DE2218158A1

DE2218158A1 - Verfahren zur Herstellung neuer unlöslicher Verbindungen aus natürlichen oder synthetischen, stickstoffhaltigen Substanzen

Info

Publication number: DE2218158A1
Application number: DE19722218158
Authority: DE
Inventors: Pierre Charles; Tixier Rene; Paris. P Wirth
Original assignee: Societe Generale de Recherches et dApplications Scientifiques Sogeras, Paris
Priority date: 1971-04-16
Filing date: 1972-04-14
Publication date: 1972-11-23
Also published as: FR2133607B1; FR2133607A1; US3836433A; CH564497A5; GB1392181A

Description

Verfahren zur Herstellung neuer unlöslicher Verbindungen aus natürlichen oder synthetischen, stickstoffhaltigen Substanzen

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Befestigung natürlicher oder synthetischer, stickstoffhaltiger Substanzen auf einem unlöslichen Träger. Dieser Träger kann in Form eines Granulats oder in Form absolut runder Kugeln verschiedener Größen auftreten. Aus diesem Grunde können sämtliche natürlichen oder synthetischen Polymere, die in der Lage sind, Gele in wässriger Lösung zu bilden, als Träger innerhalb dieses Verfahrens verwendet werden. Unter den am häufigsten verwendeten können die Polysaccharid-Gele (z.B. Agar-Agar oder Agarose) oder die Acrylamid-Gele genannt werden. Diese Gele können entweder allein oder in Verbindung mit anderen Stoffen unterschiedlicher Konzentrationen (wie z.B. eine Verbindung aus Agarose mit Acrylamid) verwendet werden.

Bei den erfindungsgemäß mit dem unlöslichen Träger zu vorbindenden Substanzen kann es sich entweder um natürliche Ge-

mische

209848/1166

A 12 441

mische wie z.B. Aminoessigsäuren, Polypeptide, Proteine oder um alle anderen biochemischen Zusammensetzungen handeln, die in ihrem Molekularaufbau einen Proteinanteil oder ganz einfach eine Amin- oder Amid-Funktion aufweisen. Unter den natürlichen Produkten können die Enzyme, die Enzym-Hemmstoffe, die Antikörper, die Antigene, die polypeptischen oder Proteinhormone sowie bestimmte Proteine wie z.B. die Konkanavaline genannt werden. Unter den Syntheseprodukten scheinen die Enzym-Hemmstoffe ebenfalls für das erfindungsgemäße Verfahren eine große Bedeutung zu besitzen. Erfindungsgemäß werden die stickstoffhaltigen Substanzen auf dem unlöslichen Träger mit Hilfe eines zweifunktionalen organischen Gemischs befestigt, das zwischen der zu befestigenden Substanz und dem Träger eine Brücke bildet. Diese Gemische sind ihrer Art nach dialdehydisch, wobei die aldehydischen Funktionen an den Endpunkten einer aliphatischen bzw. aromatischen Kette liegen. Diese Gemische entsprechen der allgemeinen Formel OHC-(R)-CHO, in der R eine aliphatische bzw. aromatische Kette unterschiedlicher Zusammensetzung und Länge darstellt. In dem am häufigsten auftretenden Fall (R)= (C^)_n, liegt η zwischen 0 und 6. Die in der Praxis am häufigsten verwendeten Dialdehyde sind das Glutaraldehyd (Pentan-Dial) und das Glyoxal (Äthan-Dial). Das dialdehydische Gemisch reagiert einerseits mit den hydrophilen Verbindungen des Träger-Gels, z.B. mit den Hydroxy1-Verbindungen der Agarose oder mit den Amid-Verbindungen des Acrylamid und andererseits mit den Amin-Funktionen der Proteine oder anderer stickstoffhaltiger Substanzen, die auf diesem Träger befestigt werden sollen.

