DE69713883T2

DE69713883T2 - Rückgewinnung von proteinen durch fällung mit ligninsulfonate

Info

Publication number: DE69713883T2
Application number: DE69713883T
Authority: DE
Inventors: T. Becker; E. Lebo
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1997-01-10
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2003-01-23
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: US20020009787A1; DE69713883D1; ATE220409T1; AU5697798A; EP0896579A1; ES2176814T3; EP0896579B1; WO1998030580A1; DK0896579T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung von Proteinen aus einer wässrigen Lösung unter Verwendung von Lignosulfonaten, die einen niedrigen Sulfonierungsgrad aufweisen.

Hintergrund der Erfindung

Sulfonierte Lignine sind natürliche phenolische Polymere, die aus dem Aufschluss von Holz abstammen. Sie werden seit langem verwendet, um Proteine aus Prozess-Abfallströmen zurückzugewinnen (1-4). Sie sind auch verwendet worden, um Antibiotika auf Peptid-Basis zu isolieren und zu stabilisieren (5).
Der Mechanismus, der an all diesen Verfahren beteiligt ist, wird nicht voll verstanden. Kawamoto und Mitarbeiter (6) untersuchten die Protein-absorbierenden Kapazitäten verschiedener Lignine und fanden keine Korrelation zwischen Fällungseffizienz und Lignin-Molekulargewicht. Sie fanden auch keine Korrelation zwischen Fällungseffizienz und dem phenolischen Hydroxylgehalt.
Das US-Patent 3,035,919 offenbart die Verwendung von alkalilöslichem Ligninprotein, um Bacitracin aus einer Lösung zu fällen.
Das US-Patent 3,047,471 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von Amyloglucosidase, das aus dem Mischen einer wässrigen Lösung oder Dispersion eines Amyloglucosidase-Präparats mit einem kleinen Anteil eines ausgewählten Protein-Fällungsmittels oder -Koagulans besteht. Die Mischung wird dann filtriert, zentrifugiert oder dekantiert, um die flüssigen und festen Anteile aufzutrennen. Der flüssige Anteil enthält das behandelte oder gereinigte Amyloglucosidase-Präparat. Bei dem Protein-Fällungsmittel kann es sich um Lignin oder Tannin handeln.
Das britische Patent 1,092,628 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines proteinhaltigen Tierfutters aus proteinhaltigem Abwasser. Das Abwasser wird mit im wesentlichen reinen Lignosulfonsäuren mit hohem Molekulargewicht oder mit mit Torulahefe fermentierter Sulfit- Abwasserflüssigkeit behandelt. Es gibt keine Angabe darüber, welcher Sulfonierungsgrad in den Lignosulfonsäuren mit hohem Molekulargewicht vorliegt.
Das US-Patent 3,616,235 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines trockenen Enzym- oder Protein-Präparats mit einem geringen Salzgehalt. Das Verfahren ist durch das Merkmal gekennzeichnet, dass eine Fällung aus einer eiweißhaltigen Kulturlösung oder einem eiweißhaltigen Kulturfiltrat mit einem anionischen, kationischen oder amphoteren synthetischen organischen Gerbstoff durchgeführt wird und dass die anschließende Extraktion von anorganischen Salzen und überschüssigem Gerbstoff unter Verwendung von Wasser oder Mischungen von Wasser und einem organischen Lösungsmittel stattfindet.
Das britische Patent 1,202,254 offenbart ein Verfahren zur Entfernung von Proteinen und etwaigen Abbauprodukten aus Abwasser. Das Verfahren schließt die Fällung der Proteine und etwaiger Abbauprodukte unter sauren Bedingungen als Komplex mit einer bzw. einem Aryl- oder Aralkylsulfonsäure oder -sulfonat und die anschließende Auftrennung des gefällten Produkts ein.
Das US-Patent 3,622,510 offenbart ein Verfahren zur Rückgewinnung von proteinhaltigem Material aus einem wässrigen Pflanzenabfluss. Das Verfahren schließt die Behandlung des Abflusses mit einer Lignosulfonat-Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht bei einem pH unter dem isoelektrischen Punkt der proteinhaltigen Materialien ein, um Lignosulfonat-Protein-Flocken zu erhalten.
Keine Literatur offenbart, ob ein gewisser Sulfonierungsgrad bevorzugt ist. In der Tat wurde in vielen der obigen Patente die Lignosulfonsäure oder das Lignosulfonat in Form einer Aufschlussflüssigkeit zugesetzt, die behandelt worden war, um andere Bestandteile, wie Zucker, zu entfernen. Die resultierende Flüssigkeit enthielt Lignosulfonat oder Lignosulfonsäure mit variierenden Sulfonierungsgraden, und Aufschlussflüssigkeit ist typisch hoch sulfoniert.

