DE69736588T2

DE69736588T2 - Subtilisin Dimer mit verbesserter Aktivität und verfahren zur Herstellung davon.

Info

Publication number: DE69736588T2
Application number: DE69736588T
Authority: DE
Inventors: Richard Palo Alto BOTT; Christian Genencor International Palo Alto PAECH; Shan Genencor International Palo Alto WU
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2017-02-18
Also published as: ES2267132T3; WO1997037007A1; DE69736588D1; CA2248649A1; EP0889957A1; NZ332236A; US6946280B1; CN1215429A; CA2248649C; US20050170471A1; EP0889957B1; BR9708453A; AU719263B2; AU2276997A; ATE338112T1; US20060084160A1; JP2000507452A; US7329528B2; DK0889957T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung hängt mit der Herstellung eines Enzymaggregats mit verbesserten Leistungs- und Verwendungseigenschaften zusammen. Die vorliegende Erfindung hängt ganz besonders mit einem Enzymmultimer zusammen, das Monomereinheiten von entweder homologem oder heterologem Ursprung umfasst, die kovalent aneinander gebunden worden sind. Das Enzymmultimer der Erfindung hat Vorteile, wie zum Beispiel eine verbesserte Leistung, was Aktivität, Allergenität oder Enzym-Substrat-Wechselwirkungen betrifft.
2. Stand der Technik
Mehrfach-Enzymaggregate sind zum Senken der Allergenität der Enzymkomponente(n) durch Erhöhen ihrer Größe vorgeschlagen worden. Zum Beispiel offenbart die PCT-Veröffentlichung No. 94/10191 oligomere Proteine, die eine geringere Allergenität als das monomere ursprüngliche Protein aufzeigen, und schlägt einige allgemeine Techniken zum Erhöhen der Größe des ursprünglichen Enzyms vor. Zusätzlich haben Enzymaggregate unter isolierten Umständen verbesserte Eigenschaften gezeigt. Zum Beispiel offenbart Naka et al., Chem. Lett., Bd. 8, S. 1303–1306 (1991) ein Meerrettichperoxidase-Aggregat, das hergestellt wird, indem ein Block-Copolymer durch eine 2-stufige Block-Copolymerisation aus 2-Butyl-2-oxazolin und 2-Methyl-2-oxazolin gebildet wird. Das Aggregat hatte mehr als 200-mal mehr Aktivität in wassergesättigtem Chloroform als das native Enzym.
Vernetzte Enzyme, die durch die Zugabe von Glutaraldehyd hergestellt werden, sind als eine Möglichkeit vorgeschlagen worden, Enzyme zu stabilisieren. Vernetzen führt jedoch, verglichen mit nativem Enzym, oft zu Aktivitätsverlusten. Zum Beispiel offenbaren Khare et al., Biotechnol. Bioeng., Bd. 35, No. 1, S. 94–98 (1990) ein mit Glutaraldehyd hergestelltes Aggregat von β-Galaktosidase aus E. coli. Während das Enzymaggregat eine Verbesserung der thermischen Stabilität bei 55 °C zeigte, hatte es eine Aktivität von nur 70,8 % von der des nativen Enzyms, was jedoch für eine gute Beibehaltung von Aktivität nach dem Vernetzen angesehen wurde.
Wells und Powers (J. Biol. Chem., 15. Mai 1986; 261 (14): 6564–70) beschreiben die Einführung einer intramolekularen Disulfidbindung zwischen den Positionen 22 und 87 oder 24 und 87 in Subtilisin aus Bacillus amyloliquefaciens.
Wie aus dem Vorstehenden klar wird, sind von Fachleuten, die sich bemühen, aggregierte Enzyme zum Zweck einer gesenkten Allergenität oder des Veränderns von Aktivitätsparametern herzustellen, einige Alternativen entwickelt worden. Ein diesen Prozessen gemeinsames Problem ist jedoch, dass es, wenn man aggregierte Enzyme gemäß der Lehren dieses Stands der Technik herstellt, nicht für möglich gehalten wird vorherzusagen, wie sich bestimmte Enzyme in der aggregierten Form verhalten werden. Darüber hinaus ist die Bildung eines Enzymaggregates gemäß der Lehren dieses Stands der Technik eine ungenaue Wissenschaft, die in hohem Maße vom Zufall abhängig ist, wodurch sie ein wesentliches Hindernis für die Herstellung eines Multienzymaggregates mit vorgewählten Aktivitäten darstellt.
