AT389894B - Verfahren zur modifizierten enzymatischen hydrolyse von proteinsubstraten - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft Proteinhydrolysate ohne bitteren Geschmack, die mittels enzymatischer Hydrolyse aus solchen Proteinen gewonnen werden, deren Hydrolyse den vorhandenen Erfahrungen nach Hydrolyseprodukte mit bitterem Geschmack ergeben.

Die der Technik zur Verfügung stehenden Proteine bedürfen zu ihrer Nutzung häufig des hydrolytischen Aufschlusses. Die Hydrolyse führt in der Regel zum Abbau der Protein-Makromoleküle zu kleineren Peptiden und gegebenenfalls bis zu Aminosäuren. Gewisse Probleme, die bei der Verwertung von Proteinen auftreten können, seien am Beispiel des Caseins erläutert, das an sich einen wertvollen Rohstoff, beispielsweiße für Zwecke der Ernährung, darstellt. Unmodifiziertes Casein-Protein hat beispielsweise im pH-Bereich 4-5, den ein großer Teil der Konsum-Getränke und Früchtedesserts aufweist, eine sehr geringe Löslichkeit. Die Folge ist ein Ausflocken des Proteins, was einerseits das Aussehen der Getränke und infolge des Zusammenbrechens der Aufschlagmassen die Qualität der Desserts stark beeinträchtigt und darüber hinaus einen unangenehmen, sandigen Geschmack hervorruft.

Da die Hydrolyseprodukte der Proteine im allgemeinen im sauren pH-Bereich besser löslich sind, lag der hydrolytische Abbau, insbesondere der enzymatische Abbau der Protein, nahe. Die Eigenschaften eines Protein-Hydrolysats hängen verständlicherweise außer von seiner Aminosäurezusammensetzung noch vom Abbaugrad ab. Ein Maß für den Abbaugrad ist z. B. der Prozentsatz an Peptidbindungen, der beim Abbauvorgang gelöst wird. (D.H. = Degree of hydrolysis).

In erster Näherung gilt, daß bei vorgegebenem Protein und vorgegebenem proteolytischem Enzym die Eigenschaften des Proteinhydrolysats durch den DH-Wert festgelegt sind, der durch den Verbrauch an Lauge bei konstantem pH während der Hydrolyse bestimmbar ist. Eines der größten Hindernisse bei der Verwertung von Proteinhydrolysaten in der Ernährung, insbesondere der menschlichen Ernährung, liegt im Bereich des Geschmacks. Der Geschmack reinen Proteins ist normalerweise ziemlich neutral. (Der mit einem Protein bestimmter Herkunft gewöhnlich assoziierte Geschmack rührt in der Regel von nicht-proteinartigen Geschmacksstoffen her. Man kann diese Geschmacksstoffe im Bedarfsfall entfernen, um eine allgemeinere Verwendbarkeit von Proteinhydrolysaten zu gewährleisten). Die gravierenden Schwierigkeiten beginnen jedoch beim bitteren Geschmack vieler Proteinhydrolysate. Der intensive Bittergeschmack von Proteinhydrolysaten läßt sich in den zum Konsum bestimmten Nahrungsmitteln kaum maskieren. Tatsächlich hat diese Bitterkeit bisher verhindert, daß es zu einer extensiven Verwendung derartiger Proteinhydrolysate in der Ernährung kam.

In der DE-OS 30 03 679 wird zu diesem Problem ausgeführt, die Anzeichen sprächen dafür, daß die Ursache des bitteren Geschmacks mit dem Proteinsubstrat Zusammenhänge und nicht mit den verwendeten Enzymen. Bestimmte Proteine, wie Casein, ergäben fast ausnahmslos bitterschmeckende Hydrolysate, wo hingegen Gelatine bei analoger Behandlung mit denselben Enzymen höchstens geringfügig bitterschmeckende Hydrolysate liefert. In der genannten Offenlegungsschrift wird als "Bitterpunkt" derjenige Gehalt an löslichem Proteinhydrolysat (in Prozent des Ausgangsproteins) definiert, bei dessen Degustation erstmalig bitterer Geschmack festgestellt wird. Das Problem des bitteren Geschmacks von Hydrolysaten ist bisher hauptsächlich bei Casein sowie Soja-, Getreide- und Maisproteinen aufgetreten; es könnte indessen auch bei intensiverer Untersuchung anderer alternativer Proteinquellen in Erscheinung treten.