Zusammenfassung der Erfindung

Derzeitige Verfahren zur Isolierung von Enzymen und anderen Proteinen sind geräte-, Zeit- und kapitalintensiv. Es besteht ein Bedarf an einem preiswerten Verfahren mit hoher Ausbeute für die Konzentration, Reinigung und Stabilisierung von Proteinen, wie Enzymen, direkt aus der Fermentationsbrühe, beispielsweise einer zellfreien Fermentationsbrühe. Es wurde gefunden, dass Lignosulfonate mit einem niedrigen Sulfonierungsgrad die bevorzugten Lignosulfonate zur Fällung von Proteinen, insbesondere Enzymen, sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung von Protein aus einer wässrigen Lösung bereit. Das Verfahren umfasst a) die Zugabe eines oder mehrere Lignosulfonate bei einem Massenverhältnis von mindestens 0,1 : 1 (Lignosulfonat zu Protein) zu der wässrigen Lösung, wobei das Lignosulfonat einen Sulfonierungsgrad von weniger als etwa 0,5 aufweist; b) das Einstellen des pH der Lösung von Schritt a) auf einen pH von etwa 1 bis 5 pH-Einheiten unter dem isoelektrischen Punkt des zu gewinnenden Proteins, um einen unlöslichen Komplex zwischen dem Lignosulfonat und dem Protein zu bilden; und gegebenenfalls c) das Abtrennen des Komplexes aus Schritt b) aus der wässrigen Lösung.
Es werden auch Lignosulfonat/Protein-Komplexe derart bereitgestellt, dass das Protein entweder als Komplex oder nach der Dekomplexierung aus dem Lignosulfonat formuliert werden kann.
Bei dem Protein handelt es sich bevorzugt um ein Pilz- oder Bakterienenzym.
Weiter werden Verfahren zur Verwendung des Lignosulfonat/Protein-Komplexes zur Bildung eines Granulats bereitgestellt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Auswirkung des Lignosulfonat-Molekulargewichts auf die Fällungsausbeute für ein 2 : 1 - Lignin/Protease-Massenverhältnis.
Fig. 2 zeigt die Auswirkung des Sulfonierungsgrades des Lignosulfonats auf die Fällungsausbeute für ein 2 : 1-Lignin/Protease-Massenverhältnis.
Fig. 3 zeigt die Ausbeute von komplexierter Amylase gegen den pH für zwei verschiedene Lignosulfonate.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In der Haupt-Ausführungsform der Erfindung wird eine wässrige Proteinlösung mit einer wässrigen Lignosulfonat-Lösung in Kontakt gebracht, und die vereinigten Lösungen werden gemischt. Vorzugsweise werden die relative Menge und der pH jeder Lösung zuvor abgeschätzt, um sicherzustellen, dass der End-pH der Mischung bei oder nahe bei dem gewünschten pH für die Komplexierung liegt. Wenn dies vorgenommen wird, scheinen die Ausbeuten besser zu sein, als wenn der pH der Mischung von Lignosulfonat und Protein direkt auf den gewünschten pH eingestellt wird (siehe Beispiel 1).
Nachdem die Lösungen gemischt worden sind und das Lignosulfonat das Protein komplexiert hat, wird der Komplex beispielsweise durch Zentrifugieren der Mischung und Sammeln des Pellets aus der wässrigen Lösung abgetrennt. Der resultierende Komplex kann, wie er ist, formuliert werden oder kann weiterbehandelt werden, um das Protein von dem Lignosulfonat zu dekomplexieren.
Die Arten von wässrigen Lösungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Lösungen ein, die bei der Produktion eines Proteins erzeugt werden, beispielsweise ganze Fermentationsbrühen, zellfreie Brühen, Zentrifugat, ultrafiltriertes Konzentrat und Säulenchromatographie-Eluat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zu komplexierende Protein ein Enzym. Der Ausdruck "Enzym" schließt Proteine ein, die chemische Änderungen in anderen Substanzen katalysieren können, ohne selbst geändert zu werden. Enzyme innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung schließen Pullulanasen, Proteasen, Cellulasen, Amylasen, Isomerasen, z. B. Glucoseisomerase, Lipasen, Oxidasen und Reduktasen ein. In der vorliegenden Erfindung weisen die Proteinkomplexe mit einem Lignosulfonat einen niedrigen Sulfonierungsgrad auf. Unter Verwendung eines Lignosulfonats mit einem niedrigen Sulfonierungsgrad werden mindestens 80% des Proteins aus der Lösung komplexiert. Vorzugsweise werden mindestens 90% des Proteins komplexiert, und am bevorzugtesten werden mindestens 95% des Proteins komplexiert.
Üblicherweise werden Lignosulfonate oder sulfonierte Lignine aus den rückständigen Aufschluss- Flüssigkeiten der Zellstoff- und Papierindustrie erhalten, wenn Lignocellulose-Material, wie Holz, Stroh oder Maisstengel, verarbeitet wird, um die Cellulose oder den Zellstoff von dem Lignin abzutrennen. Im Sulfit-Aufschlussverfahren wird das Lignocellulose-Material mit einem Sulfit oder Bisulfit aufgeschlossen, wodurch man eine rückständige sulfonierte Aufschluss-Flüssigkeit erhält, die üblicherweise als "Sulfitablauge" bezeichnet wird, in der das sulfonierte Lignin gelöst ist. In anderen Verfahren kann die rückständige Aufschluss-Flüssigkeit, wie sie aus dem Aufschlussverfahren erhalten wird, kein sulfoniertes Produkt sein. Jedoch können die rückständigen Flüssigkeiten oder Produkte, die den Lignin-Anteil des Lignocellulose-Materials aus anderen Verfahren und auch aus dem Sulfit-Verfahren enthalten, durch vielfältige bekannte Verfahren behandelt werden, um das Lignin zu den verschiedenen gewünschten Graden zu sulfonieren.
