PL91817B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych nierozpuszczalnych w wodzie preparatów proteinowych, przy czym w preparatach tych bial¬ ko osadzone jest na nowych, usieciowanych, zdol¬ nych do pecznienia kopolimerach.Jako bialko mozna na przyklad stosowac enzymy i nowe nierozpuszczalne w wodzie preparaty en¬ zymów i stosowac je do prowadzenia reakcji ka¬ talizowanych przez enzymy.Kowalencyjne wiazanie substancji z nierozpusz¬ czalnymi polimerami jako nosnikami zyskuje w ostatnich latach na wzrastajacym znaczeniu. Szcze¬ gólne zalety wykazuje wiazanie katalitycznie czyn¬ nych zwiazków, na przyklad enzymów, poniewaz mozna je w takiej postaci po zakonczeniu reakcji latwo oddzielic i wielokrotnie ponownie stosowac.Proponowano juz wielokrotnie stosowanie jako nosnika z grupami reaktywnymi kopolimerów z bezwodnika kwasu maleinowego i zwiazków winy¬ lowych. Kopolimery bezwodnika kwasu maleino¬ wego z etylenem i zwiazkami monowinylowymi staja sie jednak w czasie reakcji z wodnymi roz¬ tworami enzymów mniej lub bardziej rozpuszczal¬ nie w wodzie tak, ze celowe jest dodanie przed lub w czasie reakcji dodatkowej substancji sieciujacej, na przyklad dwuaminy. Tak wytworzone preparaty enzymów sacza sie wzglednie trudno i posiadaja rozpuszczalne skladniki, co prowadzi do strat zwia¬ zanego enzymu (E. Katchalski, Biochemistry 3, (1964), strony 1905—1919).Opisano ponadto kopolimery z akryloamidij, i kwasu maleinowego* które przeprowadza sie dro¬ ga dodatkowego ogrzewania w-postac bezwodniko- wa. Produkty te sa slabo usieciowane, pecznieja w wodzie znacznie i posiadaja jedynie mierna trwa¬ losc mechaniczna, co prowadzi do strat przez scie¬ ranie w czasie stosowania tych zywic (opis paten¬ towy RFN DOS nr 1 908 290).Stosowano równiez jako nosniki silnie usiecio¬ wane polimery, wytwarzane droga kopolimeryzacji bezwodnika kwasu maleinowego z eterami dwu- winylowymi. Wskutek przemiennego sposobu kopo¬ limeryzacji monomerów polimery te zawieraja znaczna ilosc grup bezwodnikowych, w podanych przykladach kazdorazowo powyzej 50% wagowych bezwodnika kwasu maleinowego, uwarunkowana ciezarem czasteczkowym monomerów eterów winy¬ lowych i stad tez jedynie we wzglednie waskich granicach daja sie dostosowac do kazdorazowego zastosowania (opis patentowy RFN DOS nr 2 Ó08 996).Celem wynalazku jest opracowanie nowych pro¬ duktów reakcji bialek i peptydów z nowymi, silnie usieciowanymi, zdolnymi do pecznienia w wodzie kopolimerami o dajacej sie zmieniac w szerokim zakresie zawartosci cyklicznych grup bezwodników kwasów dwukarboksylowych, nie wykazujacych wad znanych dotychczas preparatów bialka lub tez wykazujacych je w nieznacznym jedynie stopniu. 9181791817 Cel ten osiagnieto, stosujac sposób wedlug wy¬ nalazku.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania nieroz¬ puszczalnych w wodzie preparatów proteinowych polega na tym, ze usieciowany kopolimer, sklada¬ jacy sie z kopolimeryzowanych jednostek A 0,1 — 50% wagowych, zwlaszcza 2—35% wagowych bez¬ wodników a,/?-omonoolefinowych nienasyconych kwasów dwukarboksylowych o 4—9 atomach weg¬ la i B) 99,9—50% wagowych, zwlaszcza 98—30% wagowych, dwu- i/lub poli-(me*t)akrylanów dwu- i/lub polioli, metoda polimeryzacji straceniowej lub perelkowej w rozpuszczalnikach, lub miesza¬ ninach' rozpuszczalników obojetnych w stosunku do grup bezwodnikowych, w temperaturze 20 — 200°C, w obecnosci zwiazków, tworzacych rodniki i o objetosci nasypowej = 2—20 ml/g, powierzchni wlasciwej == l—400 m2/g i o zawartosci grup kar- boksylowych p0 zmydleniu grup bezwodnikowych = 0,02—10,.miligramorównowazników/g, poddaje sie reakcji z rotworami bialek z wytworzeniem pre¬ paratów proteinowych.Jako bezwodniki a,/?-monoolefinowych nienasyco¬ nych kwasów dwukarboksylowych o 4—9 atomach wegla, zwlaszcza o 4—5 atomach wegla, stosuje sie bezwodnik kwasu maleinowego, itakonowego lub cytrakonowego, zwlaszcza bezwodnik kwasu ma¬ leinowego. Do kopolimeryzacji mozna stosowac równiez mieszaniny tych bezwodników.Jako dwu- i/lub polimetakrylany lub dwu- i/lub poliakrylany dwu- i/lub polioli stosuje sie pochod¬ ne zwiazków o przynajmniej 2 alkoholowych lub fenylowych, zwlaszcza alkoholowych grupach OH lub ich produkty reakcji z tlenkami alkilenowymi o 2—8 atomach wegla, zwlaszcza o 2—4 atomach wegla, lub z mieszanina tych tlenków alkilenowych, przy czym na 1 mol zwiazku, posiadajacego grupy hydroksylowe stosuje sie 1—104, zwlaszcza 1—20 jednostek tlenku alkilenu. Jako przyklady mozna wymienic nastepujace tlenki alkilenowe: tlenek etylenu, tlenek propylenu, tlenek butylenu, tlenek trójmetylenu, tlenek czterometylenu, bis-chlorome- tylo-oksacyklobutan, tlenek styrenu, zwlaszcza tle¬ nek etylenu i tlenek propylenu. Mozliwe jest rów¬ niez stosowanie produktów reakcji zwiazków, za¬ wierajacych przynajmniej 2 atomy wodoru aktyw¬ ne wedlug Zerewitinowa, nie wywodzace sie od al¬ koholi ani fenoli, z wyzej wymienionymi tlenkami alkilenowymi celem wytworzenia dwu- i/lub poli- -(met)akrylanów.Stosowane wedlug wynalazku dwu- i poli-(met)- akrylany dwu- i polioli wytwarza sie w znany spo¬ sób, na krzyklad