Um diese Probleme zu überwinden haben Forscher Enzymaggregate entwickelt, die vorbestimmte Fusionsproteine umfassen. Bei einem typischen Fusionsprotein ist das Gen für ein Protein mit dem Gen für ein zweites Protein fusioniert, und das sich ergebende Kombinationsenzym wird als eine vollständige Einheit exprimiert. Während derartige Fusionsproteine, wie auf Enzyme angewendet, einen wichtigen Vorteil bereitstellen, was das Bereitstellen eines einzelnen Proteins betrifft, das mehrfache enzymatische Aktivitäten kombiniert, sind sie problematisch, was Expression und/oder Sekretion in einer geeigneten Wirtszelle betrifft. Zum Beispiel stellen proteolytische Spaltung, unpassende Faltung und Sekretionsprobleme innerhalb der Zelle, die sich aus der Größe oder Tertiärstruktur ergeben oder darauf zurückzuführen sind, signifikante Nachteile der Fusionsenzymtechnologie dar.
Demgemäß wäre es wünschenswert, eine neue Möglichkeit zum Herstellen von Mehrfach-Enzymsystemen, die für medizinische, diagnostische oder industrielle Zwecke nützlich sind, zu entwickeln, die fähig ist angepasst zu werden, was eingeschlossene enzymatische Aktivitäten und positionsbezogene Wechselbeziehungen dieser Enzyme betrifft, um so die Kinetik der bestimmten Anwendung zu maximieren. Es wäre ferner wünschenswert, eine neue Möglichkeit zum Herstellen von Mehrfach-Enzymsystemen zu entwickeln, die keine Probleme bei den Expressions- und Sekretionseigenschaften der Fusionsproteine aufweisen, und die beim Bestimmen der Konformation des sich ergebenden Mehrfach-Enzyms Flexibilität ermöglichen. Dem Stand der Technik misslingt es jedoch, eine Möglichkeit zum Herstellen eines Mehrfach-Enzymsystems mit derartigen Eigenschaften bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Enzymmultimer bereitzustellen, das eine veränderte Aktivität, ein verändertes Aktivitätsprofil, veränderte Umwelterfordernisse oder andere veränderte Leistungseigenschaften aufweist.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Enzymmultimer bereitzustellen, das leicht hergestellt und in existierende Prozesse und Produkte einbezogen werden kann.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Enzymmultimer bereitzustellen, das eine Vielfalt enzymatischer Aktivitäten besitzen kann.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine enzymatische Aktivität bereitzustellen, die verbesserte Allergenitätseigenschaften aufweisen kann.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Enzymmultimer bereitgestellt, das eine Vielfalt von Monomereinheiten umfasst, einschließlich einer ersten Monomereinheit mit enzymatischer Aktivität und einer zweiten Monomereinheit mit enzymatischer Aktivität, wobei jede erste Monomereinheit und zweite Monomereinheit einen Cysteinrest umfasst und die Cysteinreste durch eine Schwefel-vermittelte Bindung kovalent aneinander gebunden sind, um die erste Monomereinheit an der zweiten Monomereinheit kovalent zu befestigen.
KURZE BESCHREIBUNG DER BILDER
1 veranschaulicht ein Modell der Tertiärstruktur eines Dimers, abgeleitet von den tatsächlichen Kristallstrukturmessungen von GG36-Monomereinheiten. Das aktive Zentrum der Monomereinheiten wird als Region „A" bezeichnet, die Kalziumionen werden als Region „B" bezeichnet und die Position des eingeführten Cysteins und der Schwefel-vermittelten kovalenten Bindung als Region „C" bezeichnet.
2 veranschaulicht die vergleichenden Ergebnisse der Magermilchprotein-Hydrolyseaktivität von S24C (Monomer) und GG36 (Monomer) bei 4 ppm und 8 ppm in Anwesenheit von DTT.
3 veranschaulicht die vergleichenden Ergebnisse der Magermilchprotein-Hydrolyseaktivität von GG36-S24C (Dimer) und GG36 (Monomer) bei 4 ppm und 8 ppm.
4 veranschaulicht den zeitlichen Verlauf der Keratin-Hydrolyse durch S24C (Dimer) und GG36 (Monomer) bei 8 ppm über 120 Minuten hinweg.
