DE2106215A1 - Stliciumhaltige Materialien, auf deren Oberflache em Enzym Polymeri satprodukt befestigt ist - Google Patents

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 2. H1LBLESTRASSE

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 2, HllblestraBe 20 Ihr Zeichen

Unser Zeichen

Anwaltsakte 20 601 ße/A

Monsanto Company St. Louis (USA)

Datum

"Siliciumhaltige Materialien, auf deren Oberfläche ein • Enzym-Polymerisatprodukt befestigt ist"

Die verschiedenen Wirksamkeiten und Verwendungsfähigkeiten der Enzyme sind besonders gut erforscht und niedergelegt. Die Enzyme sind ihrer Art nach Proteineund wasserlöslich, so daJ3 ihre Verwendung ebenso durch Verlust oder "Aufbrauchen" des Enzyms begleitet ist. Vor kurzem wurden Versuche

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unternommen, die Wirksamkeit der Enzyme zu verlängern und sie unlöslich, und damit zur erneuten Gewinnung und Wiederverwendung geeignet zu machen, wobei man die Enzyme an verschiedenen organischen. Polymerisate befestigt . derartige Anstrengungen haben zu. einem mehr oder weniger großen Erfolg geführt, da sie ernsthaft an den hohen Kosten für das organische Material, das zur Kombination mit den Enzymen unter Bildung eines-unlöslichen Produkts vorgesehen ist, leiden, Es wäre sehr erwünscht, unlösliche, lang wirkende und wiederverwendbare Formen von Enzymen zur Verfügung zu haben, die nicht den Nachteil hoher Kosten haben. Es wäre weiterhin vorteilhaft, enzymatisch wirksame Materialien in einer Partikelform zur Verfügung zu haben, die einen schnellen Kontakt des Substrats mit dem löslich gemachten Enzym erlauben würde. Enzymatisch wirksame Materialien mit den vorausgehend aufgezählten Vorteilen werden durch die vorliegende Erfindung geschaffen.

Die Herstellung unlöslicher Enzym-Polymerisatprodukte ist bekannt. Ihre Vorteile bestehen darin, daß diese Produkte im Verhältnis zur Stabilität (sowohl thermischen als auch pH) und gegenüber Änderungen der Substratspezifität und des pH-Profils eine bessere Steuerung der enzymatischen Digestion und in manchen !Fällen neue und modifizierte Digestionen ermöglichen. Diese Produkte kömien ^ as dein Digestionsmedium zum Anhalten der Reaktion abfiltrie^i und sie können dann in ein neues. Medium zur Wiederverwendung eingeführt

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werden. Es ist wünschenswert, praktische Verfahrensbedingungen zum Einverleiben einer solchen unlöslichen Wirksamkeit in Kolonnen zu erreichen, wo das Substrat in flüssiger Lösung oder Suspension kontinuierlich in die Kolonne geleitet und das enzymatisch digestierte Substrat aus dem Kolonnenabfxuß wiedergewonnen wird. Bisher war es schwierig, Enzym-Produkte in Kolonnenverfahren einzubringen, da sie im allgemeinen einen geringen Durchsatz aufweisen und die Kolonnen eine begrenzte Gebrauchsdauer infolge Aufquellen und Verstopfen haben. Versuche, brauchbare Kolonnen herzustellen, wurden in der Weise vorgenommen, daß man bisher solche unlösliche Enzymprodukte mit Hilfsmitteln zum Filtern, einschließlich Diatomeenerde, Cellulose usw., mischte. Jedoch waren große Mengen dieser inerten Streckmittel notwendig, um nur einen minimalen Erfolg bei der Kolonnenverwendung zu erreichen. Weiterhin verstopften sich derartige Kolonnen gewöhnlich Tiach mehreren Betriebsstunden.

Es wurde nunmehr festgestellt, daß es möglich ist, Enzymreaktionen sowohl zu stabilisieren als auch zu modifizieren, wozu man das Enzym mit einer Polyelektrolyt-Umgebung umgibt und eine Partikelgröße und Formgebung zu erhalten, die in gepackten Kolonnen beständig ist, so daß brauchbarere Durchflußgeschwindigkeiten erreicht werden können. Zusätzlich sind einige der verschiedenen preisgünstigen silicium-Iialtigen Materialien als Träger für das katalytisch wirksame Produkt geeignet. Um die Befestigung an die Träger zu

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erreichen, werden die Träger zuerst durch eine kovalente Bindung des polymeren ioniscnen Materials (Polyanionen, Polykationen, PoIyampholyte usw.) an die Oberfläche mittels einem Kupplungsmittel modifiziert, und danach wird der bioaktive Enzymkatalysator an der polymeren Oberfläche befestigt. Auf diese Weise können bessere Durchflußgeschwindigkeiten und größere thermische und autolytische Stabilität erreicht werden» Zusätzlich können die Reaktionen bei optimalen pH-Bedingungen und unter voller Ausnutzung der Substratbesonderheit durchgeführt v/erden«

Bs ist demgemäß ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, siliciumhaltige Materialien, die ein wiederverwendbares, langwirkendes Enzym tragen sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Materialien zur Verfugung zu stellen«

Die vorliegende Erfindung betrifft ein siliciumhaltiges Material, an dem durch reaktionsfähige Gruppen, die an seiner Oberfläche aufgrund einer Organosilanbehandlung gebildet sind, ein Polymerisat befestigt ist, an dem seinerseits ein Enzymmolekül mittels einer reaktionsfähigen Gruppe in dem Enzym, die für die enzymatische Wirkung nicht wesentlich ist, befestigt ist. Die Produkte dieser Reaktion sind unlösliche, neu verwendbare, langwirkende, enzymatisch wirksame, siliciumhaltige Materialien, in denen das Enzym kovalent gebunden iste Solche Materialien können geeigneterweise in Partikelform hergestellt werden, um den schnellen und voll-

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ständigen Kontakt des enzymatisch wirksamen Materials mit dem Substrat, bei dem die enzymatisch^ Wirkung gewünscht wird, zu erleichtern«

Die Erfindung beinhaltet ein Enzym-Polymerisat, das kovalent mit einem siliciumhaltigen Material mittels einem Organosilan-Kupplungsmlttel verbunden ist. Das v.irksame Enzym kann eine neutrale Protease, eine alkalische Protease oder beides sein, und gegebenenfalls kann ebenso ein zusätzliches Enzym, z_eB_o Amylase oder Lipase, zur weiteren Erhöhung des enzymatischen Y/irkungsbereiches des Produkts verwendet werden.

Das Polymerisat enthält vorzugsweise eine freie Carboxyl- oder Carbonsäureanhydridgruppe, die zur kovalenten Bindung mit dem Enzym oder den Enzymen entweder unmittelbar oder über die Aktivierung einer Carboxylgruppe geeignet ist. Das Polymerisat kann ein relativ niederes Molekulargewicht haben und nicht vernetzt sein, oder es kann ein höheres MoIeicular^ev/icht aufweisen und selbst wasserunlöslich sein« Die:;« voruchiedenen Arten von Produkten haben ihre eigenen οροκί f'ifjoneri Verwendungsgebiete, wie in dem Uahrungsmittel- und iirauQrfiibereich. Weiterhin können sie verwendet werden zur Mf'coation or;.aniDcher Materialien, wie zur Klärung oder Umwandlung von Abwasser bzw. Abfällen und geringwertigem Protein, /,. B. Ji'iüchen in Düngemittel. Zahlreiche Verwendungegebiete für Enzyme sind bereits vorgesehen, und die Produkte der Erfindung finden leicht in allen derartigen

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Gebieten Verwendung, besonders wegen ihrer Stabilität und wegen der unterschiedlichen und in weitem Bereich vorliegenden enzymatisehen Wirksamkeit. Unabhängig, ob lösliche oder unlösliche Enzym-Polymerisat-Wirkungskomponenten verwendet werden, sind die Produkte dieser Erfindung unlöslich und zur Wiederverwendung erneut zu gewinnen, relativ stabil und von langer Wirkungsdauer.