droga reakcji dwu- i/lub polioli z chlorkiem kwasu (met)akrylowego w obecnosci mniej wiecej równomolarnych w odniesieniu do chlorku kwasowego ilosci trzeciorzedowych amin, takich jak trójetyloamina, w temperaturze ponizej °C, w obecnosci benzenu (opis patentowy RFN DOS nr. 1 907 666).Jako dwu-lub poliole o przynajmniej 2 atomach wegla zwlaszcza o 2—12 atomach wegla, w gre wchodza glikol etylenowy, propandiol-1,2, propan- diol-1,3, butandiole, zwlaszcza butandiol-1,4, hek- sandiole, dekandiole, gliceryna, trójmetylolopropan, pentaerytryt, sorbit, sacharoza i ich produkty reak¬ cji z tlenkami alkilenowymi, jak to podano wyzej.Równiez odpowiednie do tego celu sa poli-bis- -chlorometylooksacyklobutan lub tlenek polistyre¬ nu. Mozna równiez stosowac mieszaniny dwu-i po¬ lioli.Korzystnie stosuje sie dwuakrylany lub dwume- takrylany dioli o 2—4 atomach wegla i/lub produk¬ ty reakcji 1 mola tych dioli z 1—20 molami tlenku alkilenu o 2—4 atomach wegla lub trójmetakryla- nem trójmetylolopropanu.Korzystnie stosuje sie dwumetakrylany glikolu etylenowego1, glikolu dwuetyleriowego, glikolu trój- etylenowego, glikolu czteroetylenowego lub wyz¬ szych glikoli polialkilenowych o ciezarach czastecz¬ kowych do 1000 lub ich mieszaniny.U5 Poza dwu- i/lub poli-(met)akrylanami mozna równiez dodawac, jesli to pozadane, stosowane zwykle srodki sieciujace o przynajmniej 2 niesprze- zonych wiazaniach podwójnych, takie jak adypi- nian dwuwinyIowy,"' metylenobisakryloamid1, trój- akryloformal lub cyjanuran trójallilowy w ilosciach okolo 0,01—30% wagowych mieszaniny monome¬ rów.Dzieki mozliwosci róznicowania skladu mieszani¬ ny monomerów, mozna w bardzo szerokim zasiegu dopasowywac do kazdorazowego zastosowania hy- drofilowosc, gestosc usieciowania, zdolnosc pecznie¬ nia i zawartosc grup bezwodnikowych stosowanych kopolimerów.Polimeryzacje mozna prowadzic na przyklad w organicznym rozpuszczalniku jako polimeryzacje straceniowa, przy czym polimer zaczyna sie wytra¬ cac wkrótce po rozpoczeciu polimeryzacji. W za¬ sadzie mozna stosowac wszystkie rozpuszczalniki obojetne w stosunku do grup bezwodnikowych. Ko¬ rzystnymi rozpuszczalnikami sa zwlaszcza weglo- wodory alifatyczne, cykloalifatyczne i aromatyczne, jak równiez podstawione chlorowcami weglowodo¬ ry, zwiazki alkiloaromatyczne i estry kwasów kar- boksylowych. Jako przyklady mozna wymienic hep- tan, oktan, izooktan, frakcje benzyny o tempera- 40 turze wrzenia okolo 60—200°C, cykloheksan, ben¬ zen, toluen, ksyleny*, chlorobenzen, dwuchloroben- zeny, octan etylu, octan butylu.Temperatura wrzenia rozpuszczalników powinna wynosic zwlaszcza nie mniej niz 60°C i powinny sie 45 one latwo dawac usuwac z polimeru straceniowego pod zmniejszonym cisnieniem. Na 1 czesc mieszani¬ ny monomerów stosuje sie okolo 2—50, zwlaszcza —20 czesci wagowych rozpuszczalnika. Rodzaj i ilosc rozpuszczalnika wywiera istotny wplyw na 50 wlasciwosci kopolimerów, zwlaszcza na ciezar na¬ sypowy i powierzchnie wlasciwa.W wielu przypadkach korzystne jest stosowanie mieszanin wymienionych wyzej rozpuszczalników luB tez rozpoczynanie polimeryzacji w rozpuszczal- 55 niku polimeru i dodawanie w toku polimeryzacji w sposób ciagly srodka stracajacego polimer. Srociek stracajacy mozna równiez dodawac w okreslonych odstepach czasu w jednej lub kilku porcjach. Po¬ nadto mozna równiez doprowadzac mieszanine mo- 60 nomerów wraz z odpowiednim inicjatorem w roz¬ tworze lub bez rozpuszczalnika do przygotowanej ilosci rozpuszczalnika tak, ze podczas polimeryzacji utrzymuje sie równomierne niskie stezenie mono¬ merów. Przez stosowanie monomerów (met)-akrylo- 65 wych o róznej hydrofilowosci i zmiane warunków91 polimeryzacji mozna wytwarzac w szerokim zakre¬ sie produkty o dostosowanej do kazdorazowego za¬ stosowania zdolnosci pecznienia, gestosci i po¬ wierzchni wlasciwej przy dobrej trwalosci mecha¬ nicznej.Kopolimery do preparatów otrzymywanych we¬ dlug wynalazku mozna wytwarzac równiez droga polimeryzacji w zawiesinie. Najczesciej stosowany sposób polimeryzacji perelkowej, w którym mo¬ nomery, ewentualnie z dodatkiem organicznego roz¬ puszczalnika, zawiesza sie w wodzie, w tym przy¬ padku daje jedynie mierne wyniki, poniewaz bez¬ wodnik bardzo szybko ulega hydrolizie, powstajacy .kwas dwukarboksylowy przewaznie przechodzi do fazy wodnej i jedynie niewielka ilosc zostaje wbu¬ dowana do polimeru. Dlatego tez polimeryzacje w zawiesinie prowadzi sie korzystnie w srodowisku organicznym. Monomery i inicjator rozpuszcza sie w rozpuszczalniku, nie mieszajacym sie z parafina¬ mi i w obojetnym stosunku do grup bezwodniko- wych, na przyklad w acetonitrylu, dwumetylofor- mamidzie, sulfotlenku dwumetylowym lub szescio- metylotrójamidzie kwasu fosforowego 4 i rozdziela w fazie ciaglej za pomoca srodków dyspergujacych.Jako faza ciagla nadaja sie zwlaszcza weglowodo¬ ry parafinowe, takie jak heksan, heptan, oktan i wyzsze homologi, weklowodory cykloalifatyczne, ¦takie jak cykloheksan, jak równiez mieszaniny pa¬ rafin, takie jak frakcje benzyny lub olej parafino¬ wy. Stosunek objetosci fazy ciaglej do fazy mono¬ meru wynosi 1:1 do 