CH645669A5 - Verfahren zur gewinnung von maltose-phosphorylase und beta-phosphoglucose-mutase und verwendung derselben. - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von tococcus spec. DSM 1118, DSM 1119, DSM 1120 oder/und
Maltose-phosphorylase und ß-Phosphoglucose-mutase aus DSM 1121 verwendet.
Mikroorganismen und die Verwendung der so erhaltenen Die Mikroorganismen Streptococcus spec. wurden unter
Enzyme. den Nummern DSM 1118, DSM 1119, DSM 1120 und DSM
Es ist bekannt, dass Maltose-phosphorylase in Neisseria 40 1121 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen,
meningitidis (J. Biol. Chem. 199, 153 (1952)), in nichtidentifi- Grisebachstrasse 8,3400 Göttingen, DE, am 14. Oktober zierten Bierlactobacillen (Biochem. J. 78,204 (1961)) und in 1977 hinterlegt.
Lactobacillus brevis IFO 3345 = ATCC 8287 (Agr. Biol. Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass in den oben
Chem. 37,2813 (1973)) vorkommt und daraus gewonnen aufgeführten Mikroorganismen die beiden genannten En-
werden kann. 45 zyme in hoher Aktivität enthalten sind und leicht daraus ge-
Das Vorkommen von ß-Phosphoglucose-mutase ist be- wonnen werden können. Dabei ist es möglich, sowohl die bei-
kannt in Kaninchenmuskeln, Hefe und Neisseria meningitidis den einzelnen Enzyme in getrennter Form zu gewinnen, in-
(J. Biol. Chem. 236,2186 (1961)) sowie Lactobacillus brevis dem man sie nach den üblichen Methoden der Enzymanrei-
ATCC 8287. cherung aus den Extrakten dieser Mikroorganismen isoliert
Die beiden genannten Enzyme sind technisch von Inter- 50 und reinigt, beispielsweise durch Entfernung von Verunreini-
esse, da sie gemeinsam zur Bestimmung der a-Amylase, einem gungen mittels Polyäthyleniminfällung, fraktionierte Fällung diagnostisch sehr wichtigen Enzym, verwendet werden kön- mit Salzen, wie Ammoniumsulfat, Behandlung mit Adsor-
nen. Diese Bestimmung basiert auf der Hydrolyse von Stärke bentien und Austauscherchromatographie, insbesondere an durch die a-Amylase unter Bildung von Maltose. So gebildete schwach basischen Austauschern auf Basis von vernetztem
Maltose wird von der Maltosephosphorylase (MP) in Gegen- 55 Dextran oder von Cellulose.
wart von Phosphat in Glucose und ß-Glucose-1 -phosphat ge- Für die Verwendung zur a-Amylasebestimmung kann je-spalten, letzteres wird von der ß-Phosphoglucose-mutase doch direkt der Rohextrakt der genannten Mikroorganismen (ßPGM) in a-Glucose-6-phosphat umgewandelt, welches verwendet werden. Dazu können die Mikroorganismen nach dann in bekannter Weise in Gegenwart von Glucose-6-phos- üblichen physikalischen Methoden, beispielsweise mit Ultra-phat-dehydrogenase (G6PDH) NAD zu NADH reduziert 60 schall, durch die Hochdruckdispersion, Zerreiben oder derund dabei selbst in 6-Phosphogluconat übergeht. So gebilde- gleichen aufgeschlossen, unlösliche Fragmente abgetrennt tes NADH ist damit ein Mass für die a-Amylaseaktivität. und der klare Überstand als solcher oder in gefriergetrockne-Für klinische Tests mit kombinierten enzymatischen Re- ter Form zur Bestimmung der a-Amylase eingesetzt werden, aktionen, in denen also mehrere Enzyme eingesetzt werden, Wahlweise lassen sich diese Rohextrakte auch noch einer wei-spielt es eine entscheidende Rolle, ob die benötigten Enzyme 65 teren Reinigung unterziehen. Da für die Verwendung zur a-leicht zugänglich sind und ohne grosse Mühe in eine für die Amylasebestimmung eine Trennung der beiden Enzyme verAnalyse geeignete Form gebracht werden können. Denn der mieden werden soll, erfolgt die Weiterreinigung vorzugsweise Preis derartiger enzymatischer Bestimmungen wird im we- unter Anwendung eines Tests, bei welchem die Gesamtaktivi-
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tät beider Enzyme nach jedem Reinigungsschritt bestimmt wird, indem man einen geeigneten Puffer sowie Maltose, NADP und G6PDH zusetzt und die Bildung von NADPH misst. Vorzugsweise werden dabei die Enzyme MP und ß-PGM durch Zusatz von a-Glucose-1,6-diphosphat und/oder Mn2+-ionen, beispielsweise in Form von Mangansulfat oder einem anderen organischen oder anorganischen Mangansalz, aktiviert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von Maltosephosphorylase und ß-Phosphoglucomutase, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wurden, als Rohextrakt oder in angereicherter Form ohne Trennung zur Bestimmung der a-Amylase, gegebenenfalls unter Zusatz von a-Glucose-l,6-diphosphat oder/und Mn2+-ionen.
