DE3801053A1

DE3801053A1 - Verfahren zur herstellung von immobilisierten enzymen oder mikroorganismen

Info

Publication number: DE3801053A1
Application number: DE3801053A
Authority: DE
Inventors: Hideo Tanaka; Shinzi Irie
Original assignee: Kibun Food Chemifa KK; Kibun KK
Current assignee: Kibun Foods Inc
Priority date: 1987-01-16
Filing date: 1988-01-15
Publication date: 1988-07-28
Also published as: GB8800797D0; DE3801053C2; GB2199832B; CA1296665C; US4950600A; FR2609723A1; FR2609723B1; JPH0416156B2; JPS63177791A; GB2199832A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen oder Mikroorganismen.

Immobilisierte Enzyme und Mikroorganismen dienen zur kontinuierlichen Durchführung von enzymatischen bzw. mikrobiologischen Verfahren. Beispiele für die Herstellung immobilisierter Enzyme oder Mikroorganismen sind die Substratbindungsmethode, die vernetzende Polymerisationsmethode und die Methode des Einschlusses in ein Gel. Bei der Methode des Einschlusses in ein Gel werden Enzyme bzw. Mikroorganismen durch den Einschluß in ein Gel oder eine Polymermatrix immobilisiert. Es ist bereits ein derartiges Verfahren unter Verwendung von Natriumalginat bekannt, bei dem Calciumionen als Gelierungsmittel verwendet werden.

Die Methode der Immobilisierung mit Natriumalginat und Calciumionen hat bestimmte Nachteile. Die Festigkeit des Alginatgels nimmt unter dem Einfluß verschiedener Salze in der Reaktionsflüssigkeit oder der Änderung des pH-Wertes stark ab. Ferner geht das Gel in Gegenwart von Gelatbildner, wie Phosphationen, in Lösung.

Es wurden auch bereits Versuche unternommen, große Mengen an Calciumionen als Gelierungsmittel der Reaktionsflüssigkeit einzuverleiben, um die Festigkeit des Gels zu erhöhen. Dies verbessert zwar die Festigkeit des Gels, führt jedoch zu anderen Schwierigkeiten. Es hat nämlich nicht nur unerwünschte Wirkungen bei der Isolierung und Reinigung der Reaktionsprodukte, sondern hemmt auch die Enzymaktivität, z. B. die Aktivität von Glucoseisomerase oder der Mikroorganismen, die derartige Enzyme bilden, wie Streptomyces phaeochromogenes oder Bacillus coagulans.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen oder Mikroorganismen unter Verwendung von Natriumalginat zu entwickeln, bei dem die vorstehend genannten Nachteile nicht auftreten. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die Lösung der Aufgabe beruht auf folgenden Befunden: das M/G Verhältnis der Bestandteil der Alginsäure, d. h. der D-Mannuronsäure (M) zu L-Guluronsäure (G) ist für die Festigkeit des Gels kritisch. Aber nicht nur das M/G-Verhältnis ist von Bedeutung, sondern auch das Verhältnis der Zusammensetzung zwischen (1) einem Teil, der nur aus M-Resten besteht, (2) einem Teil, der nur aus G-Resten besteht und (3) einem Teil, der sowohl aus M- als auch G-Resten besteht. Die Hauptfunktion des G-Blockes ist es, mit den Metallionen eines Geliermittels unter Bildung eines festen Gels eine Bindung einzugehen. Eine stärkere und noch stabilere Bindung erfolgt zwischen dem G-Block und den Metallionen eines Geliermittels, wenn die verwendeten Metallionen nicht Calciumionen sondern Barium- oder Strontiumionen sind.

Das Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen oder immobilisierten Mikroorganismen ist dadurch gekennzeichnet, daß nach Zusatz eines Enzyms oder der Mikroorganismen zu einer wäßrigen Lösung von Natriumalginat mit einem M/G- Verhältnis von 0,01 bis 0,8, das Gemisch mit einer wäßrigen Lösung zur Gelierung in Berührung gebracht wird, die Barium- oder Strontiumionen enthält.

