SE416314B - Enzymatiskt forfarande, varvid enzymet foreligger i ett losligt komplex med hydrofob bindning och en del som modifierar enzymetsproduktivitetskinetiska egenskaper samt det losliga komplexet - Google Patents

Description

15 20 25 §O 35 40 '7803732-2 regel merparten av enzymproteinet, stabiliseras i sin rymd- struktur av bl.a. elektrostatiska bindningar, vätebindningar, van der Waalska krafter och hydrofob interaktion. Det senare begreppet innebär, att vissa hydrofoba (vattenavvisande) delar i proteinstrukturen samverkar och lokaliseras i närheten av varandra, så att enzymmolekylen kommer att bestå av regioner av mer eller mindre utpräglade hydrofoba eller hydrofila (vatten- tillvända) egenskaper.

Ett enzyms karakteristiska egenskaper, såsom löslighet, stabilitet, katalytisk aktivitet, pH- och temperaturberoende, antigena egenskaper, kofaktorberoende etc., bestämmas ej endast av de aminosyror som ingår i det aktiva centret utan av hela aminosyrasekvensen och proteinstrukturens lagring i rymden, vil- -ket sammanhänger med den hydrofoba/hydrofila balansen, laddnings- fördelningen etc. Detta gör att alla delar i enzymmolekylen i större eller mindre grad påverkar enzymets egenskaper. På mot- svarande sätt medför en förändring i strukturen, exempelvis genom införandet av en substans, att enzymets egenskaper för- ändras i mer eller mindre hög grad.

Begränsningar i ett enzyms egenskaper medför ofta be- gränsning av dess användbarhet. Vid det praktiska utnyttjandet av enzymer, både sådana som idag används och de som har potentiell användbarhet men som av olika skäl f.n. ej utnyttjas, föreligger därför mycket ofta ett behov av möjlighet till förändring av enzymets egenskaper i någon önskad riktning. Som exempel på sådana förändringar kan nämnas förbättring av ett enzyms stabili- tetsegenskaper, förskjutning av ett enzyms pH-optimum mot högre eller lägre pH-värden, ändring av löslighetsegenskaperna, infö- rande av funktionella grupper som kan utnyttjas vid ett enzyms immobilisering, förhöjning av den katalytiska aktiviteten, för- ändring av dess antigena egenskaper m.m. Det råder därför inget tvivel om att en tillräckligt enkel teknik för att på ett effektivt sätt påverka enzymers funktion skulle innebära bety- dande fördelar. _ De för praktisk utnyttjning mest avgörande egenska- perna hos ett enzym kan sammanfattas under begreppet produktivi- tetskinetiska egenskaper. Härmed avses sådana egenskaper, som direkt utgör ett uttryck för enzymets katalytiska förmåga under dess användning som katalysator, vilka i realiteten är en funk- tion av basala egenskaper hos det totala enzymsystemet, t.ex. substratkoncentration, inhibitorkoncentration, enzymmängd, 10 15 20 25 30 35 H0 , 7803732-2 temperatur, pH etc., och uttrycks med sådana traditionella para- metrar som pH-optimum, värmestabilitet, driftstabilitet, Michaelis konstant (Km), inhibitorkonstant (Ki), maximal reaktionshastighet (Vmax) etc., till skillnad fran övriga egenskaper hos enzymet, som ej påverkar dess katalytiska funktion vid dess praktiska använd- ning. Till de senare egenskaperna hör sådana, som antingen kan betraktas som allmänmolekylära, såsom molekylvikt, löslighet, till- gängliga reaktiva eller adsorptiva grupper på enzymytan, eller sådana biokemiska egenskaper som ej har med katalys att göra t.ex. anti- genicitet, eller egenskaper som uttrycks med kinetiska termer, men ej har med processanvändningen som sådan att göra t.ex. lagrings- stabilitet. egenskaper sådana fysikaliska parametrar i reaktionskärlet som om- Inte heller avses med begreppet produktivitetskinetiska röringshastighet, reaktorkärldimensioner etc.

