DE2106214A1

DE2106214A1 - Befestigung von Enzymen an silicium haltigen Materialien unter Verwendung von Akti vierungsmitteln

Info

Publication number: DE2106214A1
Application number: DE19712106214
Authority: DE
Inventors: John Herschel St Louis. Miller Robert Everett Ballwin Mo Reynolds (V St A)
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1970-02-11
Filing date: 1971-02-10
Publication date: 1971-08-19
Also published as: NL7101680A; FR2078427A5; IT987515B; JPS5533878B1; BE762744A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE B MÜNCHEN 8O, MAUERKIRCHERSTR. 45

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 80, Mauerkircherstraße 45 ·

Ihr Zeichen Ihr Schreiben Unser Zeichen 20 606 Dahin. 1 0* p66. 1971

Anwaltsakte 20 606

Monsanto Company St. Louis, Miss./USA

Befestigung von Enzymen an siliciumhaltigen Materialien unter Verwendung von Aktivierungsmitteln

Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme, die durch. Befestigung an siliciumhaltiges Material unlöslich gemacht wurden.

Die verschiedenen Aktivitäten und Verwendungen der Enzyme sind besonders gut erforscht und in Druckschriften niedergelegt. Die Enzyme sind der Beschaffenheit nach

Case 11-21-0132 Be/My 109834/1206 ~²~

β (0811) 48 82 72 (98 8272) 48 70 43 (98 70 43) 48 3310 (983310) Telegrammti BERGSTAPFPATENT München TELEX 05 24 540 BERG d Banki Bayerisch« Vertinibank Manchen 453100 Poihnhedci München 653 43

Proteineund wasserlöslich, so daß ihre Verwendung weiterhin durch Yerlust oder Aufbrauchen des Enzyms beeinträchtigt wird, Neuerdings wurden Versuche vorgenommen, die Wirksamkeit der Enzyme zu verlängern und sie unlöslich und damit zur Wiedergewinnung und Wiederverwendung geeignet zu machen, wozu man Enzyme an verschiedenen organischen Polymerisaten befestigt. Derartige Bemühungen haben zu einem größeren oder geringeren Erfolg geführt, weil sie durch die hohen Kosten der organischen Materialien, die zur Kombination mit den Enzymen zur Bildung eines unlöslichen Produkts vorgesehen sind, beeinträchtigt werden. Es wäre daher besonders erwünscht, unlösliche, langwirksame und wiederverwendbare Enzymformen zur Verfügung zu haben, die nicht den Fachteil hoher Kosten haben. Es wäre weiterhin vorteilhaft, derartige Snzymatisch wirksame Materialien in Partikelform zur Verfügung zu haben, die einen schnellen Kontakt des Substrats mit dem unlöslich gemachten Enzym ermöglichen würden. Enzymatisch wirksame Materialien mit den vorausgehend aufgezeigten Vorteilen werden durch die vorliegende Erfindung geschaffen.

Es ist demgemäß ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, unlösliche, enzymatisch wirksame, zusammengesetzte Produkte zu liefern. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung solcher Produkte zur Verfügung zu stellen.

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Die vorliegende Erfindung stellt unlösliche, enzymatisch wirksame Produkte zur Verfügung, worin ein Enzymanteil kovalent an ein Organosilan gebunden ist, das seinerseits auf der Oberfläche eines eiliciumhaltigen Materials gehalten wird· Die Produkte werden dadurch hergestellt, daß man reaktionsfähige Gruppen auf dem siliciumhaltigen Material durch Reaktion zwischen dem Organosilan und dem eiliciumhaltigen Ausgangsmaterial einführt. Danach folgt eine Reaktion des Enzyms in Gegenwart eines Aktivierungsmittels mit einer funktionellen Gruppe an dem Organasilan. Die Produkte der Reaktion sind unlösliche, wisierverwendbare, langwirkende enzymatisch wirksame Produkte, in denen das Enzym kovalent gebunden ist. Solche enzymatisch wirksamen Produkte können geeigneterweise in Partikelform gebildet werden, um den schnellen und vollständigen Kontakt mit einem Substrat, auf dem die enzymatische Wirkung gewünscht wird, zu erleichtern.