Der Sulfonierungsgrad ist ein Maß der Sulfonat- (SO§-) Gruppen pro Phenylpropan-Monomer- (C&sub9;-) Einheit des Lignins. Ein niedriger Sulfonierungsgrad sorgt für sehr gute Proteingewinnungs- Ausbeuten nach der Komplexierung von Protein aus einer Lösung.
Phenylpropan ist die Grund-Monomereinheit des natürlichen Lignin-Polymers, aber seine genaue Derivatisierung variiert von einer natürlichen Quelle zur anderen. So variiert die Elementar- Zusammensetzung unter den Baumarten. Z. B. ist die C&sub9;-Formel für WeichholzlFichtenholz C&sub9;H8,8O2,37(OCH&sub3;)0,96 und die C&sub9;-Formel für Hartholz/Birke ist C&sub9;H9,03O2,77(OCH&sub3;)1,58. Dieses ergibt Molekulargewichte von 184,15 Gramm/Mol Weichholz-Cs-Einheiten und 210,33 Gramm/Mol Hartholz-C&sub9;- Einheiten.
Auf der Grundlage der Literatur ist es vernünftig anzunehmen, dass aller sulfonischer Schwefel in einer gegebenen Probe mit der Lignosulfonat-Komponente verbunden ist. Unter Verwendung des Lignosulfonat-Gehalts eines gegebenen Produkts, wie er von dem Hersteller des Produkts beschrieben ist, kann die Sulfonierung des Lignosulfonats bestimmt werden. Es sollte bemerkt werden, dass, wenn SO&sub3;= mit Lignin reagiert, es sich mit einem Kohlenstoff-Atom in dem Polymer verknüpft, was typisch entweder das Natriumsalz (Molekulargewicht SO&sub3;Na = 103 Gramm/Mol) oder das Calciumsalz (Molekulargewicht SO&sub3;Ca¹/&sub2; = 100 Gramm/Mol) des resultierenden Lignosulfonats erzeugt.
In den folgenden Berechnungen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
SG = Sulfonierungsgrad
LSS = Sulfonat-Schwefelgehalt von Lignosulfonat (g Sulfonat-Schwefel/g Lignosulfonat)
PS = Sulfonat-Schwefelgehalt des Produkts (g Sulfonat-Schwefel/g Produkt)
PL = Lignosulfonat-Gehalt des Produkts (g Lignosulfonat/g Produkt)
LSSO = SOsNa-Gehalt von Lignosulfonat (g SOsNa/g Lignosulfonat)
LSMSO = Mol Sulfonatsalz (d. h. SOsNa) pro Gramm Lignosulfonat
LSL = äquivalenter Lignin-Gehalt von Lignosulfonat (g Lignin/g Lignosulfonat)
GL = Gramm Lignin
ML = Mol Lignin
M() - Molekulargewicht von Cs-Lignin-Einheit
Um den Sulfonierungsgrad (SG) eines gegebenen Ligninsulfonats zu berechnen, wird zuerst der Sulfonat-Schwefelgehalt der Lignin-Komponente des Lignosulfonats berechnet, indem man den bestimmten Sulfonat-Schwefelgehalt des Lignosulfonats durch den Lignin-Gehalt des Lignosulfonats dividiert.
LSS = PS/PL
Als nächstes werden die Gewichtsprozentsätze der Sulfonatgruppen in dem Lignosulfonat und beispielsweise bei einem Produkt auf Natrium-Basis die Mol SO&sub3;Na/Gramm Lignosulfonat unter Verwendung des geeigneten Molekulargewichts (103 Gramm SO&sub3;Na und 32 Gramm Mol S) berechnet:
LSSO = LSS·[M(SOsNa)/M(S)] = LSS·(103/32)
LSMSO = LSSO/M(SO&sub3;Na) = LSSO/103
Nun ist unter der Annahme einer Basis von 1 Gramm Lignosulfonat die Berechnung für den Gewichtsbeitrag aus Sulfonatgruppen wie folgt:
LSL = 1 - LSSO
GL = (1 Gramm Lignosulfonat)·LSL.
Dies muss vorgenommen werden, um die ursprünglich angenommenen Cs-Molekulargewichte zu verwenden. Schließlich wird die Zahl der Mol Lignin durch Dividieren der Gramm Lignin durch das geeignete Molekulargewicht berechnet, und ein SG-Einheitswert wird wie folgt erhalten:
SG = LSMSO/ML
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beträgt der Sulfonierungsgrad der Lignosulfonat-Probe weniger als etwa 0,5. Bevorzugt liegt der Sulfonierungsgrad zwischen 0,1 und 0,5.
Beispielsweise ist für eine Weichholz-Natriumlignosulfonat-Probe mit einem Sulfonat-Schwefelgehalt von 2,35% und einem Lignosulfonat-Gehalt von 90,2% die Berechnung des Sulfonierungsgrads der Probe wie folgt.
SO&sub3;Na-Gehalt von Lignosulfonat bezogen auf Gewicht und Mol SO&sub3;Na/Gramm Lignosulfonat:
(2,35% Sulfonat-Schwefel)/(90,2% Lignosulfonat-Schwefel) = 2,60% Sulfonat-Schwefel verbunden mit Lignosulfonat;
(2,60% Sulfonat-Schwefel)(103 Gramm SO&sub3;Na/32 Gramm S) = 8,39 Gew.-% SOsNa
(8,39 Gew.-% SO&sub3;Na)(103 Gramm SO&sub3;Na/Mol) = 0,000817 Mol SO&sub3;Na/Gramm Lignosulfonat
Die Mol Lignin:
(1 - 0,081 7 Gew.-% SOsNa)·100 = 91,8 Gew.-% Lignin
(1 Gramm LS)(91,6 Gew.-% Lignin) = 0,916 Gramm Lignin,
0,916 Gramm Lignin/(185,15 Gramm/Mol Cs-Einheiten) = 0,00487 Mol Cs-Einheiten
SG = 0,00817/0,004 87 = 0,168.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beträgt der Sulfonierungsgrad der Lignosulfonat-Probe weniger als etwa 0,5. Vorzugsweise liegt der Sulfonierungsgrad zwischen 0,1 und 0,5.
Lignosulfonate mit niedriger Sulfonierung komplexieren Proteine selbst bei den hohen Ionenstärken (d. h. 5-20 mS/cm (5-20 mmho)), die typisch für industrielle Fermentationen sind. Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, würde es erscheinen, dass der verringerte Sulfonierungsgrad hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Lignin und dem Protein gestattet, um die ionischen Wechselwirkungen zu ergänzen, die anderenfalls bei Ionenstärken über etwa 2 mS/cm (2 mmho) abgeschirmt würden.
Obwohl die vorliegenden Erfindung bei hohen Ionenstärken arbeitet, kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, die Ionenstärke der Lösung z. B. durch Verdünnung oder Diafiltration zu verringern. Im Verfahren der Erfindung wird der pH der Lignosulfonat/Protein-Lösung mindestens eine Einheit unter den isoelektrischen Punkt des Proteins erniedrigt. Wenn der pH erniedrigt wird, verbinden sich das Protein und Lignosulfonat unter Bildung eines Komplexes. Wie oben bemerkt, bildet sich der Lignosulfonat/Protein-Komplex wahrscheinlich als Ergebnis sowohl von ionischen Wechselwirkungen als auch hydrophoben Wechselwirkungen zwischen dem Lignosulfonat und dem Protein.
