DE2410693A1

DE2410693A1 - Verfahren zum immobilisieren von enzymen

Info

Publication number: DE2410693A1
Application number: DE2410693A
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Takasaki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1973-03-07
Filing date: 1974-03-06
Publication date: 1974-09-12
Also published as: JPS49110884A; US3950222A; JPS5118518B2

Description

PATENTANWÄLTE

MANITZ, FINSTERWALD & GRÄMKOW

München, den 6„ März 1974-Lo/Sv - A 3004

Agency of Industrial Science & technology 3-1 Kasumigaseki 1-chome, Ohiyoda-ku Tokyo/JAPAIT

Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Immobilisieren bzw. Unbeweglichmachen von Enzymen und insbesondere ein Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen, welches die Stufen der Behandlung von Mikroorganismuszellen oder von Mikroorganismuszellen, welche verschiedene Behandlungsformen erfahren haben, mit einem funktionelle Gruppen besitzenden Reagens und das Eeagierenlassen eines Enzyms mit den entstandenen Mikroorganismuszellen, welche diese funktioneilen Gruppen in einem freien Zustand behalten.

Die Immobilisierung (das Unlöslichmachen) von Enzymen hat große Aufmerksamkeit als Mittel auf sich gezogen, um Enzymreaktionen möglich zu machen, welche üblicherweise immer in einem ansatzweisen Arbeitsvorgang oder in einem kontinuierlichen Arbeitsvorgang durchgeführt wurden, um in einem kontinuierlichen Arbeitsvorgang abgeschlossen zu werden,. Auf diesem Gebiet xferden derzeit

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DR. G. MANITZ · DIPL.-ING. M. FINSTERWALD DIP L.-ING. W. GRAMKOW ZENTRALKASSE BAYER. VOLKSBANKEN MÖNCHEN 22, ROBERT-KOCH-STRASSE 1 7 STUTTGART SO (BAD CANNSTATT) MÖNCHEN. KONTO-NUMMER 7270 TEL. <0S9> 22 42 11. TELEX 05-29672 PATMF SEELBERGSTR.23/25.TEL.(0711)56 72 61 POSTSCHECK: MÖNCHEN 77062-805

zahlreiche Untersuchungen unternommen.

So sind z.B. eine Methode, bei welcher ein Enzym in Wasser unlöslich gemacht wird, indem, das Enzym in Anwesenheit eines bifuriktionellen Reagens, das als Mittel zur Brückenbildung zwischen den Enzymmolekülen dient, polymerisiert wird (A. Sehejter, A. Bar-Eli, Arch. Bioehem. Biophys. Vol. 136 (1970) S. 325 usw.) und eine Methode, bei welcher ein Enzym an einen wasserunlöslichen, eine aktive Gruppe besitzenden Träger, z.B. Polyacrolein oder Polyurethan, unter Bildung eines unlöslich gemachten Enzyms gebunden wird (veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 8988/1973, veröffentlichte japanische Patentanmeldung 957/1973, usw.) bereits beschrieben worden.

Die Methoden, welche bislang beschrieben wurden, besitzen verschiedene Nachteile. So bringen sie beispielsweise hohe Kosten zur Herstellung des unlöslich gemachten Enzyms mit sich, können kein unlöslich gemachtes Enzym mit ausreichend hoher Enzymaktivität liefern, besitzen den Nachteil, daß die Enzyme aus ihrer Stellung im Verlauf der Verwendung als Folge einer unzureichenden Immobilisierung austreten, und erfordern die Entwicklung unterschiedlicher Arbeitsweisen, um die Immobilisierung besonderer Enzymarten zu verfolgen. Daher haben sich diese Methoden nur bei sehr wenig kommerziellen Anwendungen als brauchbar erwiesen.

