser Mikroorganismen isoliert und reinigt, beispielsweise
durch Entfernung von Verunreinigungen mittels Polyäthyleniminfällung, fraktionierte Fällung mit
Salzen, wie Ammoniumsulfat, Behandlung mit Adsorbieren und Austauscherchromatographie, insbesondere
an schwach basischen Austauschern auf Basis von vernetztem Dextran oder von Cellulose.
Für die Verwendung zur a-Amylasebestimmung kann jedoch direkt der Rohextrakt der genannten Mikroorganismen
verwendet werden. Dazu werden die Mikroorganismen nach üblichen physikalischen Methoden,
beispielsweise mit Ultraschall, durch die Hochdruckdispersion, Zerreiben oder dergleichen aufgeschlossen,
unlösliche Fragmente abgetrennt und der klare Überstand als solcher oder in gefriergetrockneter Form zur
Bestimmung der a-Amylase eingesetzt. Wahlweise lassen sich diese Rohextrakte auch noch einer weiteren
Reinigung unterziehen. Da für die Verwendung zur a-Amylasebestimmung eine Trennung der beiden Enzyme
vermieden werden soll, erfolgt die Weiterreinigung vorzugsweise unter Anwendung eines Tests, bei welchem
die Gesamtaktivität beider Enzyme nach jedem Reinigungsschritt bestimmt wird, indem man einen geeigneten
Puffer sowie Maltose, NADP und G6PDH zusetzt und die Bildung von NADPH mißt. Vorzugsweise
werden dabei die Enzyme MP und jS-PMG durch Zusatz von a-Glucose-l,6-diphosphat und Mn2+-ionen,
beispielsweise in Form von Mangansulfat oder einem anderen organischen oder anorganischen Mangansalz, S
aktiviert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von Maltosephosphorylase oder/und
jß-Phosphogluco-mutase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, als Rohextrakt oder
in angereicherter Form zur Bestimmung der a-Amylase, gegebenenfalls unier Zusatz von ar-Glucose-l,6-diphosphat
oder/und Mn2+-ionen. Ό
Die Erfindung ermöglicht es, die beiden genannten Enzyme in wesentlich einfacherer und billigerer Weise
zu gewinnen, und zwar insbesondere in einer Form, in der sie direkt ohne vorherige Trennung zur Bestimmung
der a-AmylaEe eingesetzt werden können. Die Durchführung einer derartigen Bestimmung wird dadurch
wesentlich vereinfacht und erleichtert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen wurden auf einem 1% Maltose enthaltenden
Medium nach Kamogawa (Agr. Biol. Chem. 37, 2813 (1973)) gezüchtet und danach durch Höchdruckdispersion
aufgeschlossen. Nach Abzentrifugieren der unlöslichen Teile wurde der erhaltene Rohextrakt
direkt auf seine Eignung zur a-Amylasebestimmung nach folgendem Schema eingesetzt:
Stärke + H,0 Maltose
25
MP
Maltose + PO4 > Glucose +^S-Glucose-l-phosphat
Maltose + PO4 > Glucose +^S-Glucose-l-phosphat
jß-Glucose-l-phoshat — >
Glucose-6-phosphat J0
Glucose-6-phosphat - NAD+ 6-phosphogluconat + NADH + H+ ·
Zur Feststellung der Eignung der Rohextrakte wurde folgender Testansatz verwendet:
35
3,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer + e-Glucose-l^-diphosphat
(c =0,05), pH 6,5
0,ImIMnSO4 1%
1,0 ml 0,2 M Maltose (Merck, für biochemische Zwecke)
0,5 ml Rohextrakt.
Inkubation: 1 Stunde bei 370C
Stopp: 1 ml Probe - 3 Minuten/100°C; dann Zentrifugation
0,25 ml Überstand in folgende Bestimmung einsetzen:
modifizierter a-Glucose-6-phosphat-test:
2,54 ml 0,3 M TRA-Puffer, pH 7,6
0,1 ml 0,1 M MgCl2
0,1 ml NADP (c = 10)
0,25 ml Überstand
Start: 0,01 ml G6PDH (c = 1)
Start: 0,01 ml G6PDH (c = 1)
T = 25°; Messung von ^366
Die erhaltenen Ergebnisse zeigt nachstehende Tabelle:
60
65
| Stamm | DSM | 1267 | AE (NADPH)1) |
| Lactob. brevis | DSM | 20174 | 0,850 |
| Lactob. plantarum | DSM | 20016 | 0,675 |
| Lactob. reuteri | DSM | 1268 | 0,252 |
| Lactob. brevis | DSM | 1269 | 0,150 |
| Lactob. brevis | DSM | 43 | 0,100 |
| Lactob. plantarum | DSM | 1118 | 0,090 |
| Streptococcus spec. | DSM | 1119 | 0,210 |
| Streptococcus spec. | DSM | 1120 | 0,125 |
| Streptococcus spec. | DSM | 1121 | 0,115 |
| Streptococcus spec. | 0,110 | ||
') AE korreliert direkt mit der MP/jS-PGM-Aktivität.
21 48 036
Beispiel 2 Es wurde ein Reagens verwendet, das nachstehende Zusammensetzung aufwies:
5 Phosphatpuffer 20 mM; pH 6,5
NAD 2 mM
Maltotetraose 10 mM
lösliche Stärke -
Glucose-ljo-diphosphat Spuren
10 Rohextrakt aus Lactob. plantarum DSM 20 174 3 U/ml
auf Maltose-phosphorylase
und
j3-Phosphoglucomutase 1 U/ml
G6PDH (Leuconostoc mesent.) 9 U/ml
15 gelöst in Wasser
Die erhaltene Lösung wurde bei 300C inkubiert, mit der Probelösung versetzt und in einem Photometer
■nach 5minütiger Vorinkubation die Extinktionsdifierenz bei Hg 334 nm über 5 min gemessen. Für 2,0 ml
Reagens und 0,10 ml Probe ergibt sich folgende Berechnungsformel für die Aktivität der c-Amylase in der
20 Probe.
U/l = AE/min χ = AE/mm χ 1699.
6,18x0,1x2
25 Bei Einsatz von fünf verschiedenen Humanseren wurden mit dem obigen Reagens folgende Werte gefunden:
Serum ß-Amylase
30 1 23,5 U/l
2 88 U/l
3 100 U/l
4 120 U/l
5 146 U/l
Claims (2)
1. Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase oder/undjß-Phosphoglucomutase aus Mikroorganismen,
dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Lactobacillus brevis DSM 20054,1267,
1268, 1269, Lactobacillus plantarum DSM 20 174 und 43, Lactobacillus reuteri DSM 20 016, Lactobacillus
fermentum DSM 20 052, Streptococcus spec. DSM 1118, DSM 1119, DSM 1120 oder/und DSM 1121
verwendet wird.
2. Verwendung von nach Anspruch 1 erhaltener Maltose-phosphorylase undjß-Phosphoglucomutase als
Rohextrakt oder in angereicherter Form ohne Trennung zur Bestimmung der α-Amylase, gegebenenfalls
unter Zusatz von a-Glucose-ljo-diphosphat oder/und Mangan2+-ionen.
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