DE2237316C3

DE2237316C3 - Verfahren zur Herstellung perlförmiger, vernetzter, wasserunlöslicher Mischpolymerisate und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2237316C3
Application number: DE2237316A
Authority: DE
Inventors: Dieter Dipl.-Chem. Dr. 6500 Mainz Kraemer; Klaus Dr. 6101 Rossdorf Lehmann; Horst Dr. Pennewiss; Hermann Dipl.-Chem. Dr. Plainer; Roland 6100 Darmstadt Schweder
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 1972-07-29
Filing date: 1972-07-29
Publication date: 1985-08-29
Also published as: DE2343633C3; DE2343633B2; DE2237316A1; DE2343633A1; DE2237316B2

Description

wenigstens einer radikalisch polymerisierbaren Verbindung mit einer Halogenalkyl- oder einer Epoxidgruppe oder mit einer Carbonsäurechlorid-, Carbonsäureanhydrid-, Carbonsäureazid- oder Carbensäurephenylester-Gruppe oder einem Carbonsäureester eines Hydroxylaminderivats, der die Formel

R'

R—CO-Ο—Ν

R"

!5

20

25

30

hat, worin R ein ungesättigter polymerisierbarer Rest ist und R' und R" gleiche oder verschiedene, gegebenenfalls mit dem N-Atom zu einem heSerocycüschen Ring verbundene Alkyl- öder Acylreste sind, als gegenüber biologisch aktiven Substanzen bindungsaktives Monomer,

b) einer Verbindung mit wenigstens zwei radikalisch polymerisierbaren Kohlenstoff-Doppelbindungen,

c) wenigstens einer radikalisch polymerisierbaren wasserlöslichen Verbindung mit Carbonsäureamidgruppen, Hydroxylgruppen, Vinylsulfonsäuregruppen oder deren Salze, quaternisjerten Aniinoalkylestergruppen von «^-ungesättigten Carbonsäuren, Monomere mit Carboxylgruppen oder deren Salze, Monomere mit sekundären oder tertiären Aminogruppen oder deren Salze,

d) gegebenenfalls weiteren, nicht wasserlöslichen, radikafisch polymerisierbaren Verbindungen,

besteht, wobei die Monomeren der Gruppen a), b) und c) 50 bis 100 Mol-% und das Monomere b) allein 0,2 bis 5 Mol-%, jeweils bezogen auf das gesamte Monomerengemisch, ausmachen und so gewählt sind, daß die erhaltenen Polymerisatperlen in Wasser auf das 5- bis lOOfache Volumen oder mehr anquellen, und daß das Monomerengemisch in der organischen Flüssigkeit, die kein Lösungsmittel für die Monomeren und den Initiator ist, suspendiert und polymerisiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerisation in Gegenwart eines in der unpolaren organischen Phase löslichen statistischen Mischpolymerisats, Blockrr.ischpolymerisats oder Pfropfmischpolymerisats, das zu 60 — 95 Grundmol-% aus Acryl- oder Methacrylestern von

55

60

₆₅ wenigstens 4 C-Atome enthaltenden Alkanolen oder Vinylestern von wenigstens 4 C-Atome enthaltenden Fettsäuren und zum übrigen Teil aus polaren, wasserlöslichen Monomeren aufgebaut ist, wobei die polaren Monomereinheiten im Falle der Block- oder Pfropfmischpolymerisate nur in einen Block bzw. in den Pfropfästen einpolymerisiert sind, durchgeführt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen. 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomerenphase 20 bis 200%, bezogen auf das Gewicht der Monomeren, Formamid, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd enthält

4. Verwendung der Verfahrensprodukte nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung trägergebundener, biologisch aktiver Substanzea

5. Verwendung der Verfahrensprodukte nach den Ansprüchen 1 bis 3, zur Herstellung Trägergebundener Enzyme.

Die Erfindung befaßt sich mit der Herstellung von perlförmigen Mischpolymerisaten, die in Wasser quellen und ohne vorherige Aktivierung biologisch aktive Substanzen mit mindestens einer freien primären Amino- oder Hydroxylgruppe, wie Eniyme, Enzym-Substrate, Inhibitoren, Hormone, Antibiotika, Antikörper. Antigene, Peptide, unter Ausbildung einer covalenten Bindung anlagern. Die an das perlförmige Polymerisat gebundenen biologisch aktiven Substanzen behalten dabei ihre spezifische Aktivität und lassen sich zu entsprechenden biochemischen Reaktionen benutzen. Die Vorteile, die sich bei der Anwendung von trägergebundenen biologisch aktiven Substanzen hierbei ergeben, sind allgemein bekannt: Wiederverwendbarkeit, höhere Stabilität, schnelle Unterbrechung der Reaktion durch Filtration, keine Verunreinigung der Reaktionsprodukte, kontinuierliche Reaktion in Säulen oder ähnlichen Reaktoren.

Es ist eine Vielzahl von Trägermaterialien für biologisch aktive Stoffe bekannt. Obwohl sich einige auch in Form definierter Partikeln herstellen lassen, werden die oben angegebenen Vorteile von den bisher bekannten Produkten jedoch nur sehr unvollkommen erreicht.

Träger auf der Basis von Polysacchariden wie Cellulose, Stärke, Dextran, Agarose und deren Derivaten können enzymatisch angegriffen werden, sei es durch mikrobiologischen Befall oder Anwesenheit hydrolytischer Enzyme. Das bei diesen Trägern häufig beobachtete »Ausbluten« der biologisch aktiven Substanzen kann sowohl auf einen solchen Abbau als auch auf eine unvollständige Bindung zurückgeführt werden. Bei der oberflächlichen Bindung biologisch aktiver Stoffe an organische oder synthetische Materialien definierter, kompakter Form, wie Glasperlen oder synthetischen Fasern, ist eine besondere Aktivierung erforderlich. Die Bindungskapazität ist wegen der relativ kleinen zugänglichen Oberfläche sehr gering.

