DE3147947C2

DE3147947C2 - Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Enzyme

Info

Publication number: DE3147947C2
Application number: DE3147947A
Authority: DE
Inventors: Melvin Hubert Dr.-Chem. Sylvania Ohio Keyes
Original assignee: Owens Illinois Inc
Current assignee: OI Glass Inc
Priority date: 1980-12-04
Filing date: 1981-12-03
Publication date: 1986-09-04
Also published as: CA1177422A; BR8107902A; GB2088880B; GB2088880A; AU525924B2; AU7812781A; FR2495619B1; FR2495619A1; IT1195329B; US4716116A; IT8149830A0; DE3147947A1

Abstract

Es ist ein Verfahren zur chemischen Modifizierung natürlich vorkommender Proteine zur Herstellung biologisch aktiver halbsynthetischer Enzyme offenbart. Das Verfahren besteht in der teilweisen Denaturierung eines Proteins, Inkontaktbringen des resultierenden teilweise denaturierten Proteins mit einem Inhibitor eines Modellenzyms mit der gewünschten biologischen Aktivität und anschließendem Vernetzen des Proteins in situ in Gegenwart des Inhibitors zur Herstellung eines halbsynthetischen Enzyms mit der biologischen Aktivität des Modellenzyms. Das so erhaltene halbsynthetische Enzym zeigt eine andere biologische Aktivität als das native Protein.

Description

Proteine sind biologisch synthetisierte Makromoleküle, die verschiedene Funktionen in lebenden Systemen haben. Enzyme sind eine besondere Art biologisch aktiver Proteine, die bestimmte Reaktionen katalysieren. Derzeitig findet die Enzymtechnologie in vielen Bereichen in Industrie und Forschung Anwendung; als Beispiele seien genannt die medizinische Forschung, Nahrungsmittel-Behandlung und -Konservierung, Herstellung fermetisierter Getränke, Herstellung von Arzneimitteln und Bestimmung der Konzentration verschiedener Metabolite und Nahrungsmittelbestandteile mittels enzymatischer Analysen.

Enzyme sind in ihrer biologischen Aktivität hochspezifisch und katalysieren im allgemeinen eine bestimmte Reaktion in einem sehr hohen Grade im Vergleich zu der entsprechenden bei Raumtemperatur ohne biologische Katalyse ablaufenden Reaktion. Ein Enzym kann katalytisehe Aktivität mit Bezug auf eine Anzahl von Substraten, auf die es wirken kann, zeigen. Demgemäß kann ein gegebenes Enzym die Synthese oder den Abbau von mehr als einem Substrat katalysieren. Einige Proteine, die nicht als klassische Enzyme angesehen werden, wie Rinderserum-Albumin, zeigen sehr begrenzte katalytisehe Aktivität mit Bezug auf ein oder mehrere Substrate.

Viele Enzyme werden in der Natur in sehr kleinen Mengen gefunden. Ihre Isolierung, !Reinigung und Verwendung ist daher im Hinbück auf die Kosten und die Zeit, die zu ihrer Isolierung in verwendbarer Form erforderlich ist, auf Arbeiten in kleinem Maßstab beschränkt

Einige Enzyme kommen in der Natur in relativ großen Mengen vor und sind verhältnismäßig leicht zu isolieren, zu reinigen und zu verwenden. Leider können ίο aber die Enzyme, die in großen Mengen zur Verfügung stehen, wegen ihres bestimmten katalytischen Verhaltens nur bestimmte ausgewählte Reaktionen katalysieren.

In letzter Zeit sind viele Anstrengungen unternommen worden, synthetische biologische Katalysatoren zu synthetisieren, welche gleiches enrfmatisches Verhalten zeigen wie die natürlichen Enzyme, die entweder selten sind oder deren Isolierung teuer ist Terner sind einige Versuche unternommer, worden, native Enzyme zu modifizieren derart, daß sich ihre enzymatische Spezifität ändert so daß sie eine Reaktion katalysieren können, die sie vorher nicht katalysieren können.

Eine bekannte Technik, um enzymatisches Verhalten zur Katalysierung einer bestimmter» gewünschten Reaktion zu erhalten, ist die Synthese der sogenannten Enzym-Modell-Moleküle. Z.B. können Verbindungen niedrigen Molekulargewichts kovalent an funktioneile Gruppen gebunden werden, welche die Aktivität des Aktivitätszentrum eines Enzyms zeigen. Beispiele für solche Synthesen sind in den nachstehenden Veröffentlichungen beschrieben: Breslow R₇ Advances In Chemistry Series, R. F. Gould, Ed, American Chemical Society, Washington, D. C, 2ί -43 (1971) und Tang, C. C; Davaiian, D.; Haung, P. und Breslow, R, f. Amer. Chem. Soa, 100,3227(1978).

Eine andere Methode schließt die Verwendung einer Matrix aus einem synthetischen Polymeren ein, welches entlang seiner Hauptkette modifiziert ist, um die funktioneilen Gruppen, welche die Funktion des Aktivitäts-Zentrums eines gegebenen Enzyms aufweisen, bereitzustellen. Beispiele für die Methode siind folgenden Artikeln zu entnehmen: Wulff, G. und Schulza, I, Israel J. Chem, 17,291 (1978) und Suh, H. und Klotz, I. M., Bioorganice, 165(1977).

Eine weitere Technik umfaßt das Anhängen eines chemischen Teils an ein natives Enzym in der Nähe seines Aktivitätszentrums, um zu versuchen zu verursachen, daß solch ein Enzym mit einer anderen katalytischen Aktivität reagiert. Ein Beispiel dafür ist die Umso Wandlung von Papain, einem proteolytischen Enzym, in ein Enzym vom Typ einer Oxidase durch die kovalente Bindung eines Flavins nahe dem Aktivitätszentrum des nativen Papainenzyms, wie in folgenden Artikeln beschrieben: Levine, H. L und Kaiser, E. T, J, Amer. Chem.

Soc, 100, 7670 (1978) und Otsuki, T, Nakagawa, Y. und Kaiser, E. T, J. C. S. Chem. Comm, 11,457 (1978). Andere Beispiele für solge enzymatische Modifizierung können dem Artikel von: Wilson, M. E. und Whitesides, G. M., J. Amer. Chem. Soc, 100,306 (1978), entnommen werden.

Noch ein anderer Versuch, die Enzymspezifität zu ändern, ist die Ruhigstellung eines nativen Enzyms in einer Gel-Matrix. So ist z. B. das Enzym Trypsin in PoIyacrylamid-Gel ruhiggestellt worden. Das Polyacrylamid-Gel gestattet Aminosäureestern durch die GeI-Matrix hindurchzudiffundieren, um mit dem Enzym zu reagieren, gestattet aber größeren Proteinen das Hindurchdiffundieren nicht. So wird die Enzymspezifität durch Eliminieren des Zutritts eines der Substratmole-

küle zu dem Enzym geändert. Beispiele für solche Spezifitätsänderungen sind beschrieben in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3 Ed, 9,148 (1980), herausgegeben von Wiley und Son, Ina

Es ist auch bekannt, daß eine native Lysin-Monooxygenase derart umgesetzt werden kann, daß die Sulfhydrylgruppen auf dem Enzym blockiert sind. Wenn das bestimmte Enzym Lysin-Monooxygenase so behandelt wird, zeigt es eine neue katalytische Aktivität gegenüber Aminosäuren und katalysiert oxidativ Desaminierung anstatt, wie das natürliche Enzym, oxygenativ Decarboxylierung. Die Autoren können jedoch nicht über das modifizierte Verhalten berichten. Siehe den Artikel von Yamauchi, T.; Yamamoto, S. und Hayaiski, O, in The Journal of Biological Chemistry, 248,10,3750—3752 (1973). Es ist auch mitgeteilt worden, daß durch Umsetzen eines nativen Enzyms, z. B. Trypsin, mit seinem natürlichen Inhibitor und anschließender Vernetzung die Aktivität des Enzyms mit Bezug auf seine natürlichen Substrate modifiziert werden kann. Siehe den Artikel von Beaven, G. H. und Gratzer, W. B. in Int J. Peptide Res. 5,215-18 (1973).

