DE2251855A1 - Verfahren zur verbesserung der lagerungsstabilitaet von enzymen - Google Patents

Verfahren zur verbesserung der lagerungsstabilitaet von enzymen

Info

Publication number
DE2251855A1
DE2251855A1 DE19722251855 DE2251855A DE2251855A1 DE 2251855 A1 DE2251855 A1 DE 2251855A1 DE 19722251855 DE19722251855 DE 19722251855 DE 2251855 A DE2251855 A DE 2251855A DE 2251855 A1 DE2251855 A1 DE 2251855A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzymes
treated
enzyme
glucose isomerase
radicals
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19722251855
Other languages
English (en)
Other versions
DE2251855C3 (de
DE2251855B2 (de
Inventor
James Chujer Chen
Ia Clinton
Robert George Dworschak
Aslam Khwaja
William Harold White
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Standard Brands Inc
Original Assignee
Standard Brands Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Standard Brands Inc filed Critical Standard Brands Inc
Publication of DE2251855A1 publication Critical patent/DE2251855A1/de
Publication of DE2251855B2 publication Critical patent/DE2251855B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2251855C3 publication Critical patent/DE2251855C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
    • C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln von Enzymen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Behandeln von Enzymen in Gegenwart von Feuchtigkeit.
Enzyme haben die Neigung, daß sie beim Lagern langsam denaturiert werden oder Aktivität verlieren. Diese Neigung kann etwas verringert werden, indem man die Enzyme trocknet. Bestimmte Elnzyme sind aber extrem wärrneempfindlich, so daß ' das ■ Trocknen solcher Enzyme bei relativ niedrigen Temperaturen -vorgenommen werden muß, wodurch ausgedehnte Trocknungszeiträume erforderlich sind. Die Enzyme können auch gefroren gelagert v/erden, um den
BAD ORlGINAi 3 0 9 8 17/0912 - 2 - "
Aktivitätsverlust beim Lagern zu verringern. Diese Methoden sind aber aus einer Anzahl von Gründen nicht vollständig zufriedenstellend.
Es ist daher ein Hauptziel dieser Erfindung, ein geeignetes und wirtschaftliches Verfahren zur Behandlung von Enzymen zur Verbesserung der Lagerungsfähigkeit zur Verfügung zu stellen.
Dieses Ziel der Erfindung wird dadurch gelöst, daß man die Enzyme in Gegenwart von Feuchtigkeit bzw. Wasser mit einer effektiven Menge einer langkettigen quaternären Ammoniumverbindung behandelt.
Beispiele für Enzyme, die erfindungsgemäß behandelt werden können sind Glycose-Isomerase, £fc -Amylase, Qt- -1,6-Glucosidasen, Catalase, Malzenzyme, Glucose-oxidase, Cellulase und dergleichen. Die bevorzugten Enzyme, die gemäß der Erfindung behandelt werden, sind Glycose-Isomerase, Qi-Amylase und Pullulanase.
Eine relativ große Anzahl von langkettigen quaternären Ammoniumverbindungen kann bei dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Diese quaternären Ammoniumverbindungen können durch die allgemeine Formel
dargestellt werden, worin R, ein Radikal mit mindestens Io Kohlenstoffatomen ist, Rg für ein Radikal mit- 1 bis 2o Kohlenstoffatomen steht und R-, und Rh Radikale bedeuten, die nicht mehr als 6 Kohlenstoffatome bedeuten. Die Radikale sind aus der Gruppe ausgewählt, welche aus Alkyl, substituiertem Alkyl, Alken, Aryl, substituiertem Aryl, Aralkyl und gesättigen und
309817/0912 BAD ORIGINAL
ungesättigten cyclischen Gruppen, wobei die cyclische Gruppe durch Verbinden von IU und üu gebildet wird, besteht, wobei wenn die cyclische Gruppe ungesättigt ist,, kein R2 vorhanden ist.
X kann jedes geeignete anorganische oder organische Anion sein, z.B. Halogenid, Nitrat, Sulfat, Acetat etc.
Beispiele für quaternäre Ammoniumgruppen der obigen Formel,, welche erfindungsgemäß verwendet werden können,, sind Trimethyloctadecyl-ammonium, DimethylbenzyIdodeeylammonium, N,N-Diäthylmorpholynium, Cetylpyridinium, Trihydroxyäthyloctadeeenylammonium, Diäthylclioctadecyl-ammonium, Dioctadecylmorpholiniuni, Dime thy Idilauryl-ammonium und 2-Chloräthylbutyl-distearylammonium.