Von den Erfindern wurde bereits früher eine Methode vorgeschlagen, nach welcher Glucoseisomerase enthaltende Zellen einer Hitzebehandlung bei 55 his 90 0 unterzogen werden, damit die Glucoseisomerase innerhalb der Zellen immobilisiert wird. Da diese Methode in wirtschaftlicher Weise ein immobilisiertes Enzym erzeugen kann, wurde sie bereits zur kommerziellen Herstellung von Fructose aus Glucose angewandt. Da jedoch noch keine wirtschaftliche Methode bislang zur Immobilisierung von Glucoamylase gefunden wurde, war es bislang

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unmöglich, Glucose kontinuierlich aus Stärke (wobei dieser Ausdruck in der Beschreibung auch verflüssigte Stärke (Sirup), Dextrin und dergl. umfaßt) herzustellen, oder Fructose direkt aus Stärke durch Kombination mit Glucoseisomerase herzustellen.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur einfachen Immobilisierung von Enzymen auf Mikroorganismuszellen wie Schimmelpilzen und Aktinomyceten oder auf Behandlungsprodukten hiervon.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgbe werden beim erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismuszellen oder Behandlungsprodukte hiervon mit einem Reagens behandelt, welches zwei oder mehr funktionelle Gruppen besitzt. Als Folge hiervon werden Mikroorganismuszellen gebildet, welche eine dieser funktionellen Gruppen des Reagens chemisch hieran gebunden und weiterhin eine freie funktionelle Gruppe behalten. Wenn ein Enzym mit den erhaltenen Mikroorganismuszellen, welche die freie funktionelle Gruppe beibehalten haben, in Kontakt gebracht wird, wird es auf den Zellen als Folge der Kombination der zurückbehaltenen, freien funktionellen Gruppe mit dem Enzym immobilisiert. Auf diese Weise wird das Enzym auf den Mikroorganismuszellen mittels eines "Vernetzungsmittels" immobilisiert. Falls Glucoamylase nach dieser Methode auf Zellen, welche Glucoseisomerase enthalten, immobilisiert wird, kann daher Fructose direkt aus Stärke unter Verwendung der so hergestellten Zellen erzeugt werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden, mehr ins Einzelne gehenden Beschreibung näher erläutert.

Es wurde angenommen, daß Glucoamylase, falls sie wirtschaftlich immobilisiert werden könnte, in vorteilhafter Weise zur Herstellung von Glucose aus Stärke, oder bei Zugabe von Glucoseisomerase zum kooperativen Wirken hiermit, von Fructose direkt aus Stärke verwendet werden könnte. Daher wurden umfangreiche Untersuchungen zur Auffindung eines Verfahrens durchgeführt, das zur wirt-

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schaftlichen Immobilisierung von Glucoamylase in der Lage wäre. Hierbei wurde gefunden, daß beim Binden von Glucoamylase an Zellen eines Schimmelpilzes oder eines Aktinomyceten mit Hilfe eines Reagens, welches wenigstens zwei funktioneile Gruppen besitzt, ein hochaktives, immobilisiertes Enzym in hohen Ausbeuten hergestellt werden kann.

Das Enzym, welches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisiert v/erden kann, ist nicht auf Glucoamylase beschränkt. Verschiedene andere Enzyme wie 0&-Amylase, ß-Amylase, Isoamylase, Pullulanase, Invertase, Galactosidase, Cellulase, Protease, Lipase, Glucpseoxidase und Katalase können ebenfalls immobilisiert werden.

Es kann nicht nur ein einziges Enzym immobilisiert werden, sondern es können auch zwei oder mehr Enzyme gleichzeitig immobilisiert werden. Solche Kombinationen sind z.B. Glucoamylase und Glucoseisomerase, ß-Amylase und Isoamylase (oder Pullulanase) sowie oC-Amylase und Glucoamylase.

Für diese Immobilisierung müssen solche Enzyme nicht in gereinigter Form vorliegen, sondern sie können auch in einer rohen Form, welche Fremdproteine enthält, vorliegen.

Schimmelpilz und Aktinomyceten sind besonders geeignete Mikroorganismen zum Zweck der Immobilisierung von Enzymen. Dies «jjr.>-ührt daher, daß solche Mikroorganismen im allgemeinen relativ große Teilchen bilden, und daher die eirikche und wirtschaftliche Durchführung der Herstellung, der Gewinnung und der anderen Stufen der Handhabung von immobilisierten Enzymen ermöglichen. Ein anderer Grund ist, daß diese Träger sehr billig erhalten werden können, daß sie einen geeigneten Wert des spezifischen Gewichtes besitzen, daß sie in Reaktionsflüssigkeiten ausreichend dispergierbar sind, und daß sie große Oberflächen besitzen und daher es ermöglichen, relativ große Enzymmengen hierauf zu binden.