Obwohl diese Verfahren für viele Anwendungszwekke geeignet sind, führen sie allgemein zu modifizierten natürlichen Enzymen oder vollständig synthetisierten Enzym-Analogons, die keine hohe katalytische Aktivität haben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur chemischen Modifizierung eines billigen, im Handel erhältlichen nativen Enzyms zu schaffen, bei welchem ein halbsynthetisches Enzym erzeugt wird, das eine Aktivität mit Bezug auf eine gewünschte chemische Reaktion zeigt, die bisher durch das native Enzym katalysiert, keine industriell geeignete Reaktion war. Die neue Re. Vtion soll in systematischer Art und Weise voraussehbar sein. Während bei den bekannten, vorstehend beschriebenen Verfahren ein Enzym einfach einem Satz von Bedingungen unterworfen wurde und versucht wurde, sein Verhalten aufzuklären, soll ein systematisches Verfahren zum Modifizieren von Protein- und Enzym-Verhalten geschaffen werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren nach Anspruch 1. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Erfindungsgemäß wird also ein halbsynthetisches Enzym dadurch erhalten, daß ein natives Protein, typischerweise ein enzymatisch aktives Protein, zur teilweisen Denaturierung einem Denaturierungsmittel ausgesetzt wird, um die konformationale Struktur des Proteins teilweise auszubreiten. Danach wird das teilweise denaturierte Protein mit einem Inhibitor eines Modellenzyms in Kontakt gebracht. Anschließend wird das Protein vernetzt, um eine neue Konformation oder ein halbsynthetisches Enzym zu bilden, das durch den Inhibitor f-estgelegt wird. Dann werden der Inhibitor und überschüssiges Vernetzungsmittel von dem neugebildeten halbsynthetischen Enzym entfernt, um ein funktionelles Analogon zu dem Modellenzym zu erhalten. Das so hergestellte halbsynthetische Enzym besitzt die Aktivitätscharakteristik des Modellsystems.

Es ist gefunden worden, daß ein Protein von seiner nativen Konformation nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu einer halbsynthetischen Konformation modifiziert werden kann. Der neue konformationale Zustand bestimmt die Gestalt eins halbsynthetischen Enzyms, das katalytische Aktivität zeigt. Das Wort »Enzym«, wie es hierin gebraucht wird, ist definiert als ein Protein, welches gut bekannte katalytische Aktivität gegenüber spezifischen Substraten hat. Der Ausdruck »Protein«, wie er hierin gebraucht wird, ist definiert, wie allgemein in der einschlägigen Technik akzeptiert als ein Polypeptid, das aus Aminosäuren gebildet ist und ein biologisches Molekül darstellt.

Die Erfindung schließt ein ein Verfahren zur Modifizierung eines Proteins von einer Konformation in eine zweite Konformation, wodurch eine neue enzymrtische

ίο Aktivität des ausgewählten Proteins erzeugt wird oder eine an der untersten Grenze liegende enzymatische Aktivität des nativen Proteins auf eine industriell geeignete Stärke erhöht wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein natives Protein, typischerweise ein Enzym, Bedingungen und/oder Reagenzien unterworfen, die die Struktur des Proteins, gewöhnlich reversibel, teilweise denaturieren. Dann wird ein Inhibitor des Modellenzyms mit dem nativen Protein, das sich in dem teilweise denatuierten Zustand befindet, in Kontakt gebracht Es wird angenommen, daß es die teilweise Denaturierung dem Protein gestattet, einen Inhibitor des Enzyms, das durch das Verhalten nachgebildet werden soll, zu binden, um ein Aktivitätszentrum zu bilden, das dem Aktivitätszentrum des Modellenzyms sehr ähnlich ist Es wird angenommen, daß die Inhibitorbindung die neue Konformation, welche mindestens eil Aktivitätszentruin einschließt, das in der Lage ist, die katalytische Funktion des Modellenzyms auszuführen, schützt und festlegt, bis die neue Konformation vernetzt werden kann. Nachdem Inhibitor und das teiiweise denaturierte Protein in Kontakt gebracht worden sind, wird die Vernetzung ausgeführt, um die neue Konformation des Proteins chemisch zu stabilisieren. So wird ein neues halbsynthetisches Enzym nach einem Modellprotein hergestellt.

»Teilweise Denaturierung« bedeutet hierin eine Änderung der Konformation eines Proteins, so daß die Gestalt oder Konformation des Proteins gestört wird ohne eine irreversible starke Denaturierung des Proteins zu verursachen. »Konformation« ist definiert, wie allgemein in der einschlägigen Technik akzeptiert, als die Kombination von Sekundär- und Tertiär-Struktur eines Proteins, das in vivo biologische Aktivität besitzt. Die teilweise Denaturierung von Proteinen ist gut bekannt und ins einzelne gehend in folgenden Veröffentlichungen besprochen: dem Buch Biochemistry, von A. L. Lehninger, Worth Publishers, Inc, N. Y., 1970, S. 58; den Artikeln von P. L. Privalow »Stability of Proteins« in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 167-192; C.

Sanford »Protein Denaturation, Part C« in Advances in Protein Chemistry, Vol. 24, S. 2-97; F. R. N. Gurd, et al. »Motions in Proteins« in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 74-166; O. Jardetzky in BBA, VoI. 621, S. 227-232; R. Huber in TIBS, Dec. 1979, S. 271, und D. S.

Markovich, et al in Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 8, No. 6, S. 857-862.

»Denaturierungsmittel« bezieht sich hierin, d. h. in dieser Beschreibung und den Ansprüchen, auf Verfahrensbedingungen oder Reagenzien, weiche die teilweise Denaturierung eines Proteins verursachen. Die teilweise Denaturierung eines Proteins kann z. B. mittels Durchtränken des Proteins in einer wäßrigen Lösung bei erhöhten Temperaturen, z. B. im Bereich von 25° C bis 60°C, durchgeführt werden. Bei den meisten Proteinen wird die Struktur durch Temperaturen von 25 bis 60°C so gestört, daß eine teilweise Denaturierung resultiert. Wie bekannt, sind jedoch einige Proteine, die von thermophilen bakteriellen Quellen stammen, noch nahe

dem Kochpunkt des Wassers stabil und würden höhere Temperaturen erforderlich machen als die vorstehend allgemein offenbarten. Die teilweise Denaturierung kann auch durch Durchtränken des Proteins mit einer wäßrigen Lösung, die ein anorganisches Salz, eine anorganische oder organische Säure oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmitte! enthält, erfolgen.

Geeignete anorganische Salze, die zur Destabilisierung der Proteinstruktur dienen, schließen ein: NaF, (NH₄)JSO₄, (CH₃J₄NCl, (CH₃J₄NBr, KCH₃COO, NH₄Cl, RbCl, KCl, NaCl, CsCl, LiCl, KBr, NaBr, KNO₃, MgCl₂, NaNO₃, CaCl₂, KSCN, NaSCN, BaCl₂, NaJ und LiJ.

Geeignete anorganische Säuren schließen ein: Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und ähnliche Protonen abgebende starke anorganische Säure.

Geeignete organische Säuren schließen ein: Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure und Zitronensäure.

Geeignete mit Wasser mischbare Lösungsmittel, von denen angenommen wird, daß sie hydrophobe Gruppen am Protein solubilisieren und dadurch ihre Struktur desiabiiisieren, schließen ein: tert-Butano!, Acetoniirii, Dioxan, Aceton, Methanol, Ethanol und Oimethysulfoxid.

Der Ausdruck »Inhibitor« bedeutet hierin irgendeine Verbindung mit ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat eines halbsynthetischen Proteins, um als eine Schablone für das Aktivitätszentrum des halbsynthetischen Enzyms zu dienen. Inhibitoren werden im allgemeinen durch das Enzym nicht abgebaut wie die Substrate. Ein Beispiel für die strukturelle Ähnlichkeit eines Enzyminhibitors und des natürlichen Substrats eines Enzyms ist der Fall der Glukose-Oxidase. Glucose ist das natürliche Substrat der Glukose-Oxidase, während D-Glukal der Inhibitor der Glukose-Oxidase ist. Glukose und D-Glukal sind strukturell sehr ähnlich.

Der Ausdruck »Vernetzung« bedeutet hierin die Bildung kovalenter Bindungen, entweder intermolekulare oder intramolekulare, zwischen reaktiven Zentren an einem Piotein. Für die intramolekulare Vernetzung wird das Verfahren unter Verwendung von multifunktionellen Reagenzien, wie Glutardehyd ausgeführt. Weitere Beispiele für geeignete Vernetzungsreagenzien, die eine Vernetzung eines Proteins bewirken sind: 2-Amino-'US-dichlor-s-triazin; Diazoniumsalze; N-Hydroxysuccinamid; p-Benzoylazid und Reagenzien, die in folgenden Veröffentlichungen offenbart sind: Wold, F, Methods Enzymol, 11, HIRS, C. H. W. ed. Academic Press, 1967, 617; Fasold, H. et al; Augen. Chem. Int Ed. Engl„ 10,795,197, und Keyes, M. H, Kirk-Othmer: Encyclopedia of Chemical Technology, 9,3d ed., 1980, J. Wiley and Sons, Inc., 148-172.