Der isoelektrische Punkt (pl) eines Proteins ist der pH, bei dem das Protein keine elektrische Nettoladung trägt. Am isoelektrischen Punkt ist die elektrophoretische Mobilität null, d. h. das Protein wandert nicht in einem elektrischen Feld. Unter dem pl ist das Protein positiv geladen; über dem pl ist das Protein negativ geladen.
Die elektrophoretische Mobilität und der pl können für Proteine in ihrer nativen Form durch die Technik der isoelektrischen Fokussierung bestimmt werden. Man lässt die Protein-Probe auf einem isoelektrischen Fokussierungs-(I.E.F.-) Gel unter Verwendung eines ampholytischen Puffers zum Aufbau eines pH-Gradienten laufen. Standardisierte voreingestellte I.E.F.-Gele können erworben werden. Proteine wandern zu Punkten hoher Auflösung auf dem Gel, was gestattet, dass der pH unter Verwendung von Standards oder eines kalibrierten Gels abgelesen werden kann. Die Technik ist in Robert Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982, S. 172- 177 und S. 250-251 beschrieben.
Die Größe des erforderlichen Unterschiedes zwischen pH und pl hängt umgekehrt von dem Grad der Ladung ab, die bei dem Protein bei einem gegebenen Abfall des pH titriert wird.
Der Lignosulfonat/Protein-Komplex der vorliegenden Erfindung zeigt eine verbesserte Lagerstabilität. Der Komplex ist nicht bloß ein gefälltes Protein, sondern stellt eine einzigartige Form von Material dar. Der Komplex weist selbst bei erhöhten Temperaturen eine ausgezeichnete Langzeit- Lagerfähigkeit auf, insbesondere, wenn der Feuchtigkeitsgehalt auf etwa 5% Gew./Gew. oder weniger verringert ist. Das Trocknen des Komplexes kann beispielsweise durch Gefriertrocknung oder durch Sprühtrocknung durchgeführt werden.
Der Lignosulfonat/Protein-Komplex kann auf eine Anzahl von Weisen dekomplexiert werden.
Beispielsweise kann der Komplex in Wasser oder einem wässrigen Puffer suspendiert werden, und Base kann zugesetzt werden, um den pH anzuheben, um die Dekomplexierung zu erleichtern. Der Komplex kann auch in einem wässrigen Puffer suspendiert werden, und der Komplex kann zu einem solchen Ausmaß verdünnt werden, dass die Dekomplexierung erleichtert wird.
Beispielsweise kann ein Komplex von Lignosulfonat und Enzym am leichtesten durch Suspendieren des Komplexes in einer wässrigen Lösung und Anheben des pH über den isoelektrischen Punkt aufgebrochen werden. Der genaue Grad der Enzymaktivität, die in die Lösung freigesetzt wird, ist eine Funktion einer einzigartigen Titrationskurve jedes Proteins und Enzyms, aber im Allgemeinen kann eine vollständige Dissoziation bei 1-5 pH-Einheiten über dem pH des Proteins erwartet werden. Ein alternatives Mittel zur Dekomplexierung besteht darin, die Ionenstärke einer Suspension des Komplexes zu erhöhen. Die wenig sulfonierten Lignosulfonate (wie D460-7) weisen weniger Empfindlichkeit für die Ionenstärke auf als hoch sulfonierte Lignosulfonate (wie CBOS-6) und erfordern so im Allgemeinen sehr hohe Salzgehalte, größer als 80 mS/cm (80 mmho) an Leitfähigkeit, um mehr als 75 % des Proteins in die Lösung freizusetzen.
Protein, das aus einem Komplex mit Lignosulfonat freigesetzt worden ist, ist im Allgemeinen immer noch co-gelöst, da Lignosulfonate hochlöslich sind und in der Tat als gute Löslichmacher für Proteine bei einem pH über dem pl des Proteins wirken. Es kann wünschenswert sein, das Lignosulfonat von dem löslichen Protein abzutrennen, wenn beispielsweise die dunkle Farbe oder andere Eigenschaften des Lignosulfonats in einer Formulierung nicht erwünscht wären. Dies kann im Prinzip durch Ausflocken des Lignosulfonats mit einem mehrwertigen Kation, wie Calcium, einem kationischen Polyelektrolyt-Polymer, wie einem Polyamin, oder einem Anionenaustauscherharz vorgenommen werden.
Das Protein, das unter Verwendung der vorliegenden Erfindung gereinigt wurde, kann entweder als Teil des Komplexes oder nach der Dekomplexierung und Entfernung der Lignosulfonate einer Formulierung zugesetzt werden. Beispielsweise kann der Lignosulfonat/Protein-Komplex Detergens- Zusammensetzungen entweder direkt oder als Teil einer Granalie zugesetzt werden.
Der Komplex der Erfindung kann leicht auf inerte Trägerteilchen, wie non-pareil-Samen, Salzkörner oder durch Sprühkristallisation erzeugte Granalien, zur Bildung von Granalien aufgesprüht werden. Beispielsweise ist die pH-Stabilität von Granalien, die unter Verwendung des Komplexes hergestellt wurden, in einer Detergens-Formulierung ausgezeichnet, da der Komplex stabil bei dem Granalien- Formulierungs-pH (etwa 5-6) vorliegt, aber rasch dissoziiert wird, wenn der pH durch Kontakt mit der alkalischen Detergens-Lösung in der Waschanwendung auf 9 oder höher angehoben wird.
Der Komplex der Erfindung, in dem der Sulfonierungsgrad zwischen 0,1 und 0,5 liegt, kann auch mit Bindemitteln gemischt werden und durch Extrusion, Spheronisierung oder Hochintensitäts- Granulation granuliert werden.