In der genannten DE-OS 30 03 679 wird ein Verfahren zur Herstellung von zur Ernährung geeigneten Hydrolysaten aus Proteinsubstraten durch Hydrolyse unter Verwendung proteolytischer Enzyme vorgeschlagen, wobei gleichzeitig mit den proteolytischen Enzymen wasserlösliche und/oder mit Wasser stark quellbare Kohlenhydrate eingesetzt werden. Durch den Zusatz dieser Kohlenhydrate zu enzymatischen Ansätzen können die Proteine zu Proteinhydrolysaten abgebaut weiden, die bis zu einem hohen hydrolytischen Abbaugrad keinen oder allenfalls einen vemachlässigbar geringen Bittergeschmack aufweisen.

Das Verfahren des Standes der Technik macht somit den Zusatz von Nicht-Proteinen erforderlich, die nicht in jedem Falle als erwünscht gelten können. Es bestand daher weiterhin ein Bedarf nach einem Verfahren zur Herstellung nicht bitterschmeckender Proteinhydrolysate aus solchen Proteinen, die bei unmodifizierter enzymatischer Hydrolyse Verfahrensprodukte mit Bittergeschmack ergeben.

Die Lösung der Aufgabe kann mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Es muß als besonders überraschend betrachtet werden, daß mittels trägergebundener Proteasen ein Abbau von Proteinsubstraten über denjenigen Hydrolysegrad (Abbaugrad) hinweg gelingt, der beim normalen enzymatischen Abbau gegebenenfalls mit demselben, jedoch nicht trägergebundenen Enzymen den Bitterpunkt markiert, ohne jedoch den erwarteten bitteren Geschmack der dabei gewonnenen Hydrolyseprodukte hervorzurufen. Als "Bitterpunkt" sei im Rahmen der Erfindung derjenige Gehalt an löslichem Proteinhydrolysat in Prozent der Ausgangsproteine definiert, bei dessen Degustation erstmalig bitterer Geschmack festgestellt wird. Obwohl die Degustation individuell bedingten Schwankungen der Bitter-Empfindung bei den Degustatoren unterworfen sein kann, bildet sich erfahrungsgemäß bei einem Kollektiv mit ausreichender Zahl von Individuen (z. B. mehr als 5 Degustatoren) ein recht verläßlicher Mittelwert der Bitter-Empfindung heraus.

Die Degustation zum Zwecke des Vergleichs sollte von ein und denselben Individuen, möglichst in vergleichbarem Zustand vorgenommen werden.

Als Maß für den Abbaugrad wird der Prozentsatz an Peptidbindungen, der beim Abbauvorgang gelöst wurde (DH = Degree of Hydrolysis), herangezogen. In erster Näherung gilt, daß bei vorgegebenem Protein und vorgegebener Protease die Eigenschaften des Proteinhydrolysats durch den DH-Wert festgelegt sind, der durch den -2-

