DE3329696C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemischen Änderung der Substratspezifität eines nativen Proteins zur Herstellung eines immobilisierten enzymartigen modifizierten Proteins.

Proteine sind biologisch synthetisierte Makromoleküle, die verschiedene Funktionen in lebenden Systemen haben. Enzyme sind besondere biologisch aktive Proteine, die bestimmte Reaktionen katalysieren. Derzeitig findet die Enzymtechnologie in vielen Bereichen von Industrie und Forschung Anwendung, z. B. medizinische Forschung, Nahrungsmittel-Behandlung und -Konservierung, Herstellung fermentierter Getränke, Herstellung von Arzneimitteln und Bestimmung der Konzentration verschiedener Metabolite und Nahrungsmittelbestandteile mittels enzymatischer Analysen.

Enzyme sind in ihrer biologischen Aktivität hochspezifisch und katalysieren im allgemeinen eine bestimmte Reaktion in einem sehr hohen Grade im Vergleich zu der entsprechenden, bei Raumtemperatur ohne biologische Katalyse ablaufenden Reaktion. Ein Enzym kann katalytische Aktivität mit Bezug auf eine Anzahl von Substraten, auf die es wirken kann, zeigen. Demgemäß kann ein gegebenes Enzym die Synthese oder den Abbau von mehr als einem Substrat katalysieren. Einige Proteine, die nicht als klassische Enzyme angesehen werden, wie Rinderserum- Albumin, zeigen sehr begrenzte katalytische Aktivität mit Bezug auf ein oder mehrere Substrate.

Viele Enzyme werden in der Natur in sehr kleinen Mengen gefunden. Ihre Isolierung, Reinigung und Verwendung ist daher im Hinblick auf die Kosten und die Zeit, die zu ihrer Isolierung in verwendbarer Form erforderlich ist, auf Arbeiten in kleinem Maßstab beschränkt.

Einige Enzyme kommen in der Natur in relativ großen Mengen vor und sind verhältnismäßig leicht zu isolieren, zu reinigen und zu verwenden. Sie können aber wegen ihres bestimmten katalytischen Verhaltens nur bestimmte ausgewählte Reaktionen katalysieren.

In letzter Zeit sind viele Versuche unternommen worden, Enzyme zu synthetisieren, welche gleiches enzymatisches Verhalten zeigen wie die natürlichen Enzyme, die entweder selten sind oder deren Isolierung teuer ist. Ferner hat man versucht, native Enzyme zu modifizieren derart, daß sich ihre Substratspezifität ändert, so daß sie eine Reaktion katalysieren können, die sie vorher nicht katalysieren konnten.

Eine bekannte Technik, um enzymatisches Verhalten zur Katalysierung einer bestimmten gewünschten Reaktion zu erhalten, ist die Synthese der sogenannten Enzym-Modell- Moleküle. Zum Beispiel können Verbindungen niedrigen Molekulargewichts kovalent an funktionelle Gruppen gebunden werden, welche die Aktivität des Aktivitätszentrums eines Enzyms zeigen. (Siehe Breslow, R., Advances in Chemistry Series, R. F. Grould, Ed., American Chemical Society, Washington, D. C. 21-43 (1971) und Tang, C. C.; Davalian, D.; Haung, P. und Breslow, R., J. Amer. Chem. Soc., 100, 3918 (1978) und Breslow, R., Doherty, J., Guillot, G. und Lipsey, C., J. Amer. Chem. Soc., 100, 3227 (1978).)

Bei einer anderen Methode wird eine Matrix aus einem synthetischen Polymeren verwendet, welches entlang seiner Hauptkette modifiziert ist, um die funktionellen Gruppen, welche die Funktion des Aktivitätszentrums eines gegebenen Enzyms aufweisen, bereitzustellen. (Siehe z. B. Wulff, G. und Schulza, I., Israel J. Chem., 17, 291 (1978) und Suh, J. und Klotz, I. M., Biorganic Chemistry, 6, 165 (1977).)

Durch Anhängen eines chemischen Teils an ein natives Enzym in der Nähe seines Aktivitätszentrums hat man versucht zu verursachen, daß solch ein Enzym mit einer anderen katalytischen Aktivität reagiert. Ein Beispiel dafür ist die Umwandlung von Papain, einem proteolytischen Enzym, in ein Enzym vom Typ der Oxidase durch die kovalente Bindung eines Flavins nahe dem Aktivitätszentrum des nativen Papainenzyms, (Levine, H. L. und Kaiser, E. T., J. Amer. Chem. Soc., 100, 7670 (1978), Kaiser, E. T., et al, Adv. in Chemistry Series, No. 191, Biomimetic Chemistry, Seite 35, 1980; und Otsuki, T.; Nakagawa, Y. und Kaiser, E. T., J. C. S. Chem. Comm., 11, 457 (1978). Andere Beispiele für eine derartige enzymatische Modifikation sind dem folgenden Artikel zu entnehmen: Wilson, M. E. und Whitesides, G. M., J. Amer. Chem. Soc., 100, 306 (1978).(

Die Substratspezifität läßt sich auch durch Ruhigstellung eines nativen Enzyms in einer Gelmatrix ändern. So ist z. B. das Enzym Trypsin in Polyacrylamid-Gel ruhiggestellt worden. Das Polyacrylamid-Gel gestattet Aminosäureestern durch die Gel-Matrix hindurchzudiffundieren, um mit dem Enzym zu reagieren, gestattet aber größeren Proteinen das Hindurchdiffundieren nicht. So wird die Substratspezifität durch Eliminieren des Zutritts eines der Substratmoleküle zu dem Enzym geändert.

Die Ruhigstellung oder Immobilisierung nativer Enzyme ist Stand der Technik, ebenso die Änderung der Enzymspezifität durch Ruhigstellung. (Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 3 Ed., 9, 148 (1980), Wiley and Son, Inc.).

Zwei weitere Methoden der Enzymimmobilisierung sind in den US-PS 38 02 997 und 39 30 950 offenbart. Nach der US-PS 38 02 997 werden Enzyme durch Binden an anorganische Träger in Gegenwart ihrer Substrate stabilisiert, wodurch das Enzym immobilisiert wird. Gemäß der US-PS 39 30 950 wird ein aktiver Träger, der chemisch an das Enzym gebunden werden kann, mit einem Enzym-Substrat-Komplex, der durch Mischen eines Enzyms und eines spezifischen Substrats gebildet worden ist, in Kontakt gebracht, wobei die Transformation von Substrat zu Produkt auf einem Minimum gehalten wird. So wird die Enzymkomponente des Komplexes chemisch an den Träger gebunden.

Es ist auch bekannt, daß eine native Lysin-Monooxigenase derart umgesetzt werden kann, daß die Sulfhydrylgruppen an dem Enzym blockiert sind. Dann zeigt das Enzym Lysin- Monooxigenase eine neue katalytische Aktivität gegenüber Aminosäuren und katalysiert oxidativ Desaminierung anstatt, wie das natürliche Enzym, oxigenativ Decarboxilierung. Die Autoren können jedoch nicht über das modifizierte Verhalten berichten. (Siehe Yamauchi, T.; Yamamoto, S. und Hayaishi, O., in The Journal of Biological Chemistry, 248, 10, 3750-3752 (1973).) Auch durch Umsetzen eines nativen Enzyms, z. B. Trypsin, mit seinem natürlichen Inhibitor und anschließender Vernetzung kann Substratspezifität des Enzyms verändert werden. (Siehe Beaven, G. H. und Gratzer, W. B. in Int. J. Peptide Res., 5, 215-18 (1953).)

Außerdem sind synthetische Proteine durch Verankern eines Aminosäurerestes an einem festen Träger und anschließendes Zufügen eines Aminosäurerestes nach dem anderen hergestellt worden.

Ferner sind halbsynthetische Proteine synthetisiert worden, indem ein natives Protein einer begrenzten Hydrolyse ausgesetzt wurde, um Proteinbruchstücke zu erzeugen, denen dann ein oder mehrere Aminosäurereste angefügt oder von ihnen entfernt wurden, wodurch modifizierte Bruchstücke gebildet wurden. Diese wurden zu einem halbsynthetischen Protein mit einer geänderten Aminosäurezusammensetzung wieder zusammengefügt ("Semisynthetic Proteins" von R. E. Offord, bei John Wiley and Sons Ltd., 1980).

Obwohl diese Techniken für viele Anwendungszwecke geeignet sind, sind sie kostspielig. Nach den bekannten Methoden wird ein Enzym einfach einem Satz von Bedingungen unterworfen und dann versucht, sein Verhalten aufzuklären.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches einwandfrei arbeitendes wirtschaftliches und systematisches Verfahren zur chemischen Änderung der Substratspezifität eines billigen und in großem Umfang zur Verfügung stehenden nativen Proteins zu einem immobilisierten enzymartigen modifizierten Protein anzugeben. Das nach dem Verfahren erhaltene Protein soll eine katalytische enzymatische Aktivität mit Bezug auf eine gewünschte chemische Reaktion zeigen, die bisher, durch das native Enzym katalysiert, keine für die Industrie geeignete Reaktion war; die neue Reaktion soll systematisch vorher bestimmt werden könne.