10:1, zwlaszcza 2:1 do 5:1.Do stabilizacji zawiesiny mozna stosowac na przyklad mono- i dwuoleiniany gliceryny oraz mieszaniny tych zwiazków, mono-^i trójoleiniany lub -stearyniany sorbitanu, monoetery glikoli po¬ lietylenowych z alkoholem stearylowym lub laury- lowym lub nonylofenolem, monoestry glikoli poli¬ etylenowych z kwasem oleinowym, stearynowym i innymi kwasami tluszczowymi o wiecej niz 10 ato¬ mach wegla, jak równiez sól sodowa estru dwu- oktylowego kwasu sulfobursztynowego. Substancje te stosuje sie korzystnie w ilosci 0,1—10% w prze¬ liczeniu na mieszanine monomerów i rozpuszcza w zasadzie w fazie weglowodorowej. Wielkosc cza¬ stek polimeru zawiesinowego mozna zmniejszyc przez zwiekszenie szybkosci mieszania oraz przez dodadtek 0,1—2% w stosunku do ilosci monomeru, dalszej substancji powierzchniowo czynnej, na przyklad alkilosulfonianu.Polimeryzacje rozpoczyna sie za pomoca rodni¬ kowych inicjatorów. Odpowiednimi inicjatorami sa na przyklad zwiazki azowe lub zwiazki nadtlenowe.Najczesciej stosowanym jako inicjator polimeryza¬ cji zwiazkiem azowym jest nitryl kwasu azoizoma- slowego. Jako zwiazki nadtlenowe w gre wchodza glównie nadtlenki dwuacylowe, takie jak nadtle¬ nek dwubenzoilu lub nadweglany, takie jak nad¬ weglan dwuizopropylowy lub dwucykloheksylowy.Mozna jednak równiez stosowac jako inicjatory nacftlenki dwualkilowe, wodoronadtlenki i uklady redox czynne w organicznych rozpuszczalnikach.Inicjatory dodaje sie w ilosci 0,01.—10%, zwlasz¬ cza 0,1—3%, w stosunku do calkowitej ilosci wago¬ wej mieszaniny monomerów.Polimeryzacje prowadzi sie w temperaturze oko¬ lo 20—200°C, zwlaszcza 50—100°C w zaleznosci od 817 6 szybkosci rozpadu inicjatorów i zwykle w tempera¬ turze ponizej temperatury wrzenia rozpuszczalnika, a przy polimeryzacji perelkowej ponizej tempera¬ tury mieszania sie obydwu faz. Ponadto z reguly korzystne jest prowadzenie polimeryzacji w obojet¬ nej atmosferze, pozbawionej tlenu.Kopolimery, wytworzone droga polimeryzacji straceniowej, sa bezbarwnymi lub slabo zólto za¬ barwionymi proszkami o objetosci nasypowej 1,5—30 ml/g, zwlaszcza 2—20 ml/g i o powierzchni wlasciwej 0,1—500 m2/g, zwlaszcza 1—400 m2/g. Za¬ wartosc grup karboksylowych, oznaczona miarecz¬ kowo po zmydleniu grup bezwodnikowych, wynosi 0,02—10 milirównowazników/g, zwlaszcza 0,4—4 mi- lirównowazników/g.Polimer zawiesinowy tworzy biale lub lekko za¬ barwione perelki, które w niektórych przypadkach moga posiadac ksztalt nieregularny, o srednicy 0,03—1 mm, zwlaszcza 0,05—0,5 mm i objetosci na- sypówej okolo 1,4—8 ml/g, zwlaszcza 1,4—5 ml/g.Zawartosc grup karboksylowych, oznaczona po hy¬ drolizie grup bezwodnikowych, wynosi 0,02—10 mi¬ lirównowazników/g, zwlaszcza 0,4—4 milirównowaz¬ ników/g.Kopolimery w preparatach otrzymywanych, wed¬ lug wynalazku, zawieraja kopolimeryzowane jed¬ nostki w statystycznym rozmieszczeniu. W zwiazku z ich znaczna gestoscia usieciowania kopolimery te sa nierozpuszczalne we wszelkich rozpuszczalni- kach. Stad tez ich ciezary czasteczkowe nie daja sie oznaczyc.Kopolimery moga w wodzie peczniec do 1,1—2,5^ -krotnej wielkosci swojej objetosci nasypowej. Na¬ daja sie dobrze jako zywice dla nosników do osa- dzania substancji, mogacych reagowac z grupami bezwodnikowymi kopolimerów.Nosniki z zywic wprowadza sie w temperaturze 0—30°C bezposrednio do wodnego roztworu wiaza¬ nych substancji,- zwlaszcza do wodnego roztworu 40- bialka, przy czym nalezy utrzymywac stala wartosc . PH.Jezeli z kopolimerami maja zostac zwiazane bial¬ ka, wtedy korzystnie proces prowadzi sie przy u- zyciu pH-statu w zakresie wartosci pH = 3—10, 4g zwlaszcza 5,5—9,0. Jezeli jako bialko stosuje sie pe- nicylinacylaze, wtedy korzystnie proces prowadzi sie przy wartosci pH = 5,7—6,8. W czasie reakcji wiazania trzeba stale dodawac zasade, celem utrzy¬ mania stalej wartosci pH. W gre przy tym wchodza zasady nieorganiczne, na przyklad lugi metali alka¬ licznych i zasady organiczne, na przyklad trzecio¬ rzedowe aminy organiczne.W przeciwienstwie do opisanych w literaturze doswiadczen z innymi zywicami, które poddaje sie reakcji w buforowanych roztworach, wydajnosci zwiazanego enzymu z wyzej opisanymi zywicami byly tym lepsze, im nizsza byla zawartosc soli w roztworach.Stosunek wagowy zwiazanej substancji, na przy¬ klad bialka lub peptydu, do zywicy nosnika moze 60 wahac sie w szerokich granicach i mozna go dosto¬ sowac do pózniejszego zastosowania. Dobre wydaj¬ nosci uzyskuje sie przy stosunku 1 czesci wagowej bialka do 4—10 czesci wagowych nosnika z polime¬ ru. Optymalne stosunki zaleza jednak zarówno od 85 skladu i struktury polimeru, jak równiez od rodza-91817 ju bfalka. W przypadku licznych enzymów korzyst¬ ne jest dodawanie stabilizatora do roztworów enzy¬ mów.Jako stabilizatory w rachube wchodza glikole po¬ lietylenowe lub niejonowe srodki zwilzajace celem zmniejszenia procesu denaturacji na powierzch¬ niach, jak równiez znane reagenty -SH lub jony metali w przypadku szczególnych rodzajów enzy¬ mów.Czas trwania reakcji zalezy od rodzaju polimeru.Zazwyczaj reakcja jest ukonczona po uplywie 20 godzin w