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Beispiele von Schimmelpilzen, welche vorteilhaft sind, umfassen solche der Art Rhizopus, Aspergillus und Penicillium. Beispiele von Aktinomyceten, welche ebenfalls brauchbar sind, umfassen solche der Art Streptomyces und Actinomyces.

Die Zellen dieser Mikroorganismen können solche Zellen sein, welche als Abfallprodukte bei bestimmten Fermentationsarten auftreten. Bei der Immobilisierung von Glucoseamylase kann z.B. das immobilisierte Enzym, falls dieses Enzym auf Glucoseisomerase enthaltenden Mikroorganismuszellen immobilisiert wird, zur direkten Herstellung von Fructose aus Stärke verwendet werden.

Die zur Immobilisierung eines Enzyms zu verwendenden Zellen werden entweder einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 50°0 oder darüber, im allgemeinen im Bereich von 50° bis 10O⁰O für eine Zeitspanne von mehreren Minuten bis zu mehreren Stunden unterworfen, oder sie werden mit einer verdünnten Säure oder einem verdünnten Alkali behandelt, so daß die autolytische Aktivität der Zellen zerstört wird oder sie von einem leicht abtrennbaren Zellbestandteil befreit werden. Falls es die Umstände jedoch erfordern, können auch Mikroorganismusζeilen in einer Form verwendet werden, welche ihre physiologische Aktivität noch beibehalten, und die Zellwände von Mikroorganismen können ebenfalls eingesetzt werden.

Beispiele von Reagenzien, welche wenigstens zwei funktiaelle Gruppen besitzen und bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anwendbar sind, umfassen Tolylendiisocyanat, Tolylen-2,4~diisocyanat, Xyloldiisocyanat, m-Xyloldiisocyanat, Epichlorhydrin, Glutaraldehyd, Phenoldisulfonylchlorid, Bis-diazobenzidin, Toluol-2-isocyanat-4— isothiocyanat, Nitrophenylchloracetat, 2-Amino-4,6-dichlor-S-triazin und 2,4,6-Trichlor-S-triazin, welche im allgemeinen für das Unlöslichmachen von Enzymen nach einem Vernetzungsprozeß verwendet werden. Besonders brauchbare Reagenzien sind Isocyanatverbindungen wie Tolylen-2,4-diisocyanat,

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Das Verfahren zur Immobilisierung eines Enzyms gemäß der Erfindung wird im folgenden mit Bezug auf einen Fall näher erläutert, bei welchem Glucoamylase auf Zellen einer Spezies der Art von. Streptomyces immobilisiert wird.

Streptomyces albus (ATGG 21132) wird aerob bei 50°G für 30 Stunden in einem Medium kultiviert, welches 1 # Pet>ton, 1 % Glucose, 0,p # dibasisches Kaliumphosphat und 0,1 % Magnesiumsulfat enthält. Die Zellen werden gesammelt, in Wasser suspendiert und einer Hitzebehandlung bei 55° bis 100⁰G unterworfen. Die Zellen werden gesammelt, gewaschen, in Wasser suspendiert (im allgemeinen 0,5 bis 5 % auf Trockenbasis) und mit einer zugesetzten Was s er emulsion (etwa 20 °/o) von Tolylendiisocyanat vereinigt und gerührt.

Das Inkontaktbringen kann durch Zugabe des Reagens zu den Zellen und Rühren mit den Zellen oder durch Untertauchen der Zellen in dem Reagens durchgeführt werden. Im allgemeinen reicht die Dauer dieses Kontaktes von mehreren Minuten bis zu mehreren Stunden bei normaler Zimmertemperatur. Bei erhöhten Temperaturen kann die Zeitspanne dieser Behandlung abgekürzt werden. Nach dem Abschluß des Kontaktes werden die Zellen mit Wasser oder einer Pufferlösung gewaschen und anschließend in Kontakt mit einem Enzym gebracht.

