JPS6178400A - α−アミラ−ゼの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、α−アミラーゼの測定法に関する。

マルトース−ホスホリラーゼは、ネイセリア・メニｙギ
テイジス（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍａｎｉｎｇｉｔｉａ
ｉｓ）〔ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミスト
　リ　−（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　）、第１９９巻、第
１５６頁、１９５２年〕、同定されないビールのラクト
バシレン（ｌａｃｚｏｋａｃｉｌｌｅｎ）〔バイオケミ
カル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅ＋ｒ＋１ｃａｌＪｏｕ
ｒｎａｌ　）、第７８巻、第２０４頁、１９６１年〕及
びラクトバシルス・プレビス （Ｌａｃｉｎｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）　Ｉ
ＦＯ３３４５−ＡＴＣＣ８２８７（アグリカルチャラル
・アンド、バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　）、第６７巻、第２８１６頁、１９７３
年〕に存在し、これらから製出することができることは
公知である。

β−ホスホグルコース−ムターゼの存在は、うさぎの筋
肉、酵母及びネイセリア・メニンギテイゾス（Ｎｅ１ｓ
ｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　）　（ジャー
ナル、オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　）　、第２６６巻、第２１８６頁、１９６１年〕
並びにラクトバシルス・プレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ　）　ＡＴＣＣ８２８７で公知で
ある。

前記両酵素は工業上重要である。それというのもこれら
の酵素は一緒になってα−アミラーゼ、診断上極めて重
要な酵素、を測定するために使用することができるから
である。この測定は、α−アミラーゼによる澱粉のマル
トース會形成しての加水分解に基づく。このようにして
形成したマルトースは、燐酸塩の存在でマルトース−ホ
スホリラーゼ（ＭＰ）によってグルコースとβ−グルコ
ース−１−燐酸塩とに分解し、後者はβ−ホスホグルコ
ース−ムターゼ（／−ＰＧＭ　）によってα−グルコー
ス−６−燐酸塩に変換し、これは更に公知方法でグルコ
ース−６−燐酸塩−脱水素酵素（０６ＰＤＨ）の存在で
ＮＡＤを還元してＮＡＤＨが得られ、その際それ自体６
−ホスホグルコネートに変る。このようにして形成した
ＮＡＤＨは、それと共にα−アミラーゼの活性度の尺度
である。

数種の酵素を使用する組合された酵素反応での臨床試験
には、必要な酵素が容易に得られ、容易に分析に適当な
形にすることができるかどうかソ決定的に１要である。

実際にか＼る酵素測定の費用は、主としてこれに使用さ
れる酵素の値段によって決まる。その際特に有利なのは
、単一原料から測定試験に使用される数種の酵素全同時
に製出することができる場合である。

従来の公知原料では前記両酵素は、実際にネイセリア・
メニンヤテイジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓ　）で−緒圧なって、その使用をα−アミラ
ーゼの試験で予め分離しないで可能にする形で生じる。

しかしながら大きい欠点は、この場合極めて危険で病毒
性’（ｆ−Ｗする微生物であり、これは工業上で使用す
べき源としては著しく慎重な方法で使用することができ
るのに過ぎない。更に前記酵素の得られた活性度はこの
微生物では不十分である。ラクトバシルス・プレビス（
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　）　ＡＴ
ＣＣ８２８７は付加的にα−グルコシダーゼ、使用する
際有害な酵素を含有するので、その際精製は絶対的に必
要である。

それ故、危険なネイセリア・メニンヤテイジス（Ｎｅ１
ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　）の使用を
避け、容易に得られる無害な原料から酵素の簡単な製出
が可能になるＭＰ及び場合によりβ−ＰＭＧ　ｉ製出す
る方法が求められる。殊に微生物を使用し、その粗製抽
出物をα−アミラーゼの測定に直接に使用することので
きる両種の方法が所望される。それというのもこの粗製
抽出物は、酵素ＭＰ及びβ−ＰＭＧの十分に大きい活性
度を有し、精製は不必要だからである。