5 veranschaulicht die Aktivität von S24C (Dimer) und GG36 (Monomer) auf Keratin bei 0–8 ppm nach 120 Minuten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird ein Enzymmultimer bereitgestellt, das eine Vielfalt von Monomereinheiten umfasst, einschließlich einer ersten Monomereinheit mit enzymatischer Aktivität und einer zweiten Monomereinheit mit enzymatischer Aktivität, wobei jede erste Monomereinheit und zweite Monomereinheit einen Cysteinrest umfasst und die Cysteinreste jeder Monomereinheit durch eine Disulfidbindung kovalent aneinander gebunden sind, um die erste Monomereinheit kovalent an der zweiten Monomereinheit zu befestigen. Überraschenderweise haben die Antragsteller entdeckt, dass das erfindungsgemäße Enzymmultimer eine erhöhte Aktivität aufzeigt.
„Enzymmultimer" bedeutet ein einzelnes Proteinmolekül, das aus mindestens zwei einzelnen Enzymen besteht, die kovalent aneinander gebunden sind. So wird ein erfindungsgemäßes Enzymmultimer mindestens zwei unterschiedliche, zum Katalysieren einer chemischen Reaktion fähige Stellen, d. h. mindestens zwei aktive Zentren aufweisen. Die einzelnen Enzyme, hierin als „Monomereinheiten" bezeichnet, umfassen Varianten eines enzymatisch aktiven ursprünglichen Subtilisins aus Bacillus. Andere Monomereinheiten umfassen eine Hydrolase, wie zum Beispiel eine Protease, eine Cellulase, eine Amylase, eine Esterase, eine Lipase oder eine Hemicellulase; ein Enzym, das eine Oxidations-Reduktions-Reaktion katalysiert (eine Oxidoreduktase), wie zum Beispiel eine Peroxidase, eine Mikroperoxidase, eine Laccase, eine Ligninase, eine Oxidase, eine NADH-Reduktase, eine 2,5-DKG-Reduktase; eine Transferase; eine Isomerase, wie zum Beispiel eine Glukoseisomerase oder eine Xyloseisomerase; eine Lyase; oder eine Ligase oder Synthetase. Es wird in Betracht gezogen, dass es sich bei den Monomereinheiten des Enzymmultimers um das gleiche Enzym, die gleiche Aktivität von einem anderen Enzymprotein oder ganz unterschiedliche Enzyme handeln kann. So können die Monomereinheiten „homolog" oder „heterolog" sein. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Monomereinheiten eine bakterielle Protease oder Amylase, stärker bevorzugt eine aus Bacillus, und am meisten bevorzugt eine aus Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus stearothermophilus oder Bacillus amyloliquefaciens abgeleitete bakterielle Protease oder Amylase.
Wie hierin verwendet bedeutet „homologes Protein" oder „homologes Enzym" zwei oder mehr Proteine oder Enzyme, die von taxonomisch identischen Organismen abgeleitet sind oder die identische Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel wären zwei identische, von einem bestimmten Bacillus-Stamm abgeleitete Cellulasen homolog. Im Gegensatz dazu bedeutet „heterologe Proteine" oder „heterologe Enzyme", wie hierin verwendet, zwei oder mehr Proteine oder Enzyme, die von taxonomisch unterschiedlichen Organismen abgeleitet sind. Zum Beispiel wird ein von einer unterschiedlichen Art abgeleitetes Protein, wie zum Beispiel E. coli und Bacillus licheniformis, hierin als heterolog angesehen. Zusätzlich wird ein Protein von taxonomisch unterschiedlichen Arten, wie zum Beispiel Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus subtilis, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als heterolog angesehen. Wie hierin verwendet, werden zwei vom selben Mikroorganismus abgeleitete verschiedene Enzyme, zum Beispiel Cellulase EGI und die Cellulase EGII, die von T. Iongibrachiatum abgeleitet sind, als heterolog angesehen.