Fig. 1 zeigt den Quellungsgrad von Bariumalginat-Gelperlen und Calciumalginatgel-Perlen in einem Phosphatpuffer bei verschiedenen pH-Werten.

Fig. 2 zeigt den Quellungsgrad von Bariumalginat-Gelperlen und Calciumalginat-Gelperlen in einem Essigsäure-Barbital- Puffer bei verschiedenen pH-Werten.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Natriumalginat kann ein übliches Natriumalginat sein, das durch Extraktion von Alginsäure aus braunen Algen auf chemischem Wege und Umwandlung in das Natriumsalz erhältlich ist. Erfindungsgemäß wird ein Natriumalginat mit einem M/G-Verhältnis von 0,01 bis 0,8 verwendet. Das M/G-Verhältnis ist das Verhältnis der Reste von D-Mannuronsäure (M) zu L-Guluronsäure (G), den Bestandteilen der Alginsäure. Vorzugsweise beträgt das M/G-Verhältnis 0,01 bis 0,2.

Natriumalginat mit derartig niedrigem M/G-Verhältnis ist ein Handelsprodukt, kann jedoch auch nach speziellen Verfahren hergestellt werden, z. B. aus bestimmten Meeresalgen mit einem hohen G-Gehalt, bestimmten Teilen von Meeresalgen, z. B. den Stengeln, mit hohem G-Gehalt, oder aus Meeresalgen, die im Zeitraum von Mai bis August geernetet und extrahiert werden, oder es wird Natriumalginat mit hohem G-Gehalt verschnitten.

Natriumalginat mit einem G-Gehalt im vorgenannten Bereich liefert ein Gel mit größerer Festigkeit, das stabil und beständig gegen den Einfluß von Wärme und/oder Chelatisierungsmitteln, den Einfluß von Elektrolyten oder Änderungen des pH-Wertes ist.

Bei der Untersuchung des Einflusses des M/G-Verhätltnisses wurde festgestellt, daß ein Teil, der im allgemeinen als G bezeichnet wird, in zwei Blöcke unterteilt werden kann, von denen der eine lediglich aus G besteht und der andere sowohl aus M als auch aus G besteht. Von diesen beiden Blöcken spielt der G-Block eine Rolle bei der Bildung eines festen Gels durch Bindung mit Barium- oder Strontiumionen.

Der vorstehend beschriebene Grundgedanke der Verwendung von Natriumalginat mit hohem G-Gehalt, d. h. verhältnismäßig kleinem M/G Verhältnis und der Verwendung von Barium- und Strontiumionen wurde aufgrund dieser Befunde entwickelt.

Die Konzentration an Natriumalginat in der Lösung, die mit einem Enzym oder Mikroorganismen versetzt wird, beträgt vorzugsweise 0,5 bis 8% (Gewicht pro Volumen; W/V), vorzugsweise 3 bis 6% (W/V).

Die Wahl der zu immobilisierenden Enzyme und Mikroorganismen ist nicht kritisch. Beispiele für Enzyme sind Oxide-Reduktasen, wie Alkoholhydrogenase, D-Aminosäure-Oxidase, Catalase, Transferasen, wie Transketolase, Adenylatkinase, Hexokinase, Hydrolasen, wie β-Galactosidase, Penicillinase, Lipase, Esterase, Lyasen, wie Fumarase, Aspartase, Threoninaldolase, β-Tyrosinase, Isomerasen, wie Glucoseisomerase, Alaninisomerase und Ligasen, wei Glutathionsynthetase und Glutaminsynthetase.