Viele natürlich vorkommende Enzyme sind die Formgebung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung ihrer halbsynthetischen Analogen zugänglich, wie z. B. hydrolytische Enzyme, Redoxenzyme und Transferasen. Z. B.: Die erste Gruppe, die hydrolytischen Enzyme, schließen proteolytische Enzyme, welche Proteine hydrolysieren ein; z. B. Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bomelin, Keratinase, Carbohydrasen, welche Kohlenwasserstoffe hydrolysieren, z. B. Cellulose, Amylase, Maltase, Pektinase, Chitanase; Esterasen, welche Ester hydrolysieren, z. B. Lipase, Cholinesterase, Lecithinase, alkalische und saure Phosphatasen; Nucleasen, welche Nucleinsäure hydrolysieren, z. B. Ribonuclease, Desoxyribonuclease; und Amidasen, welche Amine hydrolysieren, 1. B. Arginase, Asparaginase, Glutaminase, Histidase und Urease. Die zweite Gruppe sind Resox- Enzyme, die Oxidations- oder Reduktionsreaktionen katalysieren. Sie schließen ein Glukose-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Catalase, Peroxidase, Lipoxidase und Cytochrom-Reduktase. In der dritten Gruppe sind Transferase-Enzyme, die Gruppen von einem Molekül auf ein anderes übertragen. Beispiele dafür sind GIutaminpyruvin-Transaminase, Glutamin-Oxalsäure-Transaminase, Transmethylase, Phosphorpyruvin-Transphosphorylase.

In der Praxis wählt man ein Modell oder erstes Protein, typischerweise ein Enzym. Dann wählt man ein zweites Protein, das nach dem ersten Protein geformt werden soll, um ein halbsynthetisches Enzym zu erhalten. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung kann man das zweite Protein auf ein davon verschiedenes halbsynthetisches Protein, welches gewünscht wird, maßschneidern. Dies gibt einen erheblichen Vorteil bei vielen klinischen und industriellen Situationen, bei denen das Enzym, das man zu verwenden wünscht, schwer erhältlich, sehr teuer oder schwer: ä reinigen ist

So Kann cili üätiVcS Protein öueX ftüzyni, «_iä5 iü größen Mengen erhältlich und/oder billig das erfindungsgemäße Verfahren umgeformt oder modifiziert werden. Das leicht erhältliche Protein oder Enzym wird in ein weniger leicht erhältliches und/oder teureres halbsynthetisches Enzym umgewandelt, welches die kataiytische Aktivität des gewünschten nativen Enzyms zeigt. Es gibt viele Anwendungsgebiete für solche enzymisch umgewandelten Produkte, wie z. B. yiele Verwendungszwecke in Industrie und Forschung, insbesondere für Forschungszwecke auf dem Gebiet der Gärung, der Arzneimittel und der Medizin sowie der Nahrungsmittelverarbeitung.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein natives Protein gereinigt und in einer c7«><MGrn«>t«»n Pitfff»rlftcuncr (reiftet T*iananh u/trH A\f* I Γιο -β· — .— · -..-..——ο _β~.~— —— ■-«- —

sung mit einem Denaturierungsmittel vermischt, um die teilweise Denaturierung des darin gelösten Proteins zu bewirken. So wird z. B. das Protein teilweise denaturiert durch Änderung der Ionenstärke der Lösung, durch Zu-₆abe eines anorganischen Salzes, durch Modifizierung des pH-Wertes der Lösung mit einer anorganischen oder organischen Protonen abgebenden Säure, oder durch Modifizierung der Lösung durch Einführung eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels. Die Kontaktzeit des Denaturierungsmittels und des Proteins kann 15 Minuten bis einige Tage betragen. Auch kann die Temperatur der Lösung erhöht werden als eine Verfahrensbedingungsmodifikation, durch welche ein Protein teilweise denaturiert wird, wie in den weiter oben gebrachten Literaturstellen offenbart, z. B. dem Artikel von Privalov. In manchen Fällen, in denen da: z-i behandelnde Protein viele Disulfidbrücken hat, z. B. Rinderserum-Albumin oder Urease, kann die teilweise Denaturiferung durch Spaltung der uisulfidbrükken in dem Protein erfolgen, wozu man das Protein Mercapto-Ethanol aussetzt.

Es wird angenommen, daß das teilweise Denaturieren des des Proteins in einer Auflockerung der Proteinstruktur resultiert, so daß es den Inhibitor, der anschließend mit der das teilweise denaturierte Protüin enthaltenden Lösung vermischt wird, aufnimmt und bindet.

Nachdem das Protein teilweise denaturiert worden ist, wird es mit einem Inhibitor des Modellenzyms vermischt und der Kontakt zwischen Protein und Inhibitor bei einer Temperatur und für eine Zeit aufrechterhalten, die ausreichen, eine Population von Komplexen von In-

hibitor und teilweise denaturiertem Enzym zu bilden. Im Fall der Umwandlung des nativen Enzyms Trypsin in ein halbsynthetisches Enzym, welches die Aktivität des nativen Enzyms Chymotrypsin nachbildet, wird das native Enzym Trypsin mit einem Chymotrypsin Inhibitor, z. B. Indol oder Benzoesäure, in Kontakt gebracht. Das Inkontaktbringen findet entweder in einer wäßrigen Lösung statt oder in einer wäßrigen Lösung, welcher organisches Lösungsmittel in so genügender Menge zugesetzt worden ist, daß die Solubilisierung des Inhibitors unterstützt wird.

Nachdem der Inhibitor mit dem teilweise denaturierten Enzym in Kontakt gebracht worden ist, wird die neue Gestalt des halbsynthetischen Enzyms durch weitgehende Vernetzung der Proteinstruktur stabilisiert. Typischerweise wird das Vernetzen mit Glutaraidehyd als Vernetzungsmittel vorgenommen, da es verhältnismäßig billig und leicht erhältlich ist; aber es kann auch irgendein anderes der weiter oben angegebenen Vernetzungsmittel mit Erfolg vernetzt werden.

Nach der Vernetzung des Proteins in die neue Struktur unter Bildung des halbsynthetischen Enzyms werden Inhibitor und irgendwelches überschüssiges Vernetzungsmittel von dem neugebildeten Halbsynthetischen Enzym nach irgendeiner geeigneten Methode entfernt. Geeignete Methoden sind Flüssigkeits-Chromatographie und erschöpfende Dialyse. Das neugebildete halbsynthetische Enzym wird z. B. durch Gelsäulenchromatographie gereinigt und die Proteinfraktion mit der stärksten Aktivität aus dem Eluant gesammelt, um das am stärksten aktive halbsynthetische Enzym zu erhalten.

Die nun folgenden Beispiele sollen das Verfahren nach der Erfindung veranschaulichen.

Beispiel 1

Teil A
Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin aus Rinderpankreas, zweimal kristallisiert salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter getestet (Kostka, V. und Carpenter, F. H., The Journal of Biological Chemistry, 239, 6,1979 (1964)). Es wurde keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt. Die Ausgangsuntersuchung auf Trypsin-Substrat-Spezifität wurde nach einer potentiometrischen pH-Stat-Methode nach Walsh uid Wilcox durchgeführt (Walsh, K. A. und Wilcox, P. E, Methods in Enzymology, edited by G. E Perlmann und L Lorand, Academic Press, 31—41 (1970). Das Trypsin wurde in 0,001 M HCl bei pH 3,0 bereitgestellt Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktion von 143 für eine l%ige Lösung wurde zur Festlegung der Konzentration in mg/ml benutzt

Vier potentiostatische pH-Stat-Untersuchungen wurden durchgeführt um die U/mg Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypins zu bestimmen. Die verwendeten Substrate waren:

!. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyl-Arginin-Etyhlester (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethylester (APEE) (0,01 M)

Teil B

Denaturierung des Enzyms

Ausreichend gereinigtes Trypsin des Teils A wurde in 100 ml einer 0,001 M HCl bei einem pH-Wert von 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 0,98 bei 280 nm zu erhalten. Das Trypsin wurde 30 Minuten zur teilweisen Denaturierung stehengelassen.