Genom att förskjuta pH-optimet hos ett enzym till det i pro- cessen lämpligast utnyttjade värdet, kan enzymets produktivitet ökas, dvs. mängden bildad produkt per tídsenhet ökar vid konstant enzymåtgång, vilket innebär möjligheter till stora tidsbesparingar och därmed även ekonomiska dylika. En sänkning av enzymets Km gentemot det aktuella substratet, en höjning av Kí gentemot i processen närvarande inhi- bitoun'resp. en höjning av Vmax påverkar naturligtvis på motsvarande sätt produktiviteten i gynnsam riktning, med alla de betydande för- delar detta innebär. Förbättring av ett enzyms värmestabilitet med- för att en högre processtemperatur kan utnyttjas, varvid Vmax för enzymet ökar, samtidigt som andra fördelar kan uppnås, exempelvis minskad risk för mikrobiologískkontamination, utfällningar etc.

Driftsstabiliteten hos ett enzym är ett uttryck för enzymets kata- lytiska aktivitet som funktion av tiden vid dess användning i en pro- cess, varur följer att en ökad driftsstabílitet medför att en större mängd produkt totalt kan produceras ur en viss mängd enzym, vilket helt uppenbart är ytterst betydelsefullt.

Några ansatser till förändring av ett enzyms egenskaper finns redan dokumenterade. Det är t.ex. välkänt att man QGHON aÜÜ_k0Va1e9t binda lösligt dextran, polyetylenglykol eller dylikt, aktiverade med BrCN eller HIOÄ, t.ex. i vissa fall kan uppnå förbättrade sta- bilitets-, aktivitets- eller löslighetsegenskaper. På samma sätt är mikromiljöeffekter kända, vilka uppstår vid immobilisering av enzymer till olika bärarmaterial. I det senare fallet har man t.ex. kunnat iaktta förskjutna pH-optima vid immobilisering till elektro- statiskt laddade polymermaterial, liksom även ändrade stabilitets-, 10 20 25 30 35 40 7803732-2 U aktivitets-, löslighetsegenskaper, kinetiska parametrar m.m.

Föreliggande uppfinning bygger emellertid på en helt annan ' teknik för åstadkommande av förändrade egenskaper hos enzymer. Tek- niken enligt föreliggande uppfinning baserar sig på bindning av enzymet till en kemisk substans, som innehåller minst en hydrofob del och minst en funktionell del med hjälp av den hydrofoba interaktionen mellan enzymet och substansen ifråga, varigenom önskad förändring i enzymets produktivitetskinetiska egenskaper uppnås. Den aktuella substansen bringas härvid i kontakt med enzymet i ett polärt lösningsmedel under lämpliga betingelser, varvid substansens hydrofoba delar och enzymets hydrofoba regioner söker sig till varandra och samverkar till bild- ning av ett mycket stabilt enzymkomplex. Den funktionella delen av substansen är ej i första hand avsedd att åstadkomma bindningar till onzynot utan kan därför utnyttjas helt vller dfllvín i nvuutt syfte, dvs. att påverka enzymets egenskaper I riktning mot förbättrad pro- duktivitetskínetik.

Den föreslagna tekniken erbjuder många fördelar. rell och kan användas för introduktion av de flesta funktionella grupper på enzymer med olika typer av katalytisk aktivitet. Tekni- ken är vidare skonsam mot enzymet, eftersom den specifikt riktar sig mot utnyttjning av proteinets hydrofoba strukturer, vilka ofta ej är direkt involverade i den katalytiska aktiviteten. Tekniken är mycket enkel och därmed även billig men ändå tillräckligt effektiv för att en tillräckligt stark bindning av substansen till enzymet skall erhållas, Tekniken är även lätt att tillämpa i praktiken med anledning av att ett flertal användbara substanser med olika typer av funktionella grupper finns kommersiellt tillgängliga.

Föreliggande uppfinning avser sålunda åstadkommande av ett lös- Den är gene- lígt enzymkomplex fö1_användníng_ vid enzymatiskt katalyserade pro- cesser. I detta enzymkomplex är enzymet bundet till en Substans; som innefattar minst en hydrofob del för åstadkommande av bindningen och minst en funktionell del för modifiering av enzymets produktivi- tetskinetiska egenskaper. I föreliggande sammanhang avses med sub- stansens "hydrofoba del" en struktur som har förmåga att med enzymet ifråga bilda ett för praktisk användning stabilt komplex. Den hydro- foba delen bör, för att man skall uppnå önskad effektivitet i den hydrofoba interaktionen med enzymproteinet men ändå erhålla en för enzymet tillräckligt skonsam inbindning, innehålla minst ett struktur- element av en rak eller grenad, mättad eller omättad, alkyl eller cykloalkylkedja med mellan 6 och 12 kolatomer. Företrädesvis utnytt- 10 15 20 25 30 35 Ä0 7803732-2 jas en mättad, rak alkylkedja med 8 kolatomer.