Es erscheint erforderlich, zum Verständnis der vorliegenden Beschreibung einige Definitionen einzufügen:

"ÄMA" ist ein Polymerisat von Äthylen und Maleinsäureanhydrid. Polymerisate dieser Art v/erden in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.

Ein Polymerisat des "ÄMA"-Typs wird nachfolgend definiert.

-Enzym ist ein Mischpolymerisat von Äthylen und Maleinsäureanhydrid mit einer enzymkovalenten 3indung. Das Produkt ist das gleiche, ob nun das Enzym unmittelbar mit einer Anhydridgruppe des Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Liischpolymerisats oder mit einer Carboxylgruppe des Äthylen-Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisats und ob ein Zwischenprodukt als aktivierender Mechanismus für die Carboxylgruppen des Polymerisats verwendet wird, oder nicht. Anhydridgruppen, die nicht an der Reaktion teiln-amen, durch welche das Produkt in einem wäßrigen Medium gebildet wird, sind in dem Produkt als Carboxyl- oder Carboxylatgruppen vorhan-

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den« Solche nicht teilnehmenden G-ruppen können jedoch zu Amid-, Imid-, Ester- usw_e Gruppen umgewandelt werden, wie sie in den ÄlaA-Iyp-Polymerisaten, wie nachfolgend definiert, vorhanden sein können,

"Wasserunlöslich" bedeutet, daß das in Präge kommende Enzym-Polymerisat sich in Wasser oder wäßriger Lösung nicht löst«

"\7asserlöslich" bedeutet nicht wasserunlöslich und wird weiterhin nachfolgend definiert.

Nach dem erfinaungsgemäßen Verfahren können Enzym-Polymerisatderivate dadurch hergestellt werden, daß man ein kristallines oder Roh-Enzym oder Enzymgemische mit dem Polymerisat in Lösung umsetzt_s wodurch man ein polymeres Produkt erhält, in dem die Enzyme kovalent gebunden sind und dieses Produkt seinerseits nachfolgend an einem mit Organosilan "behandelten, siliciumhaltigen Material befestigt. Man kann auch, das Polymerisat zuerst an dem siliciumhaltigen Material über ein Organosilan-Kupplungsmittel und dann das Enzym an dem Polymerisat befestigen.

Die Reaktion des Polymerisats mit einer Vielzahl von Enzymen kann stufenweise durchgeführt werden, jeweils ein Enzym mit oder ohne isolierendes Zwischenprodukt oder mit mehreren Enzymen gleichzeitig« Das letztere Verfahren wird

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aus Zeitgründen, Zweckmäßigkeit und Wirtschaftlichkeit bevorzugt, wenn mehr als ein Enzym in dem Produkt gewünscht wird ο

Wenn ein Anhydrid oder Carboxyl in dem Polymerisat vorhanden ist, Zc B₀ bei einem ÄIIA-Typ-Polymerisat, kann die kovalente Bindung des Enzyms mit dem Polymerisat unmittelbar durch Reaktion oder Kuppeln mit einer Anhydridgruppe oder mit einer Carboxylgruppe unter Verwendung eines Aktivierungsmittels bewirkt werden. Das Produkt ist in beiden Fällen das gleiche. Der pH-Bereich zur Durchführung der Reaktion hängt von den verwendeten Enzymen und ihren Stabilitätsbereiciien ab_o Er liegt gewöhnlich bei ungefähr 5 bis 9j5, vorzugsweise bei ungefähr 6 bis 8, wobei jedoch die Einstellung tür den jeweiligen Fall vorgenommen v/erden muß. Das Isolieren und Reinigen.wird im allgemeinen nach normalen biochemiecnen Verfahren und mittels dem allgemeinen Verfahren, wie es in den folgenden Beispielen dargestellt ist, bewirkt. Weil eine kovalente Bindung des Enzyms mit dem Polymerisat gewünscht wird, wird die Reaktion gewöhnlich bei niederen Temperaturen und bei relativ neutralen pH-Werten in Wasser oder verdünnt wäßrigem Puffer als lösungsmittel durchgeführt.

• Führt man die Reaktion in dieser Weise durch, so erhält man · das gewünschte aktive Enzym-Polymerisatderivat, aber der G-rad der in dem Polymerisatprodukt einverleibten Aktivität

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ist mitunter geringer als gewünscht, möglicherweise als Folge der Teilinaktivierung des Enzyms während dem Verfahrene Als Ausweg kann es häufig vorteilhaft sein, ein gemischtes Lösungsmittelsystem zu verwenden, wozu man ein Lösungsmittel verwendet, in dem das Enzym wenigstens teilweise löslich ist, gewöhnlich in einer Menge bis zu ungefähr 50 Vol.^o Dimethylsulfoxid (DMSO) ist besonders als Lösungsmittel zusammen mit Wasser oder einer wäßrigen Pufferlösung in einem gemischten Lösungsmittelsystem geeignet. Wenn man ein solches gemischtes Lösungsmittelsystem verwendet, v/ird das gewünschte, wirksame Enzym-Polymerisat gewöhnlich in höherer Ausbeute und in höheren Umwandlungen zu dem erwünschten v/irksamen Produkt erhalten, und die Einführung wünscnensv/erter Enzymaktivitätshöhen in das Polymerisatmolekül ist im allgemeinen weniger schwierig.

Das Polymerisat in einer solchen Reaktion enthält vorzugsweise Carboxyl- oder Anhydridbindungen, besonders dann, wenn das Enzym eine Amino-, Hydroxyl- (einschließlich phenolischer Hydroxyl-) oder Sulfhydrylgruppe enthält, die für seine enzymatisch^ Wirksamkeit nicht wesentlich ist. Sofern das Enzym eine Carboxylgruppe enthält, die für seine Wirksamkeit nicht wesentlich ist, kann das Polymerisat freie Hydroxyl- oder Amingruppen zur Umsetzung mit diesen aufweisen. Das Polymerisat ist vorzugsweise ÄMA oder ein ÄMA-iyp-Polymerisat, aber es kann irgendeines jener Arten sein, wie sie vorausgehend zur Kupplung oder zur Reaktion

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mit einem Enzym beschrieben wurden, und in jedem Pail ist das Polymerisat geeignet, eine kovalente Bindung mit dem Enzym unter Bildung eines Enzym-Polymerisatprodukts entweder unmittelbar oder mittelbar unter Verwendung eines Aktivierungsmittels zu oxiden» Insoweit man die enzymatische Wirksamkeit des Ausgangsenzyms in dem Endprodukt zu erhalten wünscht, ist es natürlich in erster Linie erforderlich, daß die Bindung des Enzyms an das Polymerisat durch eine Gruppe erfolgt, die nicht die Inaktivierung einer Aktivstelle des Enzymmoleküls zur Folge hat. Als verschiedene reaktionsfähige Gruppen von Enzymmolekülen können neben Amino- und Sulfhydryl- ebenso Hydroxyl- (einschließlich phenolische Hydroxyl-), Carboxyl- und ImidaζοIyIgruppen erwähnt werden. Solche Gruppen sind in freier oder nicht gebundener Form in inaktiven Teilen der Enzymmoleküle, wie in einem Lysin-, Cystein-, Serin-, Threonin-, Histidin- oder Typrosinteil eines Enzymmoleküls, vorhanden, wo der jeweilig in Frage kommende Anteil für die enzymatische Wirksamkeit,entweder der Beschaffenheit nach katalytisch oder substratbindend, nicht als wesentlich anzusehen ist. Es erfolgt daher die Befestigung mit dem Polymerisatmolekül durch die Beaktion des Polymerisats mit solchen Gruppen, um die Inaktivierung der Enzyme während der Befestigung mit dem Polymerisatmolekül zu /ermeiden. Im allgemeinen ist die Bindung einer Amid-, Imid-, Ester-, Thioester- oder Disulfidgruppe, die durch das Carboxyl oder Anhydrid