Die Befestigung bzw. Kopplung erfolgt erfindungsgemäß in zwei Verfahrensschritten:

- in einem ersten Stadium wird eine bekannte Menge Gel, entweder im wässrigen oder im trockenen Zustand (Gel gefriergetrocknet und neu hydratierbar ) mit einem Überschuß an Glutaraldehyd in wässriger Lösung bzw. in einem geeigneten Pufferstoff in Verbindung gebracht, wobei als Pufferstoff Tris (Hydroxylmethyl) Aminomethan ausscheidet, da dieses mit dem Dialdehyd reagieren würde.

- 2 - Das

209848/1166

A 12 441

Das auf diese Weise aktivierte Gel wird anschließend gewaschen, um das nicht abgebundene Aldehyd zu entfernen; - in einem zweiten Stadium wird die stickstoffhaltige Substanz mit den freien Aldehyd-Verbindungen kombiniert. Die Kombination aus stickstoffhaltiger Substanz und Träger wird anschließend gewaschen, um die nicht abgebundenen, überschüssigen Substanzen zu entfernen. In dieser Kombination ergibt sich der Vorteil, daß das Gel gefriergetrocknet und in trockener Form neu hydratierbar gelagert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Befestigung eignet sich insbesondere für Enzyme. Eines der größten Probleme bei der Vorbereitung unlöslicher Enzyme liegt in ihrem Aktivitatsverlust begründet, der während der bei der Befestigung ablaufenden chemischen Reaktionen zutage tritt, wobei die Aktivität des befestigten Enzyms gegenüber der des löslichen Enzyms im allgemeinen stark zurückgeht. Die Anmelderin hat bei Versuchen ermittelt, daß aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens die gesamte Aktivität des Enzyms nicht nur beibehalten, sondern in der Mehrzahl der Fälle sogar vergrößert wird und zwar insbesondere dann, wenn die Enzyme auf Acrylamid-Agarose-Gel entsprechend der nachstehenden Tabelle I befestigt werden.

Im Falle der Amylase ist die ermittelte Aktivität, obwohl diese unter 100% liegt, als bemerkenswert zu bezeichnen, da das Substrat (lösliche Stärke) ein hohes Molekulargewicht aufweist und der Kontakt mit den innerhalb der Kügelchen befestigten Enzyme-Molekülen beträchtlich herabgesetzt ist.

Darüber hinaus hat die Anmelderin festgestellt, daß die aus der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hervorgehenden, unlöslichen Enzyme gegenüber den entsprechenden löslichen Enzymen stabiler sind. Ihre Zeitstabilität sowie ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber thermischen Zerfallserscheinungen liegen über den Werten der löslichen Enzyme.

Durch die Tatsache bedingt, daß die Enzyme auf genau kalibrierten Kügelchen befestigt werden, können regelmäßige Flußreihen in der Form gebildet werden, daß die enzymatische Reaktion

- 3 - bei

209848/1166

j. A 12 441

bei Durchgang des Substrats durch die Gel-Reihe durchgeführt werden kann.

Abgesehen von der Bedeutung der auf dem Gel befestigten Enzyme, was die damit verbundenen enzymatischen Reaktionen anlangt, bestehen weitere Möglichkeiten, die mit der selektiven Affinität der Enzyme gegenüber bestimmten natürlichen Substanzen und insbesondere gegenüber ihren Hemmstoffen in Verbindung stehen. Somit kombinieren sich unlösliche proteolytische Enzyme unter bestimmten pH-Bedingungen mit ihren Hemmstoffen, die anschließend mit Hilfe einer Pufferlösung unterschiedlicher pH-Werte herausgelöst werden können. Demgegenüber ermöglicht die Verwendung von natürlichen oder synthetischen Hemmstoffen, die mit dem Gel verbunden werden, die selektive Trennung der entsprechenden Enzyme. Auch kann die Befestigung bestimmter selektiver Substrate auf dem Gel zur selektiven Absorption von Enzymen ausgenutzt werden, die auf diese Substrate wirken. Diese selektive Trennung von Enzymen auf unlöslichem Gel des Hemmstoffes oder Substrats wird vorzugsweise mittels Durchlauf der extraktiven Lösung vorgenommen, die das Enzym auf der Gel-Reihe enthält, wobei dieses letztere durch genau kalibrierte Kügelchen gebildet wird, die einen regelmäßigen und ausreichend schnellen Fluß der Lösungen durch die Gel-Reihe ermöglichen. Nach Befestigung des Enzyms wird der Aufbau gereinigt und anschließend das Enzym durch eine Pufferlösung entsprechenden pH-Wertes abgeführt. Darüber hinaus kann auch das Enzym durch Dispersion der Kügelchen in der das Enzym enthaltenden Extraktionsflüssigkeit absorbiert werden, wonach die Kügelchen durch Einwirkung der Zentrifugalkraft aufgenommen, gewaschen und anschließend das Enzym herausgelöst wird.