TeilC
Zugabe des Inhibitors

Zu 40 ml der Lösung der denaturierten Enzymlösung aus Teil B wurden 30 mg gereinigtes trockenes Indolpulver gegeben und die Mischung 1 Stunde schwach geschüttelt. Nach einer Stunde wurde das Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor-Komplex untersucht, um Inhibierung und damit Bindung des Inhibitors an das Enzym sicherzustellen.

Teil D

Vernetzung

Zu der Lösung von Teil C wurden 100 μΙ 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel gegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde bei 0 bis 5° C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt. Nach einer Stunde wurde der pH-Wert der Lösung durch Zusatz von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurden Chromatographien und zwar in einer Sephadex brand G-10 GeI-FiI-trationssäule unter Verwendung einer 0,001 M CaCIi enthaltenden 0,001 M HCl als Eluant. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraidehyds wurde in etwa einer Stunde ausgeführt unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h. Der Protein-Peak wurde bei 245 nm nachgewiesen und gesammelt und untersucht, wie weiter unten beschrieben.

so Teil F

Ergebnisse

Der nachstehend angegebene Anstieg der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist in Proben aus Teil E des halbsynthetischen Chymotrypsin, hergestellt nach der Erfindung, erhalten worden.

Substrat

ATEE
(U/mg)

BAEE
(U/mg)

Ausgangsaktivität
Endaktivität

Untersuchungsmethode 1
Änderung in Prozent

5,21

553

837 30,21

+ 160 -46

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsinsubstrat (ATEE) und verminderte Aktivität mit Bezug aufTrypsinsubstrat (BAEE) aufweist.

Dieses Beispiel zeigt ferner, daß bei Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung die Aktivität mit Bezug auf ein Substrat ansteigt sowie die Aktivität einer Art von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Trypsin, gegenüber dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Chymotrypsin, ansteigt.

Beispiel 2

Teil A
Reinigung des Enzyms

Ribonuclease-Enzym wurde in gereinigter Form als salzfreie Protease-freie Rinderpankreas-Ribonuclease (Type H-A) gekauft.

Teil B
Denaturierung des Enzyms

60 ml der gereinigten Ribonuclase aus Teil A wurden in 100 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst und einer Extinktion von 0,39 bei 280 nm ausgesetzt. Der Lösung wurden 300 μΙ von 0,2 M Mercaptoethanol als Denaturierungsmittel zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7 erhöht und 2 Stunden gehalten, wobei langsam bei 25°C gerührt und tropfenweise 0,01 M NaOH zugegeben wurde.

TeilC
Zugabe des Inhibitors

Zu 100 ml Lösung aus Teil B wurden 40 mg trockenes pulverisiertes Idol als Inhibitor zugegeben. Die Lösung wurde bei 25°C gerührt und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M NaOH innerhalb von 1 bis 1,5 Stunden auf 7 gehalten, bis das ganze Indol in Lösung war.

Teil D
Vernetzung

Die Lösung von Teil C wurde bei 25° C auf einen pH-Wert von 9,45 durch tropfenweise Zugabe von 0,1 M NaOH gebracht und 3 Stunden langsam gerührt. Dann wurde die Lösung auf 0 bis 5⁰C in einem Kaltwasserbad gekühlt. Als die Lösung 5° C erreicht hatte, wofür gewöhnlich etwa 30 Minuten benötigt werden, wurden 400 μΐ eines 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben und die Lösung 17 Stunden schwach geschüttelt.

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurde Chromatographien, und zwar in einer Sephadex Brand G-15 Säule unter Verwendung von 0,001 M HCI als Eluant Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in einer 30,48 χ 2,54 cm Säule durchgeführt Die Proteinfraktion wurde durch Überwachung bei 206 nm gesammelt

Teil F

Ergebnisse

Der nachstehend angegebene Anstieg der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Esterase ist an Proben aus Teil E der halbsynthetischen Esterose, hergestellt nach der Erfindung, erhalten worden.

Substrat

BAEE (U/mg)

Anfangsaktivität

Endaktivität

Untersuchungsmethode 1
Untersuchungsmethode 2

Änderung in %

0,00

0,3
0,4

N/A

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Esterase eine enzymatische Aktivität gegenüber dem Esterasesubstrat zeigt, wo keine Aktivität in der nativen Ribonucleose festgestellt worden war. Dies zeigt die Umwandlung einer Enzynigattung, einer Nuclease, in eine andere Enzymgattung, eine Esterase.

Beispiel 3

Teil A
Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin aus Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophiyl gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter (Kostka, V. und Carpenter, F. H., The journal of Biological Chemistry, 239, 6, 1799 (1964)) getestet und keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt. Die Ausgangsuntersuchung auf Trypsin- Substrat-Spezifivat wurde nach einer potentiometrisehen pH-Methode nach Walsh und Wilcox (Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann und L Lorancl, Academic Press, 31 —41 (1970) durchgeführt. Das Trypsin wurde in 0,001 M HCI bei pH 3,0 aufbereitet. Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktion von 143 für eine l°/oige Lösung zur Bestimmung der Konzentration in mg/ml benutzt.

so 4 Ausgangs-potentiostatische pH-Stat-Untersuchungen wurden durchgeführt, um die U/mg Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsin^ zu bestimmen. Die verwendeten Substrate waren:

1. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyl-Arginin-Ethylester(BAEE)(0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylesta· (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethylester (APEE) (0,01 M)

Teil B

Denaturierung des Enzyms

Eine ausreichende Menge gereinigten Trypsins von Teil A wurde in 100 ml einer 0,001 M HCI bei pH 3 und 25°C gelöst, um eine Extinktion von 1,4 bei 280 nm zu erhalten. Das Trypsin wurde 30 Minuten zur teilweisen Denaturierung stehengelassen.

Jl

TeilC

Zugabe des Inhibitors

Zu 40 ml der Lösung des denaturierten Enzyms von Teil B wurden 2 ml einer l%igen lndollösung (in 0,001 M HCI) gegeben und die Lösung 2 Stunden schwach geschüttelt. Nach zwei Stunden wurde derTrypsin-Chymotrypsin-lnhibitor-Komplex untersucht, um Inhibierung und damit die Bindung des Inhibitors an das Enzym sicherzustellen.

Teil D
Vernetzung

Zu der Lösung aus Teil C wurden 300 μΐ 8%igen GIutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 17 Stunden bei 0 bis 5° C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt. Nach i? Stunden wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Teil E
Reinigung

über dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Chymotrypsin, wenn erfindungsgemäß vorgegangen wird.

Beispiel 4

Teil A
Reinigung des Proteins

Rinderserum-Albumin (BSA)-Protein in gereinigter Form als kristallines lyophiles Protein mit 1 bis 3% GIobulinen wurde gekauft.

Teil B

Denaturierung des Enzyms

100 mg des gereinigten BSA aus Teil A wurden in iOOmi entionisiertem destiiiienem Wasser gelöst und zeigten eine Extinktion von 0,58 bei 280-nm. Der pH-Wert der Lösung wurde 2 Stunden unter schwachem Rühren bei 25°C durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl bei 3 gehalten.

25

5 ml der Lösung von Teil D wurden in einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule chromatographiert unter Verwendung einer 0,001 M CaCl₂ enthaltenden 0,001 M HCI als Eluant. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in etwa 1 Stunde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 254 nm nachge- 35 war. wiesen und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben untersucht.

TeilC
Zugabe des Inhibitors

Zu den 100 ml der Lösung aus Teil B wurden 40 mg trockenes pulverförmiges Indol als Inhibitor zugegeben. Die Lösung wurde bei 25°C gerührt und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl 1 bis 1,5 Stunden auf 3 gehalten, bis das ganze Indol in Lösung

Teil D

Vernetzung

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben von dem halbsynthetischen Chymotrypsin aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet worden:

Substrat

40 Der pH-Wert der Lösung von Teil C wurde bei 25°C durch tropfenweise Zugabe von 0,1 M NaOH auf 7 erhöht und 3 Stunden langsam gerührt. Dann *drde die Lösung auf 0 bis 5⁰C in einem Kaltwasserbad gekühlt. Als die Lösung die Temperatur von 5° C erreicht hatte, was gewöhlich in 30 Minuten der Fall ist, wurden 400 μΐ 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben und die Lösung 17 Stunden schwach geschüttelt.