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des Polymerisats mit einer Amin- oder Hydroxylgruppe in einem niciit we sent lichen Teil der Enzymproteinkette gebildet wird« Amide werden zweckmäßigerweise dadurch gebildet, daß man entsprechende Aminogruppen des Enzyms mit Carbonsäureanhydridgruppen an dem Trägerpolymerisat in V/asser, in wäßrigen Puffermedien ader in gemischten Lösungsmitteln umsetzte Amide, Imide und Ester werden leicht dadurch geoildet, daß man Carboxylgruppen des Polymerisats oder auch entsprechende Carboxylgruppen des Enzyms aktiviert und sie mit den entsprechenden Hydroxyl-, Amin- oder Llercaptangruppen des anderen Reaktionspartners umsetzt. Eine solche Aktivierung kann unter Verwendung verschiedener Carbodiimide, Carbodiimidazole mit Woodward's- oder Sheehan's-Reagens oder dergleichen bewirkt werden unter Bildung hochwirksamer Zwischenprodukte, die zum Umsetzen mit anderen oben erwähnten Gruppen unter milden Bedingungen geeignet sind, wobei diese das Beibehalten de'r enzymatischen Wirksamkeit begünstigen·

Das für eine solche Reaktion ausgewählte Polymerisat kann daher zur Kupplung oder Reaktion mit einer Vielzahl von Enzymen, entweder unmittelbar oder mittelbar, unter Verwendung eines Aktivierungsmittels, wie bereits erwähnt, geeignet sein, und es kann in jedem Palle die kovalente bindung mit den Enzymen bewirken« Die Bildung der angegebenen Befestigung wird durch Verfahren erreicht, die jeden erforderlichen Schutz des Enzyms sicherstellen, wobei sie eine reversible Blockierung der enzymatisch wirksamen Stelle oder-

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Stellen "beinhalten können, beispielsweise in Falle von Papain, wo Quecksilberpapain oder Zinkpapain-als Zwischenprodukt zur Reaktion mit dem Polymerisat verwendet werden kann, um größere .ausbeuten nach der Befestigung zu erhalten, v/ob ei die Schutzatome nach der Befestigungsreaktion entfernt werden.

Die Enzym-Ausgangsmaterialien können aus jeder geeigneten Quelle erhalten werden und sind entweder pflanzlich, tierisch oder werden über Mikroben ernalten» Viele sind im Handel erhältlich» ITeben Protease, ζ. ß. saurer und/oder neutraler und/oder alkalischer Protease, kann ein weiteres, unterschiedlich wirksames Enzym für eine maximale enzymatische Arbeitsfähigkeit bevorzugt v/erden, -Any la se wird bevorzugt, wobei jedoch Lipase oder Cellulose anstelle von oder zusätzlich zu Amylase verwendet werden kann. Eine Oarbohydrase, Lipase, Esterase, ITuklease oder andere i'orn von Hydrolase kann als zusätzlicher Enzym-Reaktionspartner verwendet werden. Eine Hydrase, Oxyreduktase oder Demolase oder eine Transferase oder Isomerase kann ebenso, abhängig von der vorgesehenen Endaktivität und Anwendung, verwendet werden» In jedem Verhältnis kann alkalische, neutrale oder saure Protease und vorzugsweise sowohl neutrale als auch alkalische Protease in kovalenter Bindung in dem Enzym-Polymerisatmolekül vorhanden sein.

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Viele derartige Enzyme können geeigneterweise von laikroorganismen erhalten werden, zu denen Bakterien, Hefen, Pilze und dergleichen gehören, wozu man bekannte Fermentationsmethoden verwendet, wie sie im allgemeinen in KIRK--Oi¹KIiIoR, Encyclopedia of Chemical Technology 8, 173-204 beschrieben sind, und es können weiterhin viele von Ldkroben gebildete Enzyme, die im Handel erhältlich sind, verwendet werden»

Die genaue Wirksamkeit des als Ausgangsmateriai verwendeten Enzyms oder der verwendeten Enzyme hängt von dem exakten Herstellungsverfahren ab und ist in der vorliegenden Erfindung nicht kritisch, allerdings vorausgesetzt, daß das hierdurch 'gebildete enzymatisch wirksame Produkt die gewünschte enzymatische Wirksamkeit aufv/eist. Verschiedene analytische Verfahren stehen zur Bestimmung der Aktivität des enzymatisch wirksamen Materials zur Verfügung, beispielsweise kann die Protease-Aktivität von proteolytischen Enzymen nach den allgemein bekannten Kaseindigestionsverfahren bestimmt werden« Bei diesen Untersuchungen katalysiert eine Protease die Hydrolyse von Kasein eine bestimmte Zeit und bei einer bestimmten Temperatur und bei einem bestimmten pH-Y/erto Die Reaktion wird durch Zugabe von Trichloressigsäure angehalten und die lösung filtriert. Die Farbe des Filtrats wird durch Polin-Phenol-Reagens entwickelt, und der G-rad der Enzymwirksamkeit wird apektrophotometrisch in Einheiten von Kaseintyrosin gemessen. Dieses Verfahren ist

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eingehend in dem Journal of General Physiology 30, 291 (1947) und- in Lethods of Enzymology 2, 33, Academic Press Ho Y. (1955) be schriet en ο Die Amylase-Aktivität ,/ird in allgemeinen mittels dem oekannten DinitroaaIizylsäux-e-/erfahren von Bernfeld bestimmt. ',Veitere Versuciisverfanren sind dem Fachmann bekannt und auch nachfolgend angegebene

Eine besonders wirksame Quelle für gemischte Enzyme, die als Ausgangsmaterial in der vorliegenden Erfindung verwendet v/erden können, ist ein mutatierter Bacillus subtilis-OrganismuSo Das Verf&iiren zur Herstellung dieses Organismus und der Enzyme hiervon ist in der US-Patentschrift 3 031 380 beschrieben. Eine Kulxur dieses Bacillus subtilis-(Stamm ALI)-Organismus ..-urde bei dem United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, northern Utilization Research, and Development Division, 1815 ITorth University Street, Peoria, Illinois 61604 niedergelegt und mit der Bezugsnummer NREL B-3411 bezeichnet. Das durch diesen Organismus gebildete enzymatisch v/irksame Material besteht im allgemeinen aus zwei Proteasen, ungefähr 65 bis 75 ^σβ> neutraler Protease (Wirksamkeit bei einem pH von 7>0 bis 7,5) und ungefähr 25 bis 35 $> alkalischer Protease (Wirksamkeit bei einem pH von 9 bis 10), Eine bedeutende Menge an Amylase ist ebenso vorhanden. Im allgemeinen sind ungefähr 700 000 bis ungefähr 1,2 Millionen Einheiten neutrale Protease-Aktivität pro Gramm isolierter Feststoffe und ungefähr 250 000 bis ungefähr 400 000 Ein-