Zu siliciumhaltigen Materialien, die zur Herstellung der Produkte dieser Erfindung verwendet werden können, gehören granuliertes oder faseriges Siliciuadioxyd und Silikate wie Sand, Glasgewebe, Fasern, Matten und dergl., Asbest, Diatomeenerde, Wollastonit, Fosterit, Feldspat, Mullit, verschiedene Tonarten einschließlich Bentonit, Kaolin und so weiter. Das Haupterfordern!« an das siliciumhaltige Material besteht darin, daß Oberflächen-

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Hydroxylgruppen vorhanden sein müssen, die mit den hydrolysierbaren Gruppen an einem Organosilan reaktionsfähig sind, das als Kupplungsmittel dient«

Das siliciumhaltige Material kann mit dem Organosilan in jeder geeigneten Weise durch Kontakt des ersteren mit dem letzteren umgesetzt werden, wodurch man die gewünschte Bindung durch die hydrolysierbaren Gruppen des Organosilans erhält« Gewöhnlich wird das Organosilan in einem inerten lösungsmittel wie Toluol, Xylol und dergl. gelöst , und die erhaltene Lösung wird dann auf dem siliciumhaltigen Material aufgebracht. Wäßrige Lösungen des Silane können ebenso verwendet werden.

Die Menge an verwendetem Organosilan-Kupplungsmittel ist abhängig von der Art und der Oberfläche des siliciumhaltigen Materials. Gewöhnlich sind wenigstens ungefähr 0,01 Gew.# Organosilan, bezogen auf das Gewicht des siliciumlialtigen Materials, erwünscht. Mengen im Bereich von ungefähr 0,25 bis ungefähr 2,0 Gew.i» werden bevorzugt.

Geeignete Organosilane sind substituierte Organosilane der nachfolgenden allgemeinen Formel

Τ*

- ^Si -

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X eine hydrolysierbare, zur Umsetzung mit einer Hydroxylgruppe geeignete Gruppe ist, Y Wasserstoff oder eine einwertige Kohlenwasserstoffgruppe, R eine Alkylengruppe mit 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen, Z eine funktionelle, zur Umsetzung mit dem Enzym geeignete Gruppe, η eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 oder 1, a eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 3, b eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 2, c eine ganze Zahl mit einem Wert i von 1 bis 3 bedeuten und die Summe von a + b + c = 4 beträgt.

Zu Beispielen geeigneter X-Gruppen gehören Halogen-, Hydroxy-, Alkoxy-, Cycloalkoxy-, Aryloxy-, alkoxysubatituierte Alkoxy- wie ß-Methoxyäthoxy oder dergl·, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Alkylcarboxylat- und Arylcarboxylatgruppen, vorzugsweise mit 8 oder weniger Kohlenstoffatomen.

Zu Beispielen von geeigneten Y-Gruppen in der vorausgehenden Formel gehören Wasserstoff, Methyl-, JLthyl-, Vinyl-, Isobutyl- und weitere Hydrocarbylgruppen, vorzugsweise mit 10 oder weniger Kohlenstoffatomen.

Die S-Gruppe in der vorausgehenden Formel kann jede Alkylengruppe mit bis zu ungefähr 20 Kohlenstoffatomen sein und enthält vorzugsweise von ungefähr 2 bis ungefähr 13

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Kohlenstoffatome. Beispiele solcher Gruppen sind Äthylen-, Propylen-, Butylen-, Decylen-, Undecylen-, Octadecylengruppen und dergl.

Die Z-Gruppe kann irgendeine funktioneile Gruppe sein, die zur Umsetzung mit dem Enzym ohne wesentliche Beeinträchtigung dessen Aktivität geeignet ist. Beispiele für solche Gruppen sind Amino-, primäre Amido-, Epoxy-, Isocyanat-, Hydroxy-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Halogen- wie Chlor- oder Brom-Gruppen und dergl.

Besonders bevorzugt als derartige funktionel-le Gruppen sind Aminogruppen, die mit einer Carboxylgruppe des Enzyms reagieren können, wobei die Carboxylgruppe für die enzymatisch« Wirksamkeit nicht wesentlich ist«

Besonders bevorzugte Organoeilane für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die omega-Aminoalkyl- und Aminoaryltrialkoxysilane wie gamma-Aminopropyltrimethoxysilan, Aminophenyltriäthoxysilan und dergl·

Bas wirksame Enzym kann aus jeder geeigneten Quelle, sei es pflanzlich, tierisch oder mittels Mikroben, erhalten werden. Viele derartige Enzyme sind im Handel erhältliche, (Typisch sind die Proteasen, ζ «Β. saure und/oder neutrale und/oder alkalische Proteasen. In manohen Pällen kann