Substansens funktionella del kan utgöras av vilken som helst struktur som har förmåga att förläna enzymkomplexet sådana egen- skaper som innebär en modifiering eller förändring av det fria Den funktionella delen i substansen har i föreliggande uppfinning en operationell karaktär och måste därför på detta sätt ges en operationell definition i mot- enzymets ursprungliga produktivitetskinetik. sats till ovanstående strukturmässiga beskrivning av den hydrofoba delen i substansen. Exempel på olika principiella strukturer hos den funktionella delen, som leder till en viss typ av förändring av de produktivitetskinetiska egenskaperna, beskrives närmare under de separata avsnitten nedan, vilka behandlar förskjutning av pH-optimum, förbättring av stabilitetsegenskaper, förändring av katalytisk aktivitet etc.

Det är känt, att hydrofob interaktion mellan ytaktiva substanser och proteiner kan ske under vissa betingelser under utbildning av ett komplex, där mängdförhållandena ytaktiv substans till protein, strukturen hos och koncentrationen av den förra, jonstyrkan i lös- ningen, temperaturen etc., bestämmer graden av inbindning av ytaktiv substans, konformationen hos proteinet i komplexet etc. lativt liten tillförsel av ytaktivt ämne kan till vissa proteiner med hydrofoba ytstrukturer en specifik komplexbildning ske, där ofta Vid en re- även jonbindningseffekter bidrar. Denna komplexbildning utgör snarare undantag än regel för proteiner i allmänhet. Vid en ökning av mäng- den ytaktiv substans uppnås, för flertalet ämnen och för i princip alla proteiner, vid en viss koncentration en kooperativ inbindning, där det slutliga komplexet kommer att bestå av en relativt stor mängd substans bundet till proteinet ifråga. Denna typ av inbindning är generell och tillämpbar på i princip alla proteiner. För främst icke joniska ytaktiva substanser kan i vissa fall en relativt stor mängd substans ingå i komplexet utan att bindningen sker kooperativt.

Om koncentrationen av ytaktivt ämne ökas ytterligare uppnås den kri- tiska micellbildningskoncentrationen (CMC), där micellbildning av den ytaktiva substansen konkurrerar med inbíndning av substansen till proteinet ifråga.

Genom uppfinningen åstadkommes även ett förfarande för framställ- ning av det ovan beskrivna enzymkomplexet, och vid detta förfarande sammanföres det aktuella enzymet med en kemisk substans innefattande hydrofoba och funktionella delar i ett polärt lösningsmedel till bildning av önskat enzymkomplex. Vid framställningen bör koncentra- tionsområdet väljas så, att en tillräckligt stor mängd av substans lb 15 20 25 30 55 HO '7803732-2 bindes till enzymet, för att dess produktivitetskinetiska egenska- per skall kunna förändras i önskad grad, men samtidigt micellbíld- ning av substansen undvikes. Micellbildningen innebär oftast inte något hinder för komplexets utbildning, men medför ett onödigt slö- seri med substans, som inte utnyttjas för avsett ändamål. Före- trädesvis bör därför koncentrationen av substans ligga över gränsen för kooperativ inbindning om sådan kan ske, men under CMC. Inducering av komplexbildningen kan i vissa fall ske genom svag uppvärmning av reaktionsblandningen, alternativt genom tillsats av en mindre kvan- titet denaturerande ämne, t.ex. urea.- Det bildade enzymkomplexet kan antingen användas direkt i den erhållna lösningen eller kan om det är önskvärt isoleras och tillvaratas.

