DE2215539C2

DE2215539C2 - Neue wasserunlösliche Enzym-, insbesondere Penicillinacylase-oder Enzyminhibitor-Präparate

Info

Publication number: DE2215539C2
Application number: DE2215539A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dr. 5074 Odenthal Bartl; Bruno Dr. 5090 Leverkusen Bömer; Fritz Dr. Hüper; Erich Dr. Rauenbusch; Günter Dr. 5600 Wuppertal Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-30
Filing date: 1972-03-30
Publication date: 1984-08-02
Also published as: AT324998B; ZA732180B; TR17150A; HK38376A; DK137800B; IE37475B1; PL91817B1; CA1036746A; IE37475L; IT1003075B; SE420202B; IL41885A; DD114083A5; US3910825A; BG25230A3; BR7302272D0; DD108099A5; SU537630A3; IL41885A0; CS187373B2

Description

'>> A) 0.1 bis 50 Gew.-

Die Erfindung ist durch die Patentansprüche I und 4 bis 6 definiert. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen des erflndungsgemiißen Präparats.

7,/J-nionooleflnisch ungesättigten Dicarbonsäureanhyclridcn mit 4 bis S> Kohlenstoffatomen und

B) 99,9 bis 50 Gew.-* Di- und/oder Poly(Meth)Acrylaten von Di- und/oder PoIyolen

besteht, wobei

die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate Schüttvolumina von 1,5 bis 30 ml/g und spezifische Oberflächen von 0,1 bis 500 mVg haben und der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen bei 0,02 bis 10 mÄquiv/g liegt, und

die durch Suspensionspolymerisation erhaltenen Copolymerisate einen· Durchmesser von 0,03 bis 1 mm und Schüttvolumina von 1,4 bis 8 ml/g besitzen und ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt 0,02 bis 10 mÄquiv/g beträgt.

Die erfindungsgerr.äßen Prcteinprüparate hergestellt werden, indem man - bezogen auf Gesamtmonomere -

A 0,1 bis 70 Gew.-*, vorzugsweise 2 bis 35 Gew.-56 ogj-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen und

B 99,0 bis 30 Gew.-*, vorzugsweise 98 bis 65 Gew.-% Di- und/oder PoIy-(Meth)-Acrylate von Di- und/oder Polyolen

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20 bis 200° C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert, und die so erhaltenen Copolymerisate mit Enzym-, insbesondere Penicillinacylase- oder Enzyminhibitor-Lösungen unter Bildung der erfindungsgemäßen Präparate umsetzt.

Über die Darstellung der als Ausgangsprodukte für die Synthese der erfindungsgemäßen Präparate benötigten Copolymerisate ist folgendes zu sagen.

Als «,/!-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen, die für die Herstellung der Copolymerisate benötigt werden, selen namentlich genannt: Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, Insbesondere Maleinsäureanhydrid. Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder zungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff-aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Alkylenoxlden zur Herstellung der Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate zu verwenden.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Di- und PoIy-(Meth)Äcrylate von Dl- und Polyolen werden nach bekannten Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Dl- und/oder Polyole mit (MetrOAcrylsäureciilorid in Gegenwart von in etwa äqulmolaren Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 20° C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vgl. DE-OS 19 07 666). Als die Dl- bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, kommen z. B. in Frage: Äthylenglykol, Propandiol-1,2, Propandiol-1,3, Butandiole insbesondere Butandiol-1,4, Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pentaeiythrit, Sorbit, Saccharose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxiden, wie vorstehend angegeben. Auch PoIybis-chlürrneihyl-GxacyclGbütän oder Poiystyraloxid sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.
Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 bis 20 Molen AIkyler,oxid mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet. Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von

Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykoien mit Molgewichten bis 1000 oder deren Gemische.

Falls gewünscht, könnten neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder PoIy-(Meth)Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylenbisacrylamid, Trlacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0,01 bis 30 Gcw.-% ucr Monomerenmischung zugesetzt werden.

Aufgrund der möglichen Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischungen können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit und Anhydridgruppengehalt der erfindungsgemäßen Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden.

Die Polymerisation kann τ B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen Inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe sowie halogensubstituierte Kohlenwasser-

Polymethacrylate bzw. Di- und/oder Polyacrylate von 55 stoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester. Di- unoVoder Polyolen leiten sich von Verbindungen Beispielhaft seien genannt: Heptan, Octan. Isooctan,

mindestens 2

mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungspiodukten mit Alkylenoxiden mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoff- «> atomen oder Gemischen dieser Alkylenoxide ab, wobei an 1 MoI der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1 bis 10\ bevorzugt I bis 20 Alkylenoxldbaustelne anpolymerlsiert sind. Beispielhaft seien Alkylenoxide, Äthylenoxid, Propylenoxld, Butylenoxid, Trimethylen- ^ oxid, Tetramethylenoxid, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxld, vorzugsweise Äthylenoxid und Propylenoxid genannt. Es ist auch durchaus möglich, Umset-Benzlnfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200° C, Cyclohexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzol, Äthylacetat, Butylacetat.

Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 60° C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmlschung verwendet man etwa 2 bis 50, bevorzugt 5 bis 20 Gew.-Teile, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinflußt.

In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der jbengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugesehen werden. Außerdem kann die Monomerenmiächung zusammen mit einem geeigneten Initiator als Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lesungsmittelmenge eingespeist werden, so daß während der Polymerisation eine gleichmäßige, geringe Monomerkonzenlratitin aufrechterhalten wird. Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Folymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßter Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.

Die Copolymerisate können auch durch Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Die 'rebräuchlichste Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, ggf. unter Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in Wasser suspendiert werden, läßt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da das Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase übergeht und nur in geringer Menge in das Polymere eingebaut wird. Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmäßig in organischem Medium durchgeführt. Die Monomeren und der Initiator werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z. B. Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängenden Phase verteilt. Als zusammenhängende Phase eignen sich besondere Paraffinkohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan, sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder 4-Parafflnöl. Das Volumenverhältnis, zusammenhängende Phase: Monomerphase beträgt 1:1 bis 10: 1, vorzugsweise 2 : 1 bis 5 : 1.

Zur Stabilisierung der Suspension können beispielsweise Glycerin-mono- und dluleate. sowie Gemische dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- und trioleate bzw. -stearate. Polyäthylenglykolmonoäther mit Stearyl- bzw. Laurylalkohol oder Nonylphenol, Polyäthylenglykolmonoester mit Ölsäure, Stearinsäure und anderen Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen, sowie das Na-SaIz des Sulfobernsteinsäuredioctylesters verwendet werden. Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0.1 bis 10%. bezogen auf die Monomerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgröße der Suspensionspolymerisaie kann außer durch Vergrößerung der Rührgeschwindigkeit durch Zugabe von 0,1 bis 2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren oberflächenaktiven Substanz, z. B. eines Alkylsulfonates, verringert werden.

Die Polymerisation wird durch radikalische Initiato- M) ren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z. B. Azoverbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindung Ist das Azoisobutteisäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxide wie Dibenzoylperoxid oder Percarbonate wie Diisopropyl- und Dlcyclohexylpercarbonat In Frage, es können jedoch auch Diacylperoxide. Hydroperoxide und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwendet werden.

Die Initiatoren werden in Mengen von 0,01 bis 1Ov vorzugsweise 0,1 bis 3%, bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt.

Die Polymerisation wird bei Temperaturen \.'on etwa 20 bis 200° C, vorzugsweise 50 bis 100° C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Außerdem ist es in der Regel vorteilhaft, in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.

Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schüttvolumina von 1,5 bis 30 ml/g, vorzugsweise 2 bis 20 ml/g, und spezifischen Oberflächen von 0.1 bis 500 m'/g, bevorzugt 1 bis 400 mVg. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen titnmetrisch bestimmte Gehalt a:^ Carboxylgruppen liegt bei 0,02 bis 10 mÄquiv/g. vorzugsweise bei 0,4 bis 4 mÄquiv/g.

Die Suspensionspolymerisate sind v.siße oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmäßig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03 bis 1 mm, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 mm, und Schüttvolumina von etwa 1.4 bis S ml/g, vorzugsweise 1.4 bis 5 ml/g, besitzen. Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehali beträgt 0,02 bis 10 mÄquiv/g, vorzugsweise 0,4 bis 4 m/Äquiv/g.

Die Copolymerisate enthalten die copolymerisierten Einheiten statistisch verteilt. Aufgrund ihrer hohen Vernetzungsdichte sied die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.

Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1.1-bis 2,5fache ihres Schüttvolumens quellen. Sie eignen sich vorzüglich als Trägerharze zur Fixierung von Enzyrnen, insbesondere Penicillinacylase. und Enzyminhibitoren.

Die Trägerharze werden bei Temperaturen zwischen 0 und 30" C direkt in die wäßrige Lösung des zu bindenden Stoffes eingetragen, wobei der pH-Wer\ konstant zu halten ist.

Werden die genannten Stoffe an die Copolymerisate gebunden, so arbeitet man zweckmäßigerweise mit einem pH-Staten in einem pH-Bereich von 3 bis 10, vorzugsweise von pH 5,5 bis pH 9,0. Wird Penicillinacylase eingesetzt, so arbeitet man zweckmäßigerweise zwischen pH 5,7 und pH 6,8. Während der Binujngsre^r.ktion muß zur Konstanthaltung des pH-Bereiches ständig eine Base zugesetzt werden. Dabei kommen anorganische Basen (beispielsweise Alkalilaügen) und organische Basen (beispielsweise tertiäre organische Amine) ir. Frage.