In Kunststoff in Form von Perlen eingebettete Enzyme, die als Säulenfüllung eine hohe Durchlaufgeschwindigkeit zulassen, sind nach einer Methode von N i I s s ο η und M ο s b a c h (Biochimica et Biophysica Acta, 268 [1972J S. 253 bis 256) dadurch zugänglich, daß man ungesättigte Monomere in einer wäßrigen, enzymhaltigen Lösung unter Vernetzung polymerisie-

ren läßt. Die entstehenden wasserhaltigen Polymerisatperlen schließen das Enzym ein, ohne es chemisch zu binden. Bei diesem Verfahren kann man nur verdünnte Enzymlösungen einsetzen und damit nur etwa 3% aktives Protein binden. Auch mit konzentrierteren Enzymlösungen erhält man keine höhere Beladung des Trägers mit aktivem Material, da dieses durch die radikalische Polymerisationsreaktion geschädigt wird. Aus dem fertigen Produkt können bei der Anwendung durch Quellung und Entquellung ständig wieder Enzyme ausbluten. Ist andererseits die Vernetzung so stark, daß das Enzym vollständig eingeschlossen bleibt, so können hochmolekulare Substrate nicht mehr in die Perlen einwandern und mit dem Enzym reagieren. Dasselbe gilt für alls Verfahren bei denen biologisch aktive Stoffe in Membranen, Folien oder anderen semipermeabler! Schichten eingebettet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, reaktive, biologisch nicht abbaubare Trägerkörper in Perlform zu schaffen, an die biologisch aktive Substanzen unter weitgehender Erhaltung ihrer Aktivität covalent gebunden werden können, so daß die Umsetzungsprodukte unter allen Bedingungen der Anwendung stabil sind. Die erhaltenen Enzymprodukte sollen sich leicht und vollständig von Substratlösungen trennen lassen und eine hohe Durchlaufgeschwindigkeit durch eine damit gefüllte Säule zulassen. Die Voraussetzung dafür ist ein hohes freies Volumen zwischen den Einzelpartikeln in einer Schüttung der Teilchen. Es ist bekannt, daß kugelförmige Teilchen von weitgehend einheitlicher Größe diese Voraussetzungen erfüllen, jedoch waren perlfcrmige, organisch-synthetisch- mikrobiologisch unangreifbare Trägersubstanzpii in einheitlicher KugeF gestalt, d. h. Vinyl-Perlpolymerisate, av die Enzyme chemisch gebunden werden können, bisher nicht bekannt

Gemäß der DE-OS 20 62 8Ϊ8 werden periförmige Trägerpolymere durch Polymerisation von Maleinsäureanhydrid und Vinyläthern, die in einem polaren Lösungsmittel gelöst und in einer unpolaren FlOssigkeit suspendiert sind, hergestellt Da die genannten Monomeren zum Teil in der unpolaren Flüssigkeit gelöst werden, entsteht dort ein feinteiliges Fällungspolymerisat, das sich mit den in der suspendierten Phase entstehenden Perlen zu nur annähernd kugelförmigen Teilchen oder klumpigen Gebilden zusammenlagert

Gegenstand der Erfindung ist das in den Ansprüchen beschriebene Verfahren und die Verwendung der Verfahrensprodukte.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß durch Perlpolymerisation unmittelbar reaktive Trägermaterialien erhalten werden, da die aktive Gruppe als Monomeres einpolymerisiert wird. Damit entfallen alle Schwierigkeiten, die mit der nachträglichen Aktivierung von Trägern für biologisch aktive Substanzen verbunden sind, wie z. B. Unvollständigkeit

CH₃ N-C(CH₃),

der polymeranalogen Reaktion mit dem aktivierenden Agens, besonders im Innern der Träger, quantitative Entfernung des aktivierenden Agens und chemisch agressiver Hilfsstoffe zur Vermeidung von Nebenreaks tionen bei der folgenden Anlagerung biologisch aktiver Substanzen, partieller chemischer Abbau oder unerwünschte zusätzliche Vernetzung des Trägere während der Aktivierungsreaktion. Die reaktiven »Gruppen der unter a) genannten

ίο Monomeren sind solche Gruppen, die bei Temperaturen von 0 bis 40⁰C in wäßriger Lösung mit primären Aminogruppen und Hydroxylgruppen reagieren und dabei eine kovalente Bindung zum Sauerstoff- oder Srckstoffatom der Hydroxyl- bzw. Aminogruppe bilden.

Da Wasser stets im erheblichen Oberschuß gegenüber den Hydroxyl- bzw. Aminogruppen vorliegt, sind Gruppen, die spontan mit Wasser reagieren, weniger geeignet Aktivierte Carboxylgruppen, die in den obengenannten Monomeren enthalten sind und die in

der Peptidchemie zur Bildung von Peptidblndungen umgewandelt werden, sind Carbonsäurechlorid-, Carbonsäureanhydrid- und Carbonsäureazid-G nippen.

Typische Verbindungen der unter a) genannten Monomeren sind

CH₂=C(H₁CH₃) -CO-O-N(C₂H₅),

CH₂-CH₂

CH₂=C(H₁CH₃)-CO-Ο—Ν

CH₂-CH₂ CO — CH,

CH₂=C(H₁CH₃)- CO- Ο—Ν

CO-CH₂

CH₂=C-C

25

30

35

40

45

Als Beispiele für andere Verbindungen des unter a) genannten Typs von Carboxylderivaten seien Acrylo-ier Methacrylsäurechlorid, Acryl- oder Methacrylsäu-

reanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Acryl- oder Methacrylsäure-phenylester, Glycidylacrylat oder -methacrylat, 4-Jodbutylacrylat oder -methacrylat und 2-lsopropenyl-4,4-di-methyl-oxazoIon-5 genannt. Die letztgenannte Verbindung reagiert beispielsweise mit der termina-

len Aminogruppe eines Proteins nach dem Schema:

CH₃

CH₂=C(H, CH₃)- CO- Ο—Ν

+ NH₂-Protein -> CH₂=C-CO-NH-C(CH₃)₂-CONH-Protein

0—CO

Typische Vertreter der N- bzw. O-alkylierenden Monomeren aus der Gruppe a) sind Glycidyl-acrylat oder -methacrylat und ω-Jod-alkylester der Acryl- oder Methacrylsäure, worin die Alkylgruppe im allgemeinen 2 bis 6 C-Atome enthält, oder Allylchlorid, Chlormethyl styrol und Chloracetoxyäthylmethacrylat. Bei der Umsetzung mit Enzymen, Enzym-Substraten, Inhibitoren, Hormonen, Antibiotika, Antikörpern, Antigenen und Peptiden bilden die genannten Gruppen in wäßriger Lösung bei Temperaturen im Bereich von 0 bis