Die Aufgabe wird durch das Verfahren des Anspruches 1 und die Produkte der Ansprüche 12 bis 15 gelöst; bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 11 angegeben.

Bei dem Verfahren wird ein natives Protein zu einer davon verschiedenen immobilisierten stabilen enzymartigen modifizierten Protein-Form umgebaut, welche die katalytischen Aktivitätseigenschaften eines Modellenzyms zeigt. Die Möglichkeit des Maßschneiderns eines nativen Proteins mit vorbestimmter katalytischer Aktivität bringt größere Vorteile in weiten Bereichen der Chemie und Industrie. Wenn man z. B. ein Enzym verwenden will, das nicht in großen Mengen zur Verfügung steht, sehr teuer oder schwer zu isolieren oder zu reinigen ist, kann es als Modellenzym für die Herstellung eines enzymartigen modifizierten Protein-Analogons, das seine Aktivität nachahmt, dienen.

Das native Protein wird praktisch gleichzeitig in einer Stufenfolge zu einer immobilisierten stabilen leicht isolierbaren modifizierten Protein-Form umgewandelt und immobilisiert, welche die gewünschten Eigenschaften des Modellenzyms nachahmt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein Protein aus seiner nativen Konformation in eine modifizierte Konformation übergeführt. Der neue konformationale Zustand definiert ein enzymartiges modifiziertes Protein.

Hierin bedeuten "Enzym" ein Protein bekannter katalytischer Aktivität gegenüber spezifischen Substraten, d. h. bekannter Substratspezifität, und "Protein", wie allgemein, ein Polypeptid, das aus Aminosäuren unter Bildung eines biologischen Moleküls gebildet ist.

Das Verfahren umfaßt die chemische Änderung eines nativen Proteins von einer Konformation, seinem natürlichen oder nativen Zustand, in eine zweite Konformation, einem neuen modifizierten Zustand. Es wird ein neues enzymartiges modifiziertes Protein hergestellt und praktisch gleichzeitig immobilisiert, um ein stabiles neues enzymartiges modifiziertes Protein zu erhalten, das eine oder mehrere enzymatische Aktivitäten des ausgewählten Modellenzyms aufweist. Es ist gefunden worden, daß ein natives Protein in ein modifiziertes Protein umgewandelt und praktisch gleichzeitig immobilisiert werden kann, ohne daß irgendwelche nachteiligen Wirkungen auf den Umwandlungsprozeß oder den Immobilisierungsprozeß auftreten. Es sprechen keine sterischen oder anderen strukturellen Probleme gegen die Herstellung eines neuen enzymartigen modifizierten Proteins, wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gearbeitet wird.

Es wird ein natives Protein ausgewählt, das chemisch zur Herstellung des neuen enzymartigen modifizierten Protein- Analogons eines gewünschten Modellenzyms modifiziert werden soll. Das native Protein, das die gewünschte katalytische Aktivität, nämlich das enzymatische katalytische Verhalten des Modellenzyms nicht besitzt, wird in ein stabiles immobilisiertes enzymartiges modifiziertes Protein, das die biologischen katalytischen Aktivitätscharakteristiken des Modellenzyms nachahmt, umgewandelt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das native Protein in Gegenwart eines Inhibitors für das vorbestimmte Modellenzym partiell denaturiert. (Die Definition für "Inhibitor" wird später gebracht). Das an den Inhibitor gebundene partiell denaturierte native Protein wird mit einem festen Träger für eine Zeit und bei einer Temperatur, die ausreichen, einen immobilisiertes natives Protein- Inhibitor-Adsorptionskomplex herzustellen, in Kontakt gebracht und anschließend wird der vom Träger adsorbierte partiell denaturiertes Protein-Inhibitor-Komplex unter Bildung des neuen immobilisierten enzymatischen modifizierten Proteins vernetzt. Irgendwelches überschüssiges Vernetzungsmittel und Inhibitor werden entfernt, um das neue katalytisch aktive enzymatische modifizierte Protein- Produkt zu isolieren.

Der Ausdruck "partielle Denaturierung" bedeutet hierin eine Änderung in der Konformation eines Proteins derart, daß die natürliche Gestalt oder Konformation des Proteins gestört wird, ohne daß das Protein irreversibel stark denaturiert wird. Das Wort "Konformation" hat hierin die allgemein anerkannte Bedeutung, d. h., Kombination von sekundärer und tertiärer Aminosäurestruktur, die eine charakteristische Proteingestalt erzeugt.

Die partielle Denaturierung von Proteinen ist bekannt und diskutiert in: dem Buch Biochemistry von A. L. Lehninger, Worth Publishers, Inc., New York, New York, 1970, S. 58; dem Artikel von P. L. Privalov "Stability of Proteins" in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 167-192; dem Artikel von C. Sanford "Protein Denaturation, Part C" in Advancesin Protein Chemistry, Vol. 24, S. 2-97; dem Artikel von F. R. N. Gurd, et al. "Motions in Proteins" in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 74-166, dem Artikel von O. Jardetzky in BBA, Vol. 621, S. 227-232; dem Artikel von R. Huber in TIBS, Dezember 1979, S. 271, und dem Artikel von D. S. Markovich, et al. in Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 8, No. 6, S. 857-863.

Der Ausdruck "Denaturierungsmittel" bezieht sich hierin auf Verfahrensbedingungen und Reagenzien, die die partielle Denaturierung eines Proteins verursachen, wie z. B. Tränken, des Proteins mit einer wäßrigen Lösung erhöhter Temperatur, gewöhnlich im Bereich von 25 bis 60°C. Es ist jedoch bekannt, daß einige Proteine von thermophilen bakteriellen Quellen bis nahe an den Kochpunkt des Wassers stabil sind und höhere Temperaturen als die vorstehend genannten erforderlich machen.

Reagenzien für partielle Denaturierung sind wäßrige Lösungen, die ein anorganisches Salz, eine anorganische oder organische Säure oder ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthalten.

Geeignete anorganische Salze sind z. B.: NaF, (NH₄)₂SO₄, (CH₃)₄NCl, (CH₃)₄NBr, KCH₃COO, NH₄Cl, KCl, NaCl, CsCl, LiCl, KBr, NaBr, KNO₃, MgCl₂, NaNO₃, CaCl₂, KSCN, NaSCN, BaCl₂, NaJ und LiJ.

Geeignete anorganische Säuren sind z. B. Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und andere Protonen abgebende starke anorganische Säuren.

Geeignete organische Säuren schließen ein: Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure und Zitronensäure.

Geeignete mit Wasser mischbare Lösungsmittel für die Proteindenaturierung sind z. B. tert.-Butanol, Acetonitril, Dioxan, Aceton, Methanol, Ethanol und Dimethylsulfoxid.

Der Ausdruck "Inhibitor" bedeutet hierin irgendeine Verbindung von ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat eines Modellenzyms, um als Schablone für die katalytisch aktive Stelle des enzymartigen modifizierten Proteins zu dienen. Bevorzugt ist der Inhibitor irgendeiner der bekannten klassischen Inhibitoren für ein gegebenes Modellenzym. (Siehe "Enzyme Inhibitors", Proceedings of a Meeting held in Basel, Switzerland, on 20 and 21 March 1980, edited by Urs Brodbeck, Verlag Chemie, Weinheim, "Inhibitor Index" p. 275 to 278; and "Handbook of Enzym Inhibitors", M. K. Jain, John Wiley+Sons, New York 1982, Inhibitor Index 1-380). In dieser Beschreibung und den Ansprüchen kann "Inhibitor" aber auch irgendein Molekül einschließen, das ausreichende strukturelle Ähnlichkeit mit dem klassischen Inhibitor hat, um eine inhibitorartige Stelle an dem modifizierten Protein beizubehalten (zu bewahren). Das natürliche Substrat des Modellenzyms kann in vielen Fällen als Inhibitor oder Schablone des modifizierten Proteins wirken. Inhibitoren werden allgemein nicht durch das Enzym abgebaut wie Substrate und bieten einer katalytischen Stelle leichter Schutz als das natürliche Substrat. Ein Beispiel für strukturelle Ähnlichkeit eines Enzym-Inhibitors und des natürlichen Substrats eines Enzyms ist der Fall Glucose-Oxidase. Glucose ist das natürliche Substrat der Glucose-Oxidase, während D-Glucal der Inhibitor von Glucose-Oxidase ist. Glucose und D-Clucal sind strukturell sehr ähnlich.

Das bei dem Verfahren nach der Erfindung erhaltene enzymartige modifizierte Protein ist an einem festen Träger immobilisiert, der gewöhnlich von anorganischer Zusammensetzung ist. Besonders bevorzugt sind anorganische wasserunlösliche Träger, wie feuerfeste keramische Oxide, z. B. poröse feinzerteilte anorganische Oxide, die durch Kompaktieren und Sintern keramischer Oxidpulver wie Aluminiumoxid, Zirkonoxid, Magnesiumoxid, Siliciumdioxid und Thoroxid in Pulverform gebildet werden können. Aluminiumoxid- Pulver wird wegen seiner chemischen Beständigkeit und seiner geringen Kosten besonders bevorzugt. Die Herstellung und Verwendung von keramischem Aluminiumoxid und anderen keramischen Oxidträgern ist in der US-PS 40 01 085 offenbart.