Im Gegensatz zu den Erfahrungen der Literatur mit anderen Hainen, nach denen die Umsetzung in gepufferten Lösungen durchgeführt wird, waren die Ausbeuten an gebundenem Enzym mit den oben beschriebenen Harzen um so besser, je niedriger der Salzgehalt der Lösungen war.

Das Gewichtsverhältnis von gebundener Substanz zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem spateren Verwendungszweck angepaßt werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Enzym, insbesondere Penicillinacylase. oder Enzyminhibitor zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymeren!

Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des genannten Proteins abhängig. Bei zahlreichen Enzymen ist es zweckmäßig, Stabilisatoren der Enzymlösung zuzusetzen.

Als solche kommen Polyäthylenglykole oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung der Denaturierung an Oberflächen In Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen.

Die notwendige Reaktionszeit Ist abhängig von der Art des Polymeren. Im Normalfall ist die Reaktion nach 20 h bei Raumtemperatur abgeschlossen. Bei 4° C läuft die Reaktion besser noch etwas länger. Bei präparativen Ansätzen wird der Ansatz nicht früher als 2 Stunden nach Beendigung der Alkalizugabe durch den pH-Staten abgebrochen. Das Polymere mit dem gebundenen Protein wird hierauf abgesaugt oder abzentrlfugiert und der Rückstand mit Salzlösungen hoher Ionenstärke, beispielsweise i M-Natriumchioridiösung, und anschließend mit einem Puffer gewaschen, in dem das Enzym stabil ist. Schließlich wird mit einer Lösung hoher Salzkonzentration gewaschen, wobei sich lonogen gebundenes Protein vom Träger löst.

Zur Beurteilung des Erfolges der Proteinbindung wurde bei Enzymen die enzymatische Aktivität sowohl im Polymeren als auch in der Restlösung und in den Waschwassern bestimmt. Bei Proteinen ohne spezifische Wirkung wurde der Stickstoffgehalt im Polymeren nach Kjeldahl bestimmt. Die Ausbeuten bei der Proteinbindung liegen zwischen 10 und über 90%. Betrachtet man die enzymatische Aktivität, so ist es in einigen Fällen vorteilhaft, keinen zu großen Überschuß an Polymermaterial zu verwenden, da sonst zwar das Protein vollständig gebunden wird, die Aktivität jedoch darunter leidet.

An Träger gebundene Enzyme, insbesondere PenicilliriSCyiSSC, IiHu L-nZyrniriuiuiiurcn Siiiu Vüfi jäfüDCf wissenschaftlicher und technischer Bedeutung. Die in den meisten Fällen teuren und instabilen Enzyme werden durch die Bindung an das Harz wesentlich stabilisiert. Außerdem gestattet die leichte und vollständige Rückgewinnung des Enzymharzes eine vielfache Anwendung über lange Zeitspannen.

Folgende Substanzen können beispielsweise an die Copolymerisate fixiert werden:

Enzyme: Hydrolasen wie Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chymotrypsin, Papain. Elastase; Amidasen, beispielsweise Asparaginase, Glutaminase, Urease; Acyltransferasen, beispielsweise Penicillinacylase; Lyasen, beispielsweise Hyaluronidase.

Kallikrein-Inhibitor oder Insulin. Die erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme und Enzyminhibitoren werden im allgemeinen aus Bakterien, Pilzen, Aktinomyceten oder aus tierischen Material gewonnen.

Einige Beispiele für technisch wichtige Umsetzungen mit gebundenen Enzymen sind der hydrolytische Abbau der Stärke durch covalent gebundene Amylase. die Klärung von Fruchtsäften u. a. druch gebundene Pektinase, die Herstellung enzymatisch abgebauter Eiweißhydrolysate, die Hydrolyse von Penicillinen zur 6-Aminopenicillansäure. Außerdem wurden auch gebundene Enzyme zur Isolierung von Inhibitoren durch Affinitätschromatographie und umgekehrt gebundene Inhibitoren zur Isolierung von Enzymen verwendet. Andere Anwendungen liegen im Gebiet der Medizin.

Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck bestimmt.

Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind In der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z. B. die Zusammenfassungen in Chim. Eng. News v. 15. 2. 1971, Seite 86, und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83(1971).

Ein wichtiges Beispiel für die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinpräparate stellt die Spaltung von Penicillinen mit Hilfe von Penicillinacylase dar, welche an die Copolymerisate gebunden Ist.

Zur Herstellung von 6-Amlnopenlcillansäure (6APS) können Penicilline mit Hilfe von Acylasen aus Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien, insbesondere E. coli, Erwlnla oder Actlnomyceten wie Streptomyces. Mlcromonospora, Nocardia und Pilzen wie Fusarium und Hefen gespalten werden.