Die Tabelle I zeigt den Einfluß der Konzentration von zugesetztem Tolylendiisocyanat auf eine definierte Menge von Zellen. Die Tabelle II zeigt den Einfluß der Behandlungszeit von Zellen mit ■lolylendiisocyanat. Nach dem Kontakt werden die Zellen gesammelt und dann gründlich mit Wasser gewaschen. Auf diese Weise werden Zellen der Streptomyces Spezies erhalten, welche eine hierauf zurückgehaltene, freie Diisocyanatgruppe aufweisen. Anschließend wird eine Lösung von Glucoamylase zu den erhaltenen, die freie Isocyanatgruppe zurückhaltenden Zellen hinzugegeben und mehrere Minuten bis mehrere Stunden zur Sicherstellung eines innigen Kontaktes gerührt bzw. in Bewegung gehalten. Die Tabelle III zeigt den Einfluß der Inkubationszeit von freien Isocyanatgruppen aufweisenden Zellen mit Glucoamylase.

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Tabelle I

Einfluß der	Konzentration von Tolylendiisocyanat	(Einheiten)
Menge an Tolylen-	Menge der Zellen Fixierte Glucoamylase	5,6
diisocyanat (mg)	(mg)	8,2
0	20	44,2
10	20	162,2
20	20	198,4
40	20	181,4
60	20
80	20

1 ml der Zellensuspension (20 mg) wurde zu 0 bis 0,4 ml 20 #igem, mit Wasser emulgiertem Tolylendiisocyanat hinzugegeben und bei JO⁰O unter Schütteln inkubiert. Nach 20 min wurden die Zellen abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die so erhaltenen Zellen, welche freie Isocyanatgruppen aufwiesen, wurden zu 1 ml Glucoamylaselösung (6845 Einheiten) aus Aspergillus niger hinzugegeben und 120 min bei 30°0 inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und mit destilliertem Wasser gewaschen.

Tabelle II

Einfluß der Zeit der Behandlung der Zellen mit Tolylen-

diisocyanat

Zeit der Behandlung (min) Fixierte Glucoamylase (Einheiten)

5 89,4

10 154,8

20 174,0

30 152,4

60 153,9

1 ml der Zellensuspension (20 mg) wurde zu 0,3 ml 20 #igem, mit Wasser emulgiertem Tolylendiisocyanat hinzugegeben und unter Schütteln bei 30°0 inkubiert. Nach den angegebenen Zeitinter-

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vallen wurden die Zellen filtriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die so erhaltenen Zellen, welche freie IsocyanatgjruO-aufwiesen, wurden zu 1 ml GlucoamylaselÖsung (684-5 Einheiten)

aus Asoer^illus niger hinzugegeben und 120 nin bei 30° G inkubiert« Dann wurden die Zellen filtriert und mit destilliertem Wasser gewaschen.

Tabelle III

Einfluß der Zeit der Inkubation dex' Zellen", welche freie Isocyanatgruppen aufweisen, mit Glucoamylase

Zeit (min)	Fixierte Glucoamylase
	(Einheiten)
0	3,5
10	42,3
30	87,5
120	134,2

1 ml der Zellensuspension (20 mg) wurde zu 0,3 ml 20 tigern, mit Wasser emulgiertem Tolylendiisoeyanat hinzugegeben und bei 30 unter Schütteln inkubiert. Hach 20 min wurden die Zellen abfiltriert, und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die so erhaltenen Zellen, welche freie Isocyanatgruppen aufwiesen, wurden zu 1 ml Glucoamylaselösung (6845 Einheiten) hinzugegeben und bei 30 G für die angegebenen Zeitintervalle inkubiert. Dann wurden die Zellen abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen.

Der Kontakt kann kontinuierlich durchgeführt werden, indem die Zellen als stationäre Phase gehalten werden. Danach wird überschüssiges Enzym mittels Filtration oder Zentrifugieren gewonnen. Die Zellen werden gründlich mit Wasser gewaschen. Als Folge hiervon werden Zellen erhalten, auf welchen Glucoamylase immobilisiert ist.