"Vernetzen" bedeutet hierin die Bildung kovalenter Bindungen zwischen reaktiven Stellen an einem Protein. Im allgemeinen wird die Vernetzung von Proteinen durch Verwendung multifunktioneller Reagenzien, wie Glutaraldehyd, durchgeführt. Weitere geeignete Vernetzungsmittel sind: 2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin; Diazoniumsalze, N-Hydroxysuccinamid; p-Benzoylazid, die offenbart sind in: Wold, F., Methods Enzymol, 11, edited by C. H. W. Hirs, C. H. W., Academic Press, 1967, 617; Fasold, H. et al., Augen. Chem. Int. Ed. Engl., 10, 795, 197 und Keyes, M. H., in the Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 9, 3rd Ed., 1980, J. Wiley+Sons, Inc., 148-172.

Wenn das native Protein, das in ein enzymartiges modifiziertes Protein analog einem Modellenzym umgewandelt werden soll, reich an Disulfid-Brücken ist, kann die Vernetzung des Proteins, nachdem es partiell denaturiert und dem Kontakt mit dem Inhibitor unterworfen worden ist, durch Umlagerung der Disulfid-Brücken erreicht werden. Dazu wird das native an Disulfidbrücken reiche Protein bei etwa neutralem pH verschiedenen Reagenzien ausgesetzt, die Disulfid-Brücken zu Sulfhydryl-Gruppen aufbrechen. Bevorzugt ist beta-Mercaptoethanol. Es spaltet die Disulfid- Brücken, wodurch die konformationale Struktur des Proteins gelockert und das Protein durch die Bildung von Sulfhydryl-Gruppen partiell denaturiert wird. Nachdem das Protein mit dem Inhibitor des Modellenzyms in Kontakt gebracht worden ist, können die Sulfhydryl-Gruppen in die Disulfid-Form zurückgeführt werden, um das Protein zu einem neuen stabilen enzymartigen modifizierten Protein wieder zu verketten. Die Verkettung von Sulfhydryl-Gruppen zu Disulfiden kann einfach durch Erhöhen des pH-Wertes ausgeführt werden. Ein pH-Wert von 9 bis 10 ist gewöhnlich voll ausreichend. Da aber molekularer Sauerstoff gewöhnlich ein Reaktant bei der Disulfidbrückenbildung aus Sulfhydryl ist, sollte die Reaktion bei hohem pH-Wert in Gegenwart von molelularem Sauerstoff ausgeführt werden. Andere Oxidationsmittel, die für die Oxidation von Sulfhydrylfunktionen zu den entsprechenden Disulfiden bekannt sind, sind in gleicher Weise geeignet.

Viele Enzyme sind dem Verfahren nach der Erfindung zugänglich, indem ihre enzymartigen modifizierten Protein- Analoga aus nativem Protein-Ausgangsmaterial nachgebildet werden können. Beispiele für Modellenzyme sind hydrolytische Enzyme, Redox-Enzyme und Transferase-Enzyme. Hydrolytische Enzyme schließen ein: proteolytische Enzyme, die Proteine hydrolysieren, z. B. Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; Carbohydrasen, die Kohlenhydrate hydrolysieren, z. B. Cellulase, Amylase, Maltase, Pectinase, Chitanase; Esterasen, die Ester hydrolysieren, z. B. Lipase, Cholinesterase, Lecithinase, alkalische und sauere Phosphatasen; Nucleasen, die Nucleinsäure hydrolysieren, z. B. Ribonucleinsäure, Desoxyribonucleinsäure; und Amidasen, die Amine hydrolysieren, z. B. Arginase, Asparaginase, Glutinase, Histidase und Urease. Redox-Enzyme katalysieren die Oxidations- und Reduktions-Reaktionen. Sie schließen ein: Glucose-Oxidase, Xanthin-Oxidase, Catalase, Peroxidase, Lipoxidase und Cytochrom-Reductase. Transferase-Enzyme übertragen Gruppen von einem Molekül auf ein anderes. Beispiele hierfür sind Glutamin-Brenztraubensäure- Transaminase, Glutamin-Oxalessigsäure-Transaminase, Transmethylase, Phosphobrenztraubensäure- Transphosphorylase.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung wählt man gewöhnlich zuerst ein Modellenzym aus. Dann wählt man ein natives Protein, das dem Modellenzym nachgebildet werden soll. In vielen Fällen ist das native Protein selbst enzymatisch aktiv, da viele gewöhnliche Enzyme in großen Mengen zu niedrigen Preisen in homogenen Proben zu erhalten sind. Aber nicht-enzymatische Proteine sind ebenso geeignet, wenn sie für die Verwendung in diesem Verfahren gereinigt werden können. Ein Beispiel für ein nicht-enzymatisches Protein, das als natives Protein- Ausgangsmaterial verwendet werden kann, ist Rinderserumalbumin (BSA), das in relativ reiner Form zu mäßigen Preisen erhältlich ist.

Das native Protein wird gereinigt und in einer nahezu neutralen wäßrigen Lösung in Gegenwart eines geeigneten Puffers zur Aufrechterhaltung der neutralen Reaktion gelöst.

Bei der Ausführungsform (A) wird das native Protein nach einer der weiter oben beschriebenen Methoden partiell denaturiert, um eine partiell denaturierte lösliche Form des nativen Proteins zu erhalten, und mit einem Inhibitor des Modellenzyms vermischt. Danach wird ein Träger, z. B. feinzerteiltes poröses Aluminiumoxid, mit dem partiell denaturierten nativen Protein in Gegenwart des Inhibitors für das Modellenzym vermischt und ausreichend lang bei ausreichender Temperatur belassen, daß sich der partiell denaturierte Protein-Inhibitor-Komplex bilden und an der Oberfläche des porösen feinteiligen Trägers absorbieren kann. Dann muß zur Bewahrung des neuen enzymartigen modifizierten Proteins der partiell denaturiertes natives Protein-Inhibitor-Komplex durch Vernetzen stabilisiert werden, um das enzymartige modifizierte Protein zu erhalten. Häufig wird das Vernetzen mit Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel, wie weiter vorn beschrieben, oder durch Sulfhydryl-Umlagerung vorgenommen.

Bei der Ausführungsform (B) wird das native nicht partiell denaturierte Protein an einer Oberfläche (innere und/oder äußere) eines porösen feinzerteilten keramischen Oxidträgers adsorbiert. Das immobilisierte native Protein wird dann der partiellen Denaturierung unterworfen. Das partiell denaturierte, durch Adsorption immobilisierte Protein wird mit dem Inhibitor des Modellenzyms für die Bildung des partiell denaturiertes Protein-Inhibitor-Kompelxes vermischt. Nachdem der partiell denaturiertes natives Protein-Inhibitor-Komplex gebildet ist, der schon am Träger immobilisiert worden ist, wird die Vernetzung wie vorstehend beschrieben vorgenommen.

Ausführungsform (C) basiert darauf, daß das native Protein partiell denaturiert, an einem porösen feinteiligen Träger adsorbiert und dadurch immobilisiert werden kann und danach das partiell denaturierte immobilisierte Protein mit dem Inhibitor in Kontakt gebracht werden kann. Danach wird der partiell denaturiertes natives Protein-Inhibitor-Komplex unter Erzeugung eines neuen enzymartigen modifizierten Proteins vernetzt.

Nach Ausführungsform (D) wird das stabile immobilisierte enzymartig modifizierte Protein hergestellt durch Vermischen eines partiell denaturierten nativen Disulfidgruppen aufweisenden Proteins mit einem Reduktionsmittel und mit dem Inhibitor des Modellenzyms unter Bildung eines löslichen partiell denaturiertes Protein-Inhibitor- Komplexes. Anschließend wird der Komplex an den Träger adsorbiert und dann der Komplex zur Erzeugung des neuen enzymartigen modifizierten Proteins durch ein Oxidationsmittel für Sulfhydrylgruppen vernetzt.

Vorzugsweise wird das native Protein mit Bernsteinsäureanhydrid bei niedrigem pH-Wert, z. B. etwa 4, umgesetzt, um neue negative geladene Carbonsäure-Seitenketten am Protein zu bilden. Die Carbonsäureketten, die durch die Bernsteinsäureanhydrid-Umsetzung erzeugt werden, werden durch die Reaktion der Anhydridfunktion des Bernsteinsäureanhydrids mit freien Aminogruppen am Protein gebildet. Diese Reaktion wandelt positive Aminogruppen am Protein in negative Carbonsäurereste um. Diese Umwandlung ist von Vorteil, da keramische Oxidträger, die bevorzugten Träger nach der Erfindung, bei niedrigem pH-Wert positiv geladen sind. Durch die Bildung mehrerer negativ geladener Gruppen an der Oberfläche des nativen Proteins gibt es eine größere elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Träger und dem Protein, das zu immobilisieren ist, wodurch die Bildung und Aufrechterhaltung der Protein-Immobilisation unterstützt wird.