40° C kovalente Bindungen zu O- oder N-Atomen aus. Sofern die biologisch aktiven Substanzen Eiweiücharakter haben, enthalten sie auf jeden Fall eine terminale primäre Aminogruppe sowie in vielen Fällen weitere CH- oder NH-Gruppen in Aminosäuresten des Ornithins, Citrullins, Arginins, Lysins, Serins, Threonine oder Tyrosins. Nicht eiweißartige biologisch aktive Substanzen können nur gebunden werden, wenn sie wenigstens eine primäre Amino- oder Hydroxylgruppe enthalten, wie Polysaccharide, Nukleinsäuren, Ampicillin, Yyramin. Die aktiven Monomereinheiten sind hydrolyseempfindlich und können, soweit sie nicht mit den angebotenen Wirkstoffen reagieren, in Gegenwart von Wasser in hydrophile Carboxyl- oder Hydroxylgruppen übergehen. Die aktivierten Gruppen sind deshalb in dem Trägerstoff in meist größerer Zahl vorhanden, als zur Bindung des Enzymproteins erforderlich ist

In der wäßrigen Enzymlösung quellen die Trägerstoffe auf das mehrfache ihres ursprünglichen Voiumens auf. Dabei diffundiert nicht nur Wasser, sondeir. auch die darin gelöste biologisch aktive Substanz ins innere der Teilchen und wird dort covalent gebunden. Die Quellbarkeit der Polymerisatperlen beruht auf ihrem Gehalt an hydrophilen Gruppen. Monomereinheiten mit hydrophilen Gruppen sind unter c) genannt und bilden einen wesentlichen Bestandteil des Polymerisats. Sie leiten sich von wasserlöslichen neutraler., salzartigen, sauren oder basischen Monomeren ab. Als wasserlöslich gelten im Sinne der Erfindung solche Monomere, die bei Raumtemperatur wenigstens 10%ige wäßrige Lösungen ergeben. Unter den neutralen Monomeren dieser Art kommt denen mit einer Amidgruppe besondere Bedeutung zu, vor allem Acryl- oder Methacrylamid oder N-Vinylpyrroüdon. Hydroxylgruppenhaltige Monomere, wie Äthylenglykolmonoacrylai oder -monomethacryiat, sind etwas schwächer hydrophil. Monomere mit salzartigen Gruppen sind extrem hydrophil und können in verhältnismäßig geringen Mengen am Aufbau der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate beteiligt sein. Monomer: dieser Art sind z. B. Vinylsulfonsäure und ihre Salze und die quaternisierten Aminoalkylester der a^-ungesättigien Carbonsäuren, ζ. B. Methacryloxyäthyl-trimethylammonium-chlorid. Monomere mit Carboxylgruppen bilden im alkalischen und Monomere mit sekundären oder tertiären Aminogruppen im sauren wäßrigen Milieu Salze, jedoch sind diese Monomeren bzw. die daraus entstandenen Monomereinheiten auch dann hydrophil, wenn sie nicht in Form ihrer Salze vorliegen.

Die Quellbarkeit der Trägerstoffe durch Wasser beruht nicht allein auf den hydrophilen Gruppen der in der Komponente c) zusammengefaßten Monomeren, sondern auch auf den aktivierten Gruppen der Komponente a) bzw. auf den durch Hydrolyse daraus entstehenden freien Carboxyl- oder Hydroxylgruppen. Ein Anteil bis zu 50 Mol-% der Monomeren kann wasserunlöslich und von weniger hydrophiler Natur sein. Andererseits können gewisse Anteile an hydrophoben Bausteinen für eine optimale Wirkung der gebundenen biologisch aktiven Stoffe erforderlich sein. Als nicht wasserlösliche Monomere kommen z. B. Acryl- und Methacrylsäureester aliphatischer Alkohole, Nitrile dieser Säuren, Vinylester niederer Fettsäuren, wie Vinylacetat oder Vinylpropionat, ferner Vinylidenchlorid in Betracht. Dem Einbau derartiger Monomerer sind jedoch wegen des Polymerisationsverfahrens Grenzen gesetzt. Fs gestattet nicht die Mitverwen dung von Monomeren, die sich bei der Perlpolymerisation bevorzugt in der z. B. aus höheren aliphatischen Kohlenwasserstoffen bestehenden kontinuierlichen Phase lösen, wie z. B. Acryl- und Methacrylester von s Alkoholen mit 4 oder mehr C-Atomen.

Eine ausreichende Hydrophile des Mischpolymerisats ist jedenfalls dann gegeben, wenn ein entsprechendes, ohne Mitverwendung von vernetzenden Monomeren hergesteiltes Mischpolymerisat — zumindest nach der

ίο Hydroiyse der aktivierten Gruppen — in Wasser löslich wäre. Durch die Vernetzung mittels solcher Monomeren, die zwei oder mehr radikalisch polymerisierbare Kohlenstoffdoppelbindungen enthalten, wie Glykoldimethacrylat oder -diacrylat und Triallylcyanurat, wird die Wasserlöslichkeit aufgehoben. Der optimale Vernetzungsgrad, d. h, die Wahl der Vernf.-tzungsmittelmenge innerhalb der Grenzen von 0,2 bis 5 Mol-%, wird am besten empirisch festgelegt. Der Vernetzungsgrad ist als ausreichend anzusehen, wenn die r- dymerisatpartikein in Wasser auf das 5- bis lOOfache Voiürr-en (Schüttvoiumen) oder mehr anquellen, aber als Einzelpartikeln von annähernd kugelförmiger Gestalt auch dann bestehenbleiben, wenn sie sich im wäßrigen Milieu zu einer Schieb* absetzen. Zwischen den Partikeln sollen freie, nur mit der wäßrigen Phase gefüllte Zwischenräume frei bleiben. Bei zu geringer Vernetzung würden sich die Partikeln beim Absetzen verformen und keinen Zwischenraum frei lassen, während bei zu starker Vernetzung keine eder nur eine geringe Queliung, z. B.

auf weniger als das doppelte des Ausgangsvolumens einträte.

Wegen der Hydrolyseempfindlichkeit der aktivierten Gruppen wird die Polymerisation in einem möglichst wasserfreien Medium vorgenommen. Bei einem Was sergehak von z. B. einem Prozent in der Monomeren- phase tritt im allgemeinen noch keine nennenswerte Hydrolyse der aktivierten Gruppe ein, jedoch nuß der Wassergehalt unter der Grenze bleiben, bei der ein merklicher Anteil der für die Enzymbildung benötigten reaktiven Gruppen hydrolysiert wird. Diese Grenze liegt je nach der Wasserempfindlichkeit der reaktiven Gruppe verschieden hoch, in der Regel zwrjchen 2 und 5 VoI.-%, jedoch ist das Arbeiten in vollständiger Abwesenheit von Wasser grundsätzlich vorzuziehen.