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Obwohl die vorausgegangenen Erläuterungen eine Methode beschrieben, bei welcher die Immobilisierung durch Behandlung der Zellen mit einem Reagens und anschließendes Inkontaktbringen des Enzyms mit den Zellen durchgeführt wird, kann die Immobilisierung des Enzyms auf den Zellen alternativ auch durch Eintauchen der Zellen in eine das Enzym enthaltende Lösimg und die anschließende Behandlung mit einem hierzu hinzugefügten Reagens durchgeführt werden.

Wie sich aus der zuvor gegebenen "Beschreibung ergibt, betrifft die Erfindung die Immobilisierung eines Enzyms auf Mikroorganismenzellen, indem zuerst die Mikroorganismenzellen mit einem Vernetzungsmittel in Zellen umgewandelt xverden, die eine freie funktionelle Gruppe besitzen, und dann das Enzym zur Bindung auf den Zellen gebracht xtfird. Nach diesem Verfahren können daher verschiedene Enzyme in einfacher Weise und leicht immobilisiert werden.

Wenn ein Enzym gemäß der Erfindung auf Mikroorganismenzellen immobilisiert wird, welche bereits ein anderes Enzym enthalten, ermöglicht die Verwendung der sich ergebenden Mikroorganismenzellen weiterhin die Durchführung einer Enzymreaktion, welche bis dahin zwei Verfahrensstufen erforderte, in einer Stufe.

Mikroorganismenzellen sind im Vergleich zu Ionenaustauscherharzen, Cellulose und anderen Trägern, welche jetzt angewandt werden, billig erhältlich. Daher können Mikroorganismenzellen, welche eine freie funktionelle, hierauf zurückgehaltene Gruppe aufweisen, in vortteilhafter Weise nicht nur für das Binden, die Gewinnung und die Entfernung von Enzymen, sondern in gleicher Weise auch von organischen Verbindungen wie Proteinen, Aminosäuren und organischen Säuren, anorganischen Verbindungen, Metallen, usw. verwendet werden.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.

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Beispiel 1

Streptorayces albus (ATGG 21132) wurde in ein flüssiges Medium (pH = 7,2), das 0,5 % Xylan, 4 % Haisquellwasser und 0,024 # GoGl₂.6H₂O enthielt, eingeimpft und aerob 24- Stunden bei 30⁰G kultiviert. Am Ende der Kultivierung wurden die Mikroorganismenzellen gesammelt, mit V/asser gewaschen und danach in Wasser suspendiert und einer Hitzebehandlung bei 6y°ö für 15 niin unterworfen.

Anteile von 2 ml der erhaltenen Zellensusoension wurden zu Tolylendiisocyanat, Xyloldiisocyanat, Epichlorhydrin bzw. G-lutaraldehyd, jeweils in einem Volumen von 0,2 ml, hinzugegeben. Diese Mischungen wurden 1 Stunde bei 30 G gerührt. Als Folge hiervon wurden Zellen von Streptomyces albus erhalten, welche auf sich Tolylendiisocyanat, Xyloldiisocyanat, Epichlorhydrin bzw. Glutaraldehyd gebunden aufwiesen. Es wurde gefunden, daß die so hergestellten Zellen freie funktioneile Gruppen besaßen, welche zum Binden verschiedener Enzymproteine in hohen Ausbeuten in der Lage waren. Zu diesen Zellen von Streptomyces, welche die genannten, freien funktioneilen Gruppen hierauf aufwiesen, wurde 1 ml (9200 Einheiten/ml) Glucoamylase, erzeugt von einer Rhizopus-Art, hinzugegeben und 30 min bei 30°G inkubiert. Danach wurden die Zellen von überschüssigem Enzym befreit, gründlich mit Wasser gewaschen und analysiert, um die hierauf gebundene Glucoamylasemenge zu bestimmen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle	IV

Funktionelles Reagens	Immobilisierte Glucoamylase (Einheiten)
Tolylendiisocyanat Xyloldiisocyanat Epichlorhydrin Glutaraldehyd	287,1 188,8 165,5 20,4

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Die Untersuchung der Glucoamylase wurde in einem Wasserbad bei 5°°ö an einem Gemisch von 2 % löslicher Stärke, 0,05 M Acetatpuffer und einer angemessenen Enzymmenge durchgeführt. Für die Untersuchung der immobilisierten Glucoamylase wurde die Reaktion als Schüttelreaktion durchgeführt.