Es ist auch gefunden worden, daß die Produktion enzymartiger modifizierter Proteine erhöht werden kann, wenn man verschiedene Überbrückungsgruppen verwendet, die sich zwischen die Carbonsäurereste am Protein spannen (entweder Carbonsäuregruppen vom nativen Protein oder vom Anhydrid stammend), um zur Vernetzung des Proteins beizutragen. Solche Überbrückungsgruppen sind Diaminopropan-Hydrochlorid in Gegenwart eines Carbodiimids. Ein geeignetes Carbodiimid ist z. B. Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid.

Diaminopropan liefert Aminogruppen, die mit den nativen oder den neu gebildeten, von Bernsteinsäureanhydrid stammenden Carbonsäuregruppen am nativen Protein unter Bildung kovalenter Bindungen reagieren. Dem entsprechend dienen die vom Bernsteinsäureanhydrid geschaffenen Carbonsäuregruppen am Protein nicht nur zur elektrostatischen Verankerung des Proteins am Träger, sondern ein Teil dieser Gruppen bietet auch reaktive Stellen für die Vernetzung des Proteins durch Umsetzung mit den Aminogruppen des Diaminopropans.

Es ist auch gefunden worden, daß die Produktion enzymartiger modifizierter Proteine durch die Verwendung von Carbodiimiden erhöht werden kann. Solche Carbodiimide reagieren mit Protein-Amin und -Carbonsäure-Funktionen unter Bildung kovalenter Bindungen. Die Bildung von Peptidbindungen unterstützt die Vernetzung des neu gebildeten modifizierten Proteins, indem sie seine Struktur stabilisiert.

Es ist nicht besonders kritisch, Bernsteinsäureanhydrid und das Diaminopropan in bestimmter Reihenfolge mit dem nativen Protein zu vermischen. Das native Protein kann z. B. mit Bernsteinsäureanhydrid unter Bildung von Carbonsäuregruppen umgesetzt, immobilisiert, mit Diaminopropan und anschließend mit einem Carbodiimid umgesetzt werden, um ein vernetztes enzymartiges modifiziertes Protein zu erhalten. Alternativ kann das native Protein mit dem Bernsteinsäureanhydrid umgesetzt werden, anschließend mit Diaminopropan, dann immobilisiert und danach mit dem Carbodiimid umgesetzt werden.

Es ist auch möglich, das native Protein zu denaturieren, mit dem Inhibitor in Kontakt zu bringen, zu immobilisieren und dann in einer einzigen Verfahrensstufe mit einer Kombination von Bernsteinsäureanhydrid und Carbodiimid umzusetzen, um das vernetzte neue enzymartige modifizierte Protein zu erhalten.

Bei allen Ausführungsformen der Erfindung wird der Inhibitor des Modellenzyms nach der Synthese des enzymatischen modifizierten Proteins entfernt. Gewöhnlich genügt wiederholtes Waschen des immobilisierten modifizierten Proteins, um den Inhibitor zu entfernen. Gepufferte wäßrige Lösungen können auch verwendet werden; Beispiele für solche Puffer werden weiter unten gegeben.

Das durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhaltene immobilisierte enzymartige modifizierte Protein ist stabil, leicht zu gewinnen und in Umlauf zu führen und hat eine neue enzymatische katalytische Aktivität, die das native Protein nicht besaß. Solche modifizierten Proteine, die enzymartiges katalytisches Verhalten zeigen, können anstelle eines natürlich vorkommenden Enzyms zur Durchführung katalytischer, anabolischer und katabolischer Reaktionen eingesetzt werden.

Die Erfindung wird nun noch an speziellen Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

10 g poröses feinzerteiltes Aluminiumoxid (Teilchendurchmesser von 147 bis 175 µm), wurden dreimal mit Wasser gewaschen.

Poröse inerte harte dimensionsstabile feuerfeste fluiddurchlässige Trägerpartikel können hergestellt werden durch Verdichten eines solchen feuerfesten Oxidpulvers unter Bildung "grüner Preßlinge" der gewünschten Gestalt und Sintern der grünen Preßlinge bei einer genügend hohen Temperatur ausreichend lange. Das Sintern sollte nicht bei einer Temperatur oder in einer Zeit vorgenommen werden, bei der Zusammenfallen oder Koaleszieren der Partikel unter Bildung eines nicht-porösen Körpers eintritt. Ein geeignetes Anzeichen des Sintergrades ist ein Vergleich der tatsächlichen Dichte des gebrannten Preßlings mit der theoretischen Dichte des gebrannten Oxids.

Von vielen Oxiden, die verwendet werden können, wird Aluminiumoxid wegen seiner chemischen Beständigkeit und einfachen Herstellung bevorzugt.

Bei der Bildung des feinteiligen Trägers aus dem pulverförmigen feuerfesten Oxid wird die Partikelgröße so gewählt, daß ein gesinterter Preßling erhalten wird, dessen Porosität und Porendurchmesser in dem gewünschten Bereich liegt. Verdichtungs- und Sinterverfahren zur Herstellung poröser Träger sind bekannt. Es dürfte ausreichen zu bemerken, daß Verdichtungsdrücke im Bereich von 7 bis 70 MPa und Sintertemperaturen im Bereich von 1300° bis 1700°C industriell geeignet sind. (Weitere Einzelheiten siehe "Oxide Ceramics" von E. Ryshkewitch, 1960, Academic Press, New York, N. Y.).

Zunächst wurden 0,5 g Rinderserumalbumin (BSA) Type A-6003, Partie 110F-9305) in 50 ml 1 mM (Ionenstärke) 2-Amino-2-(hydroxymethyl)- 1,3-propandiol-(Tris)-Puffer bei pH 7,5 gelöst. Die 50-ml-Lösung wurde dem gewaschenen Aluminiumoxid-Träger zugegeben, wobei ein pH-Wert von 7,5 resultierte. Die Absorbance bei 280 nm war 6,62. Dann wurden der Aluminiumoxid- Trägerlösung 0,5 ml einer 0,2-m-Lösung von beta- Mercaptoethanol (BME) zugefügt und die resultierende Lösung 0,5 Stunden geschüttelt. Danach war der pH-Wert 7.

Dann wurden 0,333 g Tryptamin, Inhibitor für Esterase, zugegeben, und der resultierende pH-Wert war 7,2. Die Lösung wurde 0,5 Stunden gerührt und der pH-Wert durch Zugabe von 0,01 m NaOH auf 8,7 erhöht.

Die Lösung wurde für weitere 1,5 Stunden geschüttelt, dann wurde der Träger mit dem gebundenen esteraseartigen modifizierten Protein 5mal mit 1 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 1% des Inhibitors Tryptamin und 30% Rohrzucker enthielt, gewaschen und in der Lösung bis zum Gebrauch gelagert.

Das so hergestellte esteraseartige modifizierte Protein wurde wie folgt untersucht: 25 ml der 1 mM L-Tryptophan- Lösung wurden durch Lösen von 0,005 g in destilliertem Wasser und Einstelen des Volumens in einem 25-ml-Meßkolben hergestellt. Dann wurden 25 ml 0,01 m L-Tryptophan- Methylester (TME)-Substrat durch Lösen von 0,0637 g in destilliertem Wasser und Einstellen des Volumens in einem 25-ml-Meßkolben hergestellt. 1 l 1 mM Tris-Puffer wurde durch Einstellen von 1 l destilliertem Wasser mit 1 n HCl auf einen pH-Wert von 3 und dann erneut Einstellen mit Tris-Puffer auf einen pH-Wert von 7,5 hergestellt. 3 l 0,03 m Acetat-Eluant wurden hergestellt durch Lösen von 12 g Natriumacetat-Trihydrat und 0,2 ml Eisessig in 3 l destilliertem Wasser. Die resultierende Eluantlösung hatte einen pH-Wert von 6.

Die Untersuchung wurde an einem HPLC durchgeführt. Die Säule wurde mit porösem Carbonsäure-Seitenketten aufweisenden Siliciumdioxid gefüllt. Die injizierte Probe wurde von einer 0,02 ml Probeschleife abgegeben.

Die Säulenretentionszeiten einer Mischung von 1 mM L-Tryptophan und 0,01 m TME (50 : 50) wurden wie üblich bestimmt.

Dann wurde eine Kontrollösung durch Mischen von 1 ml 0,1 m TME in 9 ml eines 1 mM Tris-Puffers, pH 7,0, hergestellt. Der pH-Wert der Lösung war 5,8.

10 ml Probelösung wurde hergestellt durch Zugaben von 0,5 bis 1 g (Trockengewicht) des vorstehend beschriebenen immobilisierten enzymartigen modifizierten Proteins zu 9 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 9,0, und 1 ml 0,1 m TME. Der pH-Wert der Lösung war 5,8.