ATEE (U/mg)

BAEE (U/mg)

50 Teil E
Reinigung

Anfangsaktivität

Endaktivität
Untersuchungsmethode 1

Änderung in %

3,2

52,0

12,85 45,75

+401 -14

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsin-Substrat (ATEE) und reduzierte Aktivität mit Bezug auf Trypsin-Substrat (BAEE) besitzt

Dieses Beispiel veranschaulicht auch einen wesentlichen Aktivitätsanstieg mit Bezug auf ein Substrat, wer-.n das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Es zeigt ferner den Anstieg in der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Trypsin, gegen-5 ml der Lösung von Teil D wurde, chromatographiert, und zwar unter Verwendung einer Sephadex G-15 Gel-Säule und 0,001 M HC! als Eluant. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule durchgeführt. Die Proteinfraktion wurde durch Überwachung bei 206 nm gesammelt.

60 Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgeführte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Esterase ist an Proben von der halbsynthetischen Esterase, hergestellt nach der Erfindung, aus Teil E aufgezeichnet worden.

Substrat

BAEE (U/mg)

Anfangsaktivität

Endaktivität

Untersuchungsmethode 1
Untersuchungsmethode 2

Änderung in ⁰Zo

0,00

0,06
0,022

N/A

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Esterase eine enzymatische Aktivität gegenüber dem Esterasesubitrnt zeigt, wo keine Aktivität in der nativen BSA festgestellt war. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung nicht enzymatischen Proteins, eines Albumins, in eine andere Proteingattung, eine enzymatisch aktive Esterase.

M HCI) gegeben und die Lösung eine Stunde schwach geschüttelt.

Teil D

Vernetzung

Zu der Lösung von Teil C wurden 100 μΐ 8%L«:n ίο Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel gegeben. Die resultierende Lösung wurde 20 Minuten bei 0 bis 5°C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt. Nach 20 Stunden wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Beispiel 5

Teil A
Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin von Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter (Kostka, V. und Carpenter, F. H, The Journal of Biological Chemistry, 239, 6, 1799 (1964)) getestet und keine Verunreinigung durch natives; Chymotrypsin festgestellt. Die Ausgangsuntersuchung auf Trypsinsubstrat-Spezifität wurde nach einer potentiometrischen pH-Stat Methode nach Walsh und Wilcox (Waich, K. A. und Wiicox, P. E. Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann und L. Lorand, Academic Press, 31 —41 (1970) durchgeführt. Das Trypsin wurde in 0,001 M HCl bei pH 3,0 aufbereitet. Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktion von 14,3 für eine 1%ige Lösung zur Festlegung der Konzentration in mg/ml benutzt.

Vier potentiostatische pH-Stat-Untersuchungen wurden durchgeführt, um die U/mg-Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins zu bestimmen. Die verwendeten Substrate waren:

1. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyl-Arginin-Ethylester (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester(ATrEE)(0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethylester(APEE)(0,01 M)

Teil B
Denaturierung des Enzyms

Ausreichend gereinigtes Trypsin von Teil A wurde in 100 ml einer 0,001 M HCl bei pH 3 und 25° C gelöst, um eine Extrinktion von 0,98 bei 280 nm zu geben. Das Trypsin wurde 30 Minuten für die teilweise Denaturierung stehengelassen.

TeilC
Zugabe des Inhibitors

Zu 40 ml der Lösung des denaturierten Enzyms von Teil B wurden 2 ml einer 1 %igen f ndollösung (in 0,001 Teil E

Reinieune

5 ml der Lösung von Teil D wurde an einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule unter Verwendung einer 0,001 M CaCl₂ enthaltenden 0,001 M HCI als Eiuant Chromatographien. Die Abtrennung des Indols und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in einer Stunde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 254 nm nachgewiesen und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben, untersucht.

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben aus Teil E des halbsynthetischen Chymo'rypsins, hergestellt nach der Erfindung, erhalten worden.

Substrat

	ATEE (U/mg)	BAEE (U/mg)
Anfangsaktivität	3,2	52,0
Endaktivität Untersuchungsmethode	8,45	48,0
Änderung in %	+ 264	-8

Diese Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsinsubstrat (ATEE) besitzt und reduzierte Aktivität mit Bezug auf Trypsinsubstrat (BAEE). Dieses Beispiel zeigt auch einen erheblichen Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf ein Substrat, wenn das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Dieses Beispiel veranschaulicht ferner den Anstieg der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlieh Trypsin, gegenüber dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Chymotrypsin, wenn es nach der Erfindung behandelt worden ist.

Beispiel 6

Teil A
Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin von Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach dem Verfahren von Kostka und Carpenter getestet (Kostka V. und Carpenter, F. H, The Journal of Biological Chemistry, 239,6,1799 (1964)) und keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt Die Ausgangsuntersuchung auf Trypsinsubstrat-Spezifität wurde nach einer potentiometrischen pH-Stat Methode nach Walsh und Wilcox (Walsh, K. A. und Wilcox, P. E, Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann and L Lorarid, Academic Press, 31—41 (1970) vorgenommen. Das Trypsin wurde in 0,001 M HCl bei pH 3,0 aufbereitet Die Extinktion wurde bei 280 nm bestimmt und eine Extinktion von 143 für eine l%ige Lösung zur Festlegung der Konzentration in mg/ml verwendet.

Vier potentiostatische pH-Stat-Ausgangsuntersuchungen wurden durchgeführt, um die U/mg-Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins zu bestimmen. Die verwendeten Substratewaren:

1. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)

2. Benzoyl-Arginin-Ethylester (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylalanin-Ethylester (APEE) (0,01 M)

Teil B
Denaturierung des Enzyms

Genügend gereinigtes Trypsin von Teil A wurde in 100 ml 0,001 M HCl bei pH 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 135 bei 280 nm zu geben. Das Trypsin wurde 30 Minuten zur teilweisen Denaturierung stehengelassen.

TeilC
Zugabe des Inhibitors

0,001 M CaCl₂ enthaltenden O.üOi M HCl als Eluant chromatographiert Die Abtrennung der Benzoesäure und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in etwa 1 Stunde unier Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 254 nm nachgewiesen und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben untersucht

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben aus Teil E des halbsynthetischen Chymotrypsins, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet worden.

Substrat

ATrEE (U/mg)

Anfangsaktivität

25 Endaktivität Untersuchungsmethode 1

Änderung in %

Zu der Lösung aus Teil C wurden 100 μΐ 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 17 Stunden bei 0 bis 5° C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt Nach 17 Stunden wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 0,01 M NaOH auf 5 erhöht.

Teil E

55 1,66

635

+ 382

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische Chymotrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsin-S:ibstrat (ATEE) und verminderte Aktivität mit Bezug auf Trypsinsubstrat (BAEE) besitzt.

Dieses Beispiel veranschaulicht einen erheblicher Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf ein Substrat wenn das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Das Beispiel zeigt ferner den Anstieg in der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlich Trypsin, gegenüber dem Substrat einer anderer Peptidyl-Peptid-Hydrolyse, nämlich Chymotrypsin wenn nach der Erfindung verfahren wird.

Beispiel 7

Zu 10 ml der Lösung des denaturierten Enzyms aus Teil B wurden 5 ml 1 %iger Benzoesäure in Wasser gegeben und die Lösung 1 Stunde schwach geschüttelt. Nach einer Stunde wurde der Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor-Komplex untersucht, um Inhibierung und damit die Bindung des Inhibitors an das Enzym sicherzustellen.

Teil D
Vernetzung

Teil A
Reinigung des Enzyms

Ribonucleaseenzym in gereinigter Form, als salzfreie proteasefreie Rinderpankreas-Ribonuclease wurde gekauft.

Teil B
Denaturierung des Enzyms

60 mg gereinigter Ribonuclease aus Teil A wurden in 100 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst: es zeigte eine Extinktion von 0,411 bei 280 nm. Der pH-Wert der Lösung sank auf 3 und wurde auf diesem Wen durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl innerhalb von 2 Stunden bei langsamem Rühren und 25°C aufrechterhalten.

TeilC

Reinigung

5 ml der Lösung aus Teil D wurde an einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule unter Verwendung einer Zugabe des Inhibitors

Zu 100 ml der Lösung aus Teil B wurden 40 mg trokkenes pulverförmiges Indol als Inhibitor zugegeben. Die

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Aktivitätsanstieg mit Bezug auf Substrat für Esterase ist an Proben aus Teil E der halbsynthetischen Esterase, hergestellt nach der Erfindung, nachgewiesen. Der Puffer, der bei der Untersuchungsmethode 2 beschrieben wird, wurde mit 0,01 M HCl auf den geeigneten Wert eingestellt

Substrat

	BAEE (U/mg)
Anfangsaktivität	0,00
Endaktivität
Untersuchungsmethode
pH 9	0,089
pH 8	0,15
pH 7	0,29
pH 6	0,79
pH 5	0,41

Änderung in Prozent

N/A

Lösung wurde bei 25° C gerührt und der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,01 M HCl in 1 bis 1,5 Stunden auf 3 gehalten bis das ganze Indol in Lösung war.