Die Ausbildung vernetzter kugelförmiger Teilchen des Trägerstoffes von enger Teilchengrößenverteilung erreicht man durch ein spezielles Verfahren der Perlpolymerisation, bei dem ein unpolares organisches Medium, das kein gutes Lösungsmittel für die zu polymerisierenden Monomeren ist, als kontinuierliche

Phase verwendet wird. Als solche eignen sich in

besT'iderem Maße aliphatische Kohlenwasserstoffe, vor allem solche mit 8 und mehr C-Atomen im Molekül.

Ein deutlicher Polaritätsunterschied zwischen der

Monomerenphase und der kontinuierlichen Phase ist Voraussetzung dafür, daß überhaupt eine Phasentrennung stattfindet und die Monomerenmischung zi-Beginn der Polymerisation in diskreten Tröpfchen vorliegt. Nur unter dieser Voraussetzung entstehen

_M kugelförmige Polymerpartikeln von einheitlicher Größe. Je weniger polar die beteiligten Monomeren sind, um so größer ist ihre Neigung, sich wenigstens teilweise in dem unpolaren Medium zu lösen. Dieser Neigung kann dadurch entgegengewirkt werden, daß man die Monomerenphase durch gute Lösungsmittel für die Monomeren, die mit dem unpolaren organischen Medium nicht mischbar sind, z. B. Formamid, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd, in Mengen von z. B.

20 bis 200 Gew.-%, bezogen auf die Monomerenmenge, verdünnt. Diese Maßnahme fördert gleichzeitig die weitmaschige Vernetzung und gute Quellbarkeit der Polymeren. Eine begrenzte Löslichkeit der Monomeren in der kontinuierlichen organischen Phase ist nicht störend, wenn die Polymerisation dieses Monomerenteiis in der kontinuierlichen Phase ausgeschlossen wird. Dann kann nämlich in dem Maße, wie die Monomeren in den Tröpfchen durch Polymerisation umgesetzt werden, eine Rückdiffusion der gelösten Monomeren in die Tröpfchen eintreten. Es werden daher Polymerisationsinitiatoren verwendet, die sich in dem organischen Medium möglichst wenig lösen.

Das Monomerengemisch wird in dem organischen Medium durch kräftiges Rühren zu kleinen Tröpfchen verteilt. Um den durch Rühren herbeigeführten Verteilungszustand der — gegebenenfalls lösungsmittelhaltigen - Monomerphase während der ganzen Dauer der Polymerisation aufrechtzuerhalten, wird ein Dispergiermittel mitverwendet, das in der unpolaren organischen Phase löslich ist. Für diesen Zweck eignen sich statistische Mischpolymerisate oder Block- oder Pfropfmischpolymerisate, die aus 60 bis 95 Grundmol-% Acryl- oder Methacrylsäureester von Alkylalkoholen mit wenigstens 4 C-Atomen im Alkylrest oder Vinylesiern von wenigstens 4 C-Atome enthallender Fettsäuren, und zum übrigen Teil aus polaren, wasserlöslichen Monomeren, wie Methacryloyl-cholinchlorid, Dimethylaminoäthylmethacrylat, dessen Salze mit anorganischen oder organischen Säuren aufgebaut sind. Acryl- oder Methacrylsäure oder Acryl- oder Methacrylamid, haben eine gute Dispergierwirkung. Man kann aber auch nach bekannten Methoden hergestellte Propf- oder Block-Mischpolymerisate verwenden, in denen Monomere der beiden genannten Arten nicht statistisch verteilt, sondern getrennt voneinander in verschiedenen ivioieküibiöcken oder in der Basiskette und den Seitenketten eines Pfropfpolymerisats einpolymerisiert sind. Die Dispergiermittel vermögen bereits in Mengen von 0,02%, bezogen auf das Gewicht der kontinuierlichen Phase, den Suspensionszustand bis zum Abschluß der Polymerisation aufrechtzuerhalten. Jc höher die Menge des Dispergiermittels gewählt wird und je stärker gerührt wird, um so kleinere Teilchen werden gebildet. Es wird eine Teilchengröße von 0,1 bis 1 mm im ungequolienen Zustand angestrebt.

Das Verhältnis der Monomerenphase — mit oder ohne Zusatz eines Lösungsmittels — zur kontinuierlichen Phase kann zwischen 1 :1 und 1 :10 liegen, jedoch werden Verhältnisse zwischen 1 :1,5 und 1 :4 bevorzugt. Die Stabilität des Verteilungszustandes ist um so höher, je geringer der Dichteunterschied zwischen beiden Phasen isiL Die Dichte der kontinuierlichen Phase läßt sich durch Zusatz von Halogenkohlenwasserstoffen, wie Perchloräthylen, Trichloräthylen, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff, der meist größeren und im Laufe des Poiymerisationsverfahrens noch zunehmenden Dichte der Monomerenphase anpassen.

Die Polymerisation wird durch einen in der Monomerenphase gut und in der kontinuierlichen Phase möglichst schwer löslichen, radikalbildenden Initiator, z. B. Azobis-cyanvaleriansäure, in Gang gesetzt Mit diesem Initiator tritt die Polymerisation bei Temperaturen vor 50 bis 80⁰C ein, was den Nachteil hat, daß die Löslichkeit der Monomeren in der kontinuierlichen Phase bei diesen Temperaturen unerwünscht hoch ist und dort die Gefahr einer Fällungspolymerisation besteht. Es wird daher bevorzugt, die Polymerisation bei niedriger Temperatur, z.B. 15 bis 30⁰C, mittels eines Redox-Initiator-Systems auszulösen. Geeignet ist z. B. das System Bcnzoylperoxyd/Dimethylanilin. Bei guter Rührung und Wärmeableitung kann die Polymerisation in 1 bis 3 Stunden abgeschlossen sein. Die Polymerisatperlen werden durch Filtrieren von der kontinuierlichen Phase getrennt und gegebenenfalls von anhaftenden Resten der flüssigen Phase durch Waschen mit einem

ίο wasserfreien Lösungsmittel gereinigt. Sind die Perlen in Gegenwart von Formamid, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd hergestellt worden, so werden diese Lösungsmittel im allgemeinen nicht aus den damit angequollenen Perlen entfernt, sondern sie werden in dem feuchten Zustand, in dem sie anfallen, mit der wäßrigen Enzymlösung umgesetzt. Es ist sogar vorteilhaft, die Perlen vor der Umsetzung mit derartigen

sation nicht mitverwendet werden.