temperaturze pokojowej. W temperaturze 4°C korzystniejszy jest nieco dluzszy okres reakcji.W syntezach preparatywnych reakcja zostaje przer¬ wana za pomoca pH-statu nie wczesniej, niz w 2 godziny po zakonczeniu dodawania alkaliów. Na¬ stepnie odsacza sie lub odwirowuje polimer ze zwiazanym bialkiem i pozostalosc przemywa roz¬ tworami soli o wysokiej sile jonowej, na przyklad 1 m roztworem chlorku sodowego, i nastepnie bu¬ forem, w którym enzym jest trwaly. Podczas prze¬ mywania roztworami o wysokim stezeniu soli, bial¬ ko, zwiazane jonotwórczo, zostaje odmyte z nos¬ nika.Celem oceny stopnia zwiazania bialka, oznaczono w przypadku enzymów czynnosc enzymatyczna za¬ równo w polimerach, jak równiez w roztworze resztkowym i w popluczynach.W przypadku bialek bez dzialania specyficznego zawartosc azotu w polimerze oznacza sie metoda Kjeldahla. Wydajnosc wiazania bialka wynosi od % do ponad 90%. Gdy uwzglednia sie czynnosc enzymatyczna, wtedy w niektórych przypadkach . korzystnie nie stosuje sie zbyt duzego nadmiaru polimeru, poniewaz wtecty bialko zostaje wprawdzie calkowicie zwiazane, lecz czynnosc ulega obnizeniu.Nosniki z zywic nadaja sie do wiazania wszyst¬ kich substancji, posiadajacych grupe funkcyjna, zdolna do reagowania z grupa bezwodnikowa po¬ limeru. W przypadku bialek i peptydów sa to prze¬ de wszystkim koncowe grupy aminowe lizyny i wolne grupy aminowe na koncu lancuchów pepty- dowych.Peptydy i bialka, zwiazane z nosnikami, maja du¬ ze znaczenie w nauce i technice. W wiekszosci przypadków drogie i nietrwale enzymy zostaja w znacznej mierze stabilizowane przez zwiazanie z zywica. Ponadto latwe i zupelne odzyskiwanie zywicy z erizymem umozliwia wielokrotne stosowa¬ nie w dlugim okresie czaosu.Z kopolimerami w preparatach, otrzymywanych wedlug wynalazku, mozna wiazac na przyklad en¬ zymy, takie jak hydrolazy, jak proteazy, na przy¬ klad trypsyna, chymotrypsyna, papaina, elastaza; amidazy, na przyklad asparaginaza, glutaminaza; ureaza; acylotransferazy, na przyklad penicyliacy- laza; liazy, na (przyklad hialuronidaza, ponadto inne bialka,, takie jak skladniki osocza krwi, globuliny (przeciwciala), nastepnie polipeptydy, takie jak in¬ hibitor kalikreiny lub insulina, aminokwasy, takie jak lizyna lub ananina.Bialka, stosowane w preparatach, otrzymywa¬ nych wedlug wynalazku, wytwarza sie w zasadzie z bakterii, grzybów, Actinomycetes lub z mate¬ rialu zwierzecego.Przykladem technicznie waznych reakcji ze zwia¬ zanymi enzymami jest hydrolityczna odbudowa skrobi przez kowalencyjnie zwiazana amylaze, kla¬ rowanie soków owocowych, miedzy innymi za po- l moca zwiazanej pektynazy, wytwarzanie enzyma¬ tycznie odbudowanych hydrolizatów bialkowych, hydroliza penicylin do kwasu 6-aminopenicylano- wego. Ponadto stosuje sie równiez zwiazane enzy¬ my, peptydy i inne do wyodrebniania inhibitorów za pomoca chromatografii powinowactwa i na od- wrót zwiazane inhibitory do wyodrebniania enzy¬ mów. Mozna je stosowac równiez w dziedzinie me¬ dycyny. PrzyklaJem jest zastosowanie zwiazanej L-asparaginazy lub ureazy w krazeniu pozaustro- jowym celem obnizenia poziomu asparaginy lub 18 mocznika we krwi.Te i inne liczne mozliwosci stosowania opisano w literaturze, na przyklad Chem. Eng. News z .2.1971, strona 86 i Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83 (1971).Waznym przykladem stosowania preparatów pro¬ teinowych, otrzymywanych wedlug wynalazku, jest rozszczepianie penicylin za pomoca penicylinacyla- zy, zwiazanej z kopolimerem.Celem wytworzenia kwasu 6-aminopenicylanowe- go (6 AP) mozna rozszczepiac penicyliny za pomoca acylaz z drobnoustrojów, na przyklad z baterii, zwlaszcza E. coli, Erwinia lub Aktinomycetes, ta¬ kich jak Sfcreptomyces, Micromono'spora, Nocardia i grzybów, takich jak Fusarium i drozdze.Wedlug sposobu, podanego w opisie patentowym RFN nr. 1 111 778, dotyczacego wytwarzania 6-AP, zadaje sie roztwór penicyliny G szlamem bakteryj¬ nym, zawierajacym enzym penicylinacylaze (E. C. 3.5.1.11). Dzialaniem enzymu ulega odszczepieniu grupa karbonamidowa w lancuchu bocznym penicy¬ liny bez otwarcia pierscienia y?-laktamowego.Stosowanie zawiesin drobnoustrojów wykazuje nastepujace wady: a. Zawiesina drobnoustrojów zawiera poza we¬ wnatrzkomórkowa penicylinacylaza dalsze bialka i enzymy, jak równiez skladniki, pochodzace z po¬ zywki lub produkty przemiany, powstale w czasie fermentacji. Zanieczyszczen tych nie mozna pod¬ czas przeróbki wymyc calkowicie z krystalizowane¬ go 6-AP. b. Zawiesine drobnoustrojów mozna zasadniczo stosowac tylko jeden raz. c. Zawiesina drobnoustrojów zawiera zanieczysz¬ czenia i inne enzymy, inaktywujace penicyline i/lub 6-AP przez otwarcie pierscienia /?