Teil D
Vernetzung

Der pH-Wert der Lösung aus Teil C wurde bei 25°C durch tropfenweise Zugabe von 0,1 M NaOH auf 7 erhöht und langsam 3 Stunden gerührt. Dann wurde die Lösung in einem Kaltwasserbad auf 0 bis 5° C abgekühlt Nachdem die Lösung 5° C erreicht hatte, was gewöhnlich innerhalb von 30 Minuten der Fall ist, wurden 400 μΐ einer 8%igen Glutaraldehydlösung als Vernetzungsmittel zugegeben und die Lösung 30 Stunden schwach geschüttelt.

Teil E
Reinigung

dem Verfahren von Kostka und Carpenter (Kostka, V. und Carpenter, F. H, The Journal of Biological Chemistry, 239,6,1799 (1964) getestet: es wurde keine Verunreinigung durch natives Chymotrypsin festgestellt Die Anfangsuntersuchung auf Trypsinsubstrat-Spezifität wurde durch eine potentiometrische pH-Stat-Methode nach Walsh und Wilcox (Walsh, K. A. und Wilcox, P. E, Methods in Enzymology, edited by G. E. Perlmann und L. Lorand, Acedemic Press, 31—41 (1970) durchgeführt Das Trypsin wurde in einer 0,001 M HCl bei pH 3,0 aufbereitet Die Extinktion wurde bei 280 nm ermittelt und eine Extinktion von 14,3 für eine l%ige Lösung zur Festlegung der Konzentration in mg/ml verwendet.

Vier potentiostatische pH-Stat-Anfangsuntersuchungen wurden durchgeführt um die U/mg-Aktivität für jedes Substrat des nativen Trypsins festzustellen. Die verwendeten Substrate waren:

Die Lösung aus Teil D wurde gegen einen 0,01 M Tris-Puffer bei pH 7 unter Verwendung einer Spectrapore-Röhre, die einen Molekulargewichts-Wegschnitt von etwa 3500 hatte, 20 Stunden bei 0 bis 5° C dialysiert

1. Acetyl-Tyrosin-Ethylester (ATEE) (0,01 M)
2. Benzol-Arginin-Ethylester (BAEE) (0,01 M)

3. Acetyl-Tryptophan-Ethylester (ATrEE) (0,01 M)

4. Acetyl-Phenylaiariin-Eüiyiesler (APEE) (0,01 M)

Teil B

Denaturierung des Enzyms

Ausreichend gereinigtes Trypsin aus Teil A wurde in 100 ml 0,001 M HCl bei pH 3 und 25° C gelöst, um eine Extinktion von 1,56 bei 280 nm zu geben. Man ließ das Trypsin 30 Minuten zur teilweisen Denaturierung stehen.

TeilC

Zugabe eines Inhibitors

Zu 40 ml der Lösung des denaturierten Enzyms aus Teil B wurden 2 ml rohes Phenylacetat gegeben und die Lösung mit verdünnter HCI auf pH 3 wieder eingestellt. Dann wurde die Lösung auf 40⁰C erwärmt und 2 Stunden gerührt um alles Phenylacetat zu lösen.

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Esterase enzymatische Aktivität gegenüber dem Esterasesubstrat zeigt, wo keine Aktivität in der nativen Ribonuclease festgestellt war. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Enzymgattung, einer Nuclease, in eine andere Enzymgattung, eine Esterase.

Beispiel 8

Teil A
Reinigung des Enzyms

Gereinigtes Trypsin aus Rinderpankreas, zweimal kristallisiert, salzfrei und lyophil gemacht, wurde nach Teil D
Vernetzung

Zur Lösung aus Teil C wurden 600 μΙ 8%igen Glutaraldehyds als Vernetzungsmittel zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 20 Stunden bei 0 bis 5° C und einem pH-Wert von 3 geschüttelt.

Teil E

Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurde an einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule unter Verwendung einer 0,001 M CaCI₂ enthaltenden 0,001 M HCl als Eluant Chromatographien. Die Abtrennung des Phenylacetats und des überschüssigen Glutaraldehyds wurde in etwa 1 Stunde unter Verwendung einer 30,48 χ 2,54 cm Säule und einer Eluant-Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h durchgeführt. Der Protein-Peak wurde bei 245 nm festgestellt und das Protein gesammelt und wie weiter unten beschrieben untersucht.

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf Substrat für Chymotrypsin ist an Proben des halbsynthetischen Chymotrypsin aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung,ermittelt worden.

Substrat

ATEE (U/mg)

BAEE (U/mg)

Anfangsaktivität 3,2 54

Endaktivität

Untersuchungsmethode 1 6,23 32,6

Änderung in Prozent +195 —22

Die Ergebnisse zeigen, daß das halbsynthetische

Chy-

motrypsin erhöhte Aktivität mit Bezug auf Chymotrypsinsubstrat (ATEE) und reduzierte Aktivität mit Bezug auf Trypsinsubstrat (BAEE) besitzt

Dieses Beispiel zeigt auch einen wesentlichen Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf ein Substrat, wenn das Verfahren nach der Erfindung angewendet wird. Das Beispiel veranschaulicht ferner den Anstieg in der Aktivität einer Spezies von Peptidyl-Peptid-Hydrolase, nämlieh Trypsin, gegenüber dem Substrat einer anderen Peptidyl-Peptid-Hydfolase, nämlich Chymotrypsin, wenn erfindungsgemäß verfahren wird.

Beispiel 9

Teil A
Reinigung des Enzyms

Alpha-Amylase von Bakterien wurde als gereinigtes Enzym, viermal kristallisiertes Material, isoliert von Bazillus subtilis, gekauft

Ein Gramm der gereinigten Bakterien-Alpha-Amylase wurde in 100 ml entionisiertem destilliertem Wasser gelöst und gegen 1 mM Phosphat-Puffer bei pH 7 und 0 bis 5°C 24 Stunden dialysiert Dann wurde das Präparat bis zu seiner Verwendung gefroren.

Teil B
Denaturierung des Enzyms

1 OmI gefrorenen l%igen Alpha-Amylase aus Teil A wurde auf Raumtemperatur gebracht und durch ein FiI-ter einer Porengröße von 0,20 μπι filtriert Die Konzentration nach der Lagerung wurde mit 0,67% festgestellt. Dann wurden 63 ml der Alpha-Amylaselösung mit 0,01 M NaOH auf einem pH-Wert von 10,7 titriert und 10 Minuten langsam gerührt.

^TeilC
Zugabe des Inhibitors

Die Lösung aus Teil B wurde mit 0,017 g Cellobiose als Inhibitor vermischt und 45 Minuten bei 25⁰C gerührt.

Teil D
Vernetzung

Die Lösung aus Teil C wurde bei 25° C mit 10 μΐ GIutaraldehyd als Vernetzungsmittel vermischt und 15 Minuten gerührt Nach dem Zusatz des Giutaraldehyds fiel der pH-Wert auf 9,9, un die klare Lösung wurde gelb. Der pH-Weri wurde durch tropfenweise Zugabe vo 0,01 M HCl auf 9 eingestellt, und es wurden weitere 15 L-.linuten gerührt. Dann wurde der pH-Wert langsam durch Zugabe von 0,01 M HCl auf 7 eingestellt und für eine weitere Stunde gerührt

Teil E
Reinigung

5 ml der Lösung von Teil D wurde an einer Sephadex G-10 Gel-Filtrationssäule, 1,25 χ 47 cm chromatographiert; es wurden 0,01 M Trispuffer eines pH-Wertes von 7 benutzt, und die Strömungsgeschwindigkeit war 1 ml/min. Der Protein-Peak wurde bei 206 nm nachgewiesen und das Protein gesammelt.