:i) Die Umsetzung mit der wäßrigen Enzymlösung stellt eine Konkurrenzreaktion zwischen der erwünschten kovalcnten Bindung des biologisch aktiven Stoffes und der unerwünschten Hydrolyse der aktiven Gruppen dar. Dabei ist die gewünschte Fixierung um so mehr begünstigt, je höher die Konzentration des biologisch aktiven Stoffes in der wäßrigen Lösung liegt. Die Lösungen rMlen auch möglichst frei von inaktiven Begleitproteinen oder anderen hydroxyl- oder aminogruppenhaltigen Stoffen sein, die sonst ebenfalls an den

J₀ Trägerstoff gebunden werden können Sofern nicht zur Aufrechterhaltung der Aktivität ein bestimmter pH-Bereich eingehalten werden muß, läßt man die Umsetzung mit den biologisch aktiven Substanzen bei pH 5 bis 8, vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis 30° C

_is ablaufen. Die Umsetzung kommt in dem Maße in Gang, wie die Polymerisatperlen mit Wasser anquellen. Nach einer Reaktionszeit von einigen Stunden bis einigen Tagen unter schwachem Rühren ist der größte Teil des Enzyms gebunden und der Überschuß an aktiven

.,o Gruppen hydrolysiert.

Der weitaus größte Teil der aktiven Stoffe wird in den weitmaschigen »Hohlräumen« im Innern der gequollenen Teilchen gebunden. Dort sind die empfindlichen Stoffe gegen den Abbau durch Scherkräfte, die beim Rühren oder bei hoher Strömungsgeschwindigkeit in Säulenreaktoren auftreten können, geschützt, aber für Substratmoleküle gut zugänglich. Lediglich extrem hochmolekulare Substrate werden offenbar zunächst vorwiegend von den an der Polymerisatoberfläche gebundenen Molekülen angegriffen und können b.· abnehmender Molekülgröße mit den im Innern gebundenen Stoffen in zunehmendem Maße in Reaktion treten. In der geschützten Anordnung der Enzymmoleküle dürfte auch die Ursache für die höhere Erhaltung

_5S der Enzymaktivität bei der Bindung an das Polymerisat im Vergleich zu anders aufgebauten Enzymträgerstoffen liegen. Diese werden meist als feste Teilchen aktiviert und binden das Enzym überwiegend an der Oberfläche, wo es durch Scherkräfte leicht geschädigt

_M werden kann. Bei der Bindung von Proteinen an unvernetzte Mischpolymerisate des Maleinsäureanhydrids unter gleichzeitiger Vernetzung werden vermutlich Enzymmoleküle auch im Innern der Trägerpartikeln gebunden, aber durch nachfolgende Vernetzung so siark eingeschlossen, daß eine Reaktion mit Substratmolekülen nicht mehr möglich ist.

Unter den biologisch aktiven Substanzen, die an die erfindungsgemäßen perlförmigen Träger gebunden

werden können, kommt den Enzymen, insbesondere den Hydrolasen vorherrschende Bedeutung zu. Als Beispiele für geeignete Enzyme seien Proteasen, wie Pilz- und Bakterienproteasen, Trypsin, Chymotrypsin, Pankreatin, sowie Amylasen, Ribonukleasen, Desoxyribonukleasen genannt. Die hohe Aktivität der gebundenen Eniy.tie gegenüber hochmolekularen Substraten ist besonders hervorzuheben.

Mittels gebundener Enzymsubstrate oder -Inhibitoren lassen sich in wäßrigen Medien gelöste oder in biologischem Material enthaltene Enzyme selektiv entfernen oder unwirksam machen. Von den trägergebundenen Substraten lassen sich die aufgenommenen Enzyme durch Änderung des pH-Wertes oder des Elektrolytgehalts des umgebenden Mediums wieder trennen und auf diese Weise rein isolieren. Auf die zahlreichen weiteren Möglichkeiten, das Verhalten biologische! Syteme mittels trägergebundener Hormone, wie Insulin oder Hypertensin, oder Antibiotika, wie Ampicillin, oder Antikörper, Antigent, biogener Amine und diverser Peptide zu beeinflussen, sei an dieser Stelle nur hingewiesen. Auch Gemische verschiedener biologisch aktiver Substanzen können gleichzeitig gebunden werden. Biologisch aktive Substanzen, die sich im freien Zustand wechselseitig in ihrer Wirkung beeinträchtigen würden, kann man getrennt voneinander an die erfindungsgemäß herstellbaren Trägersubstanzen binden, die erhaltenen Produkte mischen und das Gemisch anwenden.

de mit biologisch aktiven Substanzen umgesetzten Träger enthalten in typischen Fällen 5 bis 50, vorzugsweise 10 bis 30 Gew.-Vo an gebundenem Material, berechnet auf die Trockensubstanz von Träger und biologischem Material. Die Produkte liegen in Wasser als gallertige kugelförmige Partikeln von meist 1 bis 5 mrn Durchmesser vor. Infolge ihrer starken Quellung haben sie eine vom wäßrigen Medium nur wenig abweichende Dichte, so daß sie schon durch schwaches Rühren in Suspension gehalten werden können. Bei der Verwendung als Säulen- bzw. Reaktorfüllung ist die Durchlaufgeschwindigkeit der Substratlösung nur durch die Diffusionsgeschwindigkeit des Substrates begrenzt.

Der Aktivitätsverlust des gebundenen biologisch aktiven Materials bei der Anwendung und Lagerung ist deutlich geringer als bei der Aufbewahrung der nicht gebundenen Substanzen unter gleichen Bedingungen. Daher ist durch häufige Wiederbenutzung bei chargenweiser Anwendung bzw. durch hohe Lebensdauer bei kontinuierlicher Anwendung eine wesentlich höhere Ausnutzung der biologischen Aktivität möglich, als bei der Anwendung der ungebundenen Substanzen.