この目的は、微生物からマルトース−ホスホリラーゼ又
は／及びβ−ホスホグルコムターゼを製出する方法によ
って解決される。この方法はラクトバシルス・プレビス
（Ｌａｃｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）　ＤＳＭ
　２００５４、ＮＣＩＢ　８８３６．８５６１．８５６
２、ラクトバシルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　）　Ｄ８Ｍ２０１７
４及び微工研菌寄第４６２８号、ラクトバシルス・レウ
テリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔ、ｅｒｉ　
）　ＤＳＭ　２　Ｄ　０１６、ラクトバシルス・フエル
メンテユム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅ
ｎｔｕｍ）ＤＳＭ　２００５２　、ストンシトコックス
５ｐｅｃ。

（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ｐｅｃ、　）微工研
菌寄第４６２４号、微工研菌寄第４６２５号、微工研菌
寄第４６２６号又は／及び微工研菌寄第４６２７号を使
用することからなる。

意外なことに、前記微生物中では前記の両酵素は高活性
度で含有されており、これから容易に製出することがで
きることが判明した。その際両方の個々の酵素全分離し
た形で、この酵素全抽出物から酵素濃縮の常法で、例え
ば辿りエチノンイミン沈殿を用いる不純物の除去、塩、
例えば硫酸アンモニウムでの分別沈殿、吸着剤での処理
及び、殊に架橋デキストラン又はセルロースを基質とす
る弱塩基性交換剤での交換クロマトグラフィーによって
単離及び精製して製出することができる。

しかしながらα−アミラーゼの測定に使用するためには
、前記微生物の粗製抽出物を直接に使用することができ
る。このためには、微生物全常用の物理的方法によって
、例えば超音波を用いて高圧分散、すりつぶしその他罠
よって溶解し、不浴部を分離し、透明な上澄み會そのま
まか又は凍結乾燥形でα−アミラーゼを測定するために
使用する。選択的に、この粗製抽出物になお更に精製を
施こすこともできる。α−アミラーゼの測定て使用する
ためには両酵素の分離を避けなければならないので、精
製は、好ましくは両酵素の全活性度をそれぞれの精製法
によって測定する試験を使用して、適当な緩衝液並びに
マルトース、ＮＡＤＰ及びＧ６　ＰＤＨｋ添加し、ＮＡ
ＤＰＨの形成を測定して行なう。その際好ましくは酵素
ＭＰ及びβ−ＰＭＧは、α−グルコース−１，６−二燐
酸塩及びＭｎ２＋イオンを、例えば硫酸マンガン又は他
の有機又は無機のマンガン塩の形で添加して活性にする
。

それ数本発明の目的は、前記方法によって得られたマル
トース−ホスホリラーゼ又は／及びβ−ホスホグルコ−
ムターゼを、分離しないで粗製抽出物としてか又は濃縮
形で、場合によりα−グルコース−１，６−二燐酸塩又
は／及びＭｎ２＋イオンｋｍ加して使用することによっ
てα−アミラーゼを測定する方法を得ることである。

前記方法によって、前記両酵素を著しく簡単で安価な方
法でしかも、殊にこれを予め分離しないでα−アミラー
ゼを測定するためて直接に使用することができる形で製
出することができる。これによって、か＼る測定の実施
は著しく簡単になり、かつ容易になる。

次に実施例につき本発明を説明する。

実施例 次の組成’Ｉｋ’ｆｆする試薬を使用した：ＮＡＤ　　
　　　　　　　　　　　　　２ｍＭマルトテトラオース
　　　　　　　　　　　　　１０ｍＭ可溶性澱粉　　　
　　　　　　　　− グルコース−１，６−二燐酸塩　　　　　　痕跡量マル
トース−ホスホリラーゼ　　　　　　　　３Ｕ／ｍ／及
び β−ホスホグルコムターゼ　　　　　　　　　ＩＵ／ｍ
／ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　）　ｊ 得られた溶液を３０℃で培養し、試料溶液を加え、５分
間の予培養後に光度計で吸光の差異ｋ　Ｈｇ　３３４　
ｎｍで５分間測定した。試薬２．０ｔｎｌ及び試料０．
１０ｍ１に対して、試料中のα−アミラーゼの活性度に
対して次の計算式が得られる：５人の異なる人間の血清
全使用する場合に、前記試薬で次の値を測定した：

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. マルトース−ホスホリラーゼ及びβ−ホスホグルコムタ
   ーゼを、分離しないで粗製抽出物としてか又は濃縮形で
   、場合によりα−グルコース−１，６−二燐酸塩又は／
   及びマンガン＾２＾＋イオンを添加して使用することを
   特徴とするα−アミラーゼの測定法。