Enzymer kan, beroende på den typ av reaktion som katalyseras, systematiskt indelas i följande sex huvudgrupper: Oxidoreduktaser, hydrolaser, inomeraser, trunnfvraser, lyuser och ligaser. Eftersom dvn i förwlïmmundu uppfinning beskrivna hydrnfobn knmpluxhildningen är generell, och således gär att tíllämnu på i princip alla proteiner, är den även generellt användbar för att modifiera de produktivitets- kinetiska egenskaperna hos alla enzymer. De för praktiskt bruk ut- nyttjade enzymtyperna kan emellertid nära nog uteslutande systematiskt inrankas i någon av grupperna oxidoreduktaser, hydrolaser eller iso- meraser, varför uppfinningen bedömes få störst värde för enzymer till- hörande någon av dessa grupper.

Nedan anges kortfattat några olika tillämpningar av tekniken enligt föreliggande uppfinning, vilka emellertid ingalunda får be- traktas såsom inskränkande. Dessa tillämpningar avser endast att något mera konkret belysa uppfinningens användbarhet.

Förskjutning av ett enzyms pH-optimum Ändring av enzymers pH-optima är av stort tekniskt intresse ge- nom att man härigenom kan genomföra t.ex. flera enzymreaktioner simul- tant med de fördelar detta innebär i form av tidsvinst, fördelaktig enzymkinetik med lägre energiåtgång etc., eller för att man skall kunna genomföra en enzymatisk process vid ett pH-värde, där risken för mikrobiell infektion är mindre eller där konkurrerande reaktioner är mindre uttalade. Genom att i komplexform i enzymets omedelbara närhet introducera anjoniska grupper sker en attraktion av vätejoner från omgivande medium vid låg jonstyrka, varvid ett lokalt vätejon- överskott erhålles i den mikromiljö där enzymet verkar. En skenbar förhöjning av enzymets pH-optimum kan då uppmätas i ytterlösningen där substrat och reaktionsprodukter finnes. På motsvarande sätt kan 10 15 25 30 35 HO 7 7803732-2 en sänkning av pH-optimet åstadkommas genom introduktion av katjoniska grupper.

Med den aktuella tekniken kan denna modifiering lätt genomföras genom att man i det förra fallet behandlar enzymet med exempelvis natriumoktylsulfat, kaprylsyrans natriumsalt, kaliumhexylsulfonat eller liknande, medan i det senare fallet t.ex. decyltrimetylammonium- bromid, dietylhexylamin, oktylammoniumklorid eller liknande kan ut- nyttjas. Den hydrofoba delen i den använda substansen väljes med hänsyn till bl.a. nödvändig bindningsstyrka, enzymstabilitet etc., medan den funktionella delen, dvs. den an- eller katjoniska gruppen, tillsammans med koncentrationsförhållanden och dylikt vid behand- lingen avgör den förändring i enzymets nettoladdning som erhålles och därmed graden av pH-förskjutning, som på grund av den ändrade mikromiljön blir följden.

Den ovan beskrivna principen kan även tillämpas för att för- skjuta ett enzyms isoelektriska punkt samt för att förändra kine- tiska parametrar, såsom Michaelis konstant, inhibitorkonstant etc., genom att affiniteten på motsvarande sätt komer att ändras gentemot elektrostatiskt laddade substrat, inhibitorer etc.

Förbättring av ett enzyms stabilitetsegenskaper Vid praktiskt utnyttjande av enzymer, speciellt immobiliseradc sådana, är driftsstabiliteten nära nog alltid den avgörande faktorn, som bestämmer huruvida ett visst enzym går att tekniskt och eko- nomiskt utnyttja i en viss process. Enzymer kan förstöras vid an- vändningen som en följd av olika mekanismer t.ex. termisk denature- ring, inhibering från vissa substratkomponenter som tungmetaller etc., nedbrytning som en följd av mikrobiologiska angrepp etc. Det är känt, att vissa ämnen, ofta av kolhydratnatur, ibland har en stabiliseran- de inverkan på enzymet gentemot termisk denaturering, som exempelvis dextran, stärkelse, læmos, sackaros, polyetylenglykol etc. sätt är det känt att protein-protein interaktionen, vid tillsats av På samma ett externt protein till ett enzym i lösning, ofta verkar stabiliseran- de på enzymstrukturen. Med hjälp av olika komplexbildare, såsom etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller sulfhydrylgruppsinnehållande de föreningar, såsom cystein, glutation etc., kan man stabilisera ett enzym gentemot inhibering på grund av olika tungmetaller. Olika bakeriecider som antibiotika, natriumazid etc. kan på motsvarande sätt minska risken för bakterieangrepp på enzymet, och verkar därmed stabiliserande på enzymets katalytiska förmåga.