Gemäß dem Verfahren der DE-PS 11 11 778 zur Herstellung von 6-APS wird eine Penicillin G-Lösung mit einem Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penlcliilnacyiase (E. C. 3.5.UO enthält. Durch die Einwirkung des Enzyms wird die seltenständige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne daß der /?-Lactamring geöffnet wird.

Die Verwendung von Suspensionen von Mikroorganismen hat folgende Nachteile:

a. Die Suspension von Mikroorganismen enthält außer der Intracellulären Penicillinacylase weitere Proteiiis und Enzyme sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b. Die Suspension von Mikroorganismen kann wirtschaftlich zweckmäßig nur einmal eingesetzt werden.

e. Die Suspension von Mikroorganismen criihäii Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin und/oder 6-APS durch Öffnung des /?-Lactamringes inaktivieren.

d. Die Suspension enthält nur kleine Mengen an Penicillinacylase. Der Einsatz von mehr Enzymmalerial, z. B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Ausbeuten bei geringerem Gehalt von Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich.

e. Die Betriebsausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden Penlclllinacylase-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen ab.

f. Die vollständige Abtrennung suspendierter Mik iorganismen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansäize einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (Britische Patente 1169 696; 10 78 847; II 14 311).

Alle genannten Nachteile werden vermieden, wenn man anstelle einer Suspension von Mikroorganismen eine Penicillinacylase verwendet, die durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen Träger erhalten wird.

Versuche, 6-APS durch enzymatische. Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Peniciüinacylase herzustellen, sind zwar bekannt (siehe dazu DOS 19 17 057, DOS 19 07 365), konnten jedoch nicht in einen technischen Maßstab übergeführt werden. Die

Il

Gründe dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten T^rägermaterials. das /u hohem Abrieb führt, zum anderen konnten bei mäßigen Verlahrensau'beutcn nur geringe spezifische Aktivitäten ;'.n trügergebundener Penicillinacylase erreicht > werden.

Auch das In der Deutschen Patentanmeldung P^' 57 970.4 verwendete unlösliche Enzym, das durch kovalente Bindung der Penicillinacylase an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylcnbisacrylamid in und Maleinsäureanhydrid gewonnen «c.rde, hat für die Spaltung von Penicillin im technischen Maßstab Nachteile, da es slark quillt und mechanisch nicht stabil ist. Diese Nachteile beeinträchtigen die mehrmalige Wiederverwendung des so hergestellten Harzes im tech- is nischen Maßstab.

Es wurde nun gefunden, daß die genannten Nachteile vermieden werden, wenn erfindungsgemäß eine an einen wasserunlöslichen Träger ^phurulene Penicillinacylase zur Spaltung von Penicillinen verwendet wird.

Die Spaltung von Penicillinen mit erfindungsgemäßer trägergebundener Penicillinacylase läßt sich einfach und auch im großtechnischen Maßstab durchführen. Das trägergebundene unlösliche Enzym wird in einer Lösung mit 75 000 bis 150000 Il.Vml Penicillin. z.B. Penicillin G oder Penicillin V suspendiert. Die enzymatlsche Spaltung wird bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 vornehmlich im Bereich des pH-Optimums der jeweils gebundenen Penicillinacylase z. B. bei pH 7,8 durchgeführt. Zur Neutralisation des .'-gespaltenen Acylrestes z.B. der Phenylessigsäure oder der Phenoxyessigsäure verwendet man wäßrige Alkalilösungen z. B. Kali- oder Natronlauge oder organische Amine, vorzugsweise Triäthylamln. Aus dem Verbrauch der Base ist die Reaktionsgeschwindigkeit und die Beendigung der Spaltung zu ersehen. Die Penicillinacylase katalysiert sowohl die Spaltung von Penicillin zur 6-APS als auch die Resynthese der Penicilline aus den Spaltprodukten. Das Gleichgewicht ist abhängig vom pH-Wert des Mediums.

Bei kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes Penicillin. Dies kann zur Umacylierung von Penicillinen in Gegenwart anderer Acylreste oder zur Synthese von Penicillinen aus 6-APS ausgenutzt werden.

Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 38' C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z.B. bei 25° C durchgeführt, muß doppelt soviel Enzym wie bei 38° C eingesetzt werden, wenn gleiche so Reaktionszeiten erzielt werden sollen.

Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Außerdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Pencillinacylase zur Konzentration des Penicillins. Ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100 000 IU/ml Penicillin G-Kalium ist nach 10 Stunden bei pH 7,8 und 38° C vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 10⁵ Einheiten Penicillin G eingesetzt werden (eine Enzymeinheit (E) ist definiert als die Aktivität, die 1 μ Mol Penicillin G pro Minute bei 37° C zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert). Der Anteil an trokkenem Enzymharz beträgt nur 0,5 bis 1% des Reaktionsgemisches. Werden pro 10^s IU Penicillin G, 5 Einheiten Penicillinacylase eingesetzt, so dauert die

vollständige Spaltung nur zwei Stunden. Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Penicillinacylase, bei Verwendung z. B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundenc Penicillinacylase ist perlförmig. zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spezifisches Gewicht aus. Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachem Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugieren ohne Verlusi durch mechanische Beanspruchung z. B. durch Abrieb. Somit werden In Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können. Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration, da durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen. Weitere Vorteile bietet das Harz im Ualch-Prozeß wegen des vergleichsweise hohen spezifischen Gewichts, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so daß nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batsch-Prozeß im Reaktionsgefäß verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.

Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch In kontinuierlichen Verfahren z. B. in Reaktionssäulen, wobei die Perlform die erforderliche, hoch Durchflußgeschwindigkeit erlaubt.

Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach Abtrennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach bekannten Verfahren gewonnen (siehe z. B. DE-PS 1111 778) und bei pH 4,3 kristallisiert. Bei der erfindungsgemäßen Spaltung von Penicillin mit der effindungsgemäß hergestellten trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten als bei Verwendung von E. coli-Schlamm, aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung des Enzymharzes nach der DE-PA P 21 57 970.4. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt wird, 6-APS in einer Ausbeute von ca. 90% d. Th. isoliert. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung. Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei anderen Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymere zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäß hergestellten 6-APS ausgeschlossen.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum. Auch hiernach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.

Beispiel la

80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 1 Benzol gelöst und unter Rühren 4 Stunden auf 60^c C erwärmt. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100 bis 140° C) zu und polymerisiert weitere 5 Stunden bei 70⁰C. Das pulvrige Polymere

wird abgesaugt, einmal in Benzol und dreimal in Petrolather (Kp 30 bis 50° C) aufgeschlämmt und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 94 g

Schüttvolumen: 3,5 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 4,7 ml/g

spez. Oberfläche: 5 rr.Vg

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen:

3,5 mÄquiv/g

Beispiel Ib

1 g des nach Beispiel la hergestellten Trägerharzes wird in 30 ml einer wäßrigen Lösung von 120 U Penlcillinacylase (spez. Aktivität 1 U/mg Protein (Biuret)) suspendiert. Unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 6,3 durch Zugabe von ! N Natronlauge rr.it einem pH-Staten wird die Suspension 20 Stunden bei 25° C gerührt. Anschließend saugt man über eine Glasfritte G3 ab und wäscht das Harz mit je 50 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5, der 1 M-Natriumchlorld enthält und mit dem selben Puffer ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen wird die Aktivität des Harzes nicht mehr verändert.

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung: 132 U

Überstand und Waschwasser: 12 U

Harz nach der Umsetzung: 86 U das sind 6596 der Ausgangsaktivität.

Ausbeute: 97 g

Schüttvolumen: 6,4 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 8,0 ml/g

spez. Oberfläche: 298 mVg

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen:

1,5 mÄquiv/g

Beispiel 2b

6 g des nach Beispiel 2a erhaltenen Trägerharzes wurden analog zu Beispiel Ib mit 590 U Penicillin-Acylase in !65 ml Wasser urngesetzt.

Ergebnis:

Enzymaiische Aktivitäten (NIPAB-Test)

AusKangslösung: 590 U

40

Die enzymatische Akivität der Penicillln-Acylase wurde colorlmetrisch oder titrimetrisch mit 0,002 M-6-Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäure (NIPAB) als Substrat bei pH 7.5 und 25° C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der entstehenden 6-Nitro-3-aminobenzoesäure beträgt E_405n^ = 9090. 1 Einheit (U) entspricht dem Umsatz von 1 μΜοΙ Substrat pro Minute.

Beispiel 2a

Eine Lösung von 90 g Äthylenglykoldimethacrylat, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 11 Benzol wird unter Rühren zunächst bei 60° C polymerisiert. Nach 4 Sunden gibt man 200 ml Benzin (Kp 100 bis 140°) und 1 g Azoisobuttersäurenitril zu und polymerisiert 2 Stunden bei 70° und 2 Stunden bei 80° C weiter. Anschließend saugt man das Polymere ab, wäscht gründlich mit Petroläther (Kp 30 bis 50° C) und trocknet im Vakuum.

45 Überstand und Waschwasser: 26 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 325 U
das sind 60% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 2c

g des nach Beispiel 2a erhaltenen Trägerharzes wurde analog zu Beispiel Ib mit 100 mg Asparaginase umgesetzt.