Für die chromatographsiche Untersuchung muß der pH- Wert der Probelösung und der Kontrollösung gleich sein. Im allgemeinen zeigt die Probelösung einen höheren pH-Wert als die Kontrollösung, wenn sie in einem Kühlschrank eine Zeitlang gelagert worden ist. Der höhere pH-Wert kann durch Dekantieren der Lösung vom festen Träger und Ersetzen durch eine neue Kontrollösung gesenkt werden. Dies wird so lange wiederholt, bis die pH-Werte der Probe und der Kontrolle nahezu gleich sind. Da das neue esteraseenzymartige modifizierte Protein am Träger immobilisiert ist, tritt bei wiederholter Änderung der Lösung keine schädliche Wirkung ein.

Die Kontrolle und die Probe wurden auf die Säule injiziert. Die Konzentration von L-Tryptophan wurde auf der X-Achse und die Elutionszeit auf der Y-Achse aufgetragen.

Die Aktivität des Träger-immobilisierten esteraseenzymartigen modifizierten Proteins wurde nach folgender Gleichung berechnet:

in der bedeuten:
Aktivität: Units/ml Träger;
Änderung in S: die Änderung der Neigung der Molarität;
Σδ m: die Summe der Standard-Abweichung der Neigungen der Probe und der Kontrolle;
10⁺⁶ Mikromole;
10^-2 das Volumen der Probe in 1; 2,6 ist die Dichte des Trägers in g/ml und
U: Mikromole/Min.

Das Untersuchungsergebnis war wie folgt:

SubstratTME (U/ml Träger) Aktivität zu Beginn0,00 Aktivität am Schluß Untersuchung 13,9 ± 1,9 × 10^-3 Aktivität am Schluß Untersuchung 25,3 ± 0,61 × 10^-3 Aktivität am Schluß Untersuchung 38,8 ± 1,19 × 10^-3 Aktivität am Schluß Untersuchung 44,9 ± 1,114 × 10^-3

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte esteraseenzymartige Protein, hergestellt nach der Erfindung, Aktivität gegenüber Esterasesubstrat TME besitzt, wo im nativen BSA keine Aktivität nachgewiesen worden war. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung eines nichtenzymatischen Proteins, eines Alubumins, in eine andere Gattung von Protein, eines enzymatisch aktiven esteraseenzymartigen modifizierten Proteins.

Beispiel 2

60 mg Ribonuclease (No. R 5503, Type 1AS, Partie 20-F 81 001) wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Die resultierende Lösung hatte einen pH-Wert von 4,7 und eine Absorbance bei 280 nm von 0,313. Dann wurden 0,3 ml 0,2 m beta-Mercaptoethanol als Disulfid-Brücken- Aufspaltungsreagenz zugegeben, wobei der pH-Wert der Lösung auf 4,4 sank. Er wurde durch Zugabe von 1,3 ml 0,01 n NaOH auf 7,0 zurückgebracht und 2 Stunden beibehalten. Dann wurden 40 mg Indol als Inhibitor zugesetzt, für dessen Lösung 1,25 Stunden erforderlich waren. Es wurden auch 3 µl (Mikroliter) 0,01 n NaOH zugefügt, um den pH-Wert auf 7,0 zu halten.

Danach wurde der pH-Wert der Lösung durch Zugabe von 4,7 ml 0,01 m NaOH auf 9,45 gebracht. Die Lösung wurde 3 Stunden bei diesem pH-Wert gehalten, was die Zugabe von 0,9 ml 0,01 m NaOH über die 3 Stunden erforderlich machte. Dann wurden 20 g des gleichen porösen feinzerteilten Aluminiumoxids, wie in Beispiel 1, zur Hälfte dieser Lösung zugegeben. Danach wurden 0,4 g 0,01 n NaOH zugegeben, um den pH-Wert der resultierenden Träger- Proteinmischung auf 9,45 zu bringen. Danach wurden der Lösung 0,01 ml 1 mM Bernsteinsäure-Reagenz (verwendet, um die Sulfhydrylgruppen in Disulfidbrücken zurückzuführen) und 0,025 g Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid (EDC) (Vernetzungsmittel) zugegeben. Der pH-Wert der Lösung war nach 15 Minuten 7,15. Nach diesen 15 Minuten wurden 5 ml 5%iger (Gewicht/Gewicht) EDC mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min zugegeben. Man ließ die Lösung über Nacht (etwa 17 Stunden) in einem kalten Schüttler (0-5°C) reagieren. Nach der Reaktionszeit war der pH-Wert der Lösung, die das neue synthetisierte vernetzte immobilisierte enzymartig modifizierte Protein enthielt, 6,4. Er wurde durch Zugabe von 0,4 ml 0,01 n NaOH auf 7 zurückgebracht. Das immobilisierte enzymartige modifizierte Protein wurde 5mal mit 1 mM Tris-Puffer, pH 7, der 0,04% Indol enthielt, gewaschen. Es wird angenommen, daß die Inhibitor- Lösung die gewünschte Konformation des neu hergestellten enzymartigen modifizierten Proteins während der Lagerung stabilisiert.

Die Untersuchung eines erhaltenen enzymartigen modifizierten Proteins auf enzymatische Aktivität wurde an einer HPLC durchgeführt. Die Analyse wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Eluant 5 mM Tris-Puffer, pH 8,0, war und das Substrat 0,0115 m Tryptophanmethylester (TME).

Die Untersuchungsergebnisse waren die folgenden:

SubstratTME (U/ml Träger) Aktivität zu Beginn0,00 Aktivität am Schluß
- nach 1 Tag0,51 - nach 2 Tagen0,43

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das esteraseartige modifizierte Protein, hergestellt nach der Erfindung, enzymatische Aktivität mit Bezug auf Esterasesubstrat TME besitzt. An der nativen Ribonuclease war keine solche Aktivität nachgewiesen worden. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung von Enzym, einer Nuclease, in eine andere Gattung von Protein, eines esterase-enzymartig modifizierten Proteins.

Beispiel 3

60 mg Ribonuclease Type R-5000-IIA, Partie 110-F-02 051) wurden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Der pH-Wert der Ribonuclease-Lösung war zu Beginn 4,6, die Absorbance bei 280 nm 0,693. Nach 15 Minuten Wartezeit wurden 0,1 ml einer 0,1 m BME-Lösung unter langsamem Rühren bei 25°C zugegeben. Der pH-Wert der Lösung stieg nach Zugabe von 0,1 m NaOH sofort auf 7,0 an. Die resultierende neutrale Lösung wurde 1 Stunde bei etwa 25°C gerührt. Dann wurden 10 mg Indol als Inhibitor zugegeben und die Lösung 1,5 Stunden gerührt. Während des Rührens wurde der pH-Wert der Lösung langsam durch tropfenweise Zugabe von 0,1 m NaOH auf 8,2 gebracht. Nach der Rührzeit von 1,5 Stunden wurde der pH-Wert der Lösung langsam innerhalb 1 Stunde auf 9,45 gebracht und weitere 2 Stunden durch tropfenweise Zugabe von 0,1 m NaOH aufrechterhalten.

Dann wurden 10 g des Aluminiumoxid-Trägers des Beispiels 1 der partiell denaturierten inhibitor-gebundenen Enzymlösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde dann in einen Schüttler bei 0°C bis 5°C gegeben. Als die Temperatur der Lösung 5°C erreicht hatte, wurden 0,1 ml einer 8%igen Glutaraldehydlösung zugefügt. Die Mischung wurde über Nacht (etwa 17 Stunden) bei 0°C bis 5°C unter schwachem Schütteln reagieren gelassen.

Die Untersuchung des neu hergestellten esteraseenzymartig modifizierten Proteins wurde auf enzymatische Aktivität am HPLC vorgenommen. Es wurde die gleiche Methode wie in Beispiel 1 beschrieben angewandt. Die Untersuchungsergebnisse waren die folgenden:

SubstratTME (U/ml Träger) Aktivität zu Beginn0,00 Aktivität am Schluß0,52

Die Ergebnisse zeigen, daß das esterase-enzymartig modifizierte Protein, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, enzymatische Aktivität mit Bezug auf Esterasesubstrat TME aufweist. An der nativen Ribonuclease wurde vorher keine Aktivität festgestellt. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Enzymgattung, nämlich einer Nuclease in eine zweite Proteingattung, nämlich eines esterase-enzymartigen modifizierten Proteins.

Beispiel 4

60 mg Ribonuclease Partie No. 20F-81 001) wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Absorbance bei 280 nm war 0,333 bei einem pH-Wert von 4,6. Dann wurden 0,3 ml 0,2 m BME zugegeben. Man ließ die Lösung 5 Minuten stehen, wonach der pH-Wert der Lösung 4,7 war. Er wurde durch Zugabe von 2,8 ml 0,01 n NaOH auf pH 7 gebracht. Die Lösung wurde 2 Stunden durch Zugabe von 0,01 n NaOH auf dem pH-Wert 7 gehalten. Gelegentlich ist der Zusatz nicht erforderlich, weil der pH-Wert von sich aus von etwa 7 auf etwa 7,2 steigt. Wenn der pH-Wert jedoch nicht spontan ansteigt, ist die Zugabe von NaOH erforderlich. Dann wurden 20 mg gewaschenes poröses feinzerteiltes Aluminiumoxid des Beispiels 1 der Lösung bei einem pH-Wert von 7,2 zugefügt, der nach Zugabe des festen Aluminiumoxid-Trägers auf 7,7 stieg.