-laktamo- wego. d. Zawiesina zawiera jedynie niewielkie ilosci pe- nicylinacylazy. Stosowanie wiekszej ilosci materialu enzymatycznego, na przyklad celem uzyskania krót¬ szych czasów trwania reakcji i dzieki temu lep¬ szych wydajnosci 6-AP przy niewielkiej ilosci sub¬ stancji obcych, nie jest w praktyce mozliwe. e. Wydajnosci w procesie przemyslowym' 6-AP zaleza od ulegajacego wahaniom wytwarzania sie penicylinacylazy w kazdorazowej szarzy fermenta¬ cyjnej. f. Calkowite oddzielenie zawieszonych drobno¬ ustrojów wymaga w czasie przerabiania szarz z 6-AP dodatkowego etapu, powodujacego zmniejsze- 65 nie wydajnosci. Celem usuniecia bialkowych zanie- 40 50 55 6011817 i* czyszczen, mogacych wywolywac odczyny alergicz¬ ne, konieczne sa dalsze etapy oczyszczania (brytyj- * skie opisy patentowe nr. nr. 1169 696, 1078 847, 1114 311).Unika sie wszystkiGh wymienionych wad, stosu- 5 jac zamiast zawiesiny drobnoustrojów penicylina¬ cylaze, osadzona droga kowalencyjnego wiazania na nierozpuszczalnym w wodzie nosniku.Próby wytworzenia 6-AP droga enzymatycznego rozszczepiania penicylin za pomoca penicylinacyla- 10 zy, zwiazanej z nosnikiem sa wprawdzie znane (opisy patentowe RFN, DOS nr. 1 917 057, DOS nr. 1 907 365), nie udalo sie ich jednak zastosowac w skali technicznej. Przyczyny tego leza przede wszy¬ stkim w mechanicznych wlasciwosciach nosnika, 15 prowadzacych do strat przez scieranie, poza tym przy miernych wydajnosciach procesu technologicz¬ nego osiagano jedynie niewielka czynnosc wlas¬ ciwa penicylinacylazy, zwiazanej z nosnikiem.Znane jest równiez stosowanie nierozpuszczalne- 20 go preparatu enzymu, wytworzonego droga kowa¬ lencyjnego wiazania penicylinacylazy z mieszanym polimerem z * akryloamidu, N,NVmetylenobisa- kryloamidu i bezwodnika kwasu maleinowego. Pre¬ parat ten przy rozszczepianiu penicyliny w skali 25 technicznej wykazuje jednak wady, poniewaz silnie pecznieje i nie wykazuje trwalosci mechanicznej.Wady te utrudniaja ponowne stosowanie tak wy¬ tworzonej zywicy w skali technicznej.Stwierdzono, ze mozna uniknac tych wad, stosu¬ jac do rozszczepiania penicylin penicylinacylaze, zwiazana z nierozpuszczalnym, w wodzie nosnikiem otrzymywana wedlug wynalazku.Rozszczepianie penicylin za pomoca penicylinacy- 35 lazy, zwiazanej z nosnikiem, otrzymywanej wedlug wynalazku, mozna prowadzic w prosty sposób rów¬ niez w skali wielkotechnicznej. Zwiazany z nos¬ nikiem nierozpuszczalny enzym zawiesza sie w roz¬ tworze, zawierajacym 75 000 — 150 000 jednostek miedzynarodowych/ml penicyliny, na przyklad pe- 40 nicyliny G lub penicyliny V. Rozszczenianie enzy¬ matyczne prowadzi sie przy stalej wartosci pH w zakresie 6—9, zwlaszcza kazdorazowo w zakresie optymalnego pH dla zwiazanej penicylinacylazy, na przyklad przy wartosci pH = 7,8. Celem zobo- 45 jetnienia odszczepionego rodnika acylowego, na przyklad kwasu fenylooctowego lub fenoksyoctowe- go, stosuje sie wodne roztwory alkaliów, na przy¬ klad lug potasowy lub sodowy albo aminy orga¬ niczne, zwlaszcza trójetyloamine. Z ilosci zuzytej 50 zasady mozna wnioskowac o szybkosci reakcji i o zakonczeniu rozszczepiania. Penicylinacylaza katali¬ zuje zarówno rozszczepianie penicyliny do 6-AP, jak równiez resynteze penicylin z produktów roz¬ szczepiania. Równowaga zalezy od wartosci pH sro- 55 dowiska. Przy nizszych wartosciach pH równowaga przesuwa sie na. korzysc wyjsciowej penicyliny.Mozna to wykorzystac do transacylowania penicy¬ lin w obecnosci innych rodników acylowych lub do syntezy penicylin z 6-AP.Temperatura reakcji przy rozszczepianiu enzyma¬ tycznym wynosi korzystnie 38°C. W nizszych tem¬ peraturach aktywnosc enzymu spada. Jezeli na przyklad rozszczepianie prowadzi sie w temperatu¬ rze 25°C, to trzeba stosowac dwa razy tyle enzymu, 65 ile w temperaturze 38°C, jezeli chce sie uzys jednakowe czasy trwania reakcji.Szybkosc reakcji zalezy w danej temperaturze od czynnosci wlasciwej i od ilosci penicylinacylazy, zwiazanej , z nosnikiem. Ponadto szybkosc reakcji zalezy ód stosunku ilosci penicylinacylazy, zwia¬ zanej z nosnikiem, do stezenia penicyliny. Jedna szarza poddana rozszczepianiu o stezeniu 100 000 jednostek miedzynarodowych/ml (1 mg soli potaso¬ wej penicyliny G odpowiada 1598 jednostkom mi^- dzynarodowym-IU) soli potasowej penicyliny G ulega po uplywie 10 godzin przy wartosci pH = 7,8 i w temperaturze 38°C zupelnej hydrolizie ddl 6-AP i kwasu fenylooctowego, jezeli na jednostke penicylinacylazy stosuje sie 3 • 105 jednostek peni¬ cyliny G (jedna jednostke enzymu/U) definiuje sie jako czynnosc, która hydrolizuje 1 /imol kwasu 6-nitro-3-(fenyloaicetylo)-amino!benzoesowego (Nl^ PAB) w ciagu minuty w temperaturze 25°C). Udzial suchej zywicy z enzymem wynosi j'edynie 0,5—1% mieszaniny-reakcyjnej. Jezeli stosuje sie na 105 IU penicyliny G 2 jednostki penicylinacylazy, wtedy calkowite rozszczepienie trwa tylko 2 godziny. Moz¬ liwe jest uzyskanie jeszcze krótszych czasów trwa¬ nia reakcji, stosujac jeszcze wiecej zwiazanej pe¬ nicylinacylazy, stosujac na przyklad penicylinacy¬ laze, zwiazana z nosnikiem z krystalizowanego en¬ zymu.Penicylinacylaze, zwiazana z nosnikiem, otrzymy¬ wana wedlug wynalazku mozna wytworzyc w po¬ staci (perelek, przy czym wyróznia sie ona duza trwaloscia mechaniczna 'i wzglednie wysokim cie¬ zarem wlasciwym. Wlasciwosci te umozliwiaja jej wielokrotne stosowanie w ciagu dlugiego okresu czasu. Wlasciwosci te umozliwiaja ponadto stosowa¬ nie w procesach periorycznych intensywnego mie¬ szania i proste oddzielanie za pomoca wirowania bez