Dieses Verfahren ist auch in den Fällen anwendbar, in denen es darauf ankommt, Antikörper bzw. Antigene auf dem Gel zu befestigen. Durch die unlöslichen Antigene können selektiv die entsprechenden Antikörper herausgetrennt werden, z.B. die serischen Antikörper; umgekehrt nehmen die unlöslichen Antigene selektiv die entsprechenden Antikörper, so z.B. das Insulin, auf.

- 4 - TABELLE I

209848/1166

TABELLE I

A 12 441

Enzyme

Gel-Zusammensetzung % Acrylamid % Agarose

Enzym auf dehydratisiertem Gel befestigt

% Aktivität des gegenüber dem löslichen Enzym befestigten Enzym

Trypsin

4 4 6

3 4

4,6 5,0 6,5

116 114 156

Chymotrypsin 4 4 6

2 4 2

4,6 6,5 6,8

110 140 100

Proteasen,

pankreatische

3,0

120

Proteasen,

Rohsaft

(Papayer)

3,2

3,5

120 130

Älpha-Amylase	3	4	2,5	80
Urease	3	2	4,2	100
Arginase	4	2	4,1	100
Lysozyme	5	1	2,5
Cytochrome	4	4	6,0

Anmerkung: Bei den Proteasen ergaben sich die obengenannten Werte bei einem hämoglobinen Substrat ; auf einem synthetischen Substrat wurden oftmals bessere Ergebnisse beobachtet.

Eine

209848/1166

$ A 12 441

Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Verwendung von unlöslichen Proteinen, die gegenüber bestimmten biologischen Bestandteilen eine Affinität aufweisen. So besitzen beispielsweise die Concanavaline, die zur Gruppe der vegetalen Proteine gehören, eine besondere Affinität gegenüber den Polysacchariden und den Glukoproteinen. Je nach dem auf dem Gel befestigten Concanavalin ist es möglich, ein PoIysaccharid oder ein bestimmtes Glukoprotein zu trennen. Nach diesem Verfahren können nicht nur selektiv die Polysaccharide, die an der Bildung von Zellwänden beteiligt sind, sondern ebenfalls die Zellen getrennt werden, deren Wandungen diese Polysaccharide bzw. Glukoproteine enthalten.

Innerhalb dieser Beschreibung kann nur ein begrenzter Teil der Möglichkeiten genannt werden, die sich mit der Verwendung von Gelen der Gattungen des Acrylamid, der Agarose, der Acrylamid-Agarose und ähnlicher ergeben, auf denen erfindungsgemäß natürliche bzw. synthetische, stickstoffhaltige Substanzen befestigt werden können. Als Beispiel sollen nachstehend einige Verfahren genannt werden, die in die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingehen, wobei hinzuzufügen ist, daß diese Erklärungen nur beispielhaft aufzufassen sind.

In der Zielsetzung der Erfindung liegt damit die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung neuer unlöslicher Verbindungen aus natürlichen oder synthetischen, stickstoffhaltigen Substanzen,

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zwischen Träger und Substanz eine Brücke mit Hilfe eines zweifunktionalen organischen Gemisches gebildet wird.