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lieiten alkalische Protease-Aktivität pro Gramm vorhanden, wobei die Bestimmung durch die Ansonsche Variation des liunitz "Jasein"-Verfahrens erfolgt. Im allgemeinen sind ungefähr 3ÖÜ 000 bis 350 000 Einheiten Amylase-Aktivität pro Gramm, bestimmt nach dem Bernfeld-Verfahren, vorhanden» Wie in der angegebenen Patentschrift ausgeführt, können sich die relativen Anteile der Protease su Amylase in Abhängigkeit von den genauen 'Wuchsbedingungen des iiikroorganismus ändern, doch wurde festgestellt, daß neutrale und alkalische Protease und Amylase wenigstens in bestimmten Llengen, meist ohne -"-ücksicht auf Änderung des Kulturmediums und andere Bedingungen des Likroorganismenwuchses, gebildet werden« Das Verhältnis der Y.irksarakeit der alkalischen Protease zur Wirksamkeit der neutralen Protease in den üusgangSEiaterialien und in dem Produkt ist vorsugsweise ungefähr 0,25 bis 1,2 zu 1»

Eine weitere Quelle für gemischte Enzyme, die als Ausgangsmaterial nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist der B. subtilis Stamm ITRRL 644, B. subtilis btaium In[RRL 941 und Bo subtilis Stamm IAIiI 1523 (Japanische Kultursanurilung)« V/eitere Bo subtilis-Mikroorganismen stehen zur Verfügung, wobei sie Protease, ein Gemisch von Protease oder Protease und Amylase, wenigstens in einem begrenzten, wenn nicht optimalen Ausmaß, liefern,, Die so bezeichnete Streptomyces griseus-Heutralprotease hat einen breiten pH-Wirkungsbereich und kann ein Ausgangsenzym zur Einverleibung

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- 16 in die Produkte der Erfindung bilden»

Weitere typische Snzyme sind Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Carboxypeptidase, Rennin und dergleichen»

Im weitesten Sinne enthält das Polymerisat, an dem eine Vielzahl von Enzymen nach einem oder mehreren Zielen der Erfindung befestigt wird, Carboxyl- oder Anhydridbindungen, besonders dann, wenn die Enzyme eine Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe enthalten, die für ihre enzymatisch^ Wirksamkeit nicht wesentlich ist_o Sofern ein Enzym eine für seine Wirksamkeit nicht wesentliche Carboxylgruppe enthält, kann das Polymerisat Hydroxyl- oder Amingruppen enthalten, die zur Reaktion mit dieser Gruppe bestimmt sind» Oas Polymerisat kann ALIA oder ein ÄMA-Typ-Polymerisat sein, oder es kann eine der voraus beschriebenen Arten sein, die zur Kupplung oder Reaktion mit einem Enzym geeignet sind, und es ist in jedem Falle geeignet, die Enzyme zu kuppeln oder mit den Enzymen zu reagieren, um. die kovalente Bindung und Bildung des gewünschten Enzym-Polymerisatprodukts zu bewirken.

Weil die kovalente Bindung gewünscht wird, ist es klar, daß das Polymerisat so ausgewählt wird, daß es wenigstens eine ■ reaktionsfähige Stelle an jedem Polymerisatmolekül enthält, mit der die Enzyme entweder unmittelbar oder mittelbar unter Bildung einer kovalenten Bindung reagieren können. Nach die-

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ser Erfindung ist diese reaktionsfähige Stelle (oder sind diese Stellen) vorzugsweise eine Garbonsäure- oder Oarbonsäur eanhydridgruppe _o.

Das erfindungsgemäße Produkt enthält daher Enzyme, die kovalent durch G-ruppen, die für die enzymatische Wirksamkeit nicht wesentlich sind, mit einem Polymerisat verbunden sind, das (a) Ketten von Garbonsäure- oder Oarbonsäureanhydrideinheiten enthält, wobei die Polymerisatketten durch die Polymerisation von polymerisierbaren Säuren oder Anhydriden gebildet wurden, oder das (b) Einheiten von Garbonsäureoder Carbonsäureanhydridgruppen enthält, die durch Kohlenstoffketten von wenigstens einem und nicht mehr als vier Kohlenstoffatomen getrennt sind, wobei die Kohlenstoffketten !Peil einer Einheit bilden, die ein Maximum von 18 Kohlenstoffatomen enthält, die Ketten gewöhnlich durch Mischpolymerisieren einer polymerisierbaren Säure oder eines polymerisierbaren Anhydrids mit einem anderen mischpolymerisierbaren Monomer gebildet.wurden und worin vorzugsweise aie Au pj gangs säure oder das Ausgangsanhjrdrid und jedes zusätzliche mischpolymerisierbare Monomer ungesättigt sind und eine solche Polymerisation oder Mischpolymerisation eine Ungösättigtheit beinhaltende Polymerisation oder Mischpolymerisation des Additionstyps darstellt.

Der polymere Reaktionspartner wird daher vorzugsweise allgemein wie folgt erläutert: ein Polymerisat, das (a) Ketten

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von Garbonsäure- oder Carbonsäureanhydrideinlieiten enthält, wobei das Polymerisat durch Polymerisation von polymerisierbaren Säuren oder Anhydriden gebildet wurde, oder das (b) Einheiten von Garbonsäure- oder Carbonsäureanhydridgruppen enthält, die durch Kohlenstoffketten von wenigstens einem und nicht mehr als vier Kohlenstoffatomen getrennt sind, wobei die Kohlenstoffketten Teil einer Einheit bilden, die ein Maximum von 18 Kohlenstoffatomen enthält, die Ketten gewöhnlich dadurch gebildet werden, daß man eine polymerisierbar Säure oder ein polycierisierbares Ar.".-drid r;it einem anderen mischpolymerisierbaren Monomer mischpolymerisiert und worin vorzugsweise die Ausgangssäure oder das Ausgangsanhydrid und jedes zusätzlicxie mischpolymeri si erbare Monomer ungesättigt sind und eine solche Polymerisation oder Mischpolymerisation eine derartige Ungesättigtheit beinhaltende Polymerisation oder Mischpolymerisation des Additionstyps darstellt.

Unter solchen Polymerisaten werden Polyelektrolyte bevorzugt, die Einheiten der allgemeinen Formel

O=C C=O

I I

aufweisen, worin: R. und R-g Wasserstoff, Halogen (vorzugsweise Chlor), Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen (vorzugs-

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weise Methyl), Cyano und/oder Phenyl sind, vorausgesetzt, daß nicht mehr als einer der Reste R, und Rg Phenyl ist, Z ein zweiwertiger Rest (vorzugsweise Alkylen, Phenylalkylen, wiedrigalkoxyulkylen und niedrigaliphatisch-Acyloxyalkylen), der eine Kohlenstoffkette mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen enthält, ,.obei die Kohlenstoff kette Teil einer Einheit bildet, die 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, q O oder 1 ist, X und Y Hydroxy, -O Alkalimetall, OR, -OH-KH₅, -OH-R₅F, -OH-R₉IJH, -OH-ILiH₀, -IiRR¹, -(Q) -W-(KR'R¹),. und/oder

-(Q) -'.V-(OH) sind, worin χ 1 bis 4 und ρ 0 oder 1, R P x

Alkyl, Phenylalkyl und/oder Phenyl in jedem Falle mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, R¹ H oder R, Q Sauerstoff oder -IiR¹, W ein zweiwertiger Seat, vorzugsweise ITiedrigalkylen, Phenyl, Phenylalkyl, Phenylalkylphciiyl und/oder Alkylphenylalkyl mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen ist, Z und Y zusammen ein Sauerstoffatom sein können

und wenigstens einer der Reste X und Y eine Hydroxylgruppe ist oder X und Y zusammen ein Sauerstoffatom bilden« Viele dieser Polymerisate sind im Handel erhältlich und andere sind einfache Derivate von im Handel erhältlichen Produkten, die leicht entv/eder vor oder gleichzeitig mit der Enzymoefestigungsreaktion oder als geringe Modifikation des Grundpolymerisats nach der Befestigung hergestellt v/erden können. Solche, die oben beschriebenen ÄMA-Typ-Einheiten enthaltende Polymerisate werden nachfolgend als"ÄMA-Typ-Polymerisat" bezeichnet.