Die bevorzugten quaternären Ammoniumverbindungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, können durch die allgemeine Formel
dargestellt werden, worin X ein Halogenidradikal ist und η eine ganze Zahl, nämlich 12, l4 oder l6 ist.
Formulierungen, die diese Verbindungen enthalten, sind unter dem Warenzeichen Variquat 415' und Hyamine 25oo von Northern Petrochemical Company und Rohm und Haas Company im Handel, Sie stellen ein Gemisch aus $ö$ einer Verbindung, bei welcher η der obigen Formel l4 ist," Kc$ einer Verbindung, bei welcher η der obigen Formel 12;ist und lo$ einer
α-/. ν BAD ORIGINAL
309817/0912 . ~ * "
_ 1}
Verbindung, bei welcher η der obigen Formel 16 ist, dar.
Die Bedingungen, bei denen die Enzyme behandelt werden, können Je nach dem jeweiligen zu behandelnden* Enzym variieren, sowie nach der Jeweilig verwendeten langkettigen quaternären Ammoniumverbindung. Die Feuchtigkeits- bzw. Wassermenge muß naturgemäß ausreichend seinj um die langkettigen quaternären Ammoniumverbindungen,aufzulösen, so daß die Enzyme sich damit im innigen Kontakt befinden.
Enzyme werden durch Mikroorganismen intracellulär und/oder extracellular produziert. O^ -Amylase 1st ein Beispiel für ein Enzym, welches extracellular erzeugt wird. Die Qlycose-Isomerase, die durch Mikroorganismen der Genus Streptomyces prodzlert wird, ist ein Beispiel für ein Enzym, welches hauptsächlich intracellulär gebildet wird. Extracellular gebildete Enzyme sind in löslicher Form und wenn sie in dieser Form verwendet werden, können sie nur durch relativ kostspieli~ge Arbeitsweisen, beispielsweise durch eine Ultrafiltration wiedergewonnen werden. Einige Enzyme, die intracellulär gebildet werden, können innerhalb der Zellen unbeweglich gemacht werden, so daß sie während des Gebrauchs nicht ausgelaugt werden oder sie können solubilisiert werden und somit in einer Anzahl von Reaktionen oder in einem kontinuierlichen System verwendet werden. Enzyme können in oder auf inerten Trägern gebunden oderunbeweglich gemacht werden, wie DEAE Cellulose, Dextranen, Harzen, Glas und einer Vielzahl von anderen Materialien. Zur Bindung oder zur Unbeweglichmachung der Enzyme auf inerten Trägern ist es im allgemeinen notwendig, daß die Enzyme In löslicher Form vorliegen. Im Falle von intracellulär gebildeten Enzymen erfordert dies die Aufbrechung der Zellwände, um die Enzyme freizusetzen.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist auf solubili-
BAD ORIGINAL 3 09817/0912 " .
sierte Enzyme und auf unbeweglich gemachte Enzyme, die intracellulär oder auf inerten Trägern unbeweglich gemacht worden sind, anwendbar.
Die Menge der beim Verfahren der Erfindung verwendeten Menge der langkettigen quaternären Verbindungen kann von einer Vielzahl von Paktoren abhängen. Wenn die Enzyme sich in relativ reinem Zustand befinden, darin werden geringere Mengen von quaternären Ammoniumverbindungen benötigt, um eine gesteigerte Lagerungsstabilität zu erzielen. Im Falle der Glucose-Isomerase, welche auf oder in einem inerten Träger unbeweglich gemacht worden ist, ergeben etwa o,o5 bis etwa 0,8$ der quaternären Ammoniumverbindung zufriedenstellende Ergebnisse .
Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert. Beispiel 1; -
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von intracellulärer Glucose-Isomerase, die durch Wärmebehandlung unbeweglich gemacht worden ist, mit einer langkettigen quaternären Ammoniumverbindung..
Streptomyces ATCC 21175 wurde unter aerobischen Bedingungen über etwa 5o Stunden in einem geeigneten Medium gezüchtet. Der pH-Wert der gesamten Fermentationsbrühe wurde mit NaOH auf "J,5 und die Temperatur auf 75°C eingestellt. Die Brühe wurde bei diesen Bedingungen 5 Minuten lang gehalten und sodann auf 4o°C abgekühlt. Zu der Brühe wurde eine genügende Menge von Variquat Λ15 (von Northern Petrochemical Company) zugegeben, so daß darin o,o62#, bezogen auf das Volumen der Brühe, erhalten wurden. Die Brühe wurde filtriert und der Filterkuchen wurde gewaschen. Die Aktivität des Filterkuchens betrug 2oo IGIU/g