Es wird in Betracht gezogen, dass ein homologes Multimer für derartige Zwecke wie das Verbessern der katalytischen Aktivität oder Effizienz oder das Senken der Allergenität verglichen mit dem einzelnen Vorläuferenzym nützlich sein kann. Zum Beispiel kann in einem aus zwei homologen Proteasen hergestellten Enzymdimer das so erhaltene Proteasedimer eine verbesserte Aktivität oder eine gesenkte Allergenität gegenüber dem Proteasemonomer aufweisen. Alternativ dazu kann ein Multimer hergestellt werden, in dem eine Monomereinheit andere enzymatische Eigenschaften aufweist als die zweite Monomereinheit, und doch arbeiten sie auf eine sich ergänzende Weise. Zum Beispiel wird im US-Patent No. 4.933.279 behauptet, dass das Gemisch der Wildtyp-Amylase aus Bacillus licheniformis und der Wildtyp-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens einen Leistungsvorteil bei der Verflüssigung von Stärke bereitstellt. Als Ergebnis wird in Betracht gezogen, dass ein Enzymdimer, das eine erste, von einer Amylase aus Bacillus licheniformis abgeleitete Monomereinheit und eine zweite, von Bacillus stearothermophilus abgeleitete Monomereinheit umfasst, besonderen Wert haben würde. In ähnlicher Weise würden eine erste, von einer Vorläuferlipase abgeleitete Monomereinheit und eine zweite, von einer Vorläuferprotease abgeleitete Monomereinheit wegen ihrer erwarteten, sich ergänzenden Aktivität auf einem Fleck, der eine Protein-Lipid-Matrix umfasst, besondere Vorteile in Wäsche-Detergenzien aufweisen.
Das Enzymmultimer der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von natürlich vorkommenden Enzymen, die zwei oder mehrere Untereinheiten einschließen. Diese natürlich vorkommenden Enzyme sind oft dadurch gekennzeichnet, dass alle Untereinheiten in einer bestimmten Orientierung vorliegen müssen, damit enzymatische Aktivität vorkommt, und enthalten nur ein aktives Zentrum in der Kombination der Untereinheiten. In der Tat hängt die Aktivität mancher Enzyme insofern davon ab, dass sich das Enzym in multimerer Form befindet, als die Monomere, die das Multimer ausmachen, selbst keine enzymatische Aktivität aufweisen. Die bestimmten Monomere, die das Multimer ausmachen, werden oft durch ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen zusammengehalten und nicht durch kovalente, intermolekulare Disulfidwechselwirkungen oder andere chemische Verbindungen, die wie in der vorliegenden Erfindung durch Cystein- Schwefel-Reaktionen vermittelt werden. Darüber hinaus zieht die vorliegende Erfindung das Verbinden unterschiedlicher Enzymeinheiten (hierin als Monomereinheiten definiert) durch eine Disulfidbindung(en) in Betracht, wodurch ein Enzymmultimer mit mehrfachen aktiven Zentren gebildet wird.
In der Erfindung umfasst das Enzymmultimer eine erste Monomereinheit, die aus einem entsprechenden Vorläuferenzym modifiziert worden ist, um einen Cysteinrest an einer passenden Position einzuschließen. Die erste Monomereinheit ist ein Derivat eines Vorläuferenzyms und unterscheidet sich aufgrund der ortsspezifischen Substitution oder Addition von mindestens einem Cysteinrest darin. Mit „Derivat" ist gemeint, dass der Vorläufer eine Aminosäuresequenz umfasst, die von seiner Vorgänger- oder ursprünglichen Sequenz aus modifiziert wurde, entweder durch biochemische, genetische oder chemische Mittel, um die Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehr Aminosäure(n) zu bewirken. Ein „Derivat" innerhalb des Umfangs dieser Definition sollte erwünschte enzymatische Eigenschaften, die in der nativen oder ursprünglichen Form beobachtet werden, in dem Ausmaß besitzen, wie beabsichtigt wird, dass das Derivat für ähnliche Zwecke wie der Vorläufer nützlich sein soll. Bei dem Vorläuferenzym kann es sich um jedes Enzym oder dessen Variante handeln, das die gewünschte enzymatische Aktivität besitzt.