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V/eil die Enzymmoleküle ein extrem hohes Molekulargewicht aufweisen, hat selbst dann, wenn die in beispielhafter ,/eise angegebene polymere Einheit, die zur Befestigung des Enzyms brauchbar ist, nur einmal in einer Polymerisatkette auftritt, beispielsweise einmal in mehreren Hundert Einheiten, die Reaktion des Enzyms mit dieser Einheit ein Enzym-Polymerisatprodukt zum Ergebnis, das eine wesentliche enzymatische 7/irksamkeit aufweist und \/orin der Enzymanteil einen wesentlichen Teil des Molekulargewichts des polymeren Enzymprodukts bildet» Wenn mehr als eine der in beispielhafter Weise angegebenen Einheiten vorhanden ist, können mehrfache Befestigungen .unter erhöhter enzymatischer Wirksamkeit des Produkts erreicht werden» Wie nachfolgend ausgeführt, sind vorzugsweise die Einheiten der angegebenen Formel wiederkehrend, wobei η wenigstens δ ist. Wenn die Einheiten wiederkehrend sind, müssen die Symbole in den verschiedenen wiederkehrenden Einheiten nicht notwendigerweise in allen wiederkehrenden Einheiten die gleiche Bedeutung haben. Y/eiterhin können, sofern die Einheiten wiederkehrend sind, einige der X- und Y-Gruppen Bedeutungen außer Hydroxy oder Sauerstoff haben₀ So können beispielsweise einige, aber nicht alle, in Form von Imidgruppen, d. h. von Gruppen vorliegen, in denen X und Y zusammen -ITR- oder -H-W-(KR¹R') sind, worin R, W und R¹ die vorausgehend angegebenen Bedeutungen haben.

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Eine bevorzugte Art von polymerem Material, das zur Durchführung der Erfindung brauchbar ist, ist das Polymerisat einer olefinisch ungesättigten PoIycarbonsäure oder ihrem Derivat mit sich selbst oder mit ungefähr äquimolaren Anteilen von wenigstens einem anderen damit mischpolymerisierbaren Monomere Das Polycarbonsäurederivat kann ein solches nicht benachbarter Art sein, einschließlich Acrylsäure, Acrylsäureanhydrid, Methacrylsäure. Crotonsäure oder ihren entsprechenden Derivaten, einschließlich Partialsalzen, Amiden und Estern oder von benachbarter Art, einschließlich Malein-, Itakon-, Zitrakon-, ajOc-Dimethylmalein-, oi-3utylmalein-j oi-Phenylmalein-, Fumar-, Akonit-, d,-Chlormal ein-, oi-Jronimalein-, ot-Cyanomaleinsäuren einschließlich ihren Partialsalzen, Amiden und Estern. Anhydride von allen vorausgehend erwähnten Säuren können vorteilhafterweise verwendet werden.

Zu den Komonomeren, die zur Verwendung mit den oben angegebenen funktionell en Monomeren geeignet sind, gehören ot-Olefine, v/ie Äthylen, Propylen, Isobutylen, 1- oder 2-Euten, 1-Hexen, 1-Octen, 1-Decen, 1-Dodecen, 1-Octadecen und andere Vinylmonomere, ?/ie Styrol, o<,-Methylstyro.l, Vinyltoluol, Vinylpropionat, Vinylamin, Vinylchlorid, Vinylformiat, Vinylacetat, Vinylalkyläther, z. B. Methylvinyläther, Alkylacrylate, Alkylmethacrylate, Acrylamide und Alkylacrylamide oder Gfemisohe dieser Monomere. Die Reaktionsfähigkeit einiger funktioneller Grruppen in den Mischpolymerisaten, die

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man aus diesen Monomeren erhält, ermöglicht die Bildung weiterer verwendbarer funktioneller Gruppen in dem gebildeten Mischpolymerisat, einschließlich Hydroxy-, Lacton-, Amin- und lactamgruppen»

Irgendeines der angegebenen mehrbasischen Säurederivate kann mit irgendeinem der anderen oben beschriebenen Monomere und irgendeinem weiteren Monomer, das ein Mischpolymerisat mit den dibasischen Säurederivaten bildet, mischpolymerisiert werden» Die polyoasischen Säurederivate können Mischpolymerisate mit einer Vielzahl von Komonomeren sein, wobei in diesem Falle die Gesamtmenge der Komonomeren vorzugsweise ungefähr äquimolar hinsichtlich der polybasischen Säurederivate ist» Obgleich diese Mischpolymerisate durch unmittelbare Polymerisation der verschiedenen Monomeren hergestellt werden können, werden sie häufig leichter durch eine spätere Reaktionsmodifikation eines bestehenden Mischpolymerisats hergestellt.

Mischpolymerisate von Anhydriden und einem weiteren Monomer können zu Carboxyl enthaltenden Mischpolymerisaten durch die Reaktion mit Wasser und zu Ammonium, Alkali und Erdalkalimetall und Alkylaminsalzen durcn die Reaktion mit Alkalimetallverbindungen, Erdalkalimetallverbindungen, Aminen oder Ammoniak usw. entweder vor, während oder nach der Enzymbefestigung umgewandelt werden. Zu weiteren geeig-

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neten Derivaten der vorausgehenden Polymerisate gehören die Partialalkyl- oder andere -ester und Partialamide, Alkylamide, Dialkylamide, Phenylalkylamide oder Phenylamide, die dadurch hergestellt werden, daß man Carboxylgruppen an der Polymerisatkette umsetzt i.iit den ausgewählten Aminen oder mit Alkyl-· oder Phenylalkylalkohol sowie Aminoestern, Aminoamiden, Hydroxyamiden und Hydroxyestern, worin die funktioneilen Gruppen durch ITiedrigalkylen, Phenyl, Phenylalkyl, Phenylalkylphenyl oder Alkylphenylalkyl getrennt sind, die in der gleichen Weise in jedem Falle unter Berücksichtigung der Erhaltung der Enzymbefestigungsstellen, wie vorausgehend festgestellt, hergestellt werdeiie Weitere Arylgruppen können anstelle der Phenylgruppen vorhanden sein. Besonders brauchbare Derivate jind solche, in denen negativ geladene Carboxylgruppen teilweise durch Amin- oder Aminsalzgruppen ersetzt werden. Diese werden dadurch gebildet, dai3 man die angegebenen Carboxylgruppen mit Polyamiden, wie Dimethylaminopropylamin oder Dialkylaminoalkoholen, wie Dimethylaminoäthanol umsetzt, wobei die ersteren eine Amidbindung mit dem Polymerisat und die letzteren eine Esterbinaung bilden» Die geeignete Auswahl der oben angegebenen Derivate ermöglicht die Steuerung der verschiedenen Verhaltensparameter für die Enzympolymerisatprodukte der Erfindung«