■ - 6 -309817/0912 BADOHiGlNAL
Proben des Filterkuchens wurden bei verschiedenen Temperaturen, wie sie in Tabelle I gezeigt sind, 2J Tage lang gelagert und die Aktivitäten der Proben wurden bestimmt;
Tabelle I
Lagerungsstabilität von unbeweglich gemachter intracellulärer Glucose-Isomerase
Lagerungstemperatur der ' Aktivität der Probe auf
intracellulären Glucose- Trockenbasis (ICKEU/g*) nach
Isomerase 27-tägiger Lagerung
V+4°C 2oo
26,7°C 2oo
IGIU ist die Abkürzung für Internationale Glucose-Isomerase Einheiten. Dieser Wert bedeutet diejenige Enzyinmenge, die ein Mikromol Glucose je Minute in einerLösung mit 2 Mol Glucose,o,o2 Mol MgSOh, ο,οοΐ Mol CoCIp je Liter bei einem pH-Wert von 6,84 bis 6,85 (o,2 M Natrioramalestt) und einer Temperatur von 60 C in Fructose umwandelt.
Eine Kontrollprobe der intracellulären Glucose-Isomerase wurde unbeweglich gemacht und nach der oben angegebenen Arbeitsweise behandelt, mit der Ausnahme, daß kein Variquat 4l5 verwendet wurde. Die Probe wurde 27 Tage bei 4,440C gelagert und sodann die Aktivität bestimmt. Nach Lagerung der Probe wurde ein Verlust von etwa 35$ der Anfangsaktivität festgestellt.
Beispiel 2:
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von Glucose-Isomerase, die auf einem inerten Träger unbeweglich gemacht worden war, mit einer langkettigen quaternären Ammonium-Ver-
- 7 309817/0912
bindung. * ·
Streptomyces 21175 wurde in einem geeigneten Medium unter aerobischen Bedingungen über etwa 5o Stunden gezüchtet. Zu 7 1 der Brühe wurden 7o ml o, 1 M CoCl2* 6 HgO, Io5 g einer Filterhilfe und o,06% eines kationischen Netzmittels gegeben« Der pH-Wert der Brühe wurde auf 6,5 eingestellt. Die Temperatur der Brühe wurde bei 4o°C gehalten. Die Brühe wurde bei diesen Bedingungen 18 Stunden gehalten und sodann filtriert. Zu dem Filtrat wurdenl5o g Whatman DE-23 Cellulose gegeben und das Gemisch wurde gerührt, bis ungefähr etwa loo$ der Glucose-isomerase in dem Filtrat auf der Whatman DE-2J5 Cellulose absorbiert waren. Das Gemisch wurde filtriert. Der Filterkuchen wurde filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 1 1 Wasser, 1 1 o,1 M NaCl und 1 1 Wasser mit o,o5$ Variquat 4l5 gewaschen. Der Filterkuchen wurde bis zu einem Wassergehalt von etwa 4o^ an der Luft getrocknet. Proben des Filterkuchens wurden bei den in Tabelle II.beschriebenen Bedingungen gelagert, und die Aktivitäten wurden bestimmt. Es wurden weitere Proben von unbeweglich gemachter Glucose-Isomerase, wie oben beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß das Variquat 415 weggelassen wurde. Diese Proben wurden bei den in Tabelle II beschriebenen Bedingungen gelagert und die Aktivitäten wurden bestimmt.
- 8 -3098 17/0912
Tabelle II
Lagerungsstabilität der Glucose-Isomerase, die auf einem inerten Träger unbeweglich gemacht worden war
Behandlung der Probe
Anfangsaktivität der unbeweglich gernachten Glucose-Isomerase
Laserungstemperatur de:
unbeweglich gemachten
Glucose ( C)
Aktivität nach der Lagerung (lGIU/gx Trockenbasis) Lagerungsperi ode
2 Wochen' 1 Monat" 2 Monate
Behandlung mit Variquat
415
446
ft Π It tt
CaJ
O 		ti tt It tt
CD
CO
-J 		keine Behandlung
Variquat 415		 mit 43
tt H tt tt
CD
(O 		U It M tt
21
37,7
21
37,7.
446
446
446
432 430 433
433 A20 - 425
431 434 433
297 135 5
178 110 0
* IGIU 1st die Abkürzung für Internationale Glucose-Isomerase Einheiten. Dieser Wert bedeutet diejenige Ensymsenge» die ein MiJcrosiol Glucose Je Minute in einer Lösung mit 2 Hol Glucose, o,o£ Mol MgSO^, 0,0οί Mol CoCl2 Je'Liter'bei einem pH-Wert von 6,84 bis 6,85 (o,2 M Matriuramaleat) und einer Temperatur von 60 C in Fructose umwandelt.
cn
cn
Aus der obigen Tabelle wird-ersichtlich, daß bei niedrigen Lagerungstemperaturen, zJ.,5 C kein oder nur ein geringer Verlust der Aktivität des Enzyms erfolgt, ungeachtet ob die Proben mit Variquat 415 behandelt worden sind oder nicht. Bei höheren Temperaturen verlieren jedoch die Proben, die nicht behandelt worden waren, einen "signifikant größeren Teil ihrer Aktivität als die mit Variquat 41-5 behandelten Proben.