BEISPIEL I

Befestigung von Aminoessigsäuren auf Acrylamid-Agarose-Kügelchen unter Verwendung von Glutaraldehyd

100 g gefriergetrocknetes Gel werden in Suspension in 2,5 Liter wässrige Lösung mit 10%igem Glutaraldehyd-Anteil eingebracht, wonach diese Lösung unter Rühren während 4 bis 5 Stunden bei einer Temperatur zwischen 10⁰C und 25° C gehalten wird.

2O98Ä8⁶/"1166 —

A 12 441

Das auf diese Weise aktivierte Gel wird anschließend gewaschen und zwar durch Wiedereinbringung in eine Suspension von entkalktem Wasser; anschließend wird dieses solange gefiltert bzw. geschleudert bis das nicht abgebundene Glutaraldehyd vollständig entfernt ist (Spektro-photometrische Prüfung bei 280 nm).

Darüber hinaus werden 15 Gramm Aminoessigsäure in einem Liter Lösung aus Bikarbonat (Natrium) 0,1 M mit einem pH-Wert von 7,5 aufgelöst und in diese Lösung das aktivierte, geschleuderte bzw. gefilterte Gel in Suspension eingebracht. Während etwa 60 Minuten wird diese Mischung mechanisch bewegt, um somit sicherzustellen, daß sich die Aminoessigsäure mit dem Träger verbindet; anschließend wird das Gel durch Vakuumfilterung wieder aufgenommen und in mehreren Arbeitsschritten mit einem bikarbonathaltigen Pufferstoff und anschließend mit entkalktem Wasser gereinigt, um den nicht abgebundenen Teil der Aminoessigsäure zu entfernen. Anschließend wird das Gel letztmals geschleudert, wonach dieses entweder im wasserhaltigen Zustand bei Umgebungstemperatur und bei Anwesenheit eines Bakterienhemmstoffes (Natriumnitrid 0,02%), bei 4°C oder im lyophilisierten Zustand bei Raumtemperatur gelagert werden kann.

Somit wurde eine bestimmte Anzahl von Vorbereitungen getroffen und zwar ausgehend von den neutralen Aminoessigsäuren (1- und d-Tryptophan), Säuren (Säure d,l-aspartisch), Basen (1-argine und 1-lysine) sowie schwefelhaltigen Stoffen (1-cystein).

Die auf der folgenden Seite erscheinende TABELLE II zeigt die erzielten Ergebnisse.

2 0 9 8 4"8⁷/ T1 6 6 tabelle ii

TABELLE

Aminoessigsäure

Gel-Zusammensetzung % acrylamid % Agarose

Aminoessigsäure auf dehydratisiertem Gel befestigt

1-tryptophan

d-tryptophan

1-tryptophan
,S₀ 1-cystein
° 1-arginin

co d,l-aspartisch (Säure)
co I-lysin

8 8 6

"δ

6 3 2 2 4 3 2 2 2

11,9

12,3

4,5

6,5

3,2

8,0

11,6

λ Α 12 441

In dem Beispiel des Cystein ist festzustellen, daß die Menge der freien SH-Gruppierungen im befestigten Cystein von dem Verfahren '5,5'-dithio-bis (2-Nitrobenzoesäure)' abhängt, das von ELLMAN im 'Archiv, biochemigue £2, 70 (1959) beschrieben wird. Diese Menge liegt bei 55%.

BEISPIEL 2 Befestigung serischer Proteine mit Hilfe von Glutaraldehyd

10 Gramm dehydratisiertes Gel werden in Suspension in 250 ml einer wässrigen Lösung mit 10%igem Glutaraldehyd-Anteil bei Umgebungstemperatur eingebracht und während 5 Stunden bewegt. Anschließend werden die Kügelchen mehrfach mit entkalktem Wasser gewaschen, um das nicht abgebundene, überschüssige Glutaraldehyd zu entfernen.