Es können alle Arten von Mikroorganismen verwendet werden, wie Bakterien, Hefen, Pilze und Actinomyceten, die eine enzymatische Aktivität entfalten. Ferner können Zellorganzellen, Zellfraktionen und verarbeitete Produkte von Enzymen oder Mikroorganismen mit enzymatischer Aktivität verwendet werden.

Bei der Immobilisierung von Enzymen beträgt die bevorzugte Enzymkonzentration 0,01 bis 20% (Gewicht pro Volumen; W/V). Bei der Immobilisierung von Mikroorganismen beträgt die Konzentration der Mikroorganismen 0,01 bis 50% (Feuchtigkeit pro Volumen). Bei der Immobilisierung lebender Bakterien ist der Konzentrationsbereich der Mikroorganismen während der Immobilisierung noch breiter, weil sich die Anzahl der lebenden Bakterien im Gel durch Züchtung der immobilisierten Mikroorganismen in einem geeigneten Kulturmedium noch erhöhen läßt.

Die wäßrige Lösung, die Barium- oder Strontiumionen enthält und die zur Gelierung verwendet wird, wird durch Auflösen eines Barium- oder Strontiumsalzes in Wasser hergestellt. Spezielle Beispiele für Bariumsalze sind Bariumchlorid, Bariumnitrat und Bariumacetat. Besonders bevorzugt ist Bariumchlorid. Spezielle Beispiele für Strontiumsalze sind Strontiumchlorid, Strontiumnitrat und Strontiumacetat. Strontiumchlorid ist besonders bevorzugt, da besonders kostengünstig.

Die Konzentration der Barium- oder Strontiumionen in der wäßrigen Lösung kann in einem verhältnismäßig breiten Bereich liegen, im allgemeinen 0,01 bis 1,0 M, vorzugsweise 0,02 bis 0,5 M.

Das Verfahren zur Herstellung des Gels hängt ab vom Verwendungszweck des immobilisierten Enzyms oder der immobilisierten Mikroorganismen. Die folgenden Verfahren (1) bis (3) können verwendet werden.

(1) Ein Gemisch aus einer Lösung von Natriumalginat und einem Enzym oder Mikroorganismen (nachstehend einfach als Gemisch bezeichnet) wird tropfenweise durch die Düse einer Spritze oder mit einer Pipette in eine wäßrige Barium- oder Strontiumionenlösung gegeben. Es bildet sich ein immobilisiertes Produkt von Perlen.
(2) Das Gemisch wird aus der Düse z. B. einer Spritze oder Pipette kontinuierlich in eine wäßrige Barium- oder Strontiumionen enthaltende Lösung gepreßt. Es bildet sich ein immobilisiertes Produkt in Form eines Fadens.
(3) Das Gemisch wird mit einer wäßrigen Barium- oder Strontiumionen enthaltenden Lösung kontaktiert, nachdem man das Gemisch auf eine flache Platte gegossen oder Filterpapier oder Gaze damit imprägniert hat. Es bildet sich ein immobilisiertes Produkt in Form einer Membrane.

Bei allen diesen Verfahren wird die Dauer des Kontaktes mit den Barium- oder Strontiumionen, der pH-Wert, die Temperatur usw. so eingestellt, daß die Aktivität des Enzyms oder der Mikroorganismen nicht beeinträchtigt wird. Im allgemeinen beträgt die Kontaktzeit des Gemisches mit der wäßrigen Barium- oder Strontiumionenlösung 0,5 bis 24 Stunden, der pH-Wert 3 bis 11 und die Temperatur 4 bis 50°C.

Nachstehend wird die Stabilität des erfindungsgemäß hergestellten Gels anhand des Quellungsgrades des Gels bzw. der Gelperlen untersucht.