Beispiel J>:
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von cc -Amylase gemäß der Erfindung.
Bacillus sub-tilis wurde in einem geeigneten Medium bei aerobischen Bedingungen über einen Zeitraum von 44 Stunden gezüchtet. Zu der gesamten Permentationsbrühe wurden 2,6$ Calciumchlorid, o,2$ Natriumhydrosulfit und 0,09$ Sorbinsäure gegeben. Zu den Proben der Brühe wurden verschiedene Mengen von Variquat 4l5 zugesetzt. Die Proben wurden bei 3>7°C gelagert, Nach der Lagerung wurden die Enzym-Aktivitäten der Proben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.
3098 17/0912 - lo -
Tabelle III - Io -
Lagerungsstabilität von <x -Amylase
zugegebene Menge von Anfangsaktivität Aktivität nach der Lagerung (Liquefons*/ml χ Variquat 415 (Vol.-$) Liquefons /ml Lagerungsperiode (Tage)
Lo3 1 ι ό 4 13 2o O
5,7 x 3 5,6 5 a O O 3,7
II 5,6 5 4 5,2 5,2 3,5
ti 5,6 5, 5,2 5,2 5,4
It 5,7 5, 5,4 5,4 5,4
tt 5,7 5, 5,4 5,4
ο,ΐο
ο, 15
*° * Idquefon 1st als diejenige Enzymmenge definiert, welche 2,855 mg Stärke bei spezifischen Bedin- * guftgen dextrinisiert. Dieser Wert wird nach folgender Formel erre-chnet:
^ ' "■ ' - Il4o
Liquefons/g = Gewicht (g) des Enzyms χ Zeit (min.;
X&e verwendete Methode ist eine Modifizierung der Methode der American Association of Textile Chemists (AATC), veröffentlicht in American Dyestuff Reporter, 9. Juli 19o2. Die Modifizierungen der veröffentlichten Methoden sind wie folgt:
(1). Der Puffer für das Substrat wurde hergestellt, indem 25,5 S C-.P. Natriumhydroxid und 34o g Kaliumdihydrogen-phosphat in Wasser aufgelöst wurden und auf 2 1 verdünnt wurde. Der pH der Pufferlösung betrug 6,2. *
(2) 125 ml des Puffers wurden zu dem Substrat gegeben, bevor das Substrat auf das notwendige Volumen gebracht wurde.
(j5) 2o ml des Subs tr as und Io ml Enzymlösung wurden je Bestimmung verwendet. 1^
' OO
Beispiel 4:
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von Pullulanase, welche auf einem Cellulosederivat unbeweglich gemacht worden war, mit einer langkettigen Ammoniumverbindung.
Aerobacter aerogenes NRRL 289 wurde in einem geeigneten Medium gezüchtet, das Maltose und Dextrose enthielt. Die Züchtung erfolgt unter Unteitauch-aerobisehen Bedingungen bei 5o°C über l8 Stunden. Das Medium wurde filtriert, und der die Pullulariase enthaltende Filterkuchen wurde gewaschen. Der Filterkuchen'wurde in Wasser aufgeschlämmt und die Pullulanase wurde durch Verwendung eines nicht-ionogenen Netzmittels extrahiert. Die Aufschlämmung wurde filtriert und dem die Pullulanase enthaltenden Filtrat wurde mit Bromwasserstoff aktivierte Cellulose zugeführt. Die Pullulanase wurde durch.kovalente Bindung an die Cyanwasserstoff-bromid aktivierte Cellulose unbeweglich gemacht. Proben der unbeweglich gemachten Pullulanase wurden in einer o, 1 M NaCl-Lö'sung aufgeschlämmt, filtriert, mit Wasser gewaschen und sodann mit Wasser gewaschen, welches o,.o5$ Variquat 415 enthielt. Eine weitere Probe der unbeweglich gemachten Pullulanase wurde in der oben beschriebenen V/eise hergestellt, mit der Ausnahme, daß keine Behandlung mit Variquat 415 erfolgte. Die Anfangsaktivität der Proben wurde bestimmt, worauf die Proben über eine bestimmte Zeitspanne gelagert wurden und die Aktivitäten der Proben bestimmt vmrden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.
3 09817/0912 " 12 ~
Tabelle' IV
Lagerungsstabilität der Pullulanase, welche kovalent an Cyanogenbromid aktivierte Cellulose gebunden war
Herstellung der
Probe
Anfangsaktivität (IU */g) der gebundenen MLlula-
nase
Aktivität der gebundenen Pullulanase (IU */g) nacil 7-täßiger Lagerung
mit Variquat 415
behandelt
53
ohne Behandlung
mit Variquat 415
* Eine IU ist als diejenige Materialmenge definiert, welche die Hydrolyse eines /uMol von Q^-1,6-Bindungen (bezogen auf die Freisetzung von Maltotriose) je Minute von einer o,5^-ig©n Pullulan-Lösung bei einem pH von 5>ο und bei 45 C katalysiert.
309817/0912

