DE2251855C3 - Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsstabilität von solubilisierten bzw. immobilisierten Enzymen - Google Patents

Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsstabilität von solubilisierten bzw. immobilisierten Enzymen

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DE2251855C3 DE19722251855 DE2251855A DE2251855C3 DE 2251855 C3 DE2251855 C3 DE 2251855C3 DE 19722251855 DE19722251855 DE 19722251855 DE 2251855 A DE2251855 A DE 2251855A DE 2251855 C3 DE2251855 C3 DE 2251855C3
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Description

dadurch gekennzeichnet, daß man die solubilisierten bzw. immobilisierten Enzyme in Gegenwart von Wasser mit 0,05 bis 0,8%, bezogen auf die Menge des vorhandenen Wassers, einer Verbindung der folgenden Formel
Beispiele für Enzyme, die erfindungsgemäß behandelt werden können, sind Glycose-Isomerase, a-Amylase, Λ-Ι,β-Glucosidasen, Catalase, Malenzyme, Glucose-oxidasc, Cellulase und dergleichen. Die bevorzugten Enzyme, die gemäß der Erfindung behandelt werden, sind Glycose-Isomerase, a.-Amylase und Pullulanase.
Beispiele für quaternäre Ammoniumgruppen der obigen Formel, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Trimethyloctadecyl-ammonium,
ίο Dimethylbenzyldodecylarnmonium, N,N-Diäthylmorpholinium, Cetylpyridinium, Trihydroxyäthyloctadecenylammonium, Diäthyldioctadecyl-ammonium, Dioctadecylmorpholinium, Dimethyldilauryl-ammonium und 2-Chloräthylbutyl-distearylammonium.
Die bevorzugten quaternären Ammoniumverbindungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, werden durch die allgemeine Formel
N+ X"
(D
20
behandelt, worin Ri ein Radikal mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen ist, R2 für ein Radikal mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen steht und R3 und R4 Radikale mit nicht mehr als 6 Kohlenstoffatomen bedeuten, wobei die Radikale Alkyl, substituiertes Alkyl, Alken, Aryl, substituiertes Aryl, Aralkyl und/oder gesättigte und ungesättigte cyclische Radikale sind, wobei die jo cyclischen Radikale durch Verbindung von R3 und Ra gebildet werden und wobei, wenn das cyclische Radikal ungesättigt ist, kein R2 vorliegt und X" ein Halogenid-Anion bedeutet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung mit der allgemeinen Formel:
CH,
CnH2n +,—N-CH2
CH3
CH,
CnH2n+1-N-CH2
CH,
worin X ein Halogenidradikal ist und η eine ganze Zahl, nämlich 12,14 oder 16 ist, einsetzt.
Enzyme neigen dazu, beim Lagern langsam denaturiert zu werden oder an Aktivität zu verlieren. Diese Neigung kann etwas verringert werden, indem man die Enzyme trocknet. Bestimmte Enzyme sind aber extrem wärmeempfindlich, so daß das Trocknen solcher Enzyme bei relativ niedrigen Temperaturen vorgenommen werden muß, wodurch eine lange Trocknungszeit erforderlich ist. Die Enzyme können auch gefroren gelagert werden, um den Aktivitätsverlust beim Lagern zu verringern. Diese Methoden sind aber aus einer Anzahl von Gründen nicht vollständig zufriedenstellend.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsfähigkeit bestimmter Enzyme (siehe die Erfindungsdefinition) aufzuzeigen, das leicht und wirtschaftlich durchzuführen ist.
Die Erfindung wird in den Patentansprüchen angegeben.
dargestellt, worin X ein Halogenidradikal ist und η eine ganze Zahl, nämlich 12,14 oder 16 ist.
Formulierungen, die diese Verbindungen enthalten, sind im Handel erhältlich. Sie stellen ein Gemisch aus 50% einer Verbindung, bei welcher ρ der Formel II 14 ist, 40% einer Verbindung, bei welcher η der Formel Il 12 ist und 10% einer Verbindung, bei welcher η der Formeill 16 ist, dar.
Die Bedingungen, bei denen die Enzyme behandelt werden, können je nach dem jeweiligen zu behandelnden Enzym variieren sowie nach der jeweilig verwendeten langkettigen quaternären Ammoniumverbindung. Die Feuchtigkeits- bzw. Wassermenge muß naturgemäß h ausreichend sein, um die langkettigen quaternären
. 40 Ammoniumverbindungen aufzulösen, so daß die Enzy-X~ (II) me sich damit im innigen Kontakt befinden.