Die Position innerhalb des Enzyms, an welcher sich der zugefügte oder substituierte Cysteinrest befindet, sollte in einer derartigen Weise ausgewählt werden, dass Nicht-Interferenz mit dem Reaktionsmechanismus des aktiven Zentrums sichergestellt ist. So wird in einer bevorzugten Ausführungsform die Position des zugefügten oder substituierten Cysteinrestes ausgewählt, um nicht in unmittelbarer Nähe von Resten zu sein, die sich im aktiven Zentrum befinden oder die für das Substratbinden entscheidend sind, stärker bevorzugt befindet sich das zugefügte oder substituierte Cystein in einem relativ großen Oberflächenabstand vom aktiven Zentrum und/oder der Substratbindungsstelle in Bezug auf die Gesamtgröße des Moleküls. So bezieht die Disulfidbindung in einer Ausführungsform zwei Cysteinreste ein, die sich auf oder nahe der Oberfläche der Monomereinheit in einem Abstand entlang der Oberfläche des Proteins befinden, der in Bezug auf die Position des Restes im aktiven Zentrum oder des Substratbindungsrestes maximiert ist. Verschiedene Enzyme weisen unterschiedliche Tertiärstrukturen auf, welche die optimale Distanz für die Addition oder Substitution von Cysteinen ändern, um so die katalytische oder Substratbindungs-Interferenz zu beschränken. Mit einem Enzym, wie zum Beispiel der Protease aus Bacillus lentus mit allgemeinen Dimensionen von 45Å × 45Å × 45Å, sollte es jedoch möglich sein, ein zugefügtes oder substituiertes Cystein in einer Distanz von mindestens 10 Ångström, vorzugsweise 15 Ångström und am meisten bevorzugt 20 Ångström zu platzieren. Während die Existenz einer durch Röntgen-Kristallographie entwickelten Tertiärstruktur das Auswählen einer Position für das zugefügte oder substituierte Cystein erleichtern wird, ist es möglich, eine derartige Positionsinformation ohne derartige Daten zu erhalten. Es ist zum Beispiel möglich, die Position des aktiven Zentrums oder der Substratbindungsstelle durch Vernetzen oder andere im Fachgebiet anerkannte Verfahren, wie zum Beispiel Tyrosinmodifizierung und anschließende Aktivitätsmessung, wie in Svendsen, Carlsberg Res. Communication, Bd. 41, No. 5, S. 237–291 (1976), zu kartieren. Aus diesen Daten wird es möglich sein, bekannte Aminosäuren, die nicht im aktiven Zentrum sind, auszuwählen, die sich auf der Oberfläche des Proteins befinden.
Im Allgemeinen sollten, wo erhöhte Aktivität erwünscht ist, die aktiven Zentren der Monomereinheiten in einer geeigneten Weise ausgerichtet werden, um dem Substrat einen maximalen Zugang zu den aktiven Zentren der Monomereinheiten zu gestatten. Zum Beispiel würde ein Proteasemultimer, von dem beabsichtigt wird, dass es auf ein Substrat wirkt, das ein hohes Molekulargewicht hat oder schlecht diffundierbar ist, zum Beispiel Keratin, vorzugsweise so hergestellt, dass die aktiven Zentren der Monomereinheiten ähnlich ausgerichtet sind, um so die aktiven Zentren dem planaren Substrat maximal auszusetzen. In ähnlicher Weise wird erwartet, dass die Aktivität eines α-Amylase-Multimers auf Stärke, Cellulase auf Cellulose oder Hemicellulase auf Holzbrei verstärkt würde, wo die aktiven Zentren ausgerichtet sind, um Zugang zur selben Substratoberfläche zu haben. Mehrfache Aktivitäten können innerhalb des Enzymmultimers eingeschlossen sein, die synergistische oder sich ergänzende Zwecke haben. Zum Beispiel wäre ein Enzymmultimer, das eine Peroxidase und eine Cellulase umfasst, zur Verwendung in Detergenzien für die dualen Zwecke nützlich, einen celluloseartigen Stoff mit der Cellulase zu behandeln und die Farbübertragung durch Farbe, die von der Cellulose entfernt wird, mit der bleichenden Aktivität einer Peroxidase zu verhindern. In diesem Fall kann es vorteilhaft sein, das aktive Zentrum der Peroxidase auf eine derartige Weise zu positionieren, dass die aus dem Stoff durch die Cellulase freigesetzte Farbe durch die Peroxidase gebleicht wird.
Als spezifisches Beispiel sei angegeben, dass die Erfinder hierin entdeckten, dass es durch Verändern eines Serinrestes an Position +24 in dem GG36-Proteaseenzymmolekül aus Bacillus lentus zu einem Cystein möglich war, das Aktivitätsprofil der Protease zu verbessern. Unter Bezugnahme auf 1 ist es offensichtlich, dass die Position der eingeführten Cysteinreste derart ist, dass sie sich auf der Rückseite des Moleküls in Bezug auf die Position des katalytischen Zentrums befindet.