Darüber hinaus wird eine Lösung des im Natriumchlorid bei 0,15 M zu befestigenden serischen Proteins angesetzt, d.h. 1 Gramm Protein auf 100 ml chlorgesättigte Lösung. Anschließend wird das geschleuderte Gel in diese Lösung eingebracht und die Mischung mechanisch während etwa einer Stunde bewegt. Nachdem sich das Protein befestigt hat, wird das Gel in mehreren Arbeitsgängen mit der chlorgesättigten Lösung gewaschen, um das überschüssige Protein zu entfernen, wonach ein Schleudervorgang folgt. Nach einem letzten Waschvorgang mit dem Ziel, das Chlorid zu entfernen, folgt ein Schleudervorgang mit anschließender Lagerung im wasserfreien Zustand nach der Gefriertrocknung.

Dieses Verfahren wurde in zwei bestimmten Fällen angewendet und zwar im ersten Fall mit Gamma-Glubulinen auf Acrylamid-Agarose-Gel (4%-3%) und im zweiten Fall mit Serum-Albumin auf Acrylamid-Agarose-Gel (4%-2%). Im ersten Fall beträgt die Menge des befestigten Proteins 3,8% und im zweiten Fall 3,3%. Ein dritter Befestigungsversuch, und zwar Albumin auf ein Acrylamin-Agarose-Gel (6%-4%) führte zu einem Produkt, das 8% befestigtes Protein enthielt. r

- 9■ - BEISPIEL 3

209848/1166

A 12 441

10

BEISPIEL 3

Befestigung eines vegetalen Proteins mit Hilfe von Glutaraldehyd. Als Beispiel für dieses Befestigungsverfahren wird das von Concanavalin A auf Acrylamid-Agarose-Gel gegeben. Prozentaufteilung: 4% - 2%) .

Ein Gramm gefriergetrocknetes Gel wird in Suspension in 20 ml einer wässrigen Lösung mit 10%igem Glutaraldehyd-Anteil eingebracht und bei Umgebungstemperatur während drei Stunden gerührt.

Nach dem Waschen mit entkalktem Wasser zur Beseitigung des überflüssigen Glutaraldehyds und nach dem Schleudervorgang wird das Gel in eine Lösung aus Concanavalin eingebracht, die durch Auflösung von 50 mg Protein in 4 ml Natriumchlorid M entsteht, das mit 6 ml einer wässrigen Lösung aus Natriumbikarbonat 0,07 M gelöst wird. Nach zweistündigem Rühren bei einer Temperatur von 4 C wird das Gel zuerst geschleudert und anschließend in mehreren Arbeitsgängen bis zur Beseitigung des nicht befestigten Concanavalins gewaschen (Überprüfung durch Spektrophotometrie bei 280 nm) Nach einem letzten Schleudervorgang wird die aus Gel und Concanavalin bestehende Kombination ausgesondert und gelagert; die Lagerung kann entweder in Suspension in 80 ml Natriumchlorid bei 4°C oder, nach Gefriertrocknung, bei normaler Temperatur erfolgen. Die Menge des am dehydratisierten Gel befestigten Concanavalin beträgt 3,5%.

BEISPIEL 4

Befestigung eines Proteins mit hormonaler Aktivität mit Hilfe von Glutaraldehyd

Als Beispiel für dieses Verfahren wird die Befestigung eines Proteinhormons und zwar des Insulins auf Acrylamid-Agarose-Kügelchen (4%-3%) gewählt.

Entsprechend der in Beispiel 3 genannten Technik wird zuerst ein Gramm Gel aktiviert und anschließend 8O mg Insulin in 10 ml Natriumchlorid-Lösung, 0,15 M gelöst; anschließend wird in die Insulin-Lösung das aktivierte Gel eingebracht, geschleudert und während 3 Stunden bei einer Temperatur von 5°C bewegt. Die aus

- 10 - Gel

209848/1166

A 12 441

Gel und Insulin gebildete Kombination wird geschleudert, mehrere Male mit der mit Chlor gesättigten Lösung bis zur Beseitigung des überschüssigen Insulins gewaschen und anschließend nach einem letzten Schleudervorgang aufgenommen und bei einer Temperatur von 4⁰C gelagert.