Als Beispiel für die Verfahrenserieichterungen, die durch trägergebundene Enzyme möglich sind, sei die Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischem Material genannt. Als schwer abtrennbare Begleitstoffe treten vor allem Proteine auf. Sie mußten bisher durch aufwendige Extraktionsverfahren mit Phenol entfernt werden. Sie lassen sich zwar auch mit löslichen proteolytischen Enzymen abbauen, jedoch sind diese Enzyme selbst Proteine, die ebenfalls wieder nur durch Phenolextraktion entfernt werden können. Mit einer trägergebundenen Protease lassen sich die Proteine leicht und vollständig abbauen. Nach dem Abfiitneren des trägergebundenen Enzyms enthält die Substratlösung außer den Nukleinsäuren keine hochmolekularen Bestandteile mehr. Die Nukleinsäuren selbst werden häufig noch nach bekannten Verfahren in Ribonukleinsäure und Desoxyribonukleinsäure getrennt. Auch dabei verursachte die restlose Entfernung der jeweils anderen Komponente einen erheblichen Arbeitsaufwand. Mittels trägergebundener Ribonukleasc lassen sich nun Reste der Ribonukleinsäure aus der Desoxyribonukleinsäure-Fraktion entfernen. Umgekehrt kann man Ribonukleinsäure frei von Desoxyribonukleinsäure gewinnen, wenn man sie mit trägergebundener Desoxyribonuklease behandelt.

Herstellung von pcrlförmigen Trägerpolymerisaten
Beispiel 1

In einem Rundkolben (500 ml) werden 167 g n-Heptan und 333 g Perchloräthylen, das über Molekularsieb 4 A getrocknet ist, vorgelegt. Darin werden 2 g Benzoylperoxid und 0,02 g eines Stabilisators (p-lsopropylaminodiphenylamin) gelöst. Bei 20⁰C wird eine Monomerlösung zugegeben, bestehend aus

80 g Dimethylformamid
60 g Acrylamid
60 g Methacrylsäureanhydrid
1,5 g Glykoldimethacrylat
0,1 g Emulgator (statist. Copolym. n-Buiylmethacrylat/Methacryloylcholinhydrochlorid
-90/10)

Alle Monomeren und Lösungsmittel sind wasserfrei, außerdem werden sowohl die Vorlage als auch die Monomerlösung mit trockenem CO2 von Sauerstoff befreit. (Das gilt auch für die nachfolgenden Beispiele.)

Die Monomerphase wird durch konstantes Rühren in J5 der organischen Phase verteilt Der Reaktionsstart erfo!gi durch Zugabe des zweiten Redoxpartners (1 g Dimethylanilin). Bei relativ kurze. Polymerisationsdauer (30 Min.) wird die Temperatur durch Kühlung mit einer Kältemischung weitgehend konstant bei 20 bis 25°C gehalten. Die erhaltenen Perlen werden durch Dekantieren und kurzes Absaugen von der organischen Phase befreit. Sie sind noch mit Dimethylformamid angequollen und werden in diesem Zustand zur Umsetzung mit dem Enzym eingesetzt.

Beispiel 2

In einem Rundkolben (1000 ml) werden 167 g n-Heptan und 333 g Perchloräthylen, vorgelegt Bei 20⁰C wird eine Monomerlösung zugegeben, bestehend

80 g Formamid

60 g Methacrylsäureanhydrid

60 g Acrylsäure

0,8 g Äthylenglykol-dimethacrylat

0,1 g Emulgator (wie Beispiel 1)

Die Monomerphase wird unter Rühren in der organischen Phase verteilt Zum Reaktionsstart gibt man 2 g Benzoylperoxid und 1 g Dimethylanilin hintereinander zu. Die sofort einsetzende Polymerisation wird durch Kühlung mit einer Kältemischung unter Kontrolle gehallen; Temperaturanstieg über 25°C soll vermieden werden.

Die erhaltenen Perlen werden durch Dekantieren und kurzes Absaugen von der organischen Phase befreit.

Beispiel 3

In einem Rundkolben (250 ml) werden 42 g n-Heptan, 84 g Perchloräthylen und 0,5 g Benzoylperoxid vorgelegt. Bei 20⁰C wird eine Lösung zugegeben, bestehend aus

20 g Dimethylformamid

12 g Acrylamid
3 g Acrylsäure

15 g Methacrylsäureanhydrid 0,025 g Emulgator (wie Beispiel 1) 0,57 g Triäthylenglykoldimeihacrylat

Die Monomerphase wird unter Rühren in der organischen Phase verteilt und durch Einleiten von trockenem COj von Sauerstoff befreit. Der Reaktion; start erfolgt durch Zugabe von 0,25 g Dimethylanilin. Die Reaktion ist nach etwa 2 Stunden unter ständiger äußerer Kühlung des Ansatzes beendet. Die entstandenen Perlen werden abgetrennt.

Beispiel 6

In einem Rundkolben (250 ml) werden 42 g n-Heptan, 84 g Perchloräthylen und 0,5 g Benzoylperoxid vorgelegt. Bei 20°C wird eine Lösung zugegeben, bestehend aus

in

20

20 g Dimethylformamid

5 g Formamid

15 g Methacrylsäureanhydrid

7,5 g Acrylamid

7,5 g Methacrylamid

0,57 g Triäthylenglykoldimethacrylat

0,025 g Emulgator (wie Beispiel 1)

Die

der

~~g-.~-.rb.rr.

Monomerphase wird unter Rühren in

isc verieili und ciiiga&i. Der Reaktionsstart erfolgt durch Zugabe von 0,25 g Dimethylanilin. Die Polymerisation verläuft unter schwacher Wärmeentwicklung, so daß schwache äußere Kühlung genügt. Es werden feine Perlen erhalten.

Beispiel 4

In einem Rundkolben (250 ml) werden 60 g n-Heptan, 120 g Perchioräthylen und 0,25 g Benzoylperoxid vorgelegt. Bei 20⁰C wird eine Lösung zugegeben, bestehend aus

20 g Dimethylformamid

2 g Acrylsäure

0,025 g Emulgator (wie Beispiel 1)

3 g Acrylsäureanhydrid
25 g Acrylamid

0,38 g Glykoldimethacrylat

Die Monomerphase wird unter Rühren in der organischen Phase verteilt »nd entgast Der Reaktionsstart erfolgt nach Zugabe von 0,12 g Dimethylanilin. Äußere Kühlung des Ansatzes ist notwendig, um die Temperatur auf 25⁰C. zu halten. Es werden Perlen erhalten.