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ein weiteres unterschiedlich aktives Enzym wie beispielsweise Amylase damit gemischt werden, um den enzymatisohen Wirksamkeitsbereich des Produkts zu vergrößern· Weitere Enzyme wie Lijiase oder Cellulase können anstelle oder zusätzlich zu der Amylase verwendet werden. Weitere geeignete Enzyme sind Carbohydrase, Lipaee, Esterase, Nuclease oder andere Hydrolase-Arten. Eine Hydrase, Oxidreductase oder Demolase oder eine Transferase oder Isomerase kann abhängig von der vorgesehenen Endwirksamkeit und von der Anwendung ebenso verwendet werden.

Viele derartige Enzyme können geeigneterwelse aus Mikroorganismen erhalten werden, wozu Bakterien, Hefen, Pilze und dergl. gehören, wozu man bekannte fermentationsverfahren verwendet, wie sie im allgemeinen in Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 8, 173-204, beschrieben sind und eine große Vielzahl durch Mikroben gebildete Enzyme sind im Handel erhätlich·

Sie genaue Wirksamkeit des als Ausgangsmaterial verwendeten Enzyms oder der verwendeten Enzyme hängt von dem exakten Herstellungsverfahren ab und ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, vorausgesetzt, daß die hieraus hergestellten, enzymatisch wirksamen Produkte die gewünschte enzymatische Wirksamkeit aufweisen· Verschiedene analytische Verfahren stehen zur Bestimmung

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der Aktivität des enzymatisch wirksamen Materials zur Verfügung, und es kann beispielsweise die Protease-Aktivität von proteolytischen Enzymen nach den bekannten Caseindigestionsverfahren "bestimmt werden. Bei diesen Untersuchungen katalysiert eine Protease die Hydrolyse von Casein, während einer bestimmten Dauer, und einer bestimmten Temperatur und bei einem bestimmten pH-Wert. Die Reaktion wird durch Zugabe von Trichloressigsäure angehalten und die Lösung filtriert. Die Farbe des FiI-trats wird durch Folin-Phenolreagens entwickelt und die Höhe der Enzym-Aktivität wird Bpektrophotometrisch in Einheiten Caseintyrosin gemessen. Dieses Verfahren ist eingehender in dem Journal of General Physiology, 3Ό, 291 (1947) und in Methods of Enzymology 2_, 33, Acedemic Press, K.y.(1955) beschrieben. Die Amylase-Wirksamkeit wird im allgemeinen durch das allgemein bekannte Dinitrosalicyleäure-Verfahren von Bernfeld bestimmt. Weitere Untersuchungsverfahren sind dem Fachmann bekannt, ebenso einige nachfolgend angegeben.

Eine besonders wirksame Quelle für gemischte Enzyme, die als Ausgangsmaterial in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, ist ein mutatierter Bacillus subtilis-OrganismuB. Das Verfahren zur Herstellung dieses Organisaue und der Enzyme ist in der US-Patentschrift 3 031 380 beschrieben. Sine Kultur dieses Bacillus sub-

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tilis (Stamm IM)-Organismus ist bei dem United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, niedergelegt und hat zur Kennzeichnung die Nummer NHEL Β—3411. Ss wurde festgestellt, daß das durch diesen Organismus gebildete enzymatisch wirksame Material im allgemeinen aus zwei Proteasen besteht, ungefähr 65 bis 75$ neutrale Protease (Aktivität bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5) und ungefähr 25 bis 35# alkalische Protease (Aktivität bei einem pH-Wert von 9 bis 10). Es ist ebenso eine bedeutende Menge an Amyläse vorhanden. Das Produkt enthält im allgemeinen ungefähr 700 000 bis ungefähr 1,2 Millionen Einheiten neutral· Protease-Aktivität/g isolierter Peststoffe und ungefähr 250 000 bis ungefähr 4OO 000 Einheiten alkalisch· Protease-Aktivität/g, wobei die Aktivität durch die Anson'sche Variation des Kunitz'sehen Casein-Verfahrens bestimmt wurde. Im allgemeinen sind weiterhin ungefähr 300 000 bis 350 000 Einheiten Amylase-Aktivität/g, bestimmt mittels des Bernfeld-Verfahrens, vorhanden. Wie in dem angegebenen Patent ausgeführt, variieren die relativen Anteile der Protease zur Amylase in Abhängigkeit von den exakten Aufwuchsbedingungen des Organismus, jedoch wurde festgestellt, daß die neutrale und alkalische Protease und die Amylase wenigstens in gewissem Ausmaß immer ohne Rücksicht auf Änderungen in dem Kulturmedium

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und andere Wuchsbedingungen des Mikroorganismus gebildet werden.