Experimenteller Abschnitt

Die Protease-Konzentration wurde gemäß Bonneau et al. (1991), J. Am. Chem. Soc. 113(3): 1030 durch einen kolorimetrischen Spektrophotometer-Assay zur Messung der Hydrolyse-Geschwindigkeit eines synthetischen Substrats, N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid, gemessen.

Anfängliches Durchmusterungsverfahren

Eine 6 g/l-Lignosulfonat-Lösung wurde mit 10%-iger Ameisensäure auf pH 3,0 eingestellt. Eine 1 : 1-Verdünnung dieser Lösung wurde verwendet, um eine 3 g/l-Lignosulfonat-Lösung bei pH 3,0 herzustellen. 3,0 ml der Lignosulfonat-Lösung wurden in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben. 3,0 ml Protease, pH 5,0, wurden in das Röhrchen gegeben und 10 Sekunden auf einem Vortex-Mischer gemischt. Das Material wurde 5 Minuten bei 2 200 U/min zentrifugiert, und der pH und die Leitfähigkeit des Überstandes wurden gemessen. Eine 1 : 1 000-Verdünnung des Überstands wurde hergestellt, und der Protease-Assay wurde durchgeführt, wie in dem Assay-Verfahren beschrieben.

Natriumchloridkonzentrations-Experiment

1. Herstellung von Protease

Die geeignete Menge ab Natriumchlorid wurde zu 50 ml roher Protease gegeben, und der pH wurde mit 10%-iger Ameisensäure auf 5,0 eingestellt. Lösungen von 0%, 1%, 2%, 5% und 10% Natriumchlorid wurden hergestellt. Es wurde angenommen, dass rohe Protease keine signifikanten Mengen an Natriumchlorid enthält.

2. Probenherstellung

(a) 3,0 ml Lignin-Lösung zu 6 g/l, und bei pH 3,0 wurden in fünf 15 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
(b) 3,0 ml Protease mit 0% Natriumchlorid wurden zu einem der Zentrifugenröhrchen gegeben und 10 Sekunden gemischt.
(c) Das Röhrchen wurde 5 Minuten bei 2 200 U/min zentrifugiert.
(d) Der pH des Überstands in dem Röhrchen wurde gemessen und verworfen. Das Pellet wurde dann in Enzym-Verdünnungsmittel resuspendiert.
(e) Eine 1 : 1000-Verdünnung der resuspendierten Pellet-Lösung wurde hergestellt.
(f) Die Stufen 2-5 wurden für Protease mit 1%, 2%, 5% und 10% Natriumchlorid wiederholt.
(g) Der Protease-Assay wurde bei allen Proben durchgeführt, wie im Assay-Verfahren beschrieben.