Beispiel 5

In einem Rundkolben (500 ml) werden 1653 g Perchloräthylen, 83,5 g n-Heptan und 0,5 g Benzoylperoxid vorgelegt. Bei 20° C wird eine Monomerlösung zugegeben, bestehend aus

Beispiel 7

In einem Rundkolben (500 ml) werden 87 g n-Heptan, 55 g Perchloräthylen und 0,1 g des Emulgators (statistisches Copolymerisat n-Butyl-methacrylat/Methacryloylcholinchlorid 95/5) vorgelegt. Nach Abkühlen auf 20⁰C wird folgende Lösung zugegeben:

17,5 g Formamid
13,5 g Acrylamid

1,5 g Acryloyl N-hydroxy-succinimid
0375 g Äthylenglykoldimethacrylat

Die Monomerphase wird unter Rühren in der organischen Phase verteilt und entgast. Der Reaktionsstart erfolgt durch Zugabe von 0,25 g Dimethylanilin. Es werden feine Perlen erhalten.

Beispiel 8

In einem Rundkolben (500 ml) werden 87 g n-Heptan, 55 g Perchloräthylen und 0,1 g des Emulgators (statistisches Copolymerisat n-Butylmethacrylat/Methacryloylcholinchlorid 95/5) vorgelegt. Nach Abkühlen auf 20°C wird folgende Lösung zugegeben:

50

55

20 g Formamid
15 g Acrylamid
15 g Acrylsäureanhydrid

0,025 g Emulgator (wie Beispiel 1) _ω

0,76 g Glykoldimethacrylat

Die Monomerlösung wird unter Rühren in der organischen Phase verteilt and entgast Der Reaktionsstart erfoigt durch Zugabe von 0,25 g Dimethylanilin. Die Reaktion ist sehr heftig. Man kühlt den Ansatz von außen mit einer Kältemischung. Es werden Perlen erhalten.

173 g Formamid

12 g Acrylamid
3 g GlycidyJacrylat
0375 g Äthylenglykoldimethacrylat

Die Monomerphase wird unter Röhren in der organischen Phase verteilt und entgast Der Reaktionsstart erfolgt durch Zugabe von 0,5 g Dimethylanilin in zwei Portionen. Es werden feine Perlen erhalten.

Umsetzung der Perlpolymerisate mit biologisch
aktiven Substanzen

Beispiel 9

3 c des in Beispiel 1 hergestellten Perlpolymerisats werden 5 Stunden lang bei 90⁰C mit wasserfreiem Dimethylformamid angequollen. Dann wird unter starkem Rühren und Eiskühlung eine Lösung von 1 g Trypsin in 100 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)

zugegeben, 6 Stunden weitergerührt und über Nacht bei 5° C stehengelassen.

Das Produkt wird 5mal mit Kochsalzlösung gewaschen, in dem man die Perlen etwa 30 Minuten in Wasser rührt, festes Kochsalz zugibt bis zu einer Konzentration von 6%, weitere 30 Min, rührt und filtriert. Zuletzt werden die Perlen zweimal mit jeweils 2 Liter 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 0,01% Natriumazid) gewaschen und abgesaugt. Feuchtausbeute: 85 g. Proteingehait (ultraviolett-spektrometrisch nach Auflösen der Perlen in 0,5 N NaOH bei 100⁰C): 22,8%, bezogen auf Trockengewicht.

Katalytische Aktivität: Innerhalb von 60 Minuten spalten 100 mg derTrypsin-Perlen (Trockengewicht) an Casein 220 μΜοΙ Peptidbindungen. Dies entspricht der Abbauleistung von 5 mg gelöstem, kristallisierten Trypsin unter gleichen Testbedinrungen (Substratkonz. 33%. 37°C automatische Titration rlcr frei werdender! Carboxylgruppen mit 0,1 N-NaOH bei pH 8,1). Die katalytischf Aktivität der Trypsin-Perler. gegenüber hochmolekularem Substrat beträgt, bezogen auf ihren Trypsingehalt, etwa 20%. Nach fünfmal wiederholter Verwendung wurde keinerlei Aktivitätsabnahme beobachtet. Bei Verwendung des in Beispiel 7 hergestellten Perlpolymerisats als Trägersubstanz wird im wesentlichen das gleiche Ergebnis erhalten.

Beispiel 10

Chymotrypsinperlen werden in der gleichen Weise wie in Beispiel 9 hergestellt. Proteingehalt: 26%. Katalytische Aktivität gegen hochmolekulares Substrat (Casein): in 60 Min. werden von 100 mg Perlen (Trockengewicht) 250μΜοΙ Peptidbindungen unter Stsndardbedingungen gespalten, dies entspricht 25% der Aktivität von nichtgebundenem Trypsin.

Beispiel 11

Pankreatin, ein aus Pankreasdrüsen gewonnenes Trockenpulver, welches reich an proteolytischen Enzymen ist, wird in der in Beispiel 9 beschriebenen Weise im Gewichtsverhältnis 1/1 mit einer Reihe von Perlpolymerisaten umgesetzt. In der nachfolgenden Tabelle wird die proteolytische Spaltungsleistung der erhaltenen trägergebundenen Enzyme (jeweils 100 mg Trockenperlen) gegenüber einer 3,3%igen Caseinlösung innerhalb 60 min unter Standardbedingungen angegeben.

Zur Herstellung des trägergeb.
Enzyms verwendetes Perlpolymerisat

μΜοΙ gespaltene Peptidbindung pro 100 mg, 60 min

Produkt von Beispiel 1
Produkt von Beispiel 2
Produkt von Beispiel 4
Produkt von Beispiel 5

250 300 350 800

12

0,5 N-NaOH).

Katalytische Aktivität gegen hochmolekulares Substrat (Casein, Standardbedingungen): 100 mg Pronascperlen (Trockengewicht) spalten 390 μΜο¹ Peptidbindüngen pro 60 Minuten. Nach 5m*liger wiederholter Verwendung wird kein Aktivitätsverlust beobachtet. Aktivität gegen hochmolekulares Substrat (Casein): 15% bezogen auf freies Enzym. Gegenüber DNA (z. B. aus Forellensperma) ist das Produkt inaktiv.

Beispiel 13

Gewinnung hochmolekularer Nucleinsäuren aus Leber durch Entfernung des Proteins mit Pronase-Perien

13,4 g Mäuseleber werden in 60 ml 0,05 M Phcspliatpuffer (pri S, 0,02 M EDTA, 2% Sarkosyl) in einem über Trockeneis gekühlten Mörser homogenisiert und mit Pronase-Perlen gemäß Beispiel 12 (40 g Feucuipcriunj 24 Stunden lang gerührt. Die Proteolyse wird durch automatische Titraiion mit 0,1 N-NaOH verfolgt. Insgesamt werden 24 ml NaOH verbraucht. Dann wird über eine Glasfritte abgesaugt und anschließend zentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wird abgenommen, und i:: der Kälte wird mit dem gleichen Volumen eiskaltem Isopropylaikohol gefällt. Das ausgefallene, fädige Produkt wird mehrmals mit wäßrigem, schließlich mit reinem isopropylaikohol und zuletzt mit Äther gewaschen und auf Filterpapier im Vakuum getrocknet (160 mg Trockenausbeute).