strat, spowodowanych zuzyciem mechanicz¬ nym, na przyklad przez scieranie. Dzieki temu u- zyskuje sie w procesach periodycznych klarowne przesacze, które mozna bez dodatkowego saczenia przerabiac celem wytworzenia produktu koncowe¬ go, kwasu 6-AP. Wytworzona sposobem wedlug wynalazku penicylinacylaza umozliwia równiez szybkie i proste saczenie, poniewaz dzieki trwa¬ losci mechanicznej nie powstaja drobne czastki, zatykajace powierzchnie saczaca. Zywica w procesie periodycznym posiada dalsze zalety dzieki wzgled¬ nie wysokiemu ciezarowi wlasciwemu, pozwalaja¬ cemu na szybkie osadzanie sie zywicy tak, ze po ukonczeniu procesu technologicznego roztwór nad zywica daje sie latwo odlewarowac. Wynika z tego uproszczenie sposobu prowadzenia wytwarzania, poniewaz zywica w procesie periodycznym moze pozostac w reaktorze i bezposrednio zostac uzyta do nastepnego rozszczepiania.Wlasciwosci polimeru umozliwiaja ponadto stoso¬ wanie penicylinacylazy, zwiazanej z nosnikiem, nie tylko w procesach periodycznych, lecz równiez w ciaglych sposobach wytwarzania, na przyklad w kolumnach reakcyjnych, przy czym postac pere¬ lek umozliwia pozadana znaczna szybkosc przeply¬ wu.Wytworzony przez rozszczepianie enzymatyczne kwas 6-AP wyodrebnia sie, po oddzieleniu zywicy z enzymem z mieszaniny reakcyjnej, znanymi spo-91817 11 sobami (na przyklad opis patentowy RFN nr. 1111778) i przekrystalizowuje przy wartosci pH = 4,3. Przy rozszczepianiu penicylin penicylinacylaza; zwiazana z nosnikiem, wytworzona sposobem wed¬ lug wynalazku, uzyskuje sie znacznie wyzsze wy¬ dajnosci 6-AP, niz przy stosowaniu szlamu z E.coli.Uzyskuje sie równiez wyzsze wydajnosci, niz przy stosowaniu znanych preparatów zyzwicy z enzy¬ mem. Przy zastosowaniu preparatów wedlug wy¬ nalazku uzyskuje sie 6-AP z wydajnoscia, wyno¬ szaca okolo 90% wydajnosci teoretycznej. Tak wy¬ tworzony 6-AP nie zawiera zanieczyszczen bialko¬ wych. Tak wytworzony 6-AP nie zawiera praktycz¬ nie równiez polimerów, mogacych powstawac w innych sposobach wytwarzania. Uboczne dzialania alergiczne, powodowane przez bialka lub polimery, sa wykluczone w przypadku 6-AP, wytworzonego przy uzyciu preparatów, otrzymywanych wedlug wynalazku.Zwiazana z nosnikiem penicylinacylaza, wytwo¬ rzona wedlug wynalazku, moze byc stosowana wie¬ lokrotnie w dlugim okresie czasu. Równiez i póz¬ niej czynnosc enzymatyczna jest praktycznie w pel¬ ni utrzymana. ^ Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej wynalazek.Podane w ponizszych przykladach temperatury wrzenia oznaczono pod normalsnym cisnieniem.Przyklad I. a) 80 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 20 g bezwodnika kwasu male¬ inowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego roz¬ puszcza sie w 1 litrze benzenu i ogrzewa, miesza¬ jac, w ciagu 4 godzin w temperaturze 60°C. Nastep¬ nie dodaje sie 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego i 200 ml benzyny (temperatura wrzenia 100—140°C) i polimeryzuje w ciagu dalszych 5 godzin w tempe¬ raturze 70°C. Odsacza sie polimer w postaci prosz¬ ku, zawiesza jeden raz w benzenie i trzy razy w eterze naftowym (temperatura wrzenia 30—50°C) i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc wynosi 94 g, objetosc nasypowa: 3,5 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 4,7 ml/g, powierzchnia wlas- iciwa: 5 m2/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 3,5 milirównowazników/g. b) 1 g nosnika z zywicy, wytworzonej wedlug przykladu la, zawiesza sie w 30 ml wodnego roz¬ tworu 132 U penicylinacylazy [czynnosc wlasciwa 1 U/mg bialka (biuret)]. Utrzymujac stala wartosc pH: 6,3 przez dodawanie 1 n lugu sodowego za po¬ moca pH-statu, miesza sie zawiesine w ciagu 20 go¬ dzin w temperaturze 25°C. Nastepnie saczy sie przez plytke ze szkla spiekanego G 3 i przemywa zywi¬ ce porcjami po 50 ml 0,05 m buforu fosforanowego o wartosci pH = 7,5, zawierajacego 1 m chlorku sodowego i tym samym buforem bez chlorku sodo¬ wego. Przy dalszym przemywaniu czynnosc zywicy nie ulega juz zmianie.Czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwór wyjsciowy: 132 U roztwór znad osadu + woda z przemywania: 12 U, zywica po reakcji: 86 U, co odpowiada 65% czynnosci wyjsciowej.Czynnosc enzymatyczna penicylinacylazy ozna¬ cza sie kolorymetrycznie lub miareczkowo za po¬ moca 0,002 m kwasu 6-nitro-3-(N-fenyloacetylo)- -aminóbenzoesowego (NIPAB) jako substratu przy wartosci pH = 7,5 i w temperaturze 25°C. Molarny 12 40 45 50 55 65 wspólczynnik ekstynkcji powstajacego kwasu 6-ni- tro-3-aminobenzoesowego wynosi E405nm = 9090. 1 jednostka (U) odpowiada przemianie 1 wmola sub¬ stratu na minute.Przyklad II. a) Roztwór 90 g dwumetakryla¬ nu glikolu etylenowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 1 litrze benzenu polimeryzuje sie, mieszajac, w temperaturze 60°C. Po uplywie 4 godzin dodaje sie 200 ml benzyny (temperatura wrzenia 100—140°C) i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego i polimeryzuje w ciagu 2 godizn w temperaturze 70°C. i nastepnie w ciagu 2 godzin w temperaturze 80°C. Nastepnie odsacza sie polimer, przemywa dokladnie eterem naftowym (temperatura wrzenia 30—50°C) i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Wydajnosc wynosi 97 g, objetosc nasypowa: 6,4 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 8,0 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 298 m2/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 1,5 milirów¬ nowazników/g. b) 6 g nosnika z zywicy, wytworzonej wedlug przykladu II a) poddaje sie reakcji analogicznie do przykladu I b) z 590 U penicylinacylazy w 165 ml wody.