Eine Einheit wurde als die Enzymmenge definiert, welche 1 mg Glucos e/Stunde era eugt e.

Beispiel 2

Ein 2 ml Anteil "der Zellensuspension desselben Str.eptomyces-Stammes, wie er in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde rait I ml 20 tigern, mit Wasser emulgiertem Tolylendiisocyanat zusammengegeben und unter Rühren 30 min bei 30°G inkubiert.

Als Folge hiervon wurden Streptomyces-Sellen erhalten, welche hierauf eine freie Isocyanatgruppe zurückbehalten hatten-

Me' Zellen wurden danach gründlich mit Wasser gewaschen und anschließend mit 1 ml einer im Handel erhältlichen,,aus Candida utilis erzeugten Invertase für 3° min bei 30⁰C in Kontakt gehalten. Als Ergebnis waren 30 Einheiten der Invertase auf den Zellen immobilisiert worden.

Eine Einheit Invertase wurde als die Enzymmenge definiert, welche ein Reduktionsvermögen erzeugte, das 1 mg Glucose/Stunde bei 30 C in einem Reaktionsgemisch entsprach, welches .0,i M Saccharose, 0,05 M Acetatpuffer (pH = 4,5) und das Enzym enthielt.

Beispiel 3

Ein 2 ml Anteil der Zellensuspension derselben Streptomyces-Art, wie sie in Beispiel 1 verwendeb wurde, wurde mit 1 ml 20 #igem, mit Wasser emulgiertem Tolylendiisocyanat vereinigt ^rund 1 Stunde bei 30⁰C inkubiert. Als Felge hiervon wurden Streptomyces-Zellen erhalten, welche hierauf eine freie Isocyanatgruppe

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zurückbehalten hatten. Im Anschluß daran wurden die Zellen ait 1 ml einer in Fandel erhältlihen I-Ialz-3-araylase (508 Einheiten/ml) jO min bei yO°G in Kontakt gehalten. Die Zellen wurden filtriert, zur Entfernung; von überschüssigem Enzym ■■ewaschen und zur Bestimmung der hierauf immobilisierten Men- ^e an ß-Amylase analysiert. Die Analyse zeigte, daß 30,5 Einheiten ß-Amylase inmobilisiert worden waren.

Eine Einheit 3-Amylase wurde als die Enzymmen^e definiert, welche 1 ra~ Maltose/Stunde bei 57° C in einem Reaktionsgemisch erzeugt, das 2 ;Ί losliche Stärke, 0,0S H Acetatpuffer (ori = 5₅5) und das Enzym enthalt.

Beispiel 4-

Asoergillus nir;er wurde aerob in einem Medium kultiviert, welches ? ,6 Saccharose, 1,5 3 Pepton, 0,5 ;i KpTIPO^ und 0,25 % \-irß0_L .7HpO enthielt. Die erhaltenen Mikroor^anismenzellen wurden einer liitzebehandlung bei GO⁰G für 10 min unterworfen. Anschließend wurden sie gründlich mit Wasser ^ewaschen und in y/asser suspendiert. Die Zellensus^ension besaß eine Zellenkonzentration von etwa 10 mg/ml.

Eine 2 ml Probe der Zellensuspension wurde mit 1 ml 20 tigern, mit Wasser emulgiertem Jolylendiisocyanat vereinigt und dann 1 Stunde bei $0 C inkubiert. Als Folge hiervon wurden Zellen von Asper^illus niger erhalten, welche hierauf eine freie Isocyanatgrupoe zurückbehalten hatten. Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml Rhizorms-Glucoamylase (9200 Einheiten/ml) vereinigt und ^O min bei 30 G unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden gründlich gewaschen und dann zur Bestimmung der hierauf immobilisierten G-lucoamylasemen^e analysiert. Die Analyse zeigte, daß 210 Einheiten der Glucoamylase immobilisiert vrorden waren.