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Vebrauch an Natronlauge während der Hydrolyse bei Konstanthaltung des pH-Werts bestimmt werden kann. Selbstverständlich kann der Grad der Hydrolyse und deren Ergebnis hinsichtlich Zusammensetzung und Molgewicht der entstandenen Produkte mit Hilfe der verschiedenen in der Proteinchemie entwickelten Analyseverfahren (insbesondere chromatographische Methoden, Elektrophorese, Ultrazentrifuge u. a.) bestimmt werden. Als Proteinsubstrate, die bei einem ausgedehnten hydrolytischen Abbau bitterschmeckende Hydrolysate liefern, seien in erster Linie das Casein, daneben aber auch Soja-, Getreide- und Mais-Proteine genannt (Bei intensiver Untersuchung könnte sich der gleiche Sachverhalt auch für weitere alternative Proteine anderer Provenienz herausstellen). Mit Hilfe des erfmdungsgemäßen Verfahrens gelingt es beispielsweise, den Abbaugrad bei Casein über 3 %, beispielsweise über 5 % (bezogen auf die gesamten im Ausgangsprotein vorhandenen Peptidbindungen bzw. Säureamidbindungen) hinauszuführen, ohne daß bitterer Geschmack der Produkte beobachtet wird. In der Regel tritt sogar bis zu einem Abbaugrad von 15 %, bezogen auf die Peptidbindungen des Ausgangsproteins, kein bitterer Geschmack der Produkte auf.

Der Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens scheint ursächlich mit der Verwendung trägergebundener Proteasen zusammenzuhängen, insbesondere mit der Verwendung kovalent gebundener Enzyme. Vorzugsweise verwendet man Pilzproteasen unter Bedingungen, die auf deren (bekannte) Aktivitäts- und Stabilitätseigenschaften abgestimmt sind. Besonders bevorzugt sind Pilzproteasen des Genus Aspergillus. Geeignete Enzyme fallen unter die Charakterisierung gemäß E.C. 3.4.21.15 und 3.4.24.4. Besondere Eignung scheint den Enzymen zuzukommen, wenn Wirkungsoptima im neutralen und im alkalischen Bereich vorliegen. Von speziellem Interesse sind Vertreter der Art Aspergillus flavusoiyzae. Im Mittelpunkt steht die aus Untergruppe Aspergillus sojae, Gruppe A. oryzae gewonnene Pilzproteinase, beispielsweise das unter der Bezeichnung Corolase PN® im Handel befindliche Enzym oder Präparate aus Aspergillus melleus-Kulturen. Zur näheren Charakterisierung können die folgenden Daten dienen: Es handelt sich bei der COROLASE PN® um ein Produkt mit einer im neutralen und einer im alkalischen pH-Bereich aktiven Enzymeinheit. Das Wirkungsoptimum des Enzyms gegenüber Casein als Substrat liegt bei einem pH von 7-9, gegenüber Hämoglobin bei pH 6, Nebenoptimum 8. Als Temperatur-Wirkungs-Optimum des freien Enzyms wurden 50°C gefunden. Das Stabilitätsoptimum liegt bei pH 6 - 8. Der isoelektrische Punkt des Enzyms liegt bei pH 4,5 · 5. Das Enzym läßt sich durch Komplexbildner, wie EDTA, durch OH-gruppenreaktive Reagentien, wie Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), sowie durch obenflächenaktiven Substanzen wie Natriumlaurylsulfat u. ä., wenigstens partiell hemmen. Zur weiteren Charakterisierung können gegebenenfalls die Begleitaktivitäten, bestehend aus Amylase-, Cellulase-, Pentosanase- und Galactomannanaseaktivität herangezogen werden.

Bei den erfmdungsgemäß besonders interessanten Enzymen wird in der Regel ein Verhältnis "Aktivität bei pH 5 zu Aktivität bei pH 8 (gegenüber Haemoglobin als Substrat)” von 0,5 zu 1 bis 1,5 zu 1 festgestellt. Definitionsgemäß handelt es sich bei den erfindungsgemäß zu verwendenden Proteasen, insbesondere der Corolase PN um trägergebundene Enzyme.

Als Trägermaterialien kommen die an sich bekannten Trägertypen für immobilisierte Enzyme in Frage. (Vgl. O. Zaborsky "Immobilized Enzymes", Chemical Rubber Corporation Press, Cleveland, Ohio, 1973).