Under utnyttjning av tekniken enligt föreliggande uppfinning kan 10 15 20 50 35 HO '7803732-2 stabiliserande ämnen av t.ex. ovan nämnda slag introduceras i enzym- strukturen med hjälp av hydrofob interaktion. Den använda substansens funktionella del utgöres därvid av exempelvis någon av ovan nämnda strukturer medan den i uppfinningen aktuella hydrofoba delen utgöres av en struktur, i enlighet med vad som tidigare beskrivits, som är kemiskt bunden till den funktionella delen ifråga. Exempel på sub- stanser som kan utnyttjas för att förbättra stabilitetsegenskaperna hos enzymer enligt föreliggande uppfinning är oktyldextran, hexyl- sackaros, oktylpolyetylenglykol, decylglutation, hexyltiol, oktyl- EDTA, fenylcystein etc.

Förändring av ett enzyms katalytiska aktivitet Den katalytiska aktiviteten hos ett enzym är naturligtvis den mest centrala faktorn bland de egenskaper, som enzymet uppvisar, och det praktiska värdet av en förhöjning av den katalytiska förmågan inses lätt. nffinitet gentemot olika substrat vara önskvärd.

I speciella fall kan även en förändring av enzymets Generella metoder ntt åstadkomma vn riktad Förändring i Form av exempelvis en aktivi- tetsförhöjning kan inte formuleras, utan lämpliga åtgärder måste bedömas från fall till fall och anpassas till varje enskilt enzym beroende på det aktuella substratet, eventuella inhibitorer etc. Där- emot kan olika åtgärder av den typ som beskrivits under ovan angivna tillämpningar på olika sätt ändra aktiviteten och specificiteten hos ett enzym till följd av ändrad laddningsfördelníng, löslighet, yt- struktur etc. På detta sätt kan ett enzym exempelvis skyddas mot en makromolekylär inhibitor, till förmån för ett lågmolekylärt sub- strat, genom att den funktionella delen enligt ovan utgöres av en polymer som steriskt blockerar enzymets yta från ínhíbitorns angrepp.

Introduktion av en förening, vars funktionella del är elektrostatiskt laddad, kan på motsvarande sätt attrahera ett substrat med motsatt laddning, så att aktiviteten gentemot detta selektivt förhöjs. Om den funktionella delen som introduceras är kraftigt hydrofil kan enzymets vattenlöslighet ökas och därmed samtidgt affiniteten gentemot speciellt hydrofila substrat förhöjas. Genom tekniken enligt före- liggande uppfinning erhålles ett praktiskt användbart medel för åstad- kommande av rubr. förändring och uppfinningen innebär därigenom en väsentlig berikning av ifrågavarande teknik.

Uppfinningen kommer i det följande att belysas ytterligare genom konkreta utföringsexempel, varvid exempel l avser illustration av framställningen av vid uppfinningen användbara kemiska substanser. 10 15 25 30 35 UO vaozvsz-2 EXEMPEL 1 Framställning av hexyl- respf decyldextran Dextran (T 10 resp. T 500 från Pharmacia) (200 mg) upplöses i 2 M NaOH (20 ml), varefter 1-bromhexan (1,0 ml) resp. 1-bromdecan (1,0 ml) tillsättes. Blandningen skakas kraftigt vid 7000 under 12 timmar, varefter den neutraliseras med 2 M HC1. centrifugering frånskiljes den organiska fasen.

Efter kortvarig Vattenfasen dialy- seras mot destillerat vatten i två dygn vid rumstemperatur, varefter lösningen frystorkas och hexyldextran resp. decyldextran tillvara- tages.