Die Bildung des Enzymmultimers aus den einzelnen Monomereinheiten kann unter im Fachgebiet bekannten oxidierenden Bedingungen durchgeführt werden, um die Bildung einer Schwefel-vermittelten Bindung zwischen zwei Cysteinresten zu erleichtern. Im Allgemeinen wird sich eine Disulfidbindung unter wohlbekannten, passenden Bedingungen (z.B. auf Kontakt mit Sauerstoff oder Luft hin) spontan bilden, wo das substituierte oder zugefügte Cystein auf jeder Monomereinheit fähig ist, eine Disulfidbindung zu bilden. Andere Schwefel-vermittelte Bindungen, die sich innerhalb der Erfindung befinden, schließen die Verwendung von Linkern, die mit N-Ethylmaleimid, N,N'-p-Phenylendimaleimid oder Bismaleimidohexan hergestellt werden, ein.
Es wird in Betracht gezogen, dass Enzymmultimere gemäß der vorliegenden Erfindung bei jeder Anwendung von Nutzen sind, bei der festgestellt wird, dass Enzyme von Nutzen sind. Zum Beispiel wären Enzymmultimere bei jeder anerkannten Anwendung von Enzymen nützlich. Zum Beispiel sind Abbauen von Cellulose oder Stärke in Oligosaccharide oder Glukose, Detergenzien für das Reinigen, Herstellung und Waschen von Textilien, Backen, Tierfutterzusätze und Herstellung von Zellstoff und Papier alles wohlbekannte Beispiel von industriell wichtigen Prozessen und Produkten, bei welchen die Anwendung von Enzymen für wertvoll befunden worden ist und bei welchen die vorliegende Erfindung daher Vorteile bereitstellen würde.
Es ist ein besonders überraschendes Ergebnis der vorliegenden Erfindung, dass die Aktivität eines bestimmten Enzyms oder bestimmter Enzyme durch das Bilden eines Enzymmultimers, das die erwünschte Aktivität oder die erwünschten Aktivitäten umfasst, erhöht werden kann. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, ist es möglich, ein Enzymmultimer mit verbesserter Aktivität herzustellen, was die Reaktionsgeschwindigkeit betrifft, verglichen mit einer gleichen Konzentration aktiver Zentren von monomeren Enzymen, indem man den Lehren dieser Erfindung folgt. Auf ähnliche Weise wird ins Auge gefasst, dass die gesamte Aktivität, die Halbwertszeit und Leistungseigenschaften, wie zum Beispiel pH- und Temperaturabhängigkeit, in einem Enzymmultimer im Vergleich zur Enzym-Monomereinheit oder zum Vorläuferenyzm, von dem es abgeleitet ist, verändert werden können.
Es ist beabsichtigt, dass die folgenden Beispiele die Erfindung veranschaulichen, und sie sollten nicht so interpretiert werden, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung des Proteasedimers GG36
Das Klonieren und die Konstruktion für die Expression des Subtilisingens (GG36) aus Bacillus lentus ist im Wesentlichen wie im US-Patent No. 5.185.258 beschrieben, dessen Offenbarung durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Konstruktion der Variante S24C von GG36 wurde entsprechend einer oligonukleotidgesteuerten Standardmutagenese wie im US-Patent No. 5.185.258 und der PCT-Veröffentlichung No. WO 95/10615 (Genencor International, Inc.) unter Verwendung des Oligonukleotid-Primers
5'CGTGGATTGACCGGTTGTGGTGTAAAAGTT3'
durchgeführt, um die Änderung von Ser zu Cys an Position 24 der reifen Subtilisinsequenz zu erzeugen. Der unterstrichene C-Rest erzeugte die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Age I und das unterstrichene G bezeichnete die Änderung vom TCT-(Ser-)Kodon zu einem TGT-(Cys-)Kodon. Die Fermentationsbedingungen zur Herstellung des mutanten Enzyms und des Wildtypenzyms waren wie in US 5.185.258 beschrieben. Die wie vorstehend hergestellte Mutante GG36-S24C wurde dann der Luft ausgesetzt, um die Bildung der dimerisierten Mutante zu ermöglichen.
Beispiel 2
Reinigung des Proteasedimers GG36
Ein Ultrafiltrat-Konzentrat des wie in Beispiel 1 hergestellten und mit DTT behandelten GG36-S24C-Mediums wurde entsalzt (G-25-Säule) und bei pH 8,0 auf eine Kationenaustauschchromatographie (BioCad HS/M-Säule) geschickt. Die Analyse auf einem SDS-Phast-Gelsystem zeigte, dass eine Fraktion ein dimerisiertes Enzym enthielt, das ungefähr das doppelte Molekulargewicht von dem des Wildtyp-GG36-Protease-Monomers aufwies, was die Anwesenheit einer dimerisierten Form von GG36-S24C anzeigte. Anschließend an die Kationenaustauschchromatographie ist das Dimer ausreichend von irgendwelcher nicht dimerisierter Protease im Medium getrennt, um nur eine einzelne Bande auf sowohl nativen als auch SDS-Gelen bereitzustellen.