Enzymatische Aktivitäten (Asparagin-Hydrolyse)

Ausgangslösung: 21 000 U

Überstand nach der Umsetzung: 3360 U

Trägerharz nach der Umsetzung: 3910 U

das sind 19% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 3a

Die Copolymerisation von 90 g Diäthylenglykoldimethacrylat mit 10 g Maleinsäureanhydrid unter den Bedingungen von Beispiel 2a ergibt:

Ausbeute: 96 g

Schüttvolumen: 5,5 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 6,7 ml/g

spez. Oberfläche: 9,2 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen:

1,9 mÄquiv/g

Beispiel 3b

g des nach Beispiel 3a hergestellten Trägerharzes wurden zu einer Lösung von 50 mg unspezifischer Elastase mit einer enzymatischen Aktivität von 139 U in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde 16 Stun- 0£τ\ bsi Raumtemperatur ^werührt wöbe! das "H auf 5 8 konstant gehalten wurde. Nach der Umsetzung wurde das Harz abgesaugt und mit 50 ml 1 N-Natriumchloridlösung in 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 und anschließend mit 50 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,; gewaschen.

Ergebnis:

Ausgangslösung: 139 E
Überstand und Waschlösungen: 51 E
am Trägerharz gebunden: 15 E
das sind 1196 der Ausgangsaktivität.

Hierbei wurde die enzymatische Aktivität titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11,9 mg/ml) bei pH 8,0 und 25° C bestimmt. 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1 μΜοΙ Kalilauge pro Minute.

Beispiel 3c

g des nach Beispiel 3a hergestellten Trägerharzes wurde zu einer Lösung von 50 mg Urease kristallisiert (Merck) in 32 ml Wasser gegeben. Der Ansatz wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt, wobei das pH auf 6,3 konstant gehalten wurde. Die Aufarbeitung erfolgte wie in Beispiel 2d angegeben.

Ergebnis:
Ausgangslösung: 5013 U

Überstand und Waschlösungen: 1397 U
am Trägerharz gebunden: 1405 U
das sind 2896 der Ausgangsaktivität.

Die enzymatische Aktivität der Urease wurde tltrlmetrlsch mit 0,17 M-Harnstoff als Substrat, 25°C und pH 6,1 bestimmt. I Einheit (U) entspricht der Hnzymmenge, die 1 μΜοΙ Harnstoff pro Minute spaltet.

Beispiel 3d

0.4 g des nach Beispiel 3a erhaltenen Trägerharzes wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 Stunden bei einem konstanten pH-Wert von 6,3 bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Harz wird abgesaugt und mit einer Lösung von 1 N-Natrlumchlorld In 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5 und anschließend mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen des Harzes im Vakuu\h bsi 100⁰C über Phosphorpentoxid wurden is 0,47 g erhalten. Die Stickstoffbestimmung nach Dumas ergab einen Wert von 1,1% N der einem Gehalt von 8,04% oder 37,8 mg Glutathion entspricht. Das sind 94% der eingesetzten Menge an Glutathion.

20

Beispiel 4a

80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Porofor N werden in 1 I Benzol gelöst und unter langsamem Rühren 16 Stunden bei 80° C polymerisiert. Das Polymere wird analog zu Beispiel la aufgearbeitet.

Ausbeute: 95 g

Schüttvolumen: 2,5 ml/g

Quellvolumen: 3,0 ml/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen:

2,6 mÄquiv/g

Beispiel 4b

Die Umsetzung von 1 g des nach Beispiel 4a hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase analog zu Beispiel Ib liefert folgende Ergebnisse:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung: 123 U
Überstand und Waschlösungen: 13 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 79 U
das sind 64% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 4c

3(1

40

45

0,4 g des nach Beispiel 4a hergestellten Trägerharzes wurden zu einer Lösung von 40 mg Trypsin in 32 ml 0,01 M-Calciumchloridlösung gegeben und 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 6,3 gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel Ib gewaschen.

55

Enzymatische Aktivität

in der Ausgangslösung: 44 U

in Überstand und Waschlösungen: 5,2 U

am Harz gebunden: 8,3 U

das sind 19% der Ausgangsaktivität.

Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z, Physiol. Chem. 329 (1962) 278, mit Benzoyl-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 μΜοΙ Substrat bei 25° c und pH 7,8.

Beispiel 4d

1 g des nach Beispiel 4a hergestellten Harzes wurden zu einer Lösung von 50 mg unspezifischer Elastase in 32 ml Wasser gegeben. Die Suspension wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur unter Konstanthaltung des pH-Wertes auf 5,8 gerührt. Die Aufarbeitung und titrimetrische Bestimmung der Enzymaktivitäten mit Casein als Substrat wurde wie In Beispiel 3b angegeben durchgeführt.