Typische zweibasische Säure- oder -anhydrid-Olefin-Polymerisate, besonders Maleinsäure oder -anhydrid-Olefin-Polymeri-

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sate der vorausgehend beschriebenen Art (AMA-Typ) sind bekannt, beispielsweise aus den TJS Patentschriften 2 378 629» 2 396 785, 3 157 595 und 3 340 680. Im allgemeinen v/erden die Mischpolymerisate in der Weise hergestellt, daß man Äthylen oder ein anderes ungesättigtes LIonomer oder Gemische desselben, wie vorausgehend beschrieben, mit dem Säureanhydrid in Gegenwart eines Peroxidkatalysators in einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel für die Monomeren, aber ITicht-Lösungsmittel für das gebildete Mischpolymerisat umsetzt. Zu geeigneten Lösungsmitteln gehören Benzol, Toluol, Xylol, chloriertes Benzol und dergleichen,, Während Benzoylperoxid gewöhnlich der bevorzugte Katalysator ist, sind andere Peroxide, wie Acetylperoxid, Butyrylperoxid, di-tertiäres Butylperoxid, Lauroylperoxid und dergleichen oder irgendeiner der zahlreichen Azokatalysatoren zufriedenstellend, weil sie in organischen Lösungsmitteln löslich sind« Das Mischpolymerisat enthält vorzugsweise im wesentlichen äquimolare Mengen des Olefinrestes und des Anhydridrestes. Im allgemeinen wird es einen Polymerisationsgrad von 8 bis 10 000, vorzugsweise von ungefähr 100 bis 5 000 und ein Molekulargewicht von ungefähr 1 000 ois 1 000 000, vorzugsweise von ungefähr 10 000 bis 500 000, aufweisen. Die Eigenschaften des Polymerisats, wie beispielsweise das Molekulargewicht, werden durch die geeignete Auswahl des Katalysators und durch die Steuerung von einer oder mehreren der Veränderlichen, wie des Yer-

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hältnisses der Reaktionspartner, Temperatur und Katalysatorkonzentration oder der Zugabe γοη regulierenden Kettenübertragungsmitteln, wie Diisopropylbenzol, Propionsäure, Alkylaldehyden oder dergleichen, reguliert. Das Produkt wird in fester Form erhalten und durch Filtrieren, Zentrifugieren oder dergleichen gewonnene Die Entfernung irgendeines Rückstands oder haftenden Lösungsmittels kann durch Verdampfen unter Verwendung mäßiger Erhitzung bewirkt wer-· den. Zahlreiche Polymerisate dieser Art sind im Handel er- * hältlicho Besonders wertvolle Mischpolymerisate sind solche aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid in ungefähr äq^uimolaren Verhältnissen» Las Produkt ist kommerziell verfügbar.

Die so erhaltenen Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisate haben wiederkehrende Anhydridbindungen in aem Molekül, die leicht durch Wasser hydrolysiert werden unter Bildung der Säureform des Mischpolymerisats, wobei die Hydrolyseerungs- -■* geschwindigkeit proportional zu der Temperatur ist. Im Hinblick auf die Tatsache, daß die Befestigungsreaktionen der vorliegenden Erfindung in wäßrigen Lösungen oder Suspensionen oder unter Verwendung von Wasser-Lösungsmittelgemischen durchgeführt werden, weist das Produkt der Reaktion oder der Kupplung des Enzyms mit ÄMA an ihren Ketten in Kachbarschaft zu dem befestigten Enzym angeordnete Carboxyl- oder Garboxylatgruppen auf, anstelle von Anhydridgruppen, infolge der Hydrolyse der Anhydridgruppen, die nicht mit

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den Enzymen während der Reaktion reagieren. Das G-leiclie gilt für nicht reagierende Anhydridgruppen, die in anderen Polymerisaten vorhanden sind, wie in AIIA-Typ-Polymerisaten, die zu Carboxyl- oder Garboxylatgruppen während eier Reaktion hydrolysieren.

Die Bezeichnung "wasserunlöslich" bedeutet, wie bereits festgestellt, daß das in Betracht kommende Produkt sich nicht in Wasser oder v/äßrigen Lösungen löst₀ Das "wasserunlösliche" Enzym-Polymerisat kann durch Verf^iiren einschließlich Filtrieren, Zentrifugieren oder Sediment!eren abgetrennt v/erden. Derartige Eigenschaften v/erden durch Vernetzung verliehen.

Die Bezeichnung "wasserlöslich", wie sie hier verwendet wird, bedeutet, daß das in Betracht kommende Enzym-Polymerisat sich in Wasser oder wäßrigen Lösungen löst. v7ie allgemein üblich, bedeutet diese Bezeichnung jedoch nicht, daß sich das Produkt vollständig in allen Konzentrationen oder bei allen pH-Werten löst. Andererseits sind diese wasserlöslichen Produkte dadurch gekennzeichnet, daß sie bei einer Vielzahl ύοώ. Konzentrationen und pH-Werten löslich sind und daß sie im allgemeinen bei pH-V/erten von 7 oder höher löslich sind·

Es werden daher wasserunlösliche Enzym-Polymeriaatprodukte, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet

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sind, dadurch hergestellt, daß man die Enzyme mit einem wasserunlöslicnen Polymerisat umsetzt oder dail man das Reaktionsprodukt der Enzyme und das Polymerisat veranlaßt, entweder durch Reaktion mit einem polyfunktionellen Vernetzungsmittel, wie einem Polyarnin oder Polyol (einschließlich Grlykol), soweit dies .notwendig ist, unlöslich zu werden. Das Enzym-Polyrierisatprodukt ist häufig wenigstens teilweise als solches wegen der Einwirkung bzw. Reaktion des Enzymanteils auf bzw. mit den zusätzlichen Polymerisatketten unlöslich» "iiemi das Polymerisat so vorvernetzt ist, daß es eine dreidimensionale Struktur oder in manchen Fällen eine ausreichend lange lineare Zettenlänge hat, ist das Ausgangspolymerisat bereits wasserunlösliche Es gibt weitere Verfahren zur Vernetzung und diese sind dem Fachmann bekannte Weitere eingehende Beschreibungen folgen«

Die Unlöslichmachung über Vernetzung kann in drei Stufen bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Produkte durchgeführt werden:

1) Das Polymerisat kann vor dem Befestigen des Enzyms durch irgendeines der verschiedenen dem Fachmann bekannten Verfahren für Polymerisatreaktionen vernetzt v/erden, (z. B. durch Einverleiben von multifunktionellen ungesättigten Monomeren während der Herstellung des Polymerisats oder durch nachfolgende Reaktion des Polymerisats mit wenigen Mol$ multifunktionellen Aminen, G-lykolen usw.)ο

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2) Ivlultifunktionelle Amine, Glykole usw» können gleichzeitig mit dem Enzym in der Enzymbefestigungsstufe zugeführt werdenο

3) Ein inultifunktionelles Vernetzungsmittel kann dem Produkt zugeführt v/erden, nachdem das Enzym befestigt v/urde. Solche Vernetzungsmittel werden in gesteuerten Mengen ausreichend zur Unlöslichmachung des Produkts zugegeben.