Das Ribonuclease-Enzym wurde in Gegenwart des Aluminiumoxid- Trägers an den Inhibitor für das Modellenzym wie folgt gebunden. Etwa 0,04 g Indol als Inhibitor wurden der Lösung bei pH 7,7 zugefügt. Dieser pH-Wert wurde 15 Minuten aufrechterhalten. Dann wurde die Lösung durch Zugabe von 20 ml 0,01 n NaOH auf einen pH-Wert von 9,45 gebracht.

Das an den Träger gebundene partiell denaturierte Enzym wurde in Gegenwart des Inhibitors Indol durch Beibehaltung des pH-Werts von 9,45 2 Stunden bei Raumtemperatur vernetzt. Diese 2 Stunden dauernde Periode bei erhöhtem pH-Wert gestattet den Sulfhydrylgruppen wieder Disulfid- Brücken zu bilden und das neu synthetisierte esteraseartige modifizierte Protein intramolekular zu vernetzen.

Nach diesen 2 Stunden wurde die das immobilisierte esteraseartige modifizierte Protein enthaltende Lösung dekantiert und der Träger mit dem an ihn gebundenen neuen enzymartigen Protein wiederholt mit 2 l einer 1 mM-Lösung von Tris-Puffer, pH 7, die 0,04% Indol enthielt, gewaschen und unter Kühlung in der Tris- Puffer-Indollösung bis zum Gebrauch aufbewahrt.

Die Aktivität des am Träger immobilisierten esteraseartigen modifizierten Proteins wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch HPLC bestimmt.

Die Untersuchungsergebnisse waren die folgenden:

SubstratTME (U/ml Träger Aktivität zu Beginn 0,00 Aktivität am Schluß (Tage)
 111,97 ± 0,937 × 10^-3  3 5,78 ± 1,64 × 10^-3  8 7,56 ± 1,90 × 10^-3 10 7,22 ± 1,80 × 10^-3 11 8,65 ± 1,60 × 10^-3

Die Ergebnisse veranschaulichen, daß das esteraseenzymartige modifizierte Protein, hergestellt nach der Erfindung enzymatische Aktivität mit Bezug auf Esterasesubstrat TME besitzt. An der nativen Ribonuclease war vorher keine Aktivität festgestellt worden. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer enzymatischen Gattung, nämlich einer Nuclease, in eine zweite Gattung von Protein, nämlich ein esteraseartiges modifiziertes Protein.

Beispiel 5

500 ml Rinderleber-Catalaseenzym (Type C-40, Partie 109C-7370) wurden in 200 ml destilliertem deionisierten Wasser unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst. Der pH-Wert der resultierenden Lösung war 6,5. Danach wurden zur partiellen Denaturierung des Catalaseenzyms 10 mg Bernsteinsäureanhydrid in 1 ml Aceton gelöst. 300 µl der Bernsteinsäureanhydrid- Aceton-Lösung wurden der Catalase-Lösung alle 10 Minuten zugegeben. Nach Beendigung der Zugabe der ganzen Bernsteinsäureanhydrid-Aceton-Lösung war der pH-Wert der resultierenden Lösung 4,0 und die Lösung war leicht trübe.

Dieser Lösung wurde Galactosidase-Inhibitor, nämlich D-Galactal (Partie 56 129, code 2836 h), in einer Menge von 250 mg zugegeben und die Lösung 15 Minuten bei 25°C gerührt. Dann wurden 25 g des porösen feinzerteilten Aluminiumoxid-Trägers Partikelgröße 175 bis 208 µm), beschichtet mit Diethylaminoethyl-Dextran (DEAE-Dextran), zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 25°C schwach geschüttelt.

Der DEAE-Dextran-beschichtete Träger war wie folgt hergestellt. 200 g poröses Aluminiumoxid (-40+50 mesh, Partikelgröße 300 bis 400 µm) wurden wiederholt mit destilliertem deionisierten Wasser gewaschen, bis es von feinsten Teilen frei war. Dann wurden 20 g Natriumsulfat in 500 ml destilliertem deionisierten Wasser gelöst und mit 200 g Aluminiumoxid-Träger gemischt, wobei bei 25°C gerührt wurde. Danach wurden 10 g Natriumhydroxid in 250 ml destilliertem deionisierten Wasser gelöst und 32 g DEAE-Dextran (Type 0-4885, Partie, 87 C-0139) langsam zugegeben. Die Aluminiumoxid-Natriumsulfat-Mischung und die DEAE-Dextranlösung wurden dann miteinander vermischt und 2 Stunden bei 25°C schwach geschüttelt. Danach wurden 10 g Natriumhydroxid in 250 ml destilliertem deionisierten Wasser gelöst und 40 ml Epichlorhydrin unter Rühren bei 25°C zugegeben. Die Epichlorhydrinlösung wurde dann mit der DEAE-Dextran-Aluminiumoxid- Träger-Mischung vermischt und die ganze Mischung bei 25°C 24 Stunden lang schwach geschüttelt. Nach diesen 24 Stunden wurde das Präparat intensiv mit deionisierten Wasser gewaschen, bis das Waschwasser klar war. Der neu gebildete mit DEAE-Dextran beschichtete Aluminiumoxid-Träger kann unter Kühlung (bei 0-5°C) in destilliertem deionisierten Wasser bis zum Gebrauch gelagert werden.

Nach Zugabe des Inhibitors und Absorption des partiell denaturierten nativen Catalaseenzyms an dem Aluminiumoxid- Träger wurde die Catalase auf dem Träger wie folgt vernetzt.

10 mg Diaminopropan-Hydrochlorid wurden in 25 ml destilliertem deionisierten Wasser gelöst. 1 ml dieser Lösung wurde dann zu dem Präparat, das den Träger enthielt, zugegeben und 1 Stunde geschüttelt. Der pH-Wert wurde durch tropfenweise Zugabe von 1,0 m NaOH von etwa 4,0 auf etwa 7,0 gebracht. Der DEAE-Dextran-beschichtete Aluminiumoxid-Träger war von grüner Farbe und die überstehende Flüssigkeit zeigte Trübung. Dann wurden 500 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) zugegeben und das ganze 3 Stunden bei 25°C unter schwachem Schütteln reagieren gelassen, wonach die überstehende Flüssigkeit klar war.

Der Träger mit dem immobilisierten und vernetzten enzymartigen modifizierten Protein darauf wurde dann gewaschen mit 1 l destilliertem deionisierten Wasser, dann mit 1 l 0,2 m Ammoniumsulfat und anschließend mit 1 l destilliertem deionisierten Wasser gewaschen. Das Präparat wurde unter 1%iger D-Galactal-Lösung bei 0-5°C, pH 6, gelagert, um das neu gebildete enzymartige modifizierte Protein, das, wie vorstehend beschrieben, vernetzt und am Träger immobilisiert worden ist, zu stabilisieren.

Die Untersuchung des enzymartigen modifizierten Proteins auf Aktivität wurde wie folgt durchgeführt. Eine Reaktionslösung für die Untersuchung wurde durch Vermischen von 10 ml 0,002 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, mit 15 ml destilliertem deionisierten Wasser und 5 ml 0,014 m o-Nitrophenyl-beta-D-galactosid-Substrat-Lösung in einem 50-ml-Becher hergestellt.

3 ml der Lösung wurde dann in eine Küvette gebracht und diese Küvette in ein Spektrophotometer (Model ACTA III) eingebracht, worin eine Basislinie für 3 Minuten bei 405 nm aufgezeichnet wurde, um eine stabile Basislinie festzulegen. Dann wurden etwa 1 g des immobilisierten enzymartig modifizierten Proteins mit destilliertem deionisierten Wasser gewaschen und der Substratlösung zugefügt. Alle 3 Minuten wurden 3 ml Substratlösung abgezogen, die Absorbance bei 405 nm gemessen und die Ergebnisse aufgezeichnet. Die 3 ml Substratlösung wurde dann in das Reaktionsgefäß wieder zurückgegeben. Dieses Vorgehen wurde 6mal wiederholt.

Die resultierende Neigung infolge des Anstiegs der Absorbance pro Minute gibt eine Aktivität des für das enzymartige modifizierte Protein nach der Erfindung gegenüber dem Substrat o-Nitrophenyl-beta-D-galactosid. Der Anstieg in der Absorbance über eine Zeitdauer von 6 Minuten wurde mit 0,015 bestimmt.

Die Kontrolluntersuchung am DEAE-überzogenen Aluminiumoxid-Träger gegenüber o-Nitrophenyl-beta-D-galactosid wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt, ausgenommen, daß das immobilisierte modifizierte Protein durch 1 g des DEAE-beschichteten Aluminiumoxid-Trägers ersetzt wurde. Es wurde keine Absorbanceänderung innerhalb der 15-Minuten-Periode festgestellt.