Die Erfindung ermöglicht es, die beiden genannten Enzyme in wesentlich einfacherer und billigerer Weise zu gewinnen, und zwar insbesondere in einer Form, in der sie direkt ohne vorherige Trennung zur Bestimmung der a-Amylase eingesetzt werden können. Die Durchführung einer derartigen Bestimmung wird dadurch wesentlich vereinfacht und erleichtert.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
0,1 ml 0,1 MMgCl2 0, lml NADP (c = 10)
0,25 ml Überstand
5 Start:
0,01 ml G6PDH (c = 1)
T = 25 °; Messung von AE36fi
Die erhaltenen Ergebnisse zeigt nachstehende Tabelle:
10
Stamm
Lactob. brevis Lactob. plantarum Lactob. reuteri 15 Lactob. brevis Lactob. brevis Lactob. plantarum Streptococcus spec. Streptococcus spec. 20 Streptococcus spec. Streptococcus spec.
NCIB 8836 DSM 20 174 DSM 20 016 NCIB 8561 NCIB 8562 DSM 43 DSM 1118 DSM 1119 DSM 1120 DSM 1121
A E (NADPH)'
0,850 0,675 0,252 0,150 0,100 0,090 0,115 0,125 0,210 0,110
' A E korreliert direkt mit der MP/ß-PGM-Aktivität
Beispiel 1
Die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen wurden auf einem 1 % Maltose enthaltenden Medium nach Kamogawa (Agr. Biol. Chem. 37,2813 (1973)) gezüchtet und danach durch Hochdruckdispersion aufgeschlossen. Nach Abzentrifugieren der unlöslichen Teile wurde der erhaltene Rohextrakt direkt auf seine Eignung zur a-Amylasebestimmung nach folgendem Schema eingesetzt:
25
30
Stärke + H20-a ^n^y^a> Maltose
,3-MP
Maltose + PO^__^.Glucose + ß-Glucose-1-phosphat ß-Glucose-1-phosphat Ë^H^.Glucose-6-phosphat
Glucose-6-phosphat + N AD+> 6-Phosphogluconat + NADH +H+
Zur Feststellung der Eignung der Rohextrakte wurde folgender Testansatz verwendet:
3,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer + a-Glucose-l,6-diphosphat (c= 0,05), pH 6,5 0,1 ml MnS04 1%
1,0 ml 0,2 M Maltose (Merck, für biochemische Zwecke) 0,5 ml Rohextrakt
Inkubation: 1 Stunde bei 37 °C
Stopp: 1 ml Probe - 3 Minuten/100 °C; dann Zentrifu-gation 0,25 ml Überstand in folgende Bestimmung einsetzen:
modifizierter a-Glucose-6-phosphat-test:
2,54 ml 0,3 M TRA-Puffer, pH 7,6
40
45
Beispiel 2
Es wurde ein Reagens verwendet, das nachstehende Zusammensetzung aufwies:
Phosphatpuffer NAD
Maltotetraose lösliche Stärke Glucose-1,6-diphosphat Rohextrakt aus Lactob. plantarum DSM 20 174 auf Maltosephosphorylase und
ß-Phosphoglucomutase G6PDH (Leuconostoc. mesent.)
gelöst in Wasser
20 mM; pH 6,5 2mM 10 mM
Spuren 3 U/ml
1 U/ml 9 U/ml
Die erhaltene Lösung wurde bei 30 °C inkubiert, mit der Probelösung versetzt und in einem Photometer nach 5-minü-tiger Vorinkubation die Extinktionsdifferenz bei Hg 334 nm über 5 min gemessen. Für 2,0 ml Reagens und 0,10 ml Probe ergibt sich folgende Berechnungsformel für die Aktivität der a-Amylase in der Probe:
U/1 = AE/min x
2,1 x 1000 A t,, • ..