Beispiel 1

Beispiele für Lignosulfonat-Molekulargewicht und Sulfonierungsgrad

Unter Verwendung von Subtilisin-Protease, die gemäß der Offenbarung der WO 95/10615 hergestellt wurde, wurden die Fällungseffizienzen von 23 kommerziellen und experimentellen Lignosulfonaten bei Lignosulfonat-Proteaseenzym-Massenverhältnissen von 1 : 1 und 2 : 1 bestimmt. Die Proben wurden hergestellt, wie obenangegeben. Die getesteten Lignosulfonate wiesen einen breiten Bereich von Molekulargewichten und variierende Sulfonierungsgrade auf (siehe Tabelle 1). Die Fällungseffizienzen auf der Grundlage des Überstandes dieser Produkte lagen im Bereich von 0-66% bei einem 1 : 1 Lignin: Enzym-Verhältnis bis 9-93% bei einem 2 : 1 Lignin: Enzym-Massenverhältnis (siehe Tabelle 1). Während die Leitfähigkeit die Fällungseffizienz nicht zu beeinflussen schien, tat dies der pH. Obwohl der Grund dafür nicht klar ist, wurde auch beobachtet, dass die Zugabe von Lignin, das auf pH 3 voreingestellt war, zu Protease, die auf pH 5 voreingestellt war, effizienter war als die direkte Einstellung des pH einer Mischung von Lignin und Protease auf den gleichen End-pH (siehe Tabelle 2). Tabelle 1 Lignin-Fällungs-Datenbank - Protease
N/A = nicht erhältlich; Zahlen in Klammern sind Abschätzungen Tabelle 2 Auswirkung der Reihenfolge der Zugabe auf die Fällungsausbeute (Lignin: Protease-Verhältnis = 2 : 1) Fällungsausbeute
Eine weitere Analyse der 2 : 1 Lignin: Enzym-Daten zeigte an, dass es wenig Korrelation zwischen dem Lignin-Molekulargewicht und der Fällungseffizienz gab (siehe Fig. 1). Eine Korrelation wurde zwischen dem Sulfonierungsgrad und der Fällungseffizienz gefunden (Siehe Fig. 2). Lignin-Produkte mit niedrigen Sulfonierungsgraden ergaben Fällungseffizienzen von 80% oder besser.

Auswirkung von Natriumchlorid auf die Fällungseffizienz

Die Auswirkung von Natriumchlorid auf die Fällungseffizienz wurde unter Verwendung des Verfahrens, das im obigen Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben wurde, für drei Produkte bestimmt, deren Sulfonierungsgrad im Bereich von 0,17 bis 0,65 503/Cs-Einheit lag. Speziell wurden D- 451-9 (SOdCs-Einheit = 0,17), D-468-11 (SOaICs-Einheit = 0,36) und D-453-7 (SOaICg-Einheit = 0,65) getestet.
Bei allen drei Produkten wurde ein allgemeiner Trend zu niedrigerer Ausbeute mit zunehmender Natriumchlorid-Konzentration beobachtet. Bei Natriumchlorid-Konzentrationen von mehr als 20 g/l fielen die Fällungseffizienzen bei allen drei Produkten auf weniger als 65%. Die Auswirkung von Natriumchlorid schien auch unabhängig von dem Sulfonierungsgrad des Lignins zu sein, obwohl es schien, dass die Ausbeuten im Allgemeinen bei D-451-9 etwas höher waren.

Beispiel 2

Reproduzierbarkeit

Die Reproduzierbarkeit von Ausbeuten, die über das Überstand-Verfahren bestimmt wurden, welches in dem Abschnitt Anfängliches Durchmusterungsverfahren beschrieben wurde, wurden durch Durchführung von fünf Parallelansätzen von drei verschiedenen Lignin-Produkten bestimmt. Tabelle 3 Reproduzierbarkeits-Ergebnisse

Beispiel 3

Massenbilanz-Daten

Die Verwendung des Überstand-Verfahrens für die Ausbeuten-Bestimmung wurde durch Messen der Aktivitäten des Überstands und des wiederaufgelösten Pellets bei vier Lignosulfonat/Protease-Proben verifiziert. Allgemein wurde eine gute Korrelation zwischen der durch die Überstandmessungen erhaltenen Ausbeute und derjenigen gefunden, die durch Messungen des wiedergelösten Pellets erhalten wurde (siehe Tabelle 4). Tabelle 4 Massenbilanz-Daten

Beispiel 4

Auswirkung des pH auf die Komplexierung

Eine Amylase wurde gemäß der Offenbarung der WO 95/05295 hergestellt und mit zwei Lignosulfonaten, C-BOS und D-460-7, komplexiert, und die Auswirkung des pH auf die Komplexierung wurde überprüft. 0,81 g/l des Amylase-Zentrifugats wurden mit jedem Lignosulfat bei einem 2 : 1- Massenverhältnis Lignosulfonat: Enzym gemischt. Der pH wurde mit Natriumhydroxid auf 8 eingestellt und dann nach unten-durch Zugaben von 10%-iger Ameisensäure eingestellt. Bei jedem pH wurden die Aufschlämmungen zentrifugiert, und die Zentrifugate wurden unter Verwendung des löslichen Substrat- Assays, der in der WO 94/05295 beschrieben ist, auf die Amylase-Aktivität getestet. Fig. 3 zeigt den Prozentsatz an Amylase, die als Amylase/Lignosulfonat komplexiert ist, als Funktion des pH.