Die Aktivität des am Träger immobilisierten modifizierten galactosidaseartigen Proteins wurde nach folgender Gleichung berechnet:

worin bedeuten: Änderung in A/min: Änderung in der Absorbance pro Minute; 10⁶: Mikromole/Mol; V _s : das Volumen der Probe in Liter; 2,6: die Dichte des Aluminiumoxids in g/l; und 3200 der Extinktionskoeffizient von o-Nitrophenol in Liter/Mol.

Die Untersuchungsergebnisse waren wie folgt:

SubstratGalactosid (U/ml Träger) Aktivität zu Beginn0,0 Aktivität am Schluß0,59

Die Ergebnisse zeigen, daß das galactosidaseartige modifizierte Protein, hergestellt nach der Erfindung, enzymatische Aktivität mit Bezug auf o-Nitrophenyl- beta-D-galactosid-Substrat besitzt. An der nativen Catalase war vorher keine Aktivität festgestellt worden. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung von Enzym, einer Rindercatalase aus der Klasse der Oxidoreductasen, in ein galactosidase-enzymartiges modifiziertes Protein.

Beispiel 6

250 mg Catalase (Type C-40, Charge 109 C-7370) wurden in 200 ml destilliertem deioniserten Wasser gelöst. Danach wurden der Catalase 250 mg des gleichen D-Galactals wie in Beispiel 5 als Inhibitor für Galactosidase zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 25°C langsam gerührt, wobei ein pH-Wert von 6,5 resultierte.

Die Lösung wurde dann Bedingungen für die partielle Denaturierung ausgesetzt, wie folgt. 50 mg Bernsteinsäureanhydrid wurden in 1 ml Aceton gelöst. Dann wurden 0,3 ml der Bernsteinsäureanhydrid- Lösung der Enzym-Inhibitor-Lösung unter langsamem Rühren bei 25°C zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde langsam gerührt, wobei ihre Farbe grün wurde. Danach wurden 7,5 mg Diaminopropan-Hydrochlorid zugegeben; es wurde ein pH-Wert von 4,7 festgestellt. Dann ließ man die Lösung eine weitere Stunde unter Rühren stehen.

Das so hergestellte partiell denaturierte inhibitorgebundene Enzym wurde wie folgt immobilisiert. Der pH-Wert der vorstehenden Lösung wurde durch Zugabe von etwa 3 ml 0,1 m NaOH in einer Zeit von 15 Minuten auf 7 erhöht. In der nächsten Stunde wurde der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von etwa 2 ml 0,1 m NaOH auf 8 gebracht. Danach wurden 25 g DEAE-Dextran-beschichteter Aluminiumoxid-Träger, hergestellt wie in Beispiel 5, mit destilliertem deionisierten Wasser gewaschen und der pH-Wert der über dem Aluminiumoxid stehenden Lösung mit 0,01 m NaOH auf 8 erhöht. Die enzymhaltige Lösung und der DEAE-Dextran-beschichtete Aluminiumoxid- Träger wurden dann gemischt und langsam etwa 1 Stunde geschüttelt. Danach wurden 700 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethyl- aminopropyl)-carbodiimid-Hydrocholorid (EDC) zugefügt und die resultierende Mischung in ein Wasserbad von 0 bis 5°C gestellt. Die Lösung wurde etwa 1 Stunde geschüttelt, wobei ihre Temperatur während 1 Stunde auf 3° gesenkt wurde. Danach wurde zusätzlich 1 g des EDC zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde über Nacht (etwa 17 Stunden) reagieren gelassen, anschließend mit destilliertem deionisierten Wasser gewaschen und auf enzymatische Aktivität hin untersucht.

Die so hergestellte Probe wurde auf Aktivität des enzymartig modifizierten Proteins, wie in Beispiel 5 beschrieben, untersucht. Die einzige Änderung gegenüber dem Vorgehen in Beispiel 5 bestand darin, daß 10 ml 0,003 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5 anstelle von 10 ml 0,002 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7, verwendet wurden. Alle anderen Details der Untersuchung in diesem Beispiel waren mit denen in Beispiel 5 offenbarten identisch.

SubstratGalactosid (U/ml Träger) Aktivität zu Beginn0,00 Aktivität am Schluß Untersuchung Nr. 10,66 Aktivität am Schluß Untersuchung Nr. 20,62

Die Ergebnisse zeigen, daß das galactosidase-enzymartige modifizierte Protein, hergestellt nach der Erfindung, Aktivität gegenüber Galactosid-Substrat für Galactosidaseenzyme aufweist. Am nativen Catalaseenzym wurde keine Aktivität festgestellt. Dies zeigt die Umwandlung einer Gattung von enzymatischem Protein, nämlich einer Catalase aus der Gruppe der Oxidoreductasen, in ein galactosidase- enzymartiges modifiziertes Protein.

Beispiel 7 (Vergleichsbeispiel)

Um zu zeigen, daß natives Ribonucleaseenzym keine katalytische Aktivität mit Bezug auf L-Tryptophan-Methylester (TME)-Substrat der Beispiele 2-4 zeigt, wurde folgender Kontrollversuch durchgeführt.

60 mg Ribonucleaseenzym (Type R-5000, Partie 20F-2010) wurden in 100 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 7, unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst.

Die Ribonuclease enthaltende Lösung wurde dann unter Verwendung eines Spectra/Por Dialyserohres No. 3 gegen 3500 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 7, 17 Stunden bei 0-5°C dialysiert. Das Dialysierrohr No. 3 hat einen Molekulargewicht-Ausschlußbereich von 35 bis 4500 Daltons. Dann wurde 1 ml der Ribonuclease enthaltenden Lösung gegen TME-Substrat auf mögliche enzymatische Aktivität mit Bezug auf TME wie folgt untersucht.

Es wurde ein HPLC-System verwendet.

Die Säule war eine 2 mm×25 cm Säule aus rostfreiem Stahl, beschickt mit porösem Siliciumdioxid, das Carboxyl- Seitenketten enthielt und eine durchschnittliche Porengröße von 40 µm hatte. Das Säuleneluant war 0,03 m Acetat, pH 6, bei einer Flußrate von 7 ml/min. Die Absorbance des Säulenausflusses wurde bei 280 nm überwacht.

Die Untersuchungsprobelösung, die native Ribonuclease enthielt, wurde wie folgt hergestellt. 8 ml 1 mM Tris- Puffer, pH 7,5, wurden mit 1 ml 0,1 m TME, pH 3,8 und 1 ml der wie vorstehend beschrieben hergestellten Ribonucleaselösung vermischt. Die Untersuchungskontrollösung wurde hergestellt durch Vermischen von 8 ml mM Tris- Puffer, pH 7,5, 1 ml 0,1 m TME, pH 3,2, und 1 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 7,0. Der pH-Wert der Kontrollösung und der Untersuchungslösung war 5,8. Dann wurde 1 ml der Untersuchungsprobelösung aus dem Probebecher unter Verwendung einer 2 ml Subkutanspritze mit einer 18 Gauge (0,45 mm) Nadel entfernt und auf die Säule durch eine 20 ml Injektionsprobeschleife injiziert. Die Injektionszeit wurde aufgezeichnet.

Dieses Vorgehen wurde unter Verwendung der Untersuchungskontrollösung wiederholt. Beide Lösungen, die Probelösung und die Kontrollösung, wurden 4mal chromatographiert, um eine Kurve aus Molarität TME gegen die Zeit von Probe- und Kontroll-Lösung zu erhalten.

Die statistische Analyse der erhaltenen Daten zeigt tatsächlich identische Neigungen von 0,0620±0,005 für die Kontroll- und die Probelösung. Dem entsprechend zeigt die native Ribonuclease keine meßbare katalytische Aktivität mit Bezug auf das TME-Substrat.

Beispiel 8 (Vergleichsbeispiel)

Um zu zeigen, daß natives Rinderserumalbumin (BSA) keine katalytische Aktivität mit Bezug auf L-Tryptophan- Methylester (TME)-Substrat des Beispiels 1 aufweist, wurde folgende Kontrolle durchgeführt.

100 mg BSA No. 7511, Partie 90F-8351) wurden in 100 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 7, unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst.

Die BSA enthaltende Lösung wurde dann unter Verwendung eines Spectra/Por-Dialysierrohres No. 2 gegen 3500 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 7, 17 Stunden bei 0-5°C dialysiert. Das Dialysierrohr No. 2 hatte einen Molekulargewicht- Ausschlußbereich von 12-14 000 Daltons. Dann wurde 1 ml der Ribonuclease enthaltenden Lösung gegenüber TME- Substrat auf mögliche enzymatische Aktivität mit Bezug auf TME wie folgt untersucht.

Es wurde ein HPLC-System verwendet. Die Säule und ihre Beschickung waren die gleichen wie in Beispiel 7.

Das Säuleneluant war 0,03 m Acetat, pH 6, die Flußrate 7 ml/min. Es wurde die Absorbance des Säulenausflusses bei 280 nm überwacht.

Die natives BSA enthaltende Untersuchungslösung wurde wie folgt hergestellt. 8 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 7,5, wurde mit 1 ml 0,1 m TME, pH 3,2, und 1 ml der wie vorstehend beschrieben hergestellten Ribonuclease- Lösung vermischt. Die Untersuchungskontrollösung wurde hergestellt durch Vermischen von 8 ml 1 mM Tris-Puffer, pH 7,5, 1 ml 0,1 m TME, pH 3,2, und 1 ml 1 mM Tris- Puffer, pH 7,0. Der pH-Wert der Kontrollösung und der Untersuchungslösung war 5,8.