Zusätzlich ist der zur Befestigung bzw» Kupplung mit dem Polymerisat vorgesehene Enzym-Reaktionspartri^r gewöhnlich als solcher multifunktionell und trägt daher zu dem dreidimensionalen Vernetzungscharajixer des Produktes bei. Tatsäcnlich ist in vielen I¹ all en die in dieser V/eise bewirkte Unlöslichkeit ausreichend, um dem Enzym-Pol./irierisatprodukt ohne Verwendung zusätzlicher Vernetzungsmittel Unlöclichkeitseigenschaften zu verleihen,=

Es ist oftmals vorteilhaft, Mischpolymerisate zu verwenden, die bereits eine gewisse Vernetzung enthalten. Solche vernetzte Mischpolymerisate sind bekannt und mittels Durchführung der Polymerisation zu erhalten, z, B. durch die Liischpolymerisation von Maleinsäureanhydrid und Olefinkohlenwasserstoff in Gegenwart eines Vernetzungsmittels, Zo Β. einer Verbindung, die zwei olefinische Doppeloindungen enthält, wie Divinylbenzol oder Vinylcrotonat, PoIj'-1,2-butadien oder Alpha,Omega-Diolefine. Die Menge Ver-

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notzungsmittel kann sich mit dem Grad der gewünschten Unlöslichkeit ändern, wird aber im allgemeinen im Bereich von ungefähr 0,1 ois 10 Gew.?'i, bezogen auf das Gesamtmonomergemisch, liegen.

Beispielsweise kann als Verfahren zur Herstellung der dreidimensionalen Polymerisatvernetzung, wo diese erforderlich oder wünschenswert ist, eine difunktionelle Verbindung zur Vernetzung eines vorgeformten dibasische Säure/Cp-CLo-' Monoolefinmischpolymerisats verwendet werden. Dieses kann durch die Reaktion des Mischpolymerisats mit einem Polyamin, ζ« B. mit 0,1 bis 10 llol'fo Äthylendiamin, erreicht werden. Es kann auf diese Weise das Ausmaß der Vernetzung des Gesamt polymerisat s gesteuert werden. Es ist klar, daß Äthylendiamin ein typisches Beispiel für ein Vernetzungsmittel ist, aber viele weitere Verbindungen, wie die Gruppe von Alkylen und anderen ähnlichen Polyaminen, können für diesen Zweck verwendet werden. Lösliche Enzym-Polymerisatprodukte können andererseits vorteilhafterweise durch etwas unterschiedliche Arbeitsverfahren hergestellt werden.

Zur Herstellung löslicher Enzym-Polymerisatderivate wird äaher die Reaktion im wesentlichen unter nicht vernetzenden Bedingungen durchgeführt. Die unerwünschte Vernetzung kann auch dadurch verringert werden, daa man die Befestigungsreaktion in hoher Verdünnung durchführt, so daß weniger Reaktionen zwischen den verschiedenen Polymerisatmolekülen und

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einem einzelnen Enzymmolekül eintreten« ',Yalilweise begünstigen höhe Verhältnisse Enzym zu Polymerisat die Reaktion der verschiedenen Enzymmoleküle mit einem einzelnen Polymerisatmolekülo Man erhält auf diese '>7eise ein agglomeriertes Enzym/Polymerisat-System, das die gewünschten Löaungseigenschaften der einzelnen Enzymmoleküle beibehält» ,/ährend solche Verfahren, wie sie oben beschrieben sind, oftmals v/ünscuenswert sind, ist es nicht iniaer notwendig, verdünnte Lösungen oder hohe Enzym/Polymerisat-Verhältnisse zur Bevvirkung der Bildung löslicher Enzym-Polymerisat derivate zu verwenden. Die normalerv/eise löslichen Enzym-Polymerisatderivate werden natürlich durch Kuppeln mit dem siliciumhaltigen Material unlöslich gemacht.

Geeignete Kitτel zum Kuppeln des Enzym-Polymerisats mit dem siliciumhaltigen iuaterial, wie Giasperlen oder Pasern, Diatomeenerde, Sand, Tone, Asbeste und dergleichen,sind substituierte Organosilane der nachfolgenden allgemeinen formel

Χ· - Si -[E^ - Ζ·]

worin-X* eine hydrolysierbare Gruppe ist, die zur Umsetzung mit einer Hydroxylgruppe geeignet ist, Y* Wasserstoff oder eine einwertige Kohlenwasserstoffgruppe, R¹ eine Alkylengruppe mit 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen und Z¹ eine zur Umsetzung mit dem voraus erwähnten Polymerisat geeigne-

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te funktionelle Gruppe, η eine ganze Zahl von O oder 1,

a eine ganze Zalil von 1 "bis 3» b eine ganze Zahl von O bis

2, c eine ganze Zahl von. 1 bis 3 und die Summe von a + b + c gleich 4 ist_e

Zu Beispielen geeigneter X'-G-ruppen gehören Halogen-, Hydroxy-, Alkoxy-, Cycloalkoxy-, Aryloxy-, Alkoxy-substituiertes Alkoxy- wie ώ-LIethoxytithoxy oder dergleichen, Alkoxy— carbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Alkylcarboxylat- und ^rylcarboxylatgruppen, vorzugsweise mit 8 oder weniger Kohlenstoffatomen.

Beispiele geeigneter Y¹-Gruppen in der vorausgehenden formel sind Wasserstoff, iIethyl-₅ Äthyl-, Vinyl-, Isobutyl-, und andere Hydrocarbylgruppen, vorzugsweise mit 10 oder weniger Kohlenstoffatomen.

Die R'-o-ruppe in der vorausgeiienden Formel kann irgendeine Alkylengruppe mit bis zu ungefähr 20 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise von ungefähr 2 bis ungefähr 18 Kohlenstoffatomen sein. Zu Beispielen solcher Gruppen gehören Äthylen, die Propylene, die Butylene, die Decylene, die Undecylene, die Octadecylene und dergleichen.

Die Z'-Gruppe kann irgendeine zur Umsetzung mit dem voraus bezeichneten Polymerisat geeignete funktioneile Gruppe sein. Beispiele solcher Gruppen sind Amino-, primäre und sekun-

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däre Amido-, Epoxy-, Isocyanat-, Hydroxy-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Vinyl-, Allyl- und Halogen- wie Ghlor- und Bromgruppen und dergleichen.

Besonders bevorzugte Organosilan-Kupplungsinittel für die Zwecke dieser Erfindung sind die Omega-Aminoalkyl- und Aminoaryltrialkoxysilane wie Gamma-Aminopropyltrimethoxysilan, Aminophenyltriäthoxysilan und dergleichen.

Zu den siliciumhaltigen Materialien, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören Siliciumdioxid in Form .,von Sand, Pasern, Geweben oder dergleichen, Glas in Form von Geweben, Pasern, Matten oder dergleichen, Diatomeenerde, Asbest, ebenso Silikate v/ie V/ollastonit, Posterit, Peldspat, tiullit, verschiedene Tonarten einschließlich Bentonit, Kaolin usw.. Das Haupterfordernis an das siliciumhaltige Material besteht darin, daß Oberflächen-Hydroxylgruppen vorhanden sind, die mit den hydrolysierbaren Gruppen an dem Organosilan-Kupplungsmittel reaktionsfähig sind.