Enzyme werden durch Mikroorganismen intracellulär und/oder extracellular produziert. «-Amylase ist ein Beispiel für ein Enzym, welches extracellular erzeugt wird. Die Glycose-Isomerase, die durch Mikroorganismen der Genus Streptomaces produziert wird, ist ein Beispiel für ein Enzym, welches hauptsächlich intracellulär gebildet wird. Extracellular gebildete Enzyme sind in löslicher Form, und wenn sie in dieser Form verwendet werden, können sie nur durch relativ kostspielige Arbeitsweisen, beispielsweise durch eine Ultrafiltration wiedergewonnen werden. Einige Enzyme, die intracellulär gebildet werden, können innerhalb der Zellen unbeweglich gemacht werden, so daß sie während des Gebrauchs nicht ausgelaugt werden oder sie können solubilisiert werden und somit in einer Anzahl von Reaktionen oder in einem kontinuierlichen System verwendet werden. Enzyme können in oder auf inerten Trägern gebunden oder unbeweglich gemacht werden, bo wie Cellulosederivaten, Dextranen, Harzen, Glas und einer Vielzahl von anderen Materialien. Zur Bindung oder zur Unbewegiichmachung der Enzyme auf inerten Trägern ist es im allgemeinen notwendig, daß die Enzyme in löslicher Form vorliegen. Im Falle von b5 intracellulär gebildeten Enzymen erfordert dies die Aufbrechung der Zellwände, um die Enzyme freizusetzen.
Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert.
Beispiel I
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von intracellulärer Glucose-Isomerase, die durch Wärmebehandlung unbeweglich gemacht worden ist, mit einer langkettigen quaternären Ammoniumverbindung.
Streptomyces ATCC 21 175 wurde unter aerobischen Bedingungen über etwa 50 Stunden in einem geeigneten Medium gezüchtet. Der pH-Wert der gesamten Fermentationsbrühe wurde mit NaOH auf 7,5 und die Temperatur auf 75°C eingestellt. Die Brühe wurde bei diesen Bedingungen 5 Minuten lang gehalten und sodann auf 400C abgekühlt. Zu der Brühe wurde eine genügende Menge eines Gemisches aus 50% einer Verbindung, bei welcher η der Formel Il 14 ist, 40% einer Verbindung, bei welcher η der Formel Il 12 ist, und 10% einer Verbindung, bei welcher η der Formel II 16 ist, zugegeben, so daß darin 0,062%, bezogen auf das Volumen der Brühe, erhalten wurden. Die Brühe wurde filtriert und der Filterkuchen wurde gewaschen. Die Aktivität des Filterkuchens betrug 200 lGIU/g.
Proben des Filterkuchens wurden bei verschiedenen Temperaturen, wie sie in Tabelle I gezeigt sind, 27 Tage lang gelagert und die Aktivitäten der Proben wurden bestimmt.
Tabelle I
Lagerungsstabilität von unbeweglich gemachter intracellulärer Glucose-Isomerase
Lagerungstemperatur der intracellulären Glucose-Isomerase
Aktivität der Probe auf
Trockenbasis (IGIU/g*) nach 27tägiger Lagerung
4,4"C
26,7CJC
200
200
*) IGlU ist die Abkürzung für Internationale Glucose-Isomerase-Einheiten. Dieser Wert bedeutet diejenige Enzymmenge, die ein Mikromol Glucose je Minute in einer Lösung mit 2 Mol Glucose, 0,02 Mol MgSO4, 0,001 Mol CoCl2 je Liter bei einem pH-Wert von 6,84 bis 6,85 (0,2 M Natriummaleat) und einer Temperatur von 600C in Fructose umwandelt.
Eine Konlrollprobe der intracellulären Glucose-Isomerase wurde unbeweglich gemacht und nach der oben angegebenen Arbeitsweise behandelt, mit der Ausnahme, daß keine quaternäre Ammoniumverbindung verwendet wurde. Die Probe wurde 27 Tage bei 4,4° C gelagert und sodann die Aktivität bestimmt. Nach Lagerung der Probe wurde ein Verlust von etwa 35% der Anfangsaktivität festgestellt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von Glucose-Isomerase, die auf einem inerten Träger unbeweglich gemacht worden war, mit einer langkettigen quatemären Ammonium-Verbindung.