EXEMPEL 2 Förbättring av driftstabiliteten hos xylosisomeras immobiliserat till DEAE-cellulosa En lösning av xylosisomeras i 0,02 M tris-HC1-buffert (pH 8,5) (10 ml; 20 mg/ml) försättes med hexyldextran (T500) (1,0 g), varefter lösningen skakas vid rumstemperatur under tre timmar. Det bildade enzym-dextrankomplexet adsorberas därefter på DEAE-cellulosa (Whatman DE-52) (1,0 g) genom att cellulosan sättes till den enligt ovan beredda enzymlösningen under försiktig omblandning, vilken upprätt- hållas under 2 timmar vid rumstemperatur. Det härvid erhållna im- mobilíseradu enzymdextrankomnlexet packas därefter i on kolonn (0 9 mm), varefter en substratlösning av glukos i 0,02 M tris-HCl- buffert (pH 8,5) (N0% vikt/vikt), som är 0,N mM med avseende på MgS0u . 7H20, pumpas kontinuerligt genom kolonnen vid 60°C. Flödet genom kolonnen regleras kontinuerligt så, att omsättningsgraden med avseende på bildad fruktos hålles konstant vid HU%. Det immobili- serade enzymdextrankomplexet uppvisar härvid en halveringstid av 30 dagar med en total produktivitet av 18,7 g fruktos per mg enzym räknat som förhållandet mellan bildad mängd fruktos'och utnyttjad enzymmängd tills enzymet uppvisar 25% av sin initiala aktivitet. I ett referensförsök visar det sig att motsvarande siffror för icke hexyl- dextranbehandlat enzym är 8 dagar resp. U,3 g fruktos per mg enzym.

EXEMPEL 3 Förbättring av värmestabiliteten hos pullulanas En lösning av pullulanas i 0,05 M fosfatbuffert (pH 7,0) (2,0 ml; 5,0 mg/ml) försättes med deuyldextran (TIO) (100 mg), varefter lös- Det bildade enzym- ningen skakas vid rumstemperatur 1 17 timmar. dextrankomplexet isoleras genom gelfíltrering (Sephadex G 200) i ovannämnda buffertlösning. Eluatet spädes till exakt 10 ml, varefter enzym-dextrankomplexlösningen upphettas i kokande vattenbad under 5 10 15 20 25 _ 30 35 7803732-2 10 minuter. Lösningen får stå i rumstemperatur i 30 minuter, varefter kvarvarande enzymaktivitet bestämmes. parerat_enzym behandlas på samma sätt.

En referenslösning av opre- Enzym-dextrankomplexet upp- visar före värmebehandlingen en aktivitet motsvarande 80% av den ur- sprungligen tillsatta enzymmängden, medan 95% av denna kvarvarande aktivitet kvarstår efter värmebehandlingen. varande aktivitet efter motsvarande behandling är endast l7%.

EXEMPEL U Förskjutning av pH-optimet hos amyloglukosidas resp. xylosisomeras En lösning av amyloglukosidas i 0,1 M fosfat-citratbuffert (pH U,5) (5,0 ml; 8 mg/ml) som är 0,5 M med avseende på NaCl för- Säfifieß med en lösning av natriumoktylsulfonat i destillerat vatten Referensprovets kvar- (1,0 ml; H0 mg/ml), varefter blandningen får stå under omröring vid rumstemperatur i 17 timmar. På motsvarande sätt behandlas en lös- ning av xylosisomeras i 0,1 M tris-H01-buffert (pH8,5) (5 ml; 8 mg/ml) som är 0,5 M med avseende på NaCl men med en lösning av oktyltrimetyl- De på detta sätt behandlade enzymberedningarna befrias från överskott av ytaktiva ämnen samt avsaltas genom gelfiltrering (Sephadex G 50) i en 0,05 M fosfatbuffert, pH 6,5. Den på detta sätt behandlade amyloglukosidas- beredningen uppvisar ett pH-optimum vid 6,1 jämfört med ü,5 för den ammoniumbromid i destillerat vatten (1,0 ml; U0 mg/ml). icke behandlade beredningen. Xylosisomeraset, vars optimum för det natíva enzymet ligger vid pH 8,5, uppvisar på motsvarande sätt efter behandlingen optimal aktivitet vid pH 7,1.