In dem Trockenprodukt wird der DNA-Gehalt nach der fluorimetrischen Methode von J. M. K i s s a η e und E. R ο b i η s (J. Biol. Chem. 233 [1958], S. 184), die RNA nach J. M. W e b b (J. Biol. Chem. 221 [1950], S. 635) und das Protein nach der Folin-Methode (O.H.Lowryu. a.,

J. Biol. Chem, 193[195I]₁S. 2ö5) bestimmt:

Beispiel

Protease aus Streptomyces griseus wird im Gewichtsverhältnis 1/2 mit dem gemäß Beispiel 1 hergestellten Perlpolymerisat in der in Beispiel 9 angegebenen Weise umgesetzt Aus 5 g Peripoiymerisat und 23 g Enzym werden 142 g Feuchtperlen gewonnen.

Proteingehalt: 5,2% (Proteinbestimmung mit Folin-Ciocalteu-Reagenz nach Auflösen der Perlen in RNA

Protein

H₂O

< An/. IO"7U

32%
0,2%
20%

Die Ergebnisse zeigen, daß sich mit Pronase-Perlen DNA direkt aus einem Leberhomogenat stark anreichern läßt. Die Ausbeute ist praktisch quantitativ.
Zur weiteren Reinigung werden 120 mg des Trocken-Produktes in Puffer gelöst und durch Behandlung mit löslicher RNase und a-(l,4)-Amylase Glycogen und RNA abgebaut Anschließend werden diese zugesetzten Enzyme durch Schütteln mit Pronase-Perlen abgebaut und durch Isopropylalkohol-Fällung nach entsprechendem Waschen und Trocknen 20 mg Trockenprodukt erhalten. Dieses enthält außer 18% Wasser nur noch DNA.

Beispiel 14

.. 250 mg Ribonuclease A (chrom, einheitlich, frei von DNase, RNase-B und Proteasen) werden in 30 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und in der in Beispiel 9 beschriebenen Weise mit 1000 mg der in Beispiel 1 hergestellten Perlpolymerisate umgesetzt

_ω Ausbeute: 27,7 g Feuchtperlen.

Proteingehalt: 11 % (bezogen auf Trockengewicht).
Katalytische Aktivität gegen hochmolekulares Substrat: 2 g Feuchtperlen (entsprechend 84 mg Trockenperlen), 8 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 73 und 20 ml Substrat (4% Hefe-RNS mit NaOH auf pH 8 eingestellt) werden bei 37° C inkubiert

Unter den Testbedingungen spalten 100 mg Perlen (Trockengewicht) 640 μΜοΙ PhosDhoresterbinduneen

15

pro 60 Minuten. Verglichen mit nichtgebundener löslicher RNase beträgt die Aktivität der RNase-Perlen, bezogen auf ihren Proteingehalt gegen hochmolekulares Substrat 55%.

Beispiel 15

44 mg Desoxyribonuclease I (lyophyLrein, aus Rinderpankreas) werden in 8 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und mit 200 mg der in Beispiel 1 hergestellten Methacrylsäureanhydrid-Methacrylamid-Perlen in der _]Q in Beispiel 9 für Trypsin beschriebenen Weise umgesetzt

Ausheute: 5,4 g Feuchtperlen.
Proteingehalt: 44% (bezogen auf Trockengewicht).
Das Produkt ist aktiv gegenüber DNA aus Forellensper- _s ma mit einem Molekulargewicht von 18 Mio.

Beispiel 16

500 mg Insulin werden in 50 ml 0,2 M Phosphatpuffer (pH 74. 2 m§ EDTA/iü!) gelöst und mit 500 mg in _χ Dimethylformamid vorgequollenen Acrylsäureanhvdrid-Acrylamid-Perlen, hergestellt gemäß Beispiel 4, bei 5° C 10 Stunden lang gerührt und dann lOmal mit der Wasser-Kochsalzlösung-Methode gewaschen (siehe Beispiel 9).

Proteingehalt der Perlen: 28%.

In gleicher Weise werden Glucagon- und Hypertensin-P^rlen hergestellt.

Beispiel 17

Trypsin-Inhibitor aus Pankreas wird mit einem Perlpolymerisat gemäß Beispiel 8 bei pH 93 (wäßr. Bicarbonatpuffer) 30 Stunden lang umgesetzt und dann fünfmal .nit der Wasser-Kochsalzlösung-Methode, sowie dreimal aijernierend mit 1% Essigsäure und 0,2 M Phosphatpuffer, pH 74 gewaschen. Proteingehalt der Trypsin-Inhibitor-Perlen: 84% (bezogen auf Trockengewicht).

Trypsin läßt sich spezifisch an die Inhibitor-Perlen binden und im sauren pH-Bereich ohne Aktivitätsverluit desorbieren.

Beispiel 18

500 mg Tyramin wurden in 25 ml Bicarbonatpuffer (pH 9) mit 1000 mg des in Beispiel 8 hergestellten Perlpolymerisats bei Zimmertemperatur 12 Stunden umgesetzt. Nach Entfernung des nichtgebundenen Tyramins durch Waschen mit 5% Essigsäure werden Tyramin-Perlen erhalten, die bezogen auf das Trockengewicht, 20% Tyramin enthielten. Der Tyramingehalt wird ultraviolett-spektrometrisch nach alkalischer Hydrolyse in 0,5 N-NaOH bei 100" C bestimmt.

In analoger Weise wird das Antibiotikum Ampicillin an den gleichen Perltyp gebunden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung perlförmiger, vernetzter, wasserunlöslicher Mischpolymerisate durch radikalische Polymerisation eines einen radikalbildenden Initiator enthaltenden Monomerengemisches, das ein gegenüber biologisch aktiven Substanzen bindungsaktives Monomer, ein vernetzendes Comonomer und wenigstens ein weiteres Comonomer enthält, wobei das Monomerengemisch in einer unpolaren organischen Flüssigkeit zu Tröpfchen suspendiert und polymerisiert wird und die entstandenen Polymerisatperlen von der organischen Phase abgetrennt werden, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomerengemisch aus