Genannt seien einerseits hoch poröse, anorganische Trägermaterialien, wie z. B. Glas, Bentonit u. ä. neben porösen organischen polymeren Trägem. Dabei können sowohl rein synthetische Polymere, wie vernetztes Polyacrylamid u. Derivate, Polystyrol, polymere Acrylate bzw. Methacrylate, Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Polypeptide, Nylon, als auch semisynthetische Polymere, Naturstoffe und abgewandelte Naturstoffe, wie Cellulose, Chitin, Alginsäure, Kollodium, Dextran, Agarose, Stärke, dreidimensional vernetztes Polysaccharid, Keratin, Kollagen, als Träger eingesetzt werden. Als reaktive Gruppen zur Immobilisierung seien die in UUmanns Enzyklopädie der Technischen Chemie, 4. Auflage, Band 10, Chemie, S. 540 genannten angeführt. Bevorzugt werden Oxirangruppen. Weiter sind besonders bevorzugt polymere Träger auf Acrylatbasis, insbesondere die sogenannten Acrylharzperlen.

Herstellung und Handhabung der einschlägig verwendbaren Acrylharzperlen kann der GB-PS1329 062, DEOS 22 37 316, US-PS 4 070 348, DE-PS 27 22 751 entnommen werden. Besonders genannt seien die an vemetzes Copolymerisat aus Acrylamid bzw. Methacryl, Glycidylmethacrylat und einem Vernetzen in Form von Hohlperlen gebundenen Enzyme, speziell ein daran gebundenes Produkt mit einer im neutralen und einer im alkalischen pH-Bereich aktiven Enzymeinheit (Ceolase PN®).

Die Ausführung der Erfindung kann nach den für hydrolytische Reaktionen mit trägergebundenen Enzymen üblichen Methoden vorgenommen werden. So wird das Trägermaterial zweckmäßig in Verbindung mit einer Säule angewendet, wobei die Lösung des zu hydrolysierenden Substrats über die mit dem polymeren Träger beschickte Säule läuft. Die Substratlösungen enthalten in der Regel zwischen 5 und 15 Gew.-% Substrat Als Richtwert gelte beispielsweiße eine 5 %ige (Gew.-%) Lösung, z. B. eine Caseinatlösung. Der pH-Wert richtet sich in erster Näherung nach den Kenndaten des Enzyms, wobei eine gewisse Flexibilität hinsichtlich des pH-Werts angenommen werden kann. Bei der Verwendung des Enzyms Corolase PN® ist ein pH-Bereich von 6-9 zweckmäßig. Auch hinsichtlich der anwendbaren Temperaturen ist in Abhängigkeit von den Kenndaten des Enzyms eine gewisse Variationsbreite möglich, die etwa mit dem Bereich von Raumtemperatur bis 60°C angegeben werden kann. So kann die trägergebundene Corolase PN® im Bereich von 20 - 60°C verwendet werden.

Durch die Wahl der Durchflußgeschwindigkeit (Verweilzeit) ergibt sich bei Verwendung von Säulen eine -3-

Nr. 389894 gewisse Steuerungsmöglichkeit für das Hydrolysegeschehen. Es ist z. B. mit geringem Aufwand möglich, die Hydrolyse so weit fortzuführen, daß gerade noch keine bitterschmeckenden Produkte auftreten. Mit Caseinatlösung als Substrat und trägergebundener Corolase PN® als Protease erhält man z. B. auch bei Hydrolysegraden bis 15 % keine bitteren Casein-Hydrolysate. Dieses Ergebnis ist umso überraschender, als man bei Verwendung freier Corolase PN® unter sonst vergleichbaren Bedingungen bitterschmeckende Peptide ab einem Hydrolysegrad von 3 % erhält.

Die Gründe für dieses Ergebnis sind nicht unmittelbar einzusehen. Einen Hinweis könnte der experimentelle Befund darstellen, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der trägergebundenen Protease hergestellten Hydrolyseprodukte wenig bis keine Anteile an Peptiden mit Molgewichten von 1000 - 6000 Dalton aufweisen. Es käme folglich darauf an, die Reaktionsbedingungen so einzurichten, daß der Anteil an Peptiden in diesem Molgewichtsbereich minimiert wird.