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwór wyjciowy: 590 U ciecz znad osadu + woda z przemywania 26 U zywica nosnika po reakcji: 352 U, co odpowiada 60% czynnosci wyjsciowej. c) 1 g nosnika z zywicy, wytworzonej wedlug przykladu II a), poddaje -sie reakcji analogicznie do przykladu I b) z 100 mg asparaginazy.Czynnosc enzymatyczna (hydroliza asiparaginy) roztwór wyjsciowy: 21000 U, ciecz znad osadu po reakcji: 3360 U zywica nosnika po reakcji: 3910 U, co odpowiada 19% wydajnosci wyjsciowej.Przyklad III. a) W wyniku kopolimeryzacji 90 g dwumetakrylanu glikolu dwuetylenowego i 10 g bezwodnika kwasu maleinowego w warunkach, podanych w przykladzie II a), otrzymuje sie pro¬ dukt o nastepujacych danych: wydajnosc wynosi 96 g, objetosc nasypowa: 5,5 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 6,7 ml/g, po¬ wierzchnia wlasciwa: 9,2 m2/g, zawartosc kwasu po hydrolizie grup bezwodnikowych: 1,9 milirówno¬ wazników/g. b) 1 g nosnika z zywicy, wytworzonej wedlug przykladu III a), dodaje sie do roztworu 50 mg nie¬ specyficznej elastazy o czynnosci enzymatycznej 139 U w 32 ml wody. Miesza sie mieszanine reak¬ cyjna w ciagu 16 godzin w temperaturze pokojowej, utrzymujac stala wartosc pH = 5,8. Po reakcji od¬ sacza sie zywice i przemywa 50 ml 1 n roztworu chlorku sodowego w 0,05 m buforze fosforanowym o wartosci pH = 7,5, a nastepnie 50 ml 0,05 m bu¬ foru fosforanowego o wartosci pH = 7^5.Wyniki: roztwór wyjsciowy: 139 E, ciecz znad osadu i roztwory po przemywa¬ niu: 51 E, zywica nosnika: 15 E, co odpowiada 11% czynnosci wyjsciowej.Czynnosc enzymatyczna oznaczono miareczkowo91817 13 14 za pomoca kazeiny jako substratu (stezenie 11,9 mg/ml) przy wartosci pH = 8,0 i w temperaturze °C. 1 jednostka (E) odpowiada zuzyciu 1 /*mola potasowego na minute. c) 1 g nosnika z zywicy, wytworzonej wedlug przykladu Ilia), dodaje sie do roztworu 50 mg kry¬ stalizowanej ureazy (Merck) w 32 ml wody. Mie¬ szanine reakcyjna miesza sie w temperaturze po¬ kojowej w ciagu 16 godzin, utrzymujac stala war¬ tosc pH = 6,3, po czym przerabia dalej, jak poda¬ no w przykladzie II.Wyniki: roztwór wyjsciowy: 5013 U, ciecz znad osadu i roztwory z przemy¬ wania: ~ 1397 U, zywica nosnika: 1405 U, co odpowiada 28% czynnosci wyjsciowej.Czynnosc enzymatyczna ureazy oznacza sie mia¬ reczkowo za pomoca 0,17 m mocznika jako sub¬ stratu, w temperaturze 25°C i przy wartosci pH = = 6,1. 1 jednostka (U) odpowiada ilosci enzymu, która rozszczepia 1 /^mol mocznika na minute. d) 0,4 nosnika z zywicy, wytworzonej wedlug przykladu Ilia), poddaje sie reakcji z 40 mg gluta- tionu w 32 ml wody w ciagu 16 godzin przy stalej wartosci pH = 6,3 w temperaturze pokojowej. Zy¬ wice odsacza sie i przemywa roztworem In chlorku sodowego w 0,05 m buforze fosforanowym o war¬ tosci pH = 7,5 i na koniec woda. Po wysuszeniu zywicy* pod zmniejszonym cisnieniem w tempera¬ turze 100°C nad pieciotlenkiem fosforu otrzymuje sie 0,47 g produktu. Oznaczenie zawartosci azotu wedlug Dumas daje wartosc 1,1% N, co odpowiada zawartosci 8,04% lub 37,8 mg glutationu. Odpowia¬ da to 94% wprowadzonej ilosci glutationu.Przyklad IV. a)80g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 20 g bezwodnika kwasu ma¬ leinowego i 1 g poroforu N rozpuszcza sie w 1 li¬ trze benzenu i wolno mieszajac polimeryzuje w ciagu 16 godzin w temperaturze 80°C. Polimer prze¬ rabia sie analogicznie do przykladu la).Wydajnosc wynosi 95 g, objetosc nasypowa: 2,5 ml/g, objetosc pecznienia: 3,0 ml/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 2,6 mi- lirównowazników/g. b) Reakcje 1 g zywicy nosnikowej, wytworzonej wedlug przykladu IVa), z penicylinacylaza prowa¬ dzi sie analogicznie do przykladu Ib).Wyniki: czynnosci enzymatyczne (test NIPAB) roztwór wyjsciowy: 123 U ciecz znad osadu + roztwory po przemy¬ waniu: 13 U zywica nosnika po reakcji: 79 U, co odpowiada 64% czynnosci wyjsciowej. c) 0,4 g zywicy nosnikowej, wytworzonej wedlug przykladu IVa), dodaje sie do roztworu 40 mg tryp- syny w 32 ml 0,01 m roztworu chlorku wapniowego i miesza w ciagu 16 godzin w temperaturze poko¬ jowej, utrzymujac stala wartosc pH = 6,3. Zywice odsacza sie i przemywa, jak w przykladzie Ib).Czynnosc enzymatyczna: roztwór wyjsciowy: 44 U, ciecz znad osadu i roztwory po przemy¬ waniu: 5,2 U, zywica: 8,3 U, co odpowiada 19% czynnosci wyjsciowej.Czynnosc enzymatyczna oznacza sie kolory¬ metrycznie wedlug Tuppy, Z. Physiol, Chem. 329, (1962) 278, za pomoca p-nitroanilidu benzoiloargini- ny (BAPNA) jako substratu. 