Die Menge des an den dehydratisierten Kügelchen befestigten Insulins liegt bei 2,2%.

BEISPIEL 5

Befestigung von Proteinen mit enzymatischer Aktivität mit Hilfe von Glyoxal

10 g Acrylamid-Agarose-Gel (4%-2%), gefriergetrocknet, werden in Suspension in 350 ml einer 40%igen Glyoxal-Lösung eingebracht und anschließend während 5 bis 6 Stunden mechanisch bei Umgebungstemperatur bewegt. Das Gel reichert sich langsam wieder mit Wasser an und reagiert gleichzeitig mit dem Glyoxal. Nach Abschluß dieses Vorgangs wird die Suspension geschleudert und anschließend bis zur völligen Beseitigung des überschüssigen Glyoxals gewaschen (Überprüfung durch Spektrophotometrie bei 260 nm). Das gewaschene und geschleuderte Gel wird nun in Suspension in 170 ml einer l%igen Enzym-Lösung eingebracht, mit der eine Befestigung im Kalziumchlorid 0,02 M bei einem pH-Wert von 7,8 herzustellen ist; diesem Vorgang folgt eine mechanische Bewegung während zwei Stunden bei 4 C. Der unlösliche Komplex wird jetzt geschleudert, bis zur Beseitigung des überschüssigen Enzyms gewaschen und nach einem letzten Schleudervorgang im wasserhaltigen Zustand bei 4°C bzw. im gefriergetrockneten Zustand gelagert.

Dieses Verfahren wurde innerhalb eines ersten Beispiels mit Trypsin und in einem zweiten Beispiel mit Chymotrypsin durchgeführt: im ersten Fall betrug die befestigte Enzym-Menge 5,5%, im zweiten Fall 5,8%.

BEISPIEL 6

Befestigung eines Proteins mit enzymatischer Aktivität auf einem Acrylamid-Gel mit Hilfe von Glutaraldehyd

- 11 - 4 Gramm

209848/1166

A 12 441

4 Gramm Acrylamid-Gel (12% Wasserentzug) werden in Suspension in eine 10%ige Glutaraldehyd- und Natriumchlorid-Lösung (0,02 M, pH-Wert 7,5) unter Rühren eingebracht. Der Rührvorgang wird anschließend während zwei Stunden bei einer Temperatur von 50°C beibehalten. Im weiteren Verlauf wird das Gel geschleudert und mehrere Male mit einer Kalziumchlorid-Lösung 0,02 M bis zur Beseitigung des nicht abgebundenen Glutaraldehyds gewaschen (negative Reaktion des Filtrats mit Fuchsin bzw. Messung der optischen Dichte bei 280 nm)i

Darüber hinaus werden 1,20 g des zu befestigenden Enzyms in 100 ml einer Kalziumchlorid-Lösung 0,02 M, pH-Wert 7,8, gelöst. Das aktivierte und geschleuderte Gel wird nun in die Enzym-Lösung eingebracht und bei einer Temperatur von 4°C während 60 bis 90 Minuten bewegt. Zuerst wird das Gel geschleudert, mit einer Kalziumchlorid-Lösung 0,2 M gewaschen, um das nicht abgebundene Enzym zu entfernen und schließlich durch Zentrifugalbewegung aufgenommen und gefriergetrocknet. Ein mit Trypsin nach diesem Verfahren durchgeführter Werksversuch lieferte ein wasserfreies Produkt, das auf ein Gramm Gel 0,260 g Enzym enthielt.