Eine weitere Quelle für gemischte Enzyme, die als Ausgangsmaterialien für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, ist B. subtilis Stamm NBBIi 644» B.subtilie Stamm KBBL 941» B. subtilis Stamm IAM 1523 (Japanische Kultursammlung)· Es stehen noch weitere B.subtilis-Mikroorganismen zur Verfügung, die Protease, ein Gemisch von Proteasen oder Protease und Amylase wenigstens in einem eingeschränkten, wenn nicht optimalen Ausmaß liefern. Die so bezeichnete Streptomyoes griseus-Neutraiprotease hat einen breiten pH-Wirksamkeitsbereich und kann als Ausgangsenzym der Einverleibung in die Produkte dieser Erfindung dienen·

Weitere typische Enzyme sind !Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, Oarboxypeptidas«, Bennin und dergl.

TJm die gewünschte !covalentβ Bindung zwischen dem Enzym und dem Organosilan, das mit dem siliciumhaltigen Material umgesetzt wurde, zustand· zu bringen, kann ein Aktivator für die reaktionsfähigen Gruppen an dem Enzymmolekül verwendet werden»

Sie kovalente Bindung findet gewöhnlich zwischen einer

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Carboxylgruppe an dem Enzymmolekül, die für die Enzymwirksamkeit nicht wesentlich ist» und einer Aminogruppe oder dergl. an dem Organoeilan unter Bildung einer Amidbindung zwischen den beiden statt. Es kann auch eine Amidbindung dadurch gebildet werden, daß man eine Aminogruppe des Enzyms, die für die Enzymwirksamkeit nicht wesentlich ist, mit einer Carboxylgruppe eines geeigneten Organosilane umsetzt.

Geeignete Carboxylaktivatoren sind die 3-nichtsubstituierten Isooxazoliumsalze, im besonderen die N-(niedrig-Alkyl)-5-hydroxyearfcyl-is©ozazoliumsulfonate wie N-Äthyl-5-phenylisooxazo!ium-3-3ul£onate, H-tert.-Butyl-5-methylisooxazolium-3-sul£onat und dergl., die Carbodiimide wie 1-Äthyl~3~(3-dimethyiaiainopropyl)-carbodiimid, 1-Cyclehexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat, 1-Propyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid und dergl., die Carbodiimidazole wie 1-Äthyl-3-(3-diaethylaminopropyl)-carbodiimidazol, 1-Me thyl-3-(3-dimethylaminopropyl )-carbodiimidazol und dergl·, sowie die Gemische nitratierter Phenole wie Dinitrophenol mit Carbodiimiden und die Gemische von halogenierten Phenolen wie Sichlorphenolen alt Carbodiimide^

Sie Menge des rerwendeten Carboxylaktivators kann in einem weitem Bereich variieren. Es wird jedoch vorgezogen,

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daß das Verhältnis des Carboxylaktivators zu den Carboxylgruppen, bezogen auf Moiargewichtsbasis, weniger als 1:1 und insbesondere weniger als 0,5:1 ist, d.h. vorzugsweise in einem Bereich von ungefähr 0,5:1 bis ungefähr 0,025i1 liegt. Ein besonders bevorzugter Bereich ist ungefähr 0,4:1 bis ungefähr 0,04:1.

Die Enzymbefestigung an der Organosilan-funktionelle Gruppe kann in jedem geeigneten inerten Medium, gewöhnlich einem wäßrigen Medium, bei pH-Bedingungen und Temperaturen durchgeführt werden, die nicht zur Inaktivierung des Enzyms führen· Temperaturen über ungefähr 60 C sollten im allgemeinen vermieden werden. Das vorliegende Verfahren wird leicht bei Umgebungstemperaturen durchgeführt. Die Auswahl der Temperatur hängt jedoch hauptsächlich von dem jeweils verwendeten Enzym oder Enzymgemisch ab. Gewöhnlich kann die Temperatur im Bereich von ungefähr -5 bis ungefähr 30⁰C liegen. Eine Temperatur im Bereich von ungefähr O⁰C bis ungefähr 10⁰C wird bevorzugt.