1. Stabilität des Gels in einer Phosphatlösung (Quellungsgrad)

In 10 ml einer wäßrigen 0,1 M KH₂PO₄-Lösung wurden 6 Gelperlen mit einem Durchmesser von 3 mm gegeben. Die Gelperlen wurden durch tropfenweise Zugabe einer 1,5%igen wäßrigen Lösung von Natriumalginat in eine wäßrige 0,3 M Bariumchloridlösung hergestellt. Die Lösung wurde 24 Stunden bei 30°C stehengelassen. Danach wird der Quellungsgrad der Gelperlen (Gewicht der Gelperlen/Anfangsgewicht der Gelperlen) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

2. Stabilität des Gels in alkalischer Lösung (Quellungsgrad)

In 10-ml-Proben von Phosphatpufferlösung und Essigsäure- Barbital-Pufferlösung wurden jeweils 6 Gelperlen von Bariumalginat mit einem Durchmesser von 3 mm gegeben, die in ähnlicher Weise wie vorstehend beschrieben hergestellt worden sind. Die Lösung wurde 24 Stunden bei 30°C stehengelassen. Danach wurde der Quelllungsgrad der Gelperlen (Gewicht der Gelperlen/Anfangsgewicht der Gelperlen) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 und Fig. 2 zusammen mit den Ergebnissen für Calciumalginat wiedergegeben.

Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß in einer Phosphatpufferlösung Calciumalginat-Gelperlen mit einem M/G-Verhältnis von 1,2 und 0,3 bei einem pH-Wert von oberhalb 3 in Lösung gehen. Erfindungsgemäß hergestellte Bariumalginat-Gelperlen mit einem M/G-Verhältnis von 0,3 zeigen einen Quellungsgrad von lediglich etwa 1,5. Bariumalginat-Perlen mit einem M/G- Verhältnis von 1,2, d. h. außerhalb des erfindungsgemäßen M/G-Bereichs, zeigen einen Quellungsgrad von 5. Andererseits zeigen in Essigsäure-Barbital-Puffer erfindungsgemäß hergestellte Bariumalginat-Gelperlen mit einem M/G-Verhältnis von 0,3 einen Quellungsgrad von weniger als 1,5, selbst bei einem pH-Wert von 4 und darüber, während Bariumalginat-Gelperlen mit einem M/G-Verhältnis von 1,2 und Calciumalginat-Gelperlen mit einem M/G-Verhältnis von 0,3 und 1,2 einen doppelt so großen Quellungsgrad zeigten.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die Stärke der Gelperlen in den Beispielen und Kontrollversuchen wurde ausgedrückt durch die Belastung pro Querschnittseinheit, bezogen auf den Durchmesser der Perlen. Die Festigkeit wurde nach folgender Gleichung berechnet:

Beispiel 1 Kontrollversuch 1

1,0 g Natriumalginat mit einem M/G-Verhältnis von 0,3 wurden in 25 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit 6 g Glucoseisomerase-enthaltenden gefrorenen Bakterien der Art Streptomyces phaeochromogenes (Aktivität 550 Einheiten/g gefrorene Bakterien) versetzt. Das Gemisch wurde tropfenweise durch eine Düse mit einem Innendurchmesser von 1 mm in eine 0,3 M wäßrige Bariumchloridlösung gegeben. Es wurden Gelperlen erhalten. Danach wurde das Gemisch 2 Stunden bei 25°C zur Vervollständigung der Gelierung gerührt. Anschließend wurden die Gelperlen filtriert und mit Wasser mehrmals gewaschen. Es wurden 30 ml immobilisierter Actinomyceten erhalten.

Die Aktivität der Glucoseisomerase der immobilisierten Actinomyceten wurde anhand der Fructosemenge bestimmt, die bei 70°C in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 mit Glucose in Form einer 0,1 M Lösung als Substrat erhalten wurde. Die Ergebnisse zeigten Aktivität von 62,7 Einheiten pro ml immobilisierter Actinomyceten. Die Aktivitätsausbeute betrug 57,0%.