Beispiel 3
Vergleich von Proteasedimer, mutantem Monomer und Wildtypenzym bei der Magermilchhydrolyse
Casein ist das Hauptprotein in Magermilch, das etwa 80 % des Gesamtproteins umfasst. Die Hydrolyse von Magermilch ist aufgrund der Anwesenheit vieler Proteine zusätzlich zu Casein in Magermilch ein ausgezeichnetes Verfahren zum Quantifizieren von Proteaseaktivität. Das wie in den Beispielen 1 und 2 erhaltene und gereinigte GG36-S24C-Dimer wurde in einem Casein-Hydrolyseassay getestet und mit dem GG36-Monomer verglichen. Wildtyp-GG36 und GG36-S24C wurden getrennt in der gleichen Konzentration zubereitet (wie durch Proteaseaktivität gemessen wurde) und jede Lösung wurde mit 50 mM DTT in 100 mM Tris-HCl (pH 8,6) bei 4 °C gemischt. 10 mM Tris-HCl (pH 8,6) mit 50 mM DTT ohne Enzym wurde als Kontrolle verwendet. DTT wird verwendet, um irgendwelche Disulfidbrücken, die im GG36-S24C-Dimer vorliegen, zu brechen.
Magermilch wurde mit NaOH auf einen pH-Wert von 10–10,3 eingestellt und 180 μl-Teilmengen wurden mit 20 μl der passenden Enzymlösung (GG36 mit oder ohne zugefügtes DTT und GG36-S24C mit oder ohne zugefügtes DTT) auf eine sich ergebende Konzentration von 2, 4 oder 8 ppm kombiniert. Eine Kontrolle mit und ohne DTT wurde auch verwendet. Die Gemische wurden dann in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben und Schütteln bei 37 °C unterzogen. Die Trübung der Lösung wurde über den Zeitraum von einer Stunde alle 15 Minuten bei 650 nm in einem kinetischen Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, Inc., Mountain View, CA) gemessen. Eine Abnahme der Trübung zeigt Hydrolyse des Proteins in der Magermilch an.
Die Ergebnisse werden in den 2 und 3 gezeigt. 2 veranschaulicht, dass die Leistung des S24C-Monomers der Leistung des GG36-Monomers äquivalent war. Dies war notwendig, weil es nicht möglich war, das S24C-Monomer gegen das S24C-Dimer unter identischen Bedingungen zu testen, d. h. entweder in Abwesenheit oder Anwesenheit von DTT in beiden Fällen. Demgemäß wurde das S24C-Dimer in Abwesenheit von DTT mit dem GG36-Monomer verglichen, wie in 3 gezeigt wird. Das GG36-S24C-Dimer übertraf während des Verlaufs des Experiments durchweg das GG36-Monomer. Es ist besonders bemerkenswert, die Zeit zu vergleichen, die das Dimer benötigte, um ein bestimmtes Ausmaß an Trübungsverlust zu erreichen, und diese mit der Zeit zu vergleichen, die für den GG36-Wildtyp notwendig war, um das gleiche Ausmaß an Trübungsverlust zu erreichen. Zum Beispiel ergab die Konzentration des GG36-S24C-Dimers von 2 ppm in 3 bei einer Zeit von 15 Minuten einen Trübungsverlust von ungefähr 20 %. Die Zeit, die das GG36- Wildtypenzym erforderte, um einen Trübungsverlust von 20 % zu erreichen, war ungefähr das Doppelte, z. B. etwa 30 Minuten. Diese Wirkung wird durchweg beim Vergleich von Dimer und Wildtyp-Monomer auf Magermilch gesehen.
Beispiel 4
Vergleich von Proteasedimer, mutantem Monomer und Wildtypenzym bei der Keratinhydrolyse
Das wie in den Beispielen 1 und 2 erhaltene und gereinigte GG36-S24C-Dimer wurde in einem Keratin-Hydrolyseassay getestet und mit dem GG36-Monomer verglichen. Sowohl Wildtyp-GG36 als auch GG36-S24C wurden in der gleichen Konzentration zubereitet und mit 50 mM DTT in 100 mM Tris-HCl (pH 8,6) bei 4 °C kombiniert. 10 mM Tris-HCl (pH 8,6) mit 50 mM DTT ohne Enzym wurde als Kontrolle verwendet.