Teil F
tj-gebnisse

Der nachstehend aufgeführte Anstieg der Aktivität mit Bezug auf das Substrat für Glycosid-Hydrolase ist an Proben der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet worden. Die Substrate für Glycosid-Hydrolase, die verwendet worden sind, waren:

p-Nitrophenyl-^-D-galacto-pyranosid (pN/5GA) und
p-Nitrophenyl-«-D-Glucosid (pN«GL)

Substrat

pN,Ä3A <^u/m|)

_PN<*GL l^u/m|)

Anfangsaktivität

0,00

Endaktivität

Untersuchungsmethode 3 1,8 χ 10~³
Untersuchungsmethode 4 3xl0~³

0,00

1,5 χ 10-³

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Glycosid-Hydrolase enzymatische Aktivität gegenüber dem Glycosid-Hydrolase-Substrat aufweist, wo keine Aktivität an der nativen, von Bakterien stammenden Alpha-Amylase, die selbst eine Spezies von Glycosid-Hydrolase ist, festgestellt worden ist. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Glycosid-Hydrolase in eine andere Glycosid-Hydrolase.

Beispiel
Teil A

10

Reinigung des Enzyms

Es wurde Alpha-Amylase von Bakterien als gereinigtes Enzym, viermal kristallisiertes Material, isoliert aus Bacillus subtilis, gekauft.

Fünfzehn hundertstel eines Gramms der gereinigten, von Bakterien stammenden Alpha-Amylase wurden in 15 ml en (ionisiertem destilliertem Wasser gelöst und gegen 1 mM Phosphatpuffer bei pH 7 und 0 bis 5°C 24 Stunden dialysiert

Teil B
Denaturierung des Enzyms

10 ml der l°/oigen Alpha-Amylaselösung aus Teil A wurde auf Raumtemperatur gebracht und 20 Minuten zentrifugiert bei 196 600 m/s². Die Konzentration wurde mit 0,65% bestimmt Dann wurden 10 ml der Alpha-Amylaselösung mit 0.01 M NaOH bis zu einem pH von 10,6 tritiert und langsam 10 Minuten gerührt

TeilC
Zugabe des Inhibitors

Die Lösung aus Teil B wurde init 0,051 g Cellobiose als Inhibitor vermischt und 45 Minuten bei 25" C gerührt.

Teil D
Vernetzung

Die Lösung aus Teil C wurde bei 25⁰C mit 86 μΐ GIutaraldehyd als Vernetzungsmittel vermischt Unmittelbar darauf wurde eine 0,1 M Lösung von NajCO3 und NaHCO₃, pH 10,0, zugesetzt bis der pH-Wert 10 bis 15 Minuten aufrechterhalten blieb. Es wurden etwa 0,7 ml der Carbonatlölsung zugefügt

Teil E
Reinigung

1 ml der Lösung aus Teil D wurde an einer Sephadex G-10 Gr!-Filtrations-Säule, 1,25x47 cm, chromatographiert, wobei ein Tris-Puffer, 0,01 M und pH 7, benutzt und eine Strömungsgeschwindigkeit von 034 ml/min angewandt wurde. Der Protein-Peak wurde bei 254 nm festgestellt und das Protein gesammelt.

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend f.ufgezeigte Aktivitätsanstieg mit Bezug auf das Substrat für Glycosid-Hydrolase wurde an Proben der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase aus Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet. Die Substrate für Glycosid-Hydrolase, die verwendet wurden, waren:

p-Nitrophenyl-^-D-Glucosid (pN/SGL) und
p-Nitrophenyl-<*-D-GIuco<,id(pN<*GL)

Substrat

(U/mg)

pNaGL
(U/mg)

Anfangsaktivität 0,00 0,00

Endaktivität

Untersuchungsmethcxte 5 3,IxIO-⁴ 1,4XlO-⁴

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Glycosid-Hydrolase enzymatische Aktivität gegenüber dem Glycosid-Hydrolasesubstrat besitzt, wo keine Aktivität bei der nativen Alpha-Amylase, die selbst eine Spezies von Glycosid-Hydrolase ist, nachgewiesen worden war. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Glycosid-Hydrolase in eine andere Glycosid-Hydrolase.

Beispiel 11

Teil A
Reinigung des Enzyms

Alpha-Amylase von Bakterien wurde als gereinigtes Enzym, viermal kristallisiertes Material, isoliert vom Bacillus subtilis, gekauft

Fünfzehn hundertstel eines Grammes gereinigter, von Bakterien stammender Alpha-Amylase wurde in 15 ml entionisiertem destillierten? Wasser gelöst und gegen 1 mM Phosphat-Puffer bei j-H 7 und 0 bis 5° C 24 Stunden dialysiert

Teil B
Denaturierung des Enzyms

10 ml der l°/oigen Amyiase aus Teil A wurde auf Raumtemperatur gebracht und mit 196 600 m/s² 20 Minuten zentrifugiert Die Konzentration wurde mit 0,57 festgestellt Dann wurden 10 ml der Alpha-Amylase-Lösung mit 0,01 N NaOH auf einen pH-Wert von 10,6 titriert und 10 Minuten langsam gerührt.

TeilC
Zugabe des Inhibitors

Die Lösung aus Teil B wurde mit 0,051 g Cellobiose als Inhibitor vermischt und 45 Minuten bei 25° C gerührt

Teil D
Vernetzung

Die Lösung aus Teil C wurde bei 25°C mit 72 μΙ GIutaraldehyd als Vernetzungsmittel vermischt. Unmittelbar danach wurde eine 0,1 M Na₂CO₃ — NaHCO₃-Losupg, pH 10,0, zugefügt, bis der pH-Wert von 10,0 15 Minuten aufrechterhalten blieb. Vier Zehntel ml der Carbonatlösunr wurde benötigt.

Teil E
Reinigung

1 ml der Lösung aus Teil D wurde a.i einer Sephariex G-10 Gel-Filtrations-Säule, 1,25 χ 47 cm, chromatographiert, wobei 0,01 M Tris-Puffer, pH-Wert 7, benutzt und eine Strömungsgeschwindigkeit von 0,34 ml/min angewandt wurde. Der Protein-Peak wurde bei 254 nm festgestellt und das Protein gesammelt

Ol <■ 23

Teil F
Ergebnisse

Der nachstehend aufgezeigte Anstieg in der Aktivität mit Bezug auf das Substrat für Glycose-Hydrolase wurde an Proben der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase von Teil E, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet Das Substrat für Glycose-Hydrolase, das verwendet wurde, war

p-Nitrophenyl-^-D-Glucosid(pN^GL)
Substrat

pN/iGl(U/mg)

Anfangsaktivität

Endaktivität
Untersuchungsmethode 5

0,00

2,8x10-"

Die Ergebnisse zeigen, daß die halbsynthetische Glycosid-Hydrolase enzymatische Aktivität gegenüber dem Glycosid-Hydrolasesubstrat zeigt, wo keine Aktivität bei der nativen Alpha-Amylase festgestellt wurde, welche selbst eine Spezies von Glycosid-Hydrolase ist. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Glycosid-Hydrolase in eine andere Glycosid-Hydrolase.

Untersuchungsmethoden

Die in den Beispielen 1 bis 8 entnommenen Proben wurden nach zwei Methoden untersucht. Bei der Untersuchungsmethode 1 werden die vom reagierenden Substrat freigesetzten Protonen gemessen. Bei Untersuchungsmethode 2 werden spectrale Änderungen, die von Änderungen in der elektronischen Struktur herrühren und durch Hydrolyse des Substrats herbeigeführt werden, gemessen, in alien Faiien der Beispiele i bis 8 ergab jede Probe eine positive Aktivitätsänderung hinsichtlich der Aktivität, die nachzubilden war, womit die Tatsache der Schaffung von Aktivität, wo vorher keine vorhanden war, durch zwei unabhängige Meßtechniken bestätigt worden ist.

Beispiel für die Untersuchungsmethode 1

Reagenzien:

0,1 M KCI, 0,05 M CaCI₂,0.01 M Tris-Puffer bei pH 7.75.

Substrat:

Lösung von 343 mg AIpha-N-Benzoyl-L-Argininethylester ■ HCl (BAEE) in 100 ml Puffer.

Durchführung:

Verwende ein Sargent-Welch-pH-Stat, Modell pHR, fülle die Titrationbürette mit 0,1 M NaOH. Stelle die 5 ml Substratlösung in dem pH-Stat-Becher auf starkes Rühren. Stelle den Titrator auf Erhöhen des pH-Wertes auf 7,8. Lege eine starke Basislinie fest Füge 2 ml Enzymlösung zu. Der Recorder zeichnet das Volumen verbrauchter Base pro Zeiteinheit als direktes Maß für die pro Minute verbrauchten Mikromoleküle Substrat auf.

Beispiel für Untersuchungsmethode 2

Reagenzien:

0,1 M KCI, 0,05 M CaCI₂, 03 M Tris-Puffer bei pH 8,0.