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    IJ Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsstabilität von Enzymen, dadurch gekennze i ohne t , daß man die Enzyme in Gegenwart von Wasser mit einer wirksamen Menge einer Verbindung der folgenden Formel
    X"
    behandelt, worin B* ein Radikal mit mindestens Io Kohlenstoffatomen ist, H2 für ein Radikal mit 1 bis 2o Kohlenstoffatomen steht und R_ und Rj, Radikale mit nicht mehr als 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, wobei die Radikale Alkyl, substituiertes Alkyl, Alken, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl und/oder gesättigte und ungesättigte cyclische Radikale sind, wobei die cyclischen Radikale durch Verbindung von R, und R^ gebildet werden und wobei', wenn das cyclische Radikal, ungesättigt ist, kein Rp vorliegt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1> dadurch gekennzeichnet , daß man als Enzym Glucose-Isomerase,c^-Amylase, C^-ljö-ßlueosedasen, Catalase, Malzenzyine, Glucoseoxidasa oder Cellulase verwendet*
    ^. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e kennzeichnet, daß man die Enzyme mit einer wirk-
    3098t7/0tl2
    samen Menge einer Verbindung mit der allg,ei»inen »FormeIj
    behandelt, worin X ein Halogenidradikal ist und η eine ganze Zahl, nämlich 12, 14 oder 16 ist.
    4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis ">, da·* durch gekennzeichnet, äa$ man eis Enzym Glucose-Isomerase behandelt.
    5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis "Jtt da
    durch gekennzeichnet, daÖ HiaR als Enzym Oo -Amylase behandelt.
    6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis ~j»t dadurch gekennzeichnet, daß man al» Enzym Pullulanase behandelt.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6# dadurch gekennzeichnet, dall man die zu behandelnden Enzyme in oder auf inerten Trägern unbeHegllQh macht.
    8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu behandelnde Glucose-Isomerase auf einem Cellulosederivat unbeweglich
    9. Verfahren nach eine» der Anspfüoll· l.bia 8, dadurch gekennzei chnet , dafl man die zur Behand lung der Enzyme verwendete Verbindung in tfel|g*n,. vi»i etwa o,o
    30981770112
    bis etwa ο,o%, bezogen auf die Menge des vorhandenen Wassers einsetzt'. -'ί'Γ
    309817/0912
DE19722251855 1971-10-22 1972-10-23 Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsstabilität von solubilisierten bzw. immobilisierten Enzymen Expired DE2251855C3 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19181771A 1971-10-22 1971-10-22