6,18 x0,1 x 2 = AE/mm X 1699
Bei Einsatz von fünf verschiedenen Humanseren wurden mit dem obigen Reagens folgende Werte gefunden:
55
60
Serum
1
2
3
4
5
a-Amylase
23,5 U/1 88 U/1 100 U/1 120 U/1 146 U/1
C
Claims (5)
- 645 669 2PATENTANSPRÜCHE sentlichen durch den Preis der hierfür verwendeten Enzyme1. Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase bestimmt. Besonders günstig ist es dabei, wenn aus einem ein-und ß-Phosphoglucomutase aus Mikroorganismen, dadurch zigen Ausgangsmaterial mehrere für einen bestimmten Test gekennzeichnet, dass man Lactobacillus brevis DSM 20 054, verwendete Enzyme gleichzeitig gewonnen werden können. NCIB 8836, NCIB 8561, NCIB 8562, Lactobacillus planta- 5 Unter den bisher bekannten Ausgangsmaterialien kom-rum DSM 20 174 und DSM 43, Lactobacillus reuteri DSM men die beiden oben erwähnten Enzyme zwar in Neisseria 20 016, Lactobacillus fermentum DSM 20 052, Streptococcus meningitidis gemeinsam in einer Form vor, die ihrer Anwen-spec.DSM 1118, DSM 1119, DSM 1120 oder/und DSM 1121 dung in einem a-Amylase-Test ohne vorherige Trennung geverwendet. stattet. Ein beträchtlicher Nachteil besteht jedoch darin, dass
- 2. Verfahren zur Gewinnung von Maltosephosphorylase 10 es sich dabei um einen äusserst gefährlichen und virulenten aus Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismus handelt, der nur mit grössten Vorsichts-Lactobacillus brevis DSM 20 054, NCIB 8836, NCIB 8561, massnahmen als Quelle für industriell zu verwendende En-NCIB 8562, Lactobacillus plantarum DSM 20 174 und DSM zyme verwendet werden kann. Ausserdem sind die gefunde-43, Lactobacillus reuteri DSM 20 016, Lactobacillus fermen- nen Aktivitäten der genannten Enzyme in diesem Mikroorga-tum DSM 20 052, Streptococcus spec. DSM 1118, DSM ^ nismus unbefriedigend. Lactobacillus brevis ATCC 8287 ent-1119, DSM 1120 oder/und DSM 1121 verwendet und Malto- hält zusätzlich a-Glucosidase, ein bei der Verwendung stören-sephosphorylase isoliert. des Enzym, so dass hier eine Aufreinigung unumgänglich ist.
- 3. Verfahren zur Gewinnung von ß-Phosphoglucomutase Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Ver-aus Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass man fahren zur Gewinnung von MP und ß-PGM zu schaffen, wel-Lactobacillus brevis DSM 20 054, NCIB 8836, NCIB 8561, 2o ches die Verwendung des gefahrlichen Neisseria meningitidis NCIB 8562, Lactobacillus plantarum DSM 20 174 und DSM vermeidet und aus einem leicht zugänglichen harmlosen Aus-43, Lactobacillus reuteri DSM 20 016, Lactobacillus fermen- gangsmaterial eine einfache Gewinnung der Enzyme gestat-tum DSM 20 052, Streptococcus spec. DSM 1118, DSM tet. Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren 1119, DSM 1120 oder/und DSM 1121 verwendet und ß-Phos- der oben genannten Art zu schaffen, bei welchen ein Mikroor-phoglucomutase isoliert. 25 ganismus verwendet wird, dessen Rohextrakt direkt für die a-
- 4. Verwendung von nach dem Verfahren gemäss Patent- Amylasebestimmung eingesetzt werden kann, da er ausrei-anspruch 1 erhaltener Maltose-phosphorylase und ß-Phos- chend hohe Aktivitäten der Enzyme MP und ß-PGM enthält phoglucomutase als Rohextrakt oder in angereicherter Form und keiner Aufreinigung bedarf.ohne Trennung zur Bestimmung der a-Amylase. Gelöst wird diese Aufgabe erfmdungsgemäss durch ein
- 5. Verwendung nach Patentanspruch 4, dadurch gekenn- 30 Verfahren zur Gewinnung von Maltose-phosphorylase und ß-zeichnet, dass man zusätzlich a-Glucose-l,6-diphosphat und/ Phosphoglucomutase aus Mikroorganismen, welches da-oder Mangan2"1" -ionen zusetzt. durch gekennzeichnet ist, dass man Lactobacillus brevisNCIB 8836, NCIB 8561, NCIB 8562, DSM 20 054, Lactoba-cillus plantarum DSM 20 174, DSM 43, Lactobacillus reuteri35 DSM 20 016, Lactobacillus fermentum DSM 20 052, Strep-
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