BEISPIEL 7

Befestigung eines Proteins mit enzymatischer Aktivität auf einem wasserhaltigen Gel mit Hilfe von Glutaraldehyd

Auf 20 ml wasserhaltiges Gel, in einem Eichgefäß nach Ablagerung gemessen, werden 10 ml einer Glutaraldehyd/Wasser-Lösung (25%) gegeben. Anschließend wird das Gemisch im kalten Zustand während

5 Stunden bewegt und danach das aktivierte Gel geschleudert; nunmehr folgt in mehreren Arbeitsgängen eine Waschung mit entkalktem Wasser, um das überschüssige Glutaraldehyd zu entfernen. Darüber hinaus wird eine Lösung aus Trypsin (1%) und Kalziumchlorid 0,02 M, pH-Wert 7,8, vorbereitet und 10 ml dieser Lösung bei 4°C mit dem vorher gewaschenen und geschleuderten Gel vermischt. Die Suspension wird nunmehr während 60 Minuten bei einer Temperatur von 4 C bewegt und die Kombination einem Schleuder- bzw. Zentrifugalvor-

- 12 - gang

/Ü98A8/1166

A 12 441

gang unterzogen. Nach mehreren Waschgängen mit jeweils 30 ml Kalziumchlorid 0,02 M wird das Gel erneut geschleudert und anschließend entweder im wasserhaltigen oder im gefriergetrockneten Zustand gelagert.

Gemäß diesem Verfahren wurden zwei Versuche mit Trypsin durchgeführt, wobei in einem Falle als Träger Agarose-Kügelchen (4%) und im anderen Falle ein Acrylamid-Agarose-Gel (4%-2%) verwendet wurden. Die Anteile der befestigten Enzyme lagen jeweils bei 7% im ersten Fall und bei 4,9% im zweiten Fall, d.h. bezogen auf das dehydratisierte Produkt.

BEISPIEL 8

Befestigung verschiedener Enzyme bzw. Ko-Enzyme auf Acrylamid-Agarose-Gel mit Hilfe von Glutaraldehyd

In diesem Beispiel wird das Verfahren beschrieben, das im allgemeinen zur Untersuchung der Befestigung von Enzymen, enzymatischen Auszügen bzw. Ko-Enzymen auf Acrylamid-Agarose-Kügelchen unterschiedlicher Zusammensetzung angewandt wird.Nach diesem Verfahren wird 1 Gramm gefriergetrocknetes Gel abgezogen und in Suspension in 25 ml einer Kalziumchlorid-Lösung 0,02 M, pH-Wert 7-8, eingebracht, die 10% Glutaraldehyd enthält. Das Gemisch wird anschließend während 4-5 Stunden bei einer Temperatur zwischen 10 und 25°C bewegt. Nach dem Schleudervorgang wird das Gel mit der Kalziumchlorid-Lösung bis zur völligen Beseitigung des freien Glutaraldehyds gewaschen. Darüber hinaus werden 100 - 125 mg eines zu befestigenden Enzyms in 10 ml der auf 4°C abgekühlten Kalziumchlorid-Lösung 0,02 M, pH-Wert 7-8, aufgelöst. Nunmehr wird das geschleuderte Gel in die enzymatische Lösung überführt und das Gemisch während 60 - 90 Minuten bei einer Temperatur von 4 C bewegt. Nach Abschluß der Befestigung des Enzyms auf dem Gel wird letzteres durch Schleudern ausgesondert und mit der Kalziumchlorid-Lösung zur bestmöglichen Beseitigung des überschüssigen Enzyms gewaschen; anschließend, nach einem letzten Schleudervorgang, wird das Gel ausgesondert und gefriergetrocknet. In der vorher erschei-

- 13 - nenden

209848/1 166

ft A 12 441

nenden TABELLE I wurden die Ergebnisse eingesetzt, die auf eine bestimmte Anzahl von Versuchen zurückzuführen sind, die an einer Reihe von Enzymen und Ko-Enzymen vorgenommen wurden.