Die. Produkte dieser Erfindung, und ein Verfahren zur Herstellung dieear Produkte wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert·

Beispiel 1 Enzymatisch wirksames, Trypsin enthaltendes Produkt

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200 g körniges Siliciumdioxyd (Carb-0-Sil), das mit gamma-Aminopropyltrimethoxysilan umgesetzt wurde, wurde mit destilliertem Wasser (20 ml) gewaschen und in diesem suspendiert. !Trypsin (200 ml) und 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (200 mg) wurden der Suspension zugegeben und der pH-Wert derselben auf 4»8 mit 1n wäßriger Salzsäurelösung eingestellt· Das erhaltene Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 2 Stunden gerührt und der pH-Wert bei 4,8 unter Verwendung eines pH-stat gerührt. '

Danach wurden die Feststoffe aus der erhaltenen Suspension durch Zentrifugieren gewonnen und mit fünf 40 ml AIiquoten yon 10 η wäßriger Salzsäurelösung gewaschen, wonach keine Enzymwirksamkeit in der Waschlösung festgestellt werden konnte»

Die Feststoffe wurden dann mit Wasser gewaschen und in einem wäßrigen Q,05M Trispuffer (pH 8,0) suspendiert. J

Die Aliquoten wurden der hergestellten Suspension entnommen und in 3 ml-Küvetten eingefüllt und verschiedene Mengen an Tosylargininmethylester wurden jeder Küvette zugegeben. Das Hydrolysenverhältnis wurde mittels eines Spektrophotometers bei 247 m/U überwacht. Versuche zeigten, daß die Menge an auf den Feststoffen vorhandenem Enzym ungefähr 3 /Ug/5 mg festem Produkt betrug·

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B β JL β ρ 1 e 1 2 Weglassen von Organosilaii

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch blieb das körnige Siliciumdioxyd ohne Behandlung mit Organosilan. Sie gesamte frypsin-Wirkaamkeit wurde von dem Siliciumdioxyd abgewaschen, so daß keine unmittelbare Adsorption des Enzyms auf dem Siliciumdioxyd stattfand.

Beispiel 3 Weglassen von Trypsin

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei körniges Siliciumdioxyd mit gamma-Aminopropyltriaethoxysilan behandelt wurde, jedoch ohne Zugabe τοη Trypsin· Ea wurde ein enzymatisch unwirksame», festes Material erhalten·

Die Torausgehende Beschreibung und die Beispiele dienen ausschlieBlich der Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken· Die Erfindung beinhaltet alle Abweichungen .und Änderungen, die leicht von dem !Fachmann vorgenommen werden können, soweit die Abweichungen τοη dem allgemeinen Erfindungegedanken Gebrauch machen·

Patentansprüche ι

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Claims

Patentansprüche :

1_β Unlösliche, enzymatisch wirksame Zusammensetzung gekennzeichnet durch ein siliciumhaltiges Material, ein an dessen Oberfläche gehaltenes Organosilan und ein Enzym, das kovalent mit dem Organosilan über eine Amidbindung gebunden ist.

2e Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, % daß das siliciumhaltige Material körniges Siliciumdioxyd und das Organosilan omega-Aiainoalkyltrialkoxysilan, besonders gamma-Aminopropyltrimethoxysilan, ist.

3. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym Trypsin ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines unlöslichen, enzymatisch wirksamen» zusammengesetzten Produkts, dadurch ge- I kennzeichnet, daß man ein siliciumhaltiges Material mit einer hydrolysierbaren Gruppe eines Organosilans, das eine funktionelle Gruppe trägt, umsetzt und ein Enzym, mit einer reaktionsfähigen Gruppe, die für die enzymatisch^ Wirksamkeit nicht wesentlich ist, mit dem umgesetzten Organosilan dadurch verbindet, daß man die reaktionsfähige Gruppe mit der funktioneilen Gruppe des umgesetzten Organosilans in Gegenwart eines Garboxyaktivators umsetzt.

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5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung zwischen einer Carboxygruppe in dem Enzym und einer Aminogruppe in dem Organosilan vornimmt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß man als siliciumhaltiges Material Siliciumdioxyd und als Organosilan ein omega-Aminoalkyltrialkoxysilan, besonders gamma-Aminopropyltrimethoxysilan, verwendet.

7β Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Carboxylaktivator ein Carbodiimid, besonders i-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, ein Carbodiimidazol oder ein 3-nichtsubstituiertes Isooxazoliumsalz verwendet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Trypsin verwendet.

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