Streptomyces 21 175 wurde in einem geeigneten Medium unter aerobischen Bedingungen über etwa 50 Stunden gezüchtet. Zu 7 I der Brühe wurden 70 ml 0,1-M CoCI2 · 6 H2O, 105 g einer Filterhilfe und 0,06% eines kationischen Netzmittels gegeben. Der pH-Wert der Brühe wurde auf 6,5 eingestellt. Die Temperatur der Brühe wurde bei 40°C gehalten. Die Brühe wurde bei diesen Bedingungen 18 Stunden gehalten und sodann filtriert. Zu dem Filtrat wurden 150 g Whatman DE-23 Cellulose gegeben und das Gemisch wurde gerührt, bis ungefähr etwa 100% der Glucose-Isomerase in dem Filtrat auf der Whatman DE-23 Cellulose absorbiert waren. Das Gemisch wurde filtriert. Der Filterkuchen
to wurde filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 1 1 Wasser, 1 I 0,1-M NaCl und 1 I Wasser mit 0,05% der in Beispiel 1 verwendeten quaternären Ammoniumverbindung gewaschen. Der Filterkuchen wurde bis zu einem Wassergehalt von etwa 40% an der Luft getrocknet.
ü Proben des Filterkuchens wurden bei den in Tabelle Il beschriebenen Bedingungen gelagert, und die Aktivitäten wurden bestimmt. Es wurden weitere Proben von unbeweglich gemachter Glucose-Isomerase, wie oben beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, daß die quaternäre Ammoniumverbindung weggelassen wurde. Diese Proben wurden bei den in Tabelle II beschriebenen Bedingungen gelagert und die Aktivitäten wurden bestimmt.
Tabelle II
Lagerungsstabilität der Glucose-Isomerase, die auf einem inerten Träger unbeweglich gemacht worden war
Behandlung der Probe Anfangsaktivität Lagerungstemperatur Aktivität nach der Lagerung (IGIU/g*) 2 Monate
der unbeweglich der unbeweglich Trockenbasis) Lagerungsperiode 446
gemachten gemachten
Glucose-Isomerase Glucose (' C) 2 Wochen 1 Monat 433
Behandlung mit quaternärer 446 5 446 446 425
Ammoniumverbindung 433
desgl. 446 21 432 430
desgl. 446 37,7 433 420
Keine Behandlung mit 431 5 431 434 5
quaternärer Ammonium 0
verbindung
desgl. 431 21 297 135
desgl. 431 37,7 178 116
*) IGIU ist die Abkürzung für Internationale Glucose-Isomerase-Einheiten. Dieser Wert bedeutet diejenige Enzymmenge, die ein Mikromol Glucose je Minute in einer Lösung mit 2 Mol Glucose, 0,02 Mol MgSO4, 0,001 Mol CoCI; je Liter bei einem nH-Wert von 6.84 bis 6.85 (0.2 M Natriummaleati und einer Temperatur von 60 C in Fructose umwandelt.
Aus der obigen Tabelle wird ersichtlich, daß bei niedrigen Lagerungstemperaturen, z. B. 5°C kein oder nur ein geringer Verlust der Aktivität des Enzyms erfolgt, ungeachtet ob die Proben mit dei quaternären Ammoniumverbindung behandelt worden sind oder nicht. Bei höheren Temperaturen verlieren jedoch die Proben,' die nicht behandelt worden waren, einen signifikant größeren Teil ihrer Aktiviiät als die mit der quaternpren Ammoniumverbindung behandelten Proben.
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreib*, die erfindungsgemäße Behandlung von «-Amylase.
Bacillus subtilis wurde in einem geeigneten Medium bei aerobischen Bedingungen über einen Zeitraum von 44 Stunden gezüciitet. Zu der gesamten Fermentationsbrühe wurden 2,6% Calciumchlorid, 0,2% Natriumhydrosulfit und 0,09% Sorbinsäure gegeben. Zu den
Proben der Brühe wurden verschiedene Mengen von der quaternären Ammoniumverbindung gemäß Beispiel 1 zugesetzt. Die Proben wurden bei 37° C gelagert. Nach der Lagerung wurden die Enzym-Aktivitäten der Proben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 111 zusammengestellt.