BEISPIEL 9

Befestigung eines synthetischen Substrats auf einem Acrylamid-Agarose-Gel

Als Beispiel für dieses besondere Verfahren der Befestigung einer synthetischen stickstoffhaltigen Substanz wird eine Technik beschrieben, die zur chemischen Verbindung des Äthylesters des Benzoyl-Arginin mit Acrylamid-Agarose-Gel (4-3%) verwendet wird.

10 g eines dehydratisierten Gels werden in Suspension in 25 ml einer wässrigen, 10%igen Glutaraldehyd-Lösung eingebracht und das Gemisch während 4 Stunden bei Raumtemperatur bewegt.

Darüber hinaus wird 1,5 g des Substrats in 100 ml entkalktem Wasser gelöst. Dieser Lösung wird das aktivierte, gewaschene und geschleuderte Gel beigegeben und anschließend wird das Gemisch während 60 Minuten bei einer Temperatur von 5 C bewegt. Die entstehende Kombination wird nun geschleudert, in mehreren Arbeitsgängen gewaschen und nach einem abschließenden Schleudervorgang gefriergetrocknet.

Die Menge des befestigten Substrats liegt bei 1,2%.

- 14 - Patentansprüche

209848/ 116 6

Claims

Patentansprüche :

Verfahren zur Befestigung einer stickstoffhaltigen Substanz auf einem unlöslichen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Träger und Substanz eine Brücke mit Hilfe eines zweifunktionalen organischen Gemisches gebildet wird.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Träger in Form von Kügelchen auftritt.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der unlösliche Träger durch ein Polysaccharid-Gel wie z.B. das Agar oder die Agarose, das Acrylamid'oder durch eine Verbindung beider bei unterschiedlicher Konzentration gebildet wird.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der befestigten stickstoffhaltigen Substanz um ein natürliches Gemisch wie z.B. eine Aminoessigsäure, ein Polypeptid oder um ein anderes Gemisch handelt, das innerhalb seines Molekularaufbaus einen Protein-Anteil oder eine Amin- bzw. eine Amide-Funktion wie z.B. die Enzyme, die Hemmstoffe von Enzymen, die Antikörper, die Antigene, die polypeptiden oder Proteinhormone oder ein Protein wie die Concanavaline aufweist.

Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zweifunktionalen organischen Gemisch, das eine Brücke zwischen dem Träger und der stickstoffhaltigen Substanz bildet, um ein dialdehydisches Gemisch der allgemeinen Form OHC- (R)-CHO handelt.

Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß (R) eine Kette der Form (^CH ₂)_n darstellt, in der η zwischen 0 und 6 liegt.

- 15 2 09848/1166

A 12 441

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem dialdehydischen Gemisch um Glutaraldehyd bzw. um Glyoxal handelt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch g e k e η η zeichnet, daß in einer ersten Phase die Gel-Kügelchen mit einem Überschuß des in wässriger Lösung vorliegenden dialdehydischen Gemischs in Berührung kommen und daß in einer zweiten Phase die stickstoffhaltige Substanz mit den freibleibenden aldehydischen Gruppierungen kombiniert wird.

9. Verfahren zur Steigerung der Aktivität und der Stabilität der Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß diese Enzyme gemäß dem in den Ansprüchen 1 bis 8 geschilderten Verfahren auf einem Agarose-Acrylamid-Gel befestigt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym aus der Gruppe der Trypsine, Chymotrypsine, der pankreatischen Proteasen, der Proteasen des Papayer-Rohsaftes, der Alpha-Amylasen, der Urease, der Arginase, des Lysozyms und des Cytochroms gewählt wird.

11. Neue unlösliche Substanzen, die aus der Befestigung der stickstoffhaltigen Substanzen durch dialdehydisehe Brücken auf Kügelchen unlöslicher Gele entstehen, die wiederum auf den Einsatz des in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Verfahrens zurückzuführen sind.

- 16 -

209848/1166