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2251855A1 true DE2251855A1 (de) 1973-04-26
DE2251855B2 DE2251855B2 (de) 1978-03-16
DE2251855C3 DE2251855C3 (de) 1978-11-30

Family

ID=22707049

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19722251855 Expired DE2251855C3 (de) 1971-10-22 1972-10-23 Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsstabilität von solubilisierten bzw. immobilisierten Enzymen

Country Status (7)

Country Link
BE (1) BE790343A (de)
CA (1) CA986441A (de)
DE (1) DE2251855C3 (de)
DK (1) DK134182B (de)
FR (1) FR2156901B1 (de)
GB (1) GB1404500A (de)
NL (1) NL7214352A (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE416314B (sv) * 1978-04-03 1980-12-15 Svenska Sockerfabriks Ab Enzymatiskt forfarande, varvid enzymet foreligger i ett losligt komplex med hydrofob bindning och en del som modifierar enzymetsproduktivitetskinetiska egenskaper samt det losliga komplexet
LU84515A1 (fr) * 1982-12-09 1984-10-22 Oreal Composition stable pour corticotherapie locale a forte concentration hydrocortisone solubilisee
US4634673A (en) * 1984-03-28 1987-01-06 Nabisco Brands, Inc. Enzyme purification process
JPS61194034A (ja) * 1985-02-25 1986-08-28 Teijin Ltd 経鼻投与用粉末状組成物
JPH0651637B2 (ja) * 1985-03-28 1994-07-06 エーザイ株式会社 ペプタイドの吸着防止組成物
US4663288A (en) * 1985-05-22 1987-05-05 Nabisco Brands, Inc. Process for purification of enzymes
EP1645195A1 (de) * 2004-10-05 2006-04-12 Basf Aktiengesellschaft Stabile Enzymzubereitungen

Also Published As

Publication number Publication date
DE2251855C3 (de) 1978-11-30
NL7214352A (de) 1973-04-25
DK134182B (da) 1976-09-27
CA986441A (en) 1976-03-30
DK134182C (de) 1977-02-28
GB1404500A (en) 1975-08-28
FR2156901B1 (de) 1976-03-26
DE2251855B2 (de) 1978-03-16
FR2156901A1 (de) 1973-06-01
BE790343A (fr) 1973-04-20
AU4808372A (en) 1974-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2025748A1 (de) Herstellung von Enzymen aus Mikroorganismen
DE2108748C3 (de) Verfahren zur Herstellung von als Oligoglucosylfruktosen bezeichneten Oligosaccharid-Gemischen
DE3801053C2 (de)
DE2026092B2 (de) Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Protease
DE1792773A1 (de) Rohrfoermiger traeger mit enzym und verfahren zur herstellung
DE2532005A1 (de) Verfahren zur herstellung von verzuckerten staerkeprodukten
DE2251855A1 (de) Verfahren zur verbesserung der lagerungsstabilitaet von enzymen
DE1767653C3 (de) Verfahren zur Erzeugung von Isoamylase
DE2500597C2 (de) Verfahren zur gleichzeitigen Herstellung von beta-Amylase und alpha-1,6-Glucosidase
DE2116791A1 (de) Verfahren zur Herstellung von körnigen Enzympräparaten
DE3527649C2 (de)
EP0021311B1 (de) Verfahren zur Gewinnung von Cholesterinoxidase
DE2003652C3 (de) Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von CelluJase
DE2319989A1 (de) Stabilisiertes enzympraeparat, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung
DE2453860C2 (de) Erzeugung von Cyclodextrin
DE2557499A1 (de) Verfahren zur herstellung von cholestrin-oxidase
DE3333246A1 (de) Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin
DE1294307B (de) Verfahren zur Reinigung eines durch Zuechten von Schimmelpilzen, wie Schimmelpilzen der Gattung Aspergillus niger, erhaltenen Glucamylase enthaltenden Enzympraeparates von Transglucosidase
DE2752499A1 (de) Verfahren zur enzymatischen umwandlung eines penicillins in 6-aminopenicillansaeure
DE3332639C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Maltopentaose
DE2841642C2 (de) Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Tryptophan
DE2723166C3 (de) Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide
DE1952012C3 (de) Biotechnisches Verfahren zur Herstellung alkalischer Protease
DE2120412A1 (de) Verfahren zur Gewinnung von hoch wirksamen Alpha-1,6-glukosidasen
DE3301992A1 (de) Permeabilisiertes schimmelpilzmycel mit intaktem immobilisiertem glucoseoxidase-katalasesystem sowie dessen herstellung und anwendung

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
EHJ Ceased/non-payment of the annual fee