Substrat:

Löse 34,3 mg Alpha-N-Benzoyl-L-Arginin-Ethylester · HCI (BAEE) in 100 ml Puffer.
Durchführung:

Benutze ein Beckman ACTA-Spectrophotometer und stelle den Wellenlängenjustierer auf 255 nm bei einer Schlitzbreite von 1,25 nm. Korrigiere den Zero-Puffer in der Vergleichs- oder Blindprobe und der Probe. Leere die Probekammer und wasche die

ίο Küvette mit Aceton und dann mit Wasser. Fülle die Küvette mit 2,5 ml BAEE-Substratlösung und lege eine stabile Basislinie I Minute lang fest. Füge 0,5 ml der Enzymlösung zu und zeichne die Rate des Anstiegs in der Extinktion auf, wenn BAEE zu Alpha-N-Benzoyl-L-Arginin hydrolisiert wird. Trage mindestens 5 Minuten die Extinktion gegen die Zeit auf (Delta A/min).

Bei Delta Absorptionsvermögen Substrat-Produkt 808 M~' cm-' ist eine Einheit gleich der Hydrolyse eines Mikromols BAEE pro Minute bei 25⁰C und pH 8,0.

Schwert, G. W. und Takenake, T., Biochemica et Biophsica ACTA, 16,570,1955.

Beispiele für die Untersuchungsmethode 3

Die bei Beispiel 9 entnommenen Proben können nach der nachstehend beschriebenen Methode untersucht werden.

Reagenzien:

Natriumcitrat-Pufier0,05 M bei pH 4,6.
0,2 M Natriumcarbonat.

Substrat:

p-Nitrophenyl-Ä-D-Glucosid, 25 mM Lösung in 0,05 M Natriumeitratpuffer bei pH 4,6.
p-Nitrophenyl-Ä-D-Galacto-Pyranosid, 25 mM Lösung in 0,05 M Natriumeitratpuffer bei pH 4.6.

Durchführung:

Eine 100 μΙ Probe einer 25 mM Lösung von jedem Substrat in 0,05 mM Natriumeitratpuffer bei pH 4,6 wurden bei 30° C mit 350 μΙ des gleichen Puffers 5 Minuten bebrütet. Fünf solcher Lösungen wurden hergestellt. Nach der Zugabe von 50 μΐ des Enzyms zu drei der Lösungen und 50 μΙ Citratpuffer zu den beiden übrigen Kontroilösungen wurden die Lösungen bei 30⁰C bebrütet. Nach 15 Minuten wurde eine Enzym enthaltende und eine Kontrollösung ausgewählt Die Reaktion wurde durch Zugabe von 700 μΐ 0,2 M Natriumcarbonat gestoppt. Die Extinktion wurde bei 420 nm gemessen. Nach 30 Minuten wurde eine weitere Enzymlösung analysiert und nach 60 Minuten die letzte und die übrige Kontrollösung.

Siehe Methods in Enzymology, Vol. 28, pg. 720—21.

Die Aktivitäten werden unter Verwendung eines Absorptionsvermögens von 1,83χ 1O⁺⁴ M-'cm-' berechnet.

J. Biol. Chem, 233,1113(1958).
Die Extinktion von 25,2 bei 280 nm einer 1 %igen Alpha-Amylaselösung wird zur Berechnung der vorhandenen Enzymmenge benutzt

Beispiel für Untersuchungsmethode 4
Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Untersuchung

Die bei Beispiel 9 entnommenen Proben können nach folgender Methode untersucht werden.

Reagenzien:

Galactose, 0,1 %ige Lösung

Galactose, l,0°/oige Lösung

p-NitrophenyN/y-D-Galacto-PyranosidipN/iGL),

12 miM-Lösung.

p-Nitrophenol, O,5°/oige Lösung

Glucosidase,0,5°/oige Lösung

Micro-Pak-Säule 30 χ 4 cm

Extinktions-Detektor auf 206 mM einstellen

tVassereluant25°C Strömungsgeschwindigkeit 2,5 ml/min bei

141 bar (2000 psi).

Durchführung:

Ein Gemisch von der halbsynthetischen Glycosid-Hydrolase und pN/iCL wurden bebrütet und anschließend auf die Säule gegeben. Nach 18 Stunden wurde ein Peak in der Position, die für Galactose festgelegt ist, registriert. Dann wurden Peakhöhe und Konzentration von Standardgalactoselösungen bestimmt. Die Aktivität des halbsynthetischen Enzyms errechnete sich auf 3 χ 10-³ U/ml.

Beispiel zur Untersuchungsmethode 5

Die bei den Beispielen 10 und 11 entnommenen Proben können nach nachstehender Methode untersucht werden.

beiden letzten Röhrchen (ein Enzym enthaltendes und ein Kontrollröhrchen) herausgenommen und damit wie vorstehend verfahren.
U/mg wurde unter Benutzung des Absorptionsvermögens von 138XlO⁴ M-'con-¹ für p-Nitrophenol bei 420 nm berechnet.

Die Extinktion (A^l%) von 25,2 für Λ-Amylase wurde auch bei Berechnung der Enzymmenge bei dieser Untersuchung benutzt.

Reagenzien:

Natriumeitratpuffer, 0,05 M bei pH 5,0.

0,2 M Natriumcarbonat.

Substrat:

p-Nitrophenylvi-D-Glucopyranosid.
25 mM Lösung in entionisiertem destilliertem Wasser. p-Nitrophenyl-a-D-Glucopyranosid.
25 mM Lösung in entionisiertem destilliertem Wassergelöst.

Durchführung:

700 μΐ Natriumeitratpuffer, pH 5, wurden jeweils in fünf Röhrchen gegeben, von denen zwei Kontrollröhrchen waren. 100 μΙ halbsynthetisches Enzym wurden drei solcher Röhrchen zugegeben, während ΙΟΟμΙ Citratpuffer, pH 5, den Kontrollröhrchen zugegeben wurden. Diese Röhrchen wurden 10 Minuten in einem 3O⁰C warmen Becher bebrütet. Nach diesen 10 Minuten wurden 200 μΙ des verwendeten Substrats zu allen fünf Röhrchen gegeben und im 30°C-Becher bebrütet. Nach 15 Minuten Bebrütung wurden ein Kontrollröhrchen und 1 Enzym enthaltendes Röhrchen herausgenommen. Die Lösung in dem Kontrollröhrchen wurde sofort mit 1,4 ml 0,2 M Na2CO3 vermischt Das Enzym enthaltende Röhrchen wurde 2 Minuten zentrifugiert. Nach diesen 2 Minuten wurde die Flüssigkeit in ein markiertes Röhrchen gegossen und der Niederschlag verworfen. Dann wurden 500 μΐ der Lösung in ein anderes markiertes Röhrchen pipettiert und 700 μΐ 0.2 M Na2CC>3 Puffer zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Extinktion wurde bei 420 nm gemessen. Nach 30 Minuten wurde ein Röhrchen, das Enzym enthielt, herausgenommen und etwa 2 Minuten zentrifugiert Die Flüssigkeit wurde in ein markiertes Röhrchen gegossen und 500 μΐ der Lösung in ein anderes markiertes Röhrchen pipettiert Diesem Röhrchen wurden 700 μΐ der Oy M Na2CÖ3-Lösung zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Nach 45 Minuten wurden die

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines halbsynthetischen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß ein enzymatisches Protein, das nachgebildet werden soll, ausgewählt wird; ein zweites Protein, das modifiziert werden soll, so daß es eine Nachbildung des enzymatischen Proteins ergibt, ausgewählt wird; das zweite Protein mit einem Denaturierungsmittel bei einer zur teilweisen Denaturierung ausreichenden Temperatur eine ausreichende Zeit vermischt wird und das zweite Protein in situ in Gegenwart eines Inhibitors für das enzymatische Protein, das nachgebildet werden soll, vernetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als zweites Protein ein enzymatisch aktives Protein einer anderen enzymatischen Aktivität als der des enzymatischen Proteins, das nachgebildet werden soll, ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur teilweisen Denaturierung des zweiten Proteins eine wäßrige Lösung desselben hergestellt und diese Lösung bei einer zur teilweisen Denaturierung ausreichenden Temperatur und Zeit gehalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung des zweiten Proteins 15 Minuten bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 25 bis 60⁰C gehalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Protein durch Vermischen mit Wasser und Vermischen der resultierenden Lösung mit einem Denaturierungsmittel teilweise denaturiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Denaturierungsmittel eine anorganische Säure, eine organische Säure, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel oder ein anorganisches Salz eingesetzt wird.