Keratinpulver aus Rinderhuf und -horn (ICN Biomedicals Inc., Katalog-# 90211) wurde in 100 mM Natriumcarbonatpuffer bei pH 10,3 suspendiert und 15 Minuten lang kräftig gerührt. 1,5 ml Keratinlösung wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben und 15 μl Enzymlösung wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen zugefügt (0,8, 0,4, 0,2, 0,1 oder 0,0 mg/ml Enzym), um eine Endkonzentration von 8, 4, 2 und 0 ppm Protein zu ergeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur geschüttelt und zwei Teilmengen von 15 μl wurden über einen Zeitraum von zwei Stunden bei 30 Minuten aus jeder Vertiefung entnommen. Jede Teilmenge wurde in 15 μl Reagens A (20:1 0,25 M Borat und 2,5 M NaOH) auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben und mit 15 μl TNBS bei einer Konzentration von 3,5 mg/ml gemischt. Die Mikrotiterplatte wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt und 230 μl Reagens B (105,52 mg Na₂SO₃ in 200 ml 0,212 M Phosphat, pH 4,0) wurde zugefügt. Die Absorption bei 405 nm wurde auf einem kinetischen Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, Inc., Mountain View, CA) abgelesen, um die Menge an freien Aminogruppen zu bestimmen, die durch die Hydrolyse von Keratin in jeder Vertiefung freigesetzt wurde.
Die Ergebnisse werden in den 4 und 5 gezeigt.

Claims

Enzymdimer mit einer verbesserten Subtilisinaktivität, umfassend eine erste Monomereinheit mit enzymatischer Aktivität und eine zweite Monomereinheit mit enzymatischer Aktivität, wobei die erste Monomereinheit und die zweite Monomereinheit jeweils Varianten eines enzymatisch aktiven ursprünglichen Subtilisins aus Bacillus sind, wobei sich jede Monomereinheit von dem ursprünglichen Subtilisin aus Bacillus durch die Substitution oder Addition eines Cysteinrestes darin unterscheidet, und wobei die Cysteinreste durch eine Disulfidbindung, welche die erste Subtilisineinheit an der zweiten Subtilisineinheit befestigt, kovalent aneinander gebunden sind, wobei die Cysteinreste sich an einer anderen Position als dem katalytisch aktiven Zentrum und der Substratbindungsstelle jeder Monomereinheit befinden.
Enzymdimer nach Anspruch 1, wobei die erste Subtilisin-Monomereinheit und die zweite Subtilisin-Monomereinheit homolog sind.
Enzymdimer nach Anspruch 1, wobei die erste Subtilisin-Monomereinheit und die zweite Subtilisin-Monomereinheit heterolog sind.
Enzymdimer nach Anspruch 1, wobei der enzymatisch aktive Subtilisinvorläufer aus Bacillus aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem aus Bacillus lentus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus und Bacillus licheniformis abgeleiteten Subtilisin.
Enzymdimer nach Anspruch 2, wobei die erste Subtilisin-Monomereinheit und die zweite Subtilisin-Monomereinheit von einem Subtilisin aus Bacillus lentus abgeleitet sind.
Enzymdimer nach Anspruch 1, wobei die erste Monomereinheit und die zweite Monomereinheit durch eine Disulfidbindung kovalent aneinander gebunden sind, die sich an einer Position befindet, welche dem Rest an Position 24 des Subtilisins aus Bacillus lentus, das als GG36 bezeichnet wird, entspricht.
Verfahren zum Herstellen eines Enzymdimers gemäß Anspruch 1, umfassend: (a) Herstellen von ersten und zweiten Monomeren mit enzymatischer Aktivität durch Addition von oder Substitution mit einem Cysteinrest an anderen Positionen als dem katalytisch aktiven Zentrum und der Substratbindungsstelle in ersten und zweiten Monomeren eines enzymatisch aktiven ursprünglichen Subtilisinvorläufers aus Bacillus; und (b) Mischen der ersten und zweiten Monomere unter Bedingungen, um eine Disulfidbindung zwischen dem addierten oder substituierten Cysteinrest des ersten und zweiten Monomers zu bilden.
Detergens-Zusammensetzung, umfassend das dimere Enzym nach Anspruch 1.