En 4% stärkelselösning beredes genom att man suspenderar nativ potatísstärkelse (20 g) i dcstïllerat vatten (500 ml), varefter sus- pensionen kokas under kraftig omröríng i 60 minutvr. Stüvkvlselösninn- en kyles Snabbt till 600C, göres 0,0 mM med avseende på MgSOu . 7 H20 samt försättes omedelbart med på ovanstående sätt behandlade ensym- lösningar i 0,05 M fosfatbuffert (pH 6,5) (lO ml) av vardera, samt en lösning av 5!-amylas i samma buffert (l0 ml; 2 mg/ml). Bland- ningen inkuberas vid 6000 och pH 6,5 under omröring och bildad fruk- tos som funktion av tiden uppmätes genom regelbundna analyser. Ett referensprov berett på samma sätt men med obehandlade enzymbered- ningar inkuberas och analyseras parallellt. Inkubationen får fort- skrida till dess att utbytet av fruktos baserat på ingående stär- kelse uppnår 30%, vilket i det förra fallet (behandlat enzym) tar 6,5 timmar i anspråk, medan motsvarande tid i det senare fallet (obe- handlat enzym) är 18 timmar. 10 15 20 vaozvsz-2 ll EXEMPEL 5 Höjning av Ki för trypsin gentemot trypsininhibitorn i sojaböna En lösning av trypsin i 0,05 M fosfatbuffert (pfl 7,6) (2,0 ml; 5 mg/ml) försättes med decylpolyetylenglykol (50 mg), varefter bland- ningen skakas i 20 minuter vid ü°C. Inhibitorkonstanten Kí gentemot trypsininhibitorn i sojaböna bestämmes härefter för det decylpoly- etylenglykolbehandlade enzymet genom att man bestämmer enzymaktivi- teten gentemot N-bensoyl-argínin-etylester (BAEE) i närvaro av olika inhibitorkoncentrationer och jämföres med ett referensprov som under motsvarande betingelser behandlats med icke modifierad polyetylen- glykol. Kí befínnes i det förra fallet vara :>50 mg/ml medan mot- svarande värde i det senare fallet är 2,2 mg/ml.

EXEMPEL 6.

Sänkning av Km för trypsin gentemot BAEE En lösning av trypsin i 0,05 M fosfatbuffert (pH 7,6) (2,0 ml; 50 mg/ml) 0,5 M med avseende på NaCl, försattes med en lösning av natriumdecylsulfonat i destíllerat vatten (U,0 ml; 25 mg/ml), var- efter blandningen skakas under 5 minuter vid NCC. Enzymet befrias därefter från icke bundet natriumdecylsulfonat samt salter genom gelfiltrering (Sephadex G 50). Det på detta sätt behandlade en- zymets aktivitet vid olika koncentratíoner av N-bensoyl-arginin- etylester (BAEE) bestämmes därefter, varigenom Km BAEE kan beräk- nas. Km BAEE befinnes vara 0,52 mM medan motsvarande värde för det icke behandlade enzymet är ü,} mM.

Claims (5)

7803732-2 12 Patentkrav.

1. Förfarande för utförande av en enzymatisk process, k ä n n e t e c k n a t därav, att det utföres under användning av ett enzym, som föreligger i form av ett lösligt komplex, vari enzymet genom hydrofob bindning är bundet till en substans, som innefattar minst en (l) hydrofob del och minst en (l) funktionell del för modifiering av enzymets produktivitetskinetiska egenska- per.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att modifieringen innebär förskjutning av enzymets pH-optimum.

3. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att modifieringen innebär förändrade värden på Michaelis konstant (Km) eller inhibitorkontanten (Ki).

4. Förfarande enligt krav l, k ä n n e t e c k n a t därav, att modifieringen innebär förändrade stabilitetsegenska- per hos enzymet. 7

5. Lösligt enzymkomplex för användning vid förfaran- det enligt något av kraven l-4, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar ett enzym, som genom hydrofob bindning är bundet till en substans, som innehåller minst en (1) hydrofob del och minst en (1) funktionell del för modifiering av enzy- mets produktivitetskinetiska egenskaper. ANFÖRDA PUBLIKATIONER: Methods in Enzymology Vol. XLIV, Immobílized Enzymes, Ed. K. Mosbuch, N.Y., 1976, p. 357-8, 397-403,- 406-409, 438 Pharmncías broschyr: Octyl-Sephurose Cl-4B, Éhenyl-Sepharose Cl-4B, For hydrophobíc intergction chromutogrophy, June 1976-1, Uppsala, Sverige, särskilt p 1. _