Die Beladung der Träger mit dem erfindungsgemäß wirksamen Enzym kann in an sich bekannter Weise vorgenommen werden, beispielsweise durch Reagierenlassen mit den (oxirangruppenhaltigen) Acrylglasperlen, etwa vom Typ eines vernetzen Copolymerisates aus Acrylamid bzw. Methacrylamid, Glycidylmethacrylat und einem Vernetzer in Form von Hohlperlen (EUPERGIT C®). Man wäscht in an sich bekannter Weise nach, z. B. mit destilliertem Wasser und anschließend mit einer (inerten) Elektrolytlösung, beispielsweise mit 5 %iger Natriumchloridlösung. Die so erhaltenen Enzym-Trägerpräparate sind unmittelbar verwendungsfähig. Im allgemeinen wird eine 1- 20 Gew.%ige Substratlösung verwendet, beispielsweise eine wäßrige Caseinatlösung. Die mittlere Verweilzeit der Substratlösung kann 1 bis 100 Minuten, vorzugsweise 5 -10 Minuten betragen.

Beispiel 1 100 g Pilzproteinase aus A.oryzae (COROLASE PN® der Firma Röhm GmbH, Darmstadt wurde in 1 Liter 1 mol. Kalium-Phosphat-Puffer pH 8,5 gelöst. Die Enzymlösung wurde mit 100g vom vorstehend beschriebenen EUPERGIT C® gekuppelt. Damit eine gute Benetzung der Perlen gewährleistet war, rotierte das Gefäß auf einer Rollbank ca. 50 Stunden lang bei Raumtemperatur. Anschließend wurde der Träger auf einer Glas-Fritte (Por. 2-3) mit dest Wasser und danach mit einer 5 %igen Natrium-Chlorid-Lösung ausgewaschen.

Beispiel 2 5 g immobilisierte Pilzproteinase hydrolysierte in einer doppelwandigen Säule (60°C) eine 5 %ige Natrium-Caseinat-Lösung, die kontinuierlich durch die Säule gepumpt wurde. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 24 ml pro Stunde. Der Hydrolysegrad lag bei 16 %. Bittergeschmack konnte nicht festgestellt werden.

Beispiel 3 10 g immobilisierte Pilzproteinase hydrolysierte wie oben beschrieben eine 5 %ige Natrium-Caseinat-Lösung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 18 ml pro Stunde. Der Hydrolysegrad betrug 37 %. Bittergeschmack wurde festgestellt

Beispiel 4 (Vergleichsbeispiel mit freiem Enzym): 300 ml einer 5 %igen Natrium-Caseinat-Lösung wurden 30 Minuten lang mit 300 mg der COROLASE PN® (vgl. Beispiel 1) inkubiert (Temperatur 60°C). Die Reaktion wurde durch 10 minütiges Kochen der Substratlösung in einem Wasserbad abgestoppt Der Hydrolysegrad betrug 16 %. Der Bittergeschmack war sehr ausgeprägt

Beispiel 5

Eine Auftrennung der Hydrolysate von Beispiel 2 und 4 an dreidimensional vernetztes Polysaccharid hatte signifikante Unterschiede in der Molekülgröße der Bruchstücke gezeigt zwischen dem Hydrolysat, das mit freiem und jenem, das mit immobilisiertem Enzym hergestellt wurde. Bei dem nicht bitter schmeckenden Hydrolysat fehlen die Bruchstücke mit einem Molekulargewicht von ca. 1000 bis 6000. Die Bestimmung des Hydrolysegrades erfolgte durch Formoltitration. Modifiziert nach "Methods in Enzymology", Volume ΙΠ, 457 (Academic Press Inc., New York 1957).