Beispiel 5

Granulierung

Lignosulfonat/Protease-Komplex wurde als Paste hergestellt. Die verwendete Protease war die gleiche wie die in Beispiel 1 verwendete. 350 Liter von 2,6 g/l filtriertem Protease-Zentrifugat wurden mit einem Kopfmischer gerührt. Zu dieser Lösung wurden 9,1 kg einer 20%-igen Gew./Gew. Lösung von Lignosulfonat D-1030 gegeben, was ein 2 : 1 Gewichtsverhältnis von Lignin zu aktivem Enzym zum Ergebnis hatte. [Berechnung: 350 I · 0,26% Protein/100 · 2 : 1 Lignosulfonat: Enzym/0,20 = 9,1 kg.] Die Lösung wurde mit 0,5 Liter 88%-iger Ameisensäure auf einen pH von 4,8 eingestellt, was verursachte, dass sich der Lignosulfonat/Enzym-Komplex als Aufschlämmung bildete. 60 Liter dieser Aufschlämmung wurden 7 Minuten bei 3000 U/min in einer SharplesTM 3PP350 Vollmantelzentrifuge zentrifugiert. Das Zentrifugat wurde zu 0,44 g/l, Protein getestet. Der Schlamm wurde entfernt und zu 90 g/kg Protease mit einem Trockengewicht von 25,1% Gew./Gew. Feststoffe getestet. Demgemäß stellt das Proteaseenzym 9,0/25,1 = 36% der Gesamt-Feststoffe in der Lignin-Enzym-Paste dar.
Diese 60 Liter der Aufschlämmung wurden verarbeitet, was 1,087 kg Paste ergab. Die Ausbeute war: (90·1,087)/(2,6·60) = 63% Ausbeute. Die niedrige Ausbeute beruhte teilweise auf Handhabungsverlusten.
Zu 784 Gramm der obigen 90 g/kg Paste wurden 508 Gramm einer 59,5%-igen Gew./Gew. Lösung von NorligTM A-Lignosulfonat gegeben. Man ließ die Aufschlämmung mehrere Minuten mischen.
751 Gramm granuläre Natriumsulfat-Kerne wurden in einen Vector Flo-CoaterTM eingetragen und bei einer Bett-Temperatur von 60ºC fluidisiert. Die obigen 1292 g Protein-Aufschlämmung (die 70,6 g aktives Proteinenzym enthielt) wurde mit einer anfänglichen Geschwindigkeit von 20 g/Minute, die allmählich auf 38 g/Minute angehoben wurde, bei einer Einlasstemperatur von 76-81º, einer Auslasstemperatur von 44-52º, einem Zerstäubungs-Luftdruck von 4-5 Bar und einem Luftstrom von 3,9-4,5 m³/s (8 300 - 9 500 cfm) auf die Kerne aufgesprüht. Nach der Enzymauftragung wurde ein EnzoguardTM-Standard-Schutzgranalienüberzug aufgebracht, wie im US-Patent 5,324,659 beschrieben. EnzoguardTM ist ein abriebbeständiger Polymerüberzug, der Polyvinylalkohol, nicht-ionisches Tensid und Titandioxid-Pigment einschließt.
Aus der Auftragmaschine wurden 1,491 kg Granalien mit einer Aktivität von 41,7 g/kg Protein geerntet, was eine 88,2%-ige Ausbeute an aktivem Enzym darstellte.

Beispiel 6

Detergens-Formulierung/Stabilität

Die Lagerstabilität des in Beispiel 6 (Probe 1) hergestellten Granulats und eines Granulats, das auf ähnliche Weise unter Verwendung einer Protease hergestellt wurde, welche gemäß der Offenbarung der WO 91/06637 hergestellt werden kann (Probe 3), wurden mit Kontrollgranulaten verglichen, die unter Verwendung der gleichen Proteasen hergestellt wurden, welche nicht mit Lignosulfonat komplexiert worden waren (Proben 2 bzw. 4).
Jedes der Granulate wurde in ein Pulverdetergens mit Bleichmittel bei Konzentrationen formuliert, die ausreichend waren, um 0,11 ppm aktives Enzym für den Waschvorgang zu liefern. Das voll formulierte Pulver wurde in offenen Behältern bei 26,7ºC (80ºF)/60% relativer Feuchtigkeit über bis zu 6 Wochen gelagert. In regelmäßigen Intervallen wurden Proben des Produkts aus der Lagerung entnommen und bezüglich des Reinigungsverhaltens und der beibehaltenen Enzymaktivität getestet.
Die Waschtest-Ergebnisse zeigten, dass nach sechswöchiger Lagerung alle Proben sowohl bezüglich des Reinigungsverhaltens als auch der beibehaltenen Enzymaktivitätsleistung im Wesentlichen identisch waren.