1 jednostka (U) odpo¬ wiada rozszczepieniu 1 /*mola substratu w tempera¬ turze 25°C i przy pawrtosci pH 7,8. d) 1 g zywicy wytworzonej wedlug przykladu IVa dodaje sie do roztworu 50 mg niespecyficznej 1G elastazy w 32 ml wody. Zawiesine miesza sie w cia¬ gu 16 godzin w temperaturze pokojowej, utrzymu¬ jac stala wartosc pH = 5,8. Przerabia sie dalej i miareczkowo oznacza czynnosc enzymatyczna za pomoca kazeiny jako substratu, jak opisano w jg przykladzie Illb).Czynnosc enzymatyczna: rozwtór wyjsciowy: 139 U, ciecz znad osadu i roztwory po przemy¬ waniu: ' 32 U, aj zywica: 36 U, co odpowiada 26% czynnosci wyjsciowej.PrzykladV. a) W reaktorze, zaopatrzonym w mieszadlo ogrzewa sie 1 litr benzyny (tempera¬ tura wrzenia 100—140°C) i 1 g nitrylu kwasu azoizo- maslowego w ciagu 1 godziny w temperaturze 90°C.Nastepnie wkrapla sie w temperatejpe 80°C roz¬ twór 95 g dwumetakrylanu glikolu etylenowego, g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w ciagu 3 godzin i miesza w takiej samej temperaturze w ciagu dalszych 2 go¬ dzin. Odacza sie polimer, przemywa go kilkakrotnie benzenem i eterem naftowym (temperatura wrzenia —50°C) i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Wydajnosc wynosi 96 g, objetosc nasypowa: 14 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 18,2 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 70 m2^, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 0,5 milirów- nowazników/g. b) 0,4 g zywicy, wytworzonej wedlug przykladu 40 Va), miesza sie z 40 mg glutationu w 32 ml wody w ciagu 16 godzin, utrzymujac stala wartosc pH = = 6,3, w temperaturze pokojowej. Zywice odsacza sie, przemywa i suszy wedlug przykladu Md)..Otrzymuje sie 0,46 g zywicy, zawierajacej 0,9% N wedlug Dumas. Odpowiada to zawartosci 6,6% lub ,4 mg glutationu, czyli 76% uzytej ilosci.Przyklad VI. a) Roztwór 62,5 g dwumetakry¬ lanu glikolu czteroetylenowego, 37,5 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizoma¬ slowego w 150 ml octanu butylu i 1 litrze benzyny (temperatura wrzenia 100—140°C) polimeryzuje sie, mieszajac, w ciagu 2 godzin w temperaturze 70°C, w ciagu 2 godzin w temperaturze 75°C i 1,5 godziny w temperaturze 90°C. Polimer odsacza sie, ekstra¬ huje przez 24 godziny w ejkstraktorze Soxhleta ben- 55 zenem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.Wydajnosc wynosi 77 g, objetosc nasypowa: 7,3 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 8,2 ml/g, po¬ wierzchnia wlasciwa: 19,4 m2/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 4,0 milirówno- 60 wazników/g. b) 1 g zywicy nosnikowej, wytworzonej wedlug przykladu Via), podaje sie rekacji z penicylinacyla¬ za analogicznie do przykladu Ib).Czynnosc enzymatyczna (test NIPAB): jg roztwór wyjsciowy: 107 U, 45 5091 817 16 28 U, 55 U, ecz znad osadu i roztwory po przemy¬ waniu: zywica nosnika po reakcji: co odpowiada 51% czynnosci wyjsciowej.Przyklad VII. a) Roztwór 90 g dwumetakry^ lanu glikolu czteroetylenowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1,0 g nitrylu kwasu azoizo- maslowego w 200 ml acetonitrylu zawiesza sie w 1000 ml benzyny (temperatura wrzenia 100 — 140°C), w której rozpuszczono 5 g mieszaniny mo¬ no- i dwuoleiriianu gliceryny. Mieszanine reakcyj¬ na polimeryzuje sie do wytworzenia stalych pere¬ lek (okolo 2 godzin) w temperaturze 60°C i na¬ stepnie w ciagu 20 godzin w temperaturze 65°C.Odsacza sie polimer, zawiesza trzy razy w benzenie i trzy razy w eterze naftowym (temperatura wrze¬ nia 30—50°C) i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 50°C.Wydajnosc wynosi 94 g, srednia srednica czastek: ?okolo 0,35 mm, objetosc nasypowa: 2,8 ml/g, obje¬ tosc pecznienia w wodzie: 3,1 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 3,4 m2/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 1,5 milirównowazników/g. b) 1 g zywicy nosnikowej, wytworzonej wedlug przykladu VIIa), poddaje sie reakcji z penicylinacy- laza analogicznie 'do przykladu Ib).Czynnosc enzymatyczna (test NIPAB): roztwór wyjsciowy 107 U, ciecz znad osadu i roztwory po przemy¬ waniu: 51 U, zywica nosnika po reakcji: 19 U, co odpowiada 18% czynnosci wyjsciowej. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nierozpuszczalnych w wo¬ dzie preparatów proteinowych, znamienny tym, ze usjeciowany kopolimer, skladajacy sie z kopolime- ryzowanych jednostek A) 0,1—50% wagowych bez¬ wodników a,/?-monoolefinowych nienasyconych kwasów dwukarboksylowych o 4—9 atomach wegla i B) 99,9—50% wagowych dwu- i/lub polimetakry¬ lanów dwu- i/lub polioli, i o objetosci nasypowej = = 2—20 ml/g, powierzchni wlasciwej = 1—400 m2/g i o zawartosci grup karboksylowych po zmydleniu grup bezwodnikowych = 0,02—20 milirównowazni¬ ków/g, poddaje sie reakcji w wodnej zawiesinie z roztworem bialka.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ko¬ polimer poddaje sie reakcji z wodnym roztworem penicylinacylazy o niskiej zawartosci soli w zakre¬ sie wartosci pH = 5,7—6,8.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze proces prowadzi sie w srodowisku reakcyjnym, w którym stezenie soli na poczatku reakcji kopoli¬ meru z roztworem penicylinacylazy wynosi mniej niz 0,02 mola/litr. RS^K Zakl. Graf. W-wa, Srebrna 16 z. 604-77/O — 100 + 20 egz. PL