Tabelle III
Lagerungsstabilitä't von σ-Amylase
Zugegebene Menge
an quaternärer
Ammonium
verbindung		 Anfangsaktivität
Liquefons/ml		 Aktivität
ι -ι 		nach der Lagerung
6		 (Liquefons*)/ml ·
13		 103) Lagerungspericde (Tage)
20 34		 0
0 5,7 · 10' 5,6 5 0 0 3,7
0,05 5,7 · 10' 5,6 5 5,2 5,2 3,5
0,10 5,7 ■ 103 5,6 5,4 5,2 5,2 5,4
0,15 5,7 ■ 103 5,7 5,2 5,4 5,4 5,4
0,20 5,7 · 10' 5,7 5,4 5,4 5,4
*) Liquefon ist als diejenige Enzymmenge definiert, welche 2,855 mg Stärke bei spezifischen Bedingungen dextrinisiert. Dieser Wert wird nach folgender Formel errechnet:
Liquefons/g
1140
Gewicht (g) des Enzyms · Zeit (min)
Die verwendete Methode ist eine Modifizierung der Methode der American Association of Textile Chemists (AATC), veröffentlicht in American Dyestuff Reporter, 9. Juli 1962. Die Modifizierungen der veröffentlichten Methoden sind wie folgt:
(1) Der Puffer für das Substrat wurde hergestellt indem 25,3 g CP. Natriumhydroxid und 340 g Kaliumdihydrogen-phosphat in Wasser aufgelöst wurden und auf 2 1 verdünnt wurde. Der pH der Pufferlösung betrug 6,2.
(2) 125 ml des Puffers wurden zu dem Substrat gegeben, bevor das Substrat auf das notwendige Volumen gebracht wurde.
(3) 20 ml des Substrats und 10 ml Enzymlösung wurden je Bestimmung verwendet.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt die Behandlung von Pullulanase, welche auf einem Cellulosederivat unbeweglich gemacht worden war, mit einer langkettigen Ammoniumverbindung.
Aerobacter aerogenes NRRL 289 wurde in einem geeigneten Medium gezüchtet, das Maltose und Dextrose enthielt. Die Züchtung erfolgt unter Untertaiich-aerobischen Bedingungen bei 3Ü°C über 18 Stunden. Das Medium wurde filtriert, und der die Pullulanase enthaltende Filterkuchen wurde gewaschen, Der Filterkuchen wurde in Wasser aufgeschlämmt und die Pullulanase wurde durch Verwendung eines nichtionogenen Netzmittels extrahiert. Die Aufschlämmung wurde filtriert und dem die Pullulanase enthaltenden Filtrat wurde mit Bromwasserstoff aktivierte Cellulose zugeführt. Die Pullulanase wurde durch kovalente Bindung an die Cyanwasserstoff-bromid
do aktivierte Cellulose unbeweglich gemacht. Proben der unbeweglich gemachten Pullulanase wurden in einer 0,1 -m NaCI-Lösung aufgeschlämmt, filtriert, mit Wasser gewaschen und sodann mit Wasser gewaschen, welches 0,0'% der in Beispiel I verwendeten <ii;aternären
to Ammoniumverbindung enthielt. Eine weitere Probe der unbeweglich gemachten Pullulanase wurde in der oben beschriebenen Weise hergestellt, mit der Ausnahme, daß keine Behandlung mit einer quaternären Ammoni
univerbindung erfolgte. Die Anfangsakiiviiät der Proben wurde bestimmt, worauf die Proben über eine bestimmte Zeitspanne gelagert wurden und die
Aktivitäten der Proben bestimmt wurden. Die erhaltenen Krgehnisse sind in Tabelle IV /usammengesieül.
Tabelle IV
Lagerungsstabilität der Pullulanase, welche kovaleni an Cyanogenbromid aktivierte Cellulose gebunden war
Herstellung der Probe
Anl'angsaktivitiil (IU*)/g) der gebundenen Pullulanase Aktivität der gebundenen Pullulanase (lU*)/g) nach 7Üigiger
Lagerung
Mit der in Beispiel 1 53
verwendeten quaternären Ammoniumverbindung
Ohne Behandlung 53
mit einer quaternären Ammoniumverbindung
*) Eine IU ist als diejenige Materialnienge definiert, welche die Hydrolyse eines iiMols von a-l,6-Bindungcn (be/ogen auf die Freisetzung von Maltotriosc) je Minute von einer 0,5%igen Pullulan-Lösung bei einem pH von 5.0 und bei 45 C katalysiert.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsstabilität
(a) von stabilisierten Enzymen, bzw.
(b) von immobilisierten Enzymen, die intrazellulär unbeweglich gemacht worden sind, bzw.
(c) von immobilisierten Enzymen, die in oder auf inerten Trägern unbeweglich gemacht worden sind,
DE19722251855 1971-10-22 1972-10-23 Verfahren zur Verbesserung der Lagerungsstabilität von solubilisierten bzw. immobilisierten Enzymen Expired DE2251855C3 (de)

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