Zum Vergleich wurde Natriumalginat mit einem M/G-Verhältnis von 1,2 verwendet, und es wurden immobilisierte Actinomyceten in ähnlicher Weise hergestellt wie vorstehend beschrieben. Die Aktivität betrug 62,7 Einheiten/ml. Die Aktivitätsausbeute betrug 57,0%.

Die Festigkeit der immobilisierten Actinomyceten enthaltenden Gelperlen ist in Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II

Beispiel 2 Kontrollversuch 2

1,0 g Natriumalginat mit einem M/G-Verhältnis von 0,3 wurden in 25 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 0,25 g teilweise gereinigtem und verdünntem β-Galactosidasepulver (Aktivität 80 000 Einheiten/g bei 25°C und pH 7,5) versetzt. Das Gemisch wurde tropfenweise durch eine Düse mit einem Innendurchmesser von 1 mm in eine 0,3 M wäßrige Strontiumchloridlösung gegeben. Es wurden Gelperlen erhalten. Das Rühren wurde 2 Stunden bei 25°C fortgesetzt, um die Gelierung zu vervollständigen. Danach wurden die Gelperlen abfiltriert und gewaschen. Es wurden 30 ml immobilisierte β-Galactosidase erhalten.

Die Aktivität der immobilisierten β-Galactosidase wurde durch die Menge an Glucose bestimmt, die bei einem pH-Wert von 7,5 und einer Temperatur von 25°C mit Lactose in Form einer 9-gew.-%igen Lösung als Substrat gebildet wurde. Die Ergebnisse zeigten eine Aktivität von 520 Einheiten/ml immobilisierte β-Galactosidase.

Die Aktivitätsausbeute wurde nach folgender Gleichung berechnet:

A = Aktivität; Y = Ausbeute; AY = Aktivitätsausbeute;
immobil. β-Gal. = immobilisierte β-Galactosidase.

Zum Vergleich wurde Natriumalginat mit einem M/G-Verhältnis von 1,2 zur Herstellung von immobilisierter β-Galactosidase auf ähnliche Art wie vorstehend beschrieben verwendet. Die Aktivität betrug 520 Einheiten/ml immobilisierte β-Galactosidase und die Aktivitätsausbeute 65%.

Die Festigkeit der immobilisierten β-Galactosidase-Gelperlen ist in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

Die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Gele der immobilisierten Enzyme oder immobilisierten Mikroorganismen haben eine wesentlich höhere Festigkeit als die nach den bekannten Geleinschlußverfahren hergestellten Gele aus Natriumalginat und Calciumionen. Die erfindungsgemäß hergestellten Gele sind auch bei Änderungen des pH-Wertes oder in Gegenwart von Chelatisierungsmitteln stabil. Dies gestattet enzymatische Verfahren über lange Zeiträume oder irgendwelche verfahrenstechnische Schwierigkeiten, wie Verstopfung in Durchflußkolonnen durchzuführen. Das Verfahren der Erfindung hat den weiteren Vorteil, daß die Immobilisierung einstufig in einem einfachen Verfahren durchgeführt werden kann.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen oder Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus Enzym oder Mikroorganismen und einer wäßrigen Lösung von Natriumalginat mit einem M/G-Verhältnis von 0,01 bis 0,8 mit einer wäßrigen Lösung von Barium- oder Strontiumionen zur Gelierung zusammenbringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das M/G-Verhältnis 0,01 bis 0,2 beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Alginsäure in dem Gemisch 0,5 bis 8 (W/V) % beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Alginsäure 3 bis 6 (W/V) % beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration an Enzym oder Mikroorganismen im Gemisch 0,01 bis 20 (W/V) % bzw. 0,01 bis 50 (W/V) % beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines löslichen Barium- oder Strontiumsalzes verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch mit einer wäßrigen Barium- oder Strontiumionen enthaltenden Lösung während 0,5 bis 24 Stunden bei einem pH-Wert von 3 bis 11 und einer Temperatur von 4 bis 50°C zusammenbringt.