Enzymatische Aktivität

In der Ausgangslösung: 139 U

in Überstand und Waschlösungen: 32 U

am Harz gebunden: 36 U

das sind 26% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 5a

In einem Rührgefäß werden 1 1 Benzin (Kp 100 bis 140° C) und I g Azoisobuttersäurenitril 1 Stunde auf 90° erwürmt. Dann wird bei 80° C eine Lösung von 95 g Äthylenglykoldiniethacrylat, 5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril innerhalb 3 Stunden zugetropft und weitere 2 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt. Das Polymere wird abgesaugt, mehrmals mit Benzol und Petroläther (Kp 30 bis 50^c C) gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 96 g

Schüttvolumen: 14 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 18,2 ml/g

spez. Oberfläche: 70 mVg

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydriclgruppen:

0,5 mÄquiv/g

Beispiel 5b

0,4 g des nach Beispiel 5a hergestellten Harzes wurden mit 40 mg Glutathion in 32 ml Wasser 16 Stunden unter Konstanthaltung von pH 6,3 bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde abgesaugt und nach Beispiel 3d gewaschen und getrocknet. 2s wurden 0,46 g Harz erhalten, das 0,9% N nach Dumas enthielt. Dem entspricht ein Gehalt von 6,6% oder 30,4 mg Glutathion, das sind 76% der eingesetzten Menge.

Beispiel 6a

Eine Lösung von 62,5 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 37,5 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 150 ml Butylacetat und 11 Benzin (Kp 100 bis 140⁰C) wird unter Rühren 2 Stunden bei 70=C, 2 Stunden bei 75° C und 1,5 Stunden bei 90° C polymerisiert. Das Polymere wird abgesaugt, 24 Stunden im Soxhlet-Extraktor mit Benzol extrahiert und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 77 g

Schüttvolumen: 7,3 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 8,2 ml/g

spez. Oberfläche: 19,4 m^!/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydriclgruppen:

4,0 mÄquiv/g.

Beispiel 6b

Die Umsetzung von 1 g des nach Beispiel 6a hergestellten Trägerharzes .nit Penicillin-Acylase analog zu Beispiel Ib lieferte folgende Ergebnisse:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung: 107 U
Überstand und Waschlösungen: 28 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 55 U
das sind 51% der Ausgangsaktivität.

Beispiel 7a

Eine Lösung von 90 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat. 10 g Maleinsäureanhydrid und 1,0 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1000 ml Benzin (Kp 100 bis 140= C), in dem 5 g eines Gemisches von Giycsrin-rnciio- und -dicleat gelöst wurden, suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird bis zur Bildung fester Perlen (ca. 2 Stunden) bei 60^c C und anschließend 20 Stunden bei 65^C C polymerisiert. Das Polymerisat wird abfiltriert, dreimd in Benzol und dreimal in Petroläther (Kp 30 bis 50° C) aufgeschlämmt und im Vakuum bei 50^c C getrocknet.

Ausbeute: 94 g

mittlerer Teilchendurchmesser: ~ 0.35 mm

Schüttvolumen: 2.8 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 3,1 ml/g

spez. Oberfläche: 3,4 m'Vg

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,5 mÄquiv/g.

Beispiel 7b

Die Umsetzung von 1 g des nach Beispiel 7a hergestellten Trägerharzes mit Penicillin-Acylase analog zu Beispiel Ib lieferte folgende Ergebnisse:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)
Ausgangslösung: 107 U
Überstand und Waschlösungen: 51 U
Trägerharz nach der Umsetzung: 19 U

das sind 18% der Ausgangsaktivität.

Beispiele für die Penicillinspaltung

Beispiel 8

79 g feuchte trägergebundene PenicilHuacylase mit einer Aktivität von 687 U (NIPAB-Test), die durch

ίο Bindung von Penicillinacylase an ein Copoiymerisat aus Äthylenglykoldimethacrylat und Maleinsäureanhydrid nach Beispiel 2 dargestellt worden ist, werden mit 129 g Penicillin G-Kalium in 2000 ml Wasser 9 Stunden bei 38° C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird hierbei durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7,8 gehalten. Die Aufnahme an Triäthylamin kommt mit Beendigung der Reaktion zum Stillstand. Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert oder abgesaugt, mit jeweils 200 ml

-m Wiccar „„Η Π ~> X(.Dh«c«'nni„,,fTor „U C ς „..„U..„...„

A.V "tu*».a WIIX* W," I'll llu3yi»U|JUIIVI [ill V,~T 1 f Uh. I Ig V T» U~

schen; sie ist damit für einen neuen Absatz bereit. Das Filtrat, einschließlich der Waschlösungen wird im Vakuum auf 300 ml eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrisehen Punkt bei pH 4,3 in Gegenwart von 200 ml Methylisobutylketon ausgefällt. Nach einer Stunde wird abgesaugt, mit 200 ml Wasser und dann mit 200 ml Aceton nachgewaschen. Die 6-APS wird im Vakuum bei 40⁰C getrocknet; Schmelzpunkt 208^cC. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 67,8 g, das sind 90,5% der Theorie. Die Reinheit beträgt 98%.