Durchführung: 5 ml Probe wird in ein 100 ml Becherglas pipettiert und auf pH 7,4 eingestellt Nach Zugabe von 5 ml neutralisierter 40 %iger Formalinlösung titriert man mit 0,01 n Natronlauge auf pH 83. Säurehvdrolvse:

In Bombenrohre wurden 100,300 und 500 mg Natrium-Caseinat der Firma De Melkindustrie Veghel BV, Holland mit 10 ml 3 n HCl eingeschmolzen und 17 Stunden bei 121°C im Trockenschrank stehen gelassen. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde von 0,5 ml Säurehydrolysat eine Formoltitration durchgeführt -4-

Claims (15)

1. Nr. 389894 Blindwert: Mit 5 ml 5 %iger Natrium-Caseinat-Lösung wurde ebenfalls eine Formoltitration durchgeführt. Ausrechnung: Säurehydrolyse 0,5 ml (= 5 mg Natrium-Caseinat) wurden mit 3,47 ml 0,01 n NaOH titriert, d. h. 100 mg Natrium-Caseinat verbrauchen 69,40 ml. Blindwert 5 ml (= 250 mg Natrium-Caseinat) wurden mit 15,00 ml 0,01 n NaOH titriert, d. h. 100 mg Natrium-Caseinat verbrauchen 6,00 ml. Geht man davon aus, daß bei der Säurehydrolyse das Natrium-Caseinat vollständig abgebaut worden war, so ergibt sich nach Abzug des Blindwertes für die Totalhydrolyse von 100 mg Natrium-Caseinat ein Natronlaugenverbrauch von 63,40 ml 0,01 n NaOH. Daraus läßt sich der Abbaugrad der Hydrolysate im Vergleich zum säurehydrolysierten Natrium-Caseinat berechnen. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur modifizierten enzymatischen Hydrolyse von Proteinsubstraten, deren unmodifizierter enzymatischer Abbau über einen Abbaugrad von 3 Prozent der Peptid-Bindungen im Molekül hinaus bitterschmeckende Hydrolyseprodukte ergibt, bis zu einem hydrolytischen Abbaugrad von mindestens 5 Prozent der Peptid-Bindungen im Molekül ohne Bildung bitterschmeckender Hydrolyseprodukte, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Hydrolyse der Proteinsubstrate mittels trägergebundener Proteinasen durchführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Hydrolyse der Proteinsubstrate bis zu einem hydrolytischen Abbaugrad von 15 Prozent der Peptid-Bindungen im Molekül durchführt.
3. 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Casein und/oder Caseinate als Substrat verwendet
4. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als trägergebundene Proteinase Pilzprotease verwendet
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Pilzproteasen aus Aspergillus-Arten verwendet
6. 6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Enzymprodukt Wirkungsoptima im neutralen und im alkalischen pH-Bereich aufweist
7. 7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekulargewicht der Proteasen im Bereich 20 000 - 50 000 Dalton liegt
8. 8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß mal als Pilzproteinase das Enzym Corolase PN (Pilzproteinase aus der Untergruppe Aspergillus sojae, aus der Gruppe Aspergilus oryzae) verwendet
9. 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Hydrolyse des Proteinsubstrates im pH-Bereich 6-9 durchführt
10. 10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Hydrolyse im Temperaturbereich von 18 - 60°C durchführt
11. 11. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 1 bis 20 Gew.-%ige wäßrige Caseinatlösung als Substrat verwendet. -5- Nr. 389894
12. 12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die trägergebundenen Proteinasen mittels eines Säulenreaktors anwendet.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die mittlere Verweilzeit der Substratlösung 1 5 bis 100 Minuten, vorzugsweise 5 bis 10 Minuten, beträgt.
14. 14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Träger Acrylharzperlen mit haftungsvermittelnden Gruppen daistellen.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die polymeren Träger Acrylharzperlen mit Oxirangruppen als haftungsvermittelnde Gruppen darstellen. -6-