Beispiel 7

Xylanase

Xylanase ist ein Enzym, das von der Geflügelindustrie verwendet wird, um die Futtereffizienz zu verbessern. Das Enzym wird normalerweise als Vormischung hergestellt und mit dem Futter gemischt. Das fertige Futter wird für die Aufnahme durch die Hühner pelletiert. Das Pelletierungsverfahren beinhaltet die Einspritzung von Wasserdampf in die Mundstücke, in denen das Futter extrudiert wird. Dieses Verfahren verringert die Umweltlast und setzt die Stärken frei, die als Bindemittel wirken.
Drei Chargen von Vormischung, die Xylanaseenzym (GC 140, im Handel erhältlich von Genencor International, Inc.) enthielten, wurden unter Verwendung eines Fließbett-Granulierungsverfahrens hergestellt. Zwei der drei Chargen enthielten Xylanaseenzym, das mit einem Lignosulfonat komplexiert war, eine Vormischungscharge mit nicht-komplexierter Xylanase wurde als Kontrollformulierung verwendet.
Charge 1
Xylanase 367,6 ml
Lignosulfonat (D-460-7) 147 ml
Weizenträger 596 g
Charge 2
Xylanase 367,6 ml
Weizenträger 632 g
Charge 3
Xylanase 367,6 ml
Lignosulfonat (D-460-7) 73,52 ml
Weizenträger 596 g
Verfahren:
Die Herstellung der Vormischung mit der komplexierten Xylanase beinhaltete ein Zweistufen- Verfahren.
Stufe Nr. 1. Komplexierung: Dieser Schritt beinhaltete die langsame Zugabe von Lignosulfonat zu der flüssigen Xylanase unter Rühren. Eine pH-Einstellung war bei diesem Verfahren erforderlich, um einen pH-Bereich bereitzustellen, in dem das Xylanaseenzym stabil ist.
Dies wurde durch Zugabe von Ameisensäure während der Lignosulfat/Xylanase- Komplexbildung erzielt.
Stufe Nr. 2. Vormischung: Eine Charge der Vormischung wurde unter Verwendung der unkomplexierten Xylanase hergestellt, und die anderen zwei enthielten Lignosulfonat/- Xylanase-Komplex. Die Charge 1 wurde hergestellt, indem man die komplexierte Xylanase mit dem Weizenträger in einem Hobart-Mischer mischte und die Mischung in einem Fließbett-Trockner trocknete. Die anderen zwei Chargen wurden hergestellt, indem man Lignosulfonat/Xylanase in einer Fließbett-Granulierungsvorrichtung auf den Träger sprühte. Literaturstellen
1. J. Wallerstein und E. Farber (1944) Indust. and Eng. Chem. 36(8): 772-774
2. US-Patent 2,418,311 (1947) W. McFarlane und N. Nikolaiczuk
3. US-Patent 3,390,999 (1964) L. Jantzen
4. A. Hopwood und G. Rosen (März 1972) Process Biochem. 15-17
5. US-Patent 3,053,919 (1962) J. Ziffler und T. Cairney
6. H. Kawamoto, F. Nakutsubo und K. Murakami (1992) Mokuzai Gakkaishi 38(1) 81-84

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines Proteins aus einer wässrigen Lösung, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Zugabe von einem oder mehreren Lignosulfonat(en) bei einem Massenverhältnis von mindestens 0,1 : 1 (Lignosulfonat zu Protein) zu der wässrigen Lösung, wobei das Lignosulfonat einen Sulfonierungsgrad von weniger als etwa 0,5 aufweist;

(b) Einstellen des pH der Lösung von Schritt (a) auf einen pH von etwa 1-5 pH-Einheiten unter dem isoelektrischen Punkt des zu gewinnenden Proteins, um einen unlöslichen Komplex zwischen dem Lignosulfonat und dem Protein zu bilden; und

(c) Abtrennen des unlöslichen Komplexes von Schritt (b) aus der wässrigen Lösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der Sulfonierungsgrad zwischen 0,1 und 0,5 liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem der pH auf einen pH von etwa 2-4 pH-Einheiten unter dem isoelektrischen Punkt des Proteins eingestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Protein ein Pilz- oder Bakterienenzym ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in dem das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amylase, Protease, Cellulase, Lipase, Xylanase, Pullulanase, Reductase, Oxidase und Glucoseisomerase.

6. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt des Trennens der Lignosulfonat- und der Proteinkomponente des Komplexes.

7. Lignosulfonat/Protein-Komplex, in dem das Lignosulfonat einen Sulfonierungsgrad von weniger als etwa 0,5 aufweist.

8. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 7, in dem der Sulfonierungsgrad zwischen 0,1 und 0,5 liegt.

9. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 7, in dem das Protein ein Pilz- oder Bakterienenzym ist.

10. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 7, in dem das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Amylase, Protease, Cellulase, Lipase, Xylanase, Pullulanase, Reductase, Oxidase und Glucoseisomerase.

11. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 7, der direkt in eine flüssige, granuläre, pulverförmige oder pastenförmige Protein-haltige Formulierung formuliert ist.

12. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 8, in dem der Komplex unter Verwendung eines organischen oder anorganischen Salzes, Polyols, organischen Polymers oder eines Tensids formuliert ist.

13. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 8, in dem der Komplex einen Kern oder ein Teilchen überzieht, um eine Granalie zu bilden, die den Komplex enthält.

14. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 8, in dem der Komplex mit Bindemitteln gemischt und durch Extrusion, Spheronisierung oder Hochintensitäts-Granulation granuliert ist.

15. Lignosulfonat/Protein-Komplex nach Anspruch 8, in dem der Komplex direkt in eine Tensid-Paste oder andere trockene Detergens-Zusammensetzung agglomeriert ist.

16. Verfahren zur Verwendung des Komplexes nach Anspruch 7, um eine Protein-haltige Granalie zu bilden, wobei das Verfahren das Auftragen des Komplexes auf die Oberfläche eines Kerns oder Teilchens und gegebenenfalls ein weiteres Beschichten des Teilchens umfasst.