Beispiel 9

60 g feuchte, trägergebundene Penicillinacylase mit einer Aktivität von 673 U (NIPAB-Test), die durch Bindung von Penicillinacylase an ein Copoiymerisat aus Tetraäthylenglykoidimethacrylat und Maleinsäureanhydrid gemäß Beispiel 1 hergestellt worden ist, werden mit 129 g Penicillin G-Kalium in 2000 ml Wasser 9 Stunden bei 38° C gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von Triäthylamin auf 7,8 konstant gehalten. Die weitere Aufarbeitung wird analog zu Beispiel 1 durchgeführt. Die Ausbeute an 6-APS beträgt 65,3 g, das sind 87% der Theorie.

Claims

Patentansprüche:

1. Wasserunlösliches Enzym-, insbesondere Penicillinacylase- oder Enzyminhibitor-Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt, welches an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Einheiten von

10

A) 0,1 bis 50 Gew.-% agS-monoolefinisch ungesät

tigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4 bis 9 Kohlenstoffatomen und

B) 99,9 bis 50 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)-

Acrylaten von Di- und/oder Polyolen

besteht, wobei

20

C) die durch Fällungspolymerisation erhalienen Copolymerisate Schüttvolumina von 1,5 bis 30 ml/g und spezifische Oberflächen von 0,1 bis 500 mVg haben und der nach Verseifung der Anhydridgruppen titrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen bei 0,02 bis 10 mÄquiv/g liegt, und

D) die durch Suspensionspolymerisation erhaltenen Copolymerisate einen Durchmesser von 0.03 bis 1 mm und Schüttvolumina von 1,4 bis 8 ml/g besitzen und ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxylgruppengehalt 0,02 bis 10 mÄquiv/g beträgt.

2. Wasserunlösliches Präparat gemäß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisates aus Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid und die copolymerisierten Einheilen der Komponente B des Copolymerisates aus Di(Meth)Acrylaten von Diolen mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1 bis 20 Molen Alkylenoxld mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bzw. aus Trimethylolpropantrimethacrylat bestehen.

3. Wasserunlösliches Präparat gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und die der Komponente B aus Dimethacrylaten von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Telraäthylenglykol oder höheren Polyäthylenglykolen mit Molgewichten bis 1000 bestehen.

4. Verwendung eines wasserunlöslichen Präparates gemäß Anspruch 3 zur Durchführung einer durch Enzyme katalysierbaren Reaktion.

5. Verwendung eines wasserunlöslichen Präparates gemäß Anspruch 3 zur hydrolytischen Spaltung von Substraten.

6. Verwendung von wasserunlöslicher Penicillin- ^W) acylase gemäß Anspruch 3 zur Spaltung von Penicillinen unter Bildung von 6-Amlnopenlcillansiiure. · Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat In den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z. B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.

Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymere des Maleinsäureanhydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wäßrigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so daß vor oder während der Umsetzung zweckmäßig ein zusätzlicher Vernetzer z. B. ein Diamin zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtriebar und besitzen lösliche i*n*.eile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt [vgl. E. Katchalski, Biochemistry 3, (1964), Seiten 1905 bis 1919].

Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mäßige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vgl. DE-OS 19 08 290).

Außerdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt. Aufgrund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen - in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid -, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden kann (vgl. DE-OS 20 08 996).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Umsetzungsprodukte von Enzymen, Insbesondere Penicillinacylase, oder Enzyminhibitoren mit neuen stark vernetzten, in Wasser quellfähigen Copolymerisaten mit stark variierbarem Gehalt an cyclischen Dlcarbonsäureanhydrldgruppen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden. Die neuen Umsetzungsprodukte von Enzymen. insbesondere Penicillinacylase, oder Enzyminhibitoren mit den neuen Copolymerisaten soilten die Nachteile der bisher bekannten Proteinpräparate nicht bzw. nur in geringerem Maße .ufweisen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß nach den Methoden der Perl- oder Fällungspolymerisation Anhydride ^-monoolefinisch ungesättigter Dicarbonsäuren und Dl-, oder Poly-(Melh)Acrylate von Di- oder Polyolen zu statistisch aufgebauten Copolymerisaten polymerisiert und diese erfindungsgemäßen Copolymerisate mit wäßrigen Proteinlösungen zu Proteinpräparaten umgesetzt wurden.

Die Erfindung betrifft somit wasserunlösliches Enzym-, insbesondere Penicillinacylase- oder Enzyminhibitor-Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt, welches an ein vernetztes Copolymerisat gebunden ist. das aus copolymerlslerien Einheiten von