Das siliciumhaltige Material kann mit dem Organosilan-Kupplungsmittel in jeder geeigneten Weise behandelt werden, wozu man das erstere mit dem letzteren zur Erhaltung der gewünschten Bindung in Kontakt bringt. Gewöhnlich wird das Organosilan in einem inerten Lösungsmittel, v/ie Toluol, Xylol oder dergleicnen gelöst, und die ernaltene lrösung wird dann

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auf das siliciumhaltige Material aufgebrachte Wäßrige Lösungen des oilans können ebenso verwendet werden₀

Die Menge an verwendetem Kupplungsmittel ist abhängig von der Art und der Oberfläche des siliciumhaltigen Materials und ebenso natürlich von dem jeweiligen Polymerisat, auf de.m zuletzt das Material befestigt werden soll. Gewöhnlich sind wenigstens ungex'ähr 0,01 Gew.^ Kupplungsmittel, bezogen auf das Gewicht des siliciumhaltigen Materials, 'erwünschte Mengen im Bereich von ungefähr 0,25 bis ungefähr 2,0 Gew.^ werden bevorzugte

Die Enzym-Polymerisatprodukte dieser Erfindung können in der V/eise .hergestellt werden, daß man das geeignete Organosilan-behandelte siliciumhaltige Material mit reaktionsfähigen Gruppen an der Oberfläche bildet und dieses Material mit dem voraus bezeichneten Polymerisat so umsetzt, daß das behandelte siliciumhaltige Material im wesentlichen damit beschichtet wird. Danach wird das gewünschte Enzym an der Polymerisatbeschichtung befestigt, wozu man reaktionsfähige Gruppen des Enzyms, die für die enzymatisch^ Wirksamkeit nicht v/es entlich sind, mit den reaktionsfähigen Gruppen des Polymerisats umsetzt.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein,wie vorausgehend angegeben, hergestelltes Enzym-Polymerisat mit einem Organosilan-behandelten siliciumhaltigen Material so

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in Kontakt gebracht, daß die Organosilan-re&ktionsfähigen Gruppen mit dem Polymerisat reagieren und dadurch kovalent das Polymerisat mit der Oberfläche des behandelten siliciumhaltigen Materials binden»

Wie oben bereits angegeben, gehören zu den Enzymen, die zur Kupplung nach dieser Erfindung geeignet sind, Enzyme (z. 3. Papain, Picin, Bromelain usw.), tierische Enzyme (z. 3„ Trypsin, Chymotrypsin, Pancreuspepsin, Pancreuslipase usw„) und mikrooische Enzyme (z. 3₀ oakterielle oder Pilzproteasen, Amylasen, Lipasen, CellulasenXxsw.). Die Bedingungen für die Befestigung der jeweiligen Enzyme mit den spezifischen Polymerisat-beschichteten, behandelten, siliciumhaltigen Materialien ändern sich beträchtlich, abhängig von der Beschaffenheit des Enzyms und der Eigenschaft der verwendeten polymeren Beschichtung,

Die Produkte dieser Erfindung und ein Verfahren zur Herstellung dieser Produkte werden weiterhin durch die folgenden Beispiele erläutert, in denen ein im Handel erhältliches Β« subtilis-Enzymgemisch, das neutrale Protease (1,27 x 10 Einhei t en/G-r amm), alkalische Protease (0,30 χ 10⁶ Einheiten/Gramm) und Amylase (0,31 x 10⁶ Einheiten/ Gramm) zur Herstellung unlöslicher, enzymatisch wirksamer Produkte enthält, verwendet v/urde.

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Beispiel 1 - EnzyniDindung an Galciumsilikat Calciumsilikat (5»O g) gekuppelt mit 0,25 Gew_o$ Gamma-Aminopropyltrimetiioxysilan und Β_β subtilis-Enzymgemiscli (1,0 g) werden in 20 ml einer Dimethylsulfoxid-(DLISO)-Lösung von AUA (DLiSO:AM G-ew./Gew.-Verhältnis 5:1) angeschlämmt. Die erhaltene Schlämme v/ird bis zur Gelierung gerührt, die nach ungefähr 8 Minuten stattfindet.

Danach wird das gebildete Gel in einem Laboratoriumsmischgerät mit gestoßenem Eis, Wasser (150 ml) und n-Propanol (75 ml) für 45 Sekunden gemischt, Wasser (300 ml) zugegeben und das erhaltene Gemisch 72 Std. Dei 4 0 gerührt. Das Gemisch wird dann zentrifugiert unu. die Peststoffe lyophilisierto Ungefähr 4»3 g festes Produkt mit einer Proteaseaktivität. von ungefähr 1000 Einheiten pro Gramm werden erhaltene

Beispiel 2 - Enzymbindung an Siliciumdioxid In ähnlicher V/eise v.ie in Beispiel 1, aber unter Verwendung von partikelförmigem Siliciumdioxid als siliciumhaltigen Material unter Behandlung des Materials mit Gamma-Aminopropyltrimetlioxysilan und durch Inkontaktbringen des behandelten Materials mit einem B. subtilis-Enzymgemisch in einer Dirnethylsulfoxidlösung von AiA wird ein unlösliches, enzymatisch wirksames Produkt erhalten.

Beispiel 3 - Enzymbindung an Wollastonit In ähnlicher Weise, wie in Beispiel 1, aber unter Verwendung

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von Gamma-Aminopropyltrimethoxysilan und -unter Behandlung von Wollastonit und danach durch Inkontaktbringen des behandelten Wollastonit mit B. subtilis-Enzymgemisch in einer DimethylsulfoxidlöBung von MiA wird ein unlösliches, enzymatisch wirksames Produkt erhalten.

Die vorausgehenden Beispiele erläutern die Erfindung in mehr ins einzelne gehender Weise, ohne sie einzuschränken.. Die Erfindung beinhaltet alle Abweichungen und Änderungen von den Beispielen, soweit die Abweichungen von dem allgemeinen Erfindungsgedanken Gebrauch machen«

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Claims (2)

- 37 Patentansprüche;

1. Unlösliche, enzymatisch wirksame Zusammensetzung gekennzeichnet durch ein siliciumhaltiges Material, ein Organosilan, das an dessen Oberfläche gehalten ist, ein Polymerisat, das Carboxyl- oder Anhydridbindungen enthält und kovalent mit dem Organosilan verbunden ist und ein Enzym, das kovalent mit dem Polymerisat verbunden ist„

2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat ein Äthylen/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat, das Organosilan Qmega-Aminoalkyltrialkoxysilan, vorzugsweise G-amma-Aminopropyltrimethoxysilan, das Enzym eine Protease, vorzugsweise ein Gemisch von neutraler Protease, alkalischer Protease und Amylase und das siliciumhaltige Material Oalciumsilikat ist.

3ο Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen, enzymatisch wirksamen, zusammengesetzten Produkts dadurch gekennzeichnet, daß man ein siliciumhaltiges Material mit einer hydrolysierbaren Gruppe eines Organosilans, das eine funktionelle Gruppe auf v/eist, umsetzt, die funktioneile Gruppe des Organosilans mit einem Polymerisat, das Garboxyl- oder Anhydridgruppen aufweist, umsetzt und ein Enzym mit einer reaktionsfähigen Gruppe, die für die enzymatische ■ Wirksamkeit nicht wesentlich ist, durch Umsetzen der reak-

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- 38 tionsfähigen Gruppe an dem Polymerisat befestigt.

4o Verfahren gemäß Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymerisat Äthylen/ilaleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat, als siliciumhaltiges Material Galciumsilikat, als Organosilan Omega-Aminoalkyltrialkoxysilan, vorzugsweise
Gamina-Aminopropyltrimethoxysilan und als Enzym eine Protease, vorzugsweise ein Gemisch von neutraler Protease, alkalischer Protease und Amylase verwendet«

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