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Beispiel 5

Rhizopus oryzae wurde aerob in einera Medium kultiviert, welches 5 # Saccharose, 1,5 fi Pep ton, 0,5 ^r:o Κ,-,ΗΡΟ^ und 0,25 % MgSO^.7H_p0 enthielt. Die erhaltenen MilcroOrganismenzellen wurden einer Hitzebehandlung bei 50 0 für 10 Minuten unterworfen. Anschließend wurden sie gründlich mit Wasser gewaschen und in Wasser suspendiert. Die Zellensuspension besaß eine Zellenkonzentration von 10,0 mg/ml.

Eine 2 ml Probe der Zellensuspension wurde mit 1 ml 20 tigern, mit Wasser emulgiertem 'folylendiisocyanat vereinigt und dann 1 Stunde bei 50°G inkubiert. Als Folge hiervon wurden Zellen von Hhizopus oryzae erhalten, welche hierauf eine freie Isocyanatgruppe zurückbehalten hatten. Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml Rhizopus Glucoanylase (9200 Einheiten/ml) vereinigt und JO min bei 50°G unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden gründlich gewaschen und dann zur Bestimmung der hierauf immobilisierten Glucoamylasemenge analysiert. Die Analyse zeigte, daß 120 Einheiten der Glucoamylase immobilisiert worden waren.

- Patentansprüche -

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von i-Iikroorganismenzellen, welche eine freie funktioneile Gruppe aufweisen, dadurch gekennzeichnet , daß Mikroorganismenzellen mit einem Reagens behandelt werden, welches wenigstens zwei funktionalle Gruppen besitzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenzellen, welche hierauf eine
freie funktioneile GruoOe zurückbehalten haben, zur Reaktion mit einem Enzym unter Immobilisierung des Enzyms auf den Zellen gebracht werden.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das funktioneile Gruppen aufweisende Reagens eine Isocyanatverbindung ist.

U-. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Isocyanatverbindung Tolylendiisocyanat ist.

5- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichdas

net, daß/funktionelle Griroen besitzende Reagens Glutaraldehyd ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenzellen Abfallzellen aus einem I'ermentationsprozeß sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenzellen Zellen sind, welche
kultiviert wurden, um ein spezifisches Enzym zu enthalten.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenzellen Zellen von Schimmelpilzen und/oder Aktinomyceten sind.

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9· Verfahren nach Anspruch 3, dadurch 55 e k e η η ζ e i c h η e t, daß die Mikrporganismenzellen eine 8'oezies von ^eiius Streotomyces sind.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismenzellen eine Spezies von o:enus AsOergillus sind.

11* Verfahren nach Anspruch B, dadurch ~ e k e η η ζ eich net, daß die Mikroorganismenzellen eine Spezies von genus Rhizopus sind.

12. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e k e η η ζ e lehnet, daß die Mikroorsanismenzellen eine Spezies von n;enus Penicillin, s ind.

13.· Mikroorganisrnenzellen, welche eine freie funktioneile G-rurroe aufweisen, hergestellt durch Behandlung mit einem Reagens, welches zwei oder mehr funktionelle G-rutren besitzt.

14-. l-Iikroor^anisiaenzellen, welche ein mit einer freien funktioneilen Gruppe immobilisiertes Enzym aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch "Behandlung von Mikroorganismen-Zellen, welche ein immobilisiertes Enzym hierauf enthalten, mit einem Reagens, das zwei oder mehr funktionelle G-ruOpen besitzt, erhalten wurden.

15. Mikroorganismenzellen, welche mit einer freien funktionellen Gruppe immobilisierte Glucoamylase besitzen, dadurch r$ e Ic e η η zeichnet, daß sie durch Behandlung von Mikroorganismenzellen, welche hierin.immobilisierte Glucoamylase besitzen, mit einem zwei oder mehr funktionelle Gruor>en aufweisenden Reagens erhalten worden sind.

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