Dann wurde 1 ml der Untersuchungsprobelösung aus dem Probebecher unter Verwendung einer 2 ml Subcutanspritze mit einer 18 Gauge (0,45 µm)-Nadel entfernt und auf die Säule durch eine 20 ml Injektionsprobeschleife injiziert. Die Zeit der Injektion wurde aufgezeichnet.

Dieses Vorgehen wurde unter Verwendung der Untersuchungskontrollösung wiederholt. Beide Lösungen wurden 4mal chromatographiert, um eine Kurve von Molarität TME gegen die Zeit für die Probe- und die Kontrollösung zu erhalten.

Die statistische Analyse der erhaltenen Daten zeigte tatsächlich identische Neigungen von 0,06±0,0065 sowohl für die Kontrollösung als auch für die Probelösung. Demgemäß zeigt native Ribonuclease keine meßbare katalytische Aktivität mit Bezug auf das TME- Substrat.

Beispiel 9 (Vergleichsbeispiel)

Um zu zeigen, daß native Catalase keine katalytische Aktivität mit Bezug auf p-Nitrophenyl-beta-D-Galactose (NBG)-Substrat der Beispiele 5 und 6 zeigt, wurde folgender Kontrollversuch durchgeführt.

250 mg Catalase (Type 7275) wurden in 25 ml 0,5 mM Acetat-Puffer, pH 4, unter langsamem Rühren bei 25°C gelöst. Die Lösung wurde dann in ein Dialysierrohr No. 2, wie in Beispiel 8, eingebracht und gegen 3500 ml 5 mM Acetat-Puffer, pH 4, 17 Stunden bei 0,5°C dialysiert.

Dann wurden 0,2 ml dieser Untersuchungsprobe abgezogen und gegen NBG-Substrat auf mögliche enzymatische Aktivität von Ribonuclease gegen NBG wie folgt untersucht.

Die Untersuchungsprobemischung wurde durch Mischen von 2,4 ml 0,03 m Natriumphosphat-Puffer, der 50 ppm eines Bakterizids (Bioban brand antibacterial agent) enthielt, mit 0,5 ml 0,014 m NBG in einer 3 ml Küvette hergestellt. Die Küvette wurde dann in ein Spectrophotometer (ACTA III) eingestellt und eine gerade Basislinie 3 Minuten lang aufgezeichnet. Die Absorbance wurde bei 405 nm überwacht. Dann wurde 0,1 ml Catalaselösung der NBG-Substrat-Lösung in der Küvette zugegeben. Die Küvette wurde 4mal umgekehrt, um homogene Mischung in der Küvette sicherzustellen, und in das Spectrophotometer für weitere Messung zurückgestellt. Die Absorbance-Änderung wurde über eine Zeitdauer von 20 Minuten aufgezeichnet. Es wurden keine meßbaren katalytischen Aktivitätseigenschaften mit Bezug auf NBG- Substrat in der nativen Catalase festgestellt.

Claims (15)

1. Verfahren zur chemischen Änderung der Substratspezifität eines nativen Proteins zur Herstellung eines immobilisierten enzymartigen modifzierten Proteins, gekennzeichnet durch

• (A) a. Auswählen eines Enzyms, das nachgebildet werden soll, als Modellenzym;
• b. partielles Denaturieren eines nativen Proteins in Gegenwart eines Inhibitors für das Modellenzym, wobei der Inhibitor eine Verbindung von ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Modellenzyms ist, um als Schablone für die katalytisch aktive Stelle des enzymartigen modifizierten Proteins zu dienen, zur Bildung eines partiell denaturiertes natives Protein-Modellenzyminhibitor- Komplexes;
• c. Inkontaktbringen des partiell denaturiertes Protein-Modellenzyminhibitor-Komplexes mit einem festen Träger so lange und bei einer Temperatur, daß der partiell denaturiertes Protein-Modellenzyminhibitor- Komplex an dem festen Träger absorbiert wird;
• d. Vernetzen des absorbiertes immobilisiertes Protein-Modellenzyminhibitor-Komplexes zur Bildung eines immobilisierten enzymartigen modifizierten Proteins;
  und
• e. Entfernen des Inhibitors des Modellenzyms und eventuell noch vorhandenen Vernetzungsmittels;
  oder
• (B) a. Auswählen eines Enzyms, das nachgebildet werden soll, als Modellenzym;
• b. Absorbieren eines nativen Proteins an einem festen Träger, um das native Protein zu immobilisieren;
• c. partiell Denaturieren des absorbierten nativen Proteins;
• d. Vernetzen des partiell denaturierten adsorbierten Proteins in Gegenwart eines Inhibitors für das Modellenzym, wobei der Inhibitor eine Verbindung von ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Modellenzyms ist, um als Schablone für die katalytisch aktive Stelle des enzymartigen modifizierten Proteins zu dienen, zur Bildung eines immobilisierten enzymartig modifizierten Proteins; und
• e. Entfernen des Inhibitors des Modellenzyms und eventuell noch vorhandenen Vernetzungsmittels;
  oder
• (C) a. Auswählen eines Enzyms, das nachgebildet werden soll, als Modellenzym;
• b. partiell Denaturieren eines nativen Proteins;
• c. Inkontaktbringen des partiell denaturierten nativen Proteins mit einem festen Träger ausreichend lange und bei einer Zeit, daß Adsorption und Immobilisierung des partiell denaturierten Proteins an dem festen Träger stattfindet;
• d. Vernetzen des partiell denaturierten adsorbierten Proteins in Gegenwart eines Inhibitors für das Modellenzym, wobei der Inhibitor eine Verbindung von ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Modellenzyms ist, um als Schablone für die katalytisch aktive Stelle des enzymartigen modifizierten Proteins zu dienen, zur Bildung eines immobilisierten enzymartigen modifizierten Proteins; und
• e. Entfernen des Inhibitors des Modellenzyms und eventuell noch vorhandenen Vernetzungsmittels;
  oder
• (D) wenn das native Protein mindestens 3 Disulfid-Gruppen pro Molekül aufweist,
• a. Auswählen eines Enzyms, das nachgebildet werden soll, als Modellenzym;
• b. Vermischen des Disulfidgruppen aufweisenden nativen Proteins mit einem Reduktionsmittel für Disulfidbrücken in Gegenwart eines Inhibitors für das Modellenzym, wobei der Inhibitor eine Verbindung von ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Modellenzyms ist, um als Schablone für die katalytisch aktive Stelle des enzymartigen modifizierten Proteins zu dienen, unter Bildung eines partiell denaturiertes natives Protein-Modellenzyminhibitor- Komplexes;
• c. Inkontaktbringen des Komplexes mit einem festen Träger bei einer Temperatur und für eine Zeit, die ausreichen, den Komplex an dem Träger zu adsorbieren und zu immobilisieren;
• d. Vermischen des immobilisierten natives Protein- Modellenzyminhibitor-Komplexes mit einem Oxidationsmittel für Sulfhydrylgruppen bei einer Temperatur und für eine Zeit, die ausreichen, die Disulfidbindungen in dem Protein zu bilden, um ein modifiziertes enzymartiges Protein herzustellen;
• e. Entfernen des Inhibitors des Modellenzyms und eventuell noch vorhandenen Vernetzungsmittels.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei den Ausführungsformen (A), (B) und (C) als Vernetzungsmittel Glutaraldehyd eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei den Ausführungsformen (A), (B) und (C) als Vernetzungsmittel Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei den Ausführungsformen (A), (B) und (C) als Vernetzungsmittel ein Gemisch von einem organischen Diamin und einem organischen Carbodiimid eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei den Ausführungsformen (A), (B) und (C) als Diamin Diaminopropan-Hydrochlorid und als Carbodiimid Ethyl- 3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid eingesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als fester Träger ein feinzerteiltes poröses keramisches anorganisches Oxid verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ausführungsform (A) in Stufe (c) der partiell denaturiertes Protein-Modellenzyminhibitor- Komplex vor dem Mischen mit dem festen Träger mit einem organischen Säureanhydrid vermischt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ausführungsform (B) in Stufe (b) das native Protein vor dem Vermischen mit dem festen Träger mit einem organischen Säureanhydrid vermischt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ausführungsform (C) das native Protein nach der partiellen Denaturierung und vor der Adsorption an dem festen Träger mit einem organischen Säureanhydrid vermischt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ausführungsform (D) als Reduktionsmittel für die Disulfidbrücken β-Mercaptoethanol eingesetzt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Ausführungsform (D) als Oxidationsmittel für die Sulfhydrylgruppen eine wäßrige, molekularen Sauerstoff enthaltende Lösung eines pH-Wertes über 7 eingesetzt wird.

12. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 1, Ausführungsform (A).

13. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 1, Ausführungsform (B).

14. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 1, Ausführungsform (C).

15. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 1, Ausführungsform (D).