DE2120438A1 - Verfahren zur Verbesserung'der Eigenschaften von Isoamylasen (Alpha-1,6glukosidasen) - Google Patents

Verfahren zur Verbesserung'der Eigenschaften von Isoamylasen (Alpha-1,6glukosidasen)

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DE2120438A1 DE19712120438 DE2120438A DE2120438A1 DE 2120438 A1 DE2120438 A1 DE 2120438A1 DE 19712120438 DE19712120438 DE 19712120438 DE 2120438 A DE2120438 A DE 2120438A DE 2120438 A1 DE2120438 A1 DE 2120438A1
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Description

Ken Hayashibara 26. April I97I
Okayama / Japan SJ/Hu
kho 7153
Verfahren zur Verbesserung der Eigenschaften von Isoamylasen (Alpha-1,6-glukosidasen)
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Eigenschaften von Isoamylasen (Alpha-1,6-glukosidasen), insbesondere zur Erhöhung der Hitze- "und pH-Stabilität sowie der optimalen Wirkungstemperatur von durch Kultivieren von Stämmen der Actinomycetes-Gattungen erhaltenen Enzymlösungen.
Die bekannten Enzyme, welche die Alpha-1,6-glukosidbindungen von Stärke zersetzen, umfassen im allgemeinen die aus Hefe erhaltene Isoamylase, die mittels Aerobacter aerogenes bereitete Pullulan£se und die aus Pflanzenquellen gewonnenen R-Enzyme, Die HitzeStabilität dieser Enzyme ist verhältnismäßig niedrig: die optimalen Temperaturen ihrer Wirkungsbereiche liegen zwischen 50 und 5O0G; um i?O°O ist der Inaktivierungsgrad der Enzyme im Laufe verlängerter Einwirkungen bereits recht hoch.
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_2_ 2120433
Dementsprechend ist es notwendig, zwecks Verhütung einer Inaktivierung, den Stärkeabbau bei einer Temperatur unterhalb 500G durchzuführen. In diesem Falle ist aber die Reaktionsgeschwindigkeit gering, die ihrerseits gegebenenfalls eine Verlängerung der Reaktionsdauer zur Folge hat; letztere kann zusätzlich eine durch andere Bakterien verursachte Verunreinigung bewirken. Diese Umstände stellen ein starkes Hindernis für die industrielle. Verwertung solcher Enzyme dar.
Im Verlauf von Untersuchungen zur Auffindung von Isoamylasen mit günstigerer Wirkungsweise wurden die Hitze- und pH-Stabilitäten verschiedener Enzyme, die mittels einer Anzahl von Actinomyceten-Stämme bereitet wurden, geprüft. Hierbei setzte man den isolierten Kulturen der Actinomyceten-Stämme Nr.250,295, 734- und 657 eine 2/1,000 M-Lösung von A'thylendiamintetraacetat (abgekürzt EDTA) zu, wodurch die in den Gemischen vorliegenden Metallionen blockiert wurden. Die Prüfung der Aktivität derart behandelter Enzyme ergab, daß jene nur noch 34,5% derjenigen unbehandelter Enzyme betrug.
Nach Auffindung der starken Wirkungen von Metallionen-Zusätzen wurde die Einwirkung von Metallsalzen, wie MgSO^, CaCX-,, Ga= (OGOCH7)2, Fe^SO4, ZnSO4 und BaGl2, auf die Enzymaktivität untersucht. Zu diesem Zweck wurden durch 24-stündige Dialyse der Enzymlösungen gegen 1/1,000 M-EDTA-Lösung Fraktionen bereitet, einigen der letzteren verschiedene Metallionen in einer Konzen-
1 8 98 4 8V 1 709
tration von etwa 5 mM je 0,5 ml Enzymlösung zugegeben und diese 1 h bei 5O0C inkubiert; die metallfrei gebliebenen Fraktionen inkubierte man bei 400C. Die Ergebnisse der Bestimmung aer übriggebliebenen enzymatisehen Aktivität zeigt die Tabelle 1.
Tabelle I
wirkung von		 Metallionen auf die Enzymaktivität. Relative
Aktivität
% 		1 h Behandlung
400C		 Relati
ve Akti
vität % 		bei
50		 0C
Hetallealz-
Zusatx		 Halten bei 500C 115,7 Einhei
ten
E/ml		 106,0 Ein
hei
ten
E/ml		 Rela
tive
Aktivi
tät %
Einhei
ten
E/ml		 102,0 15,7 95,6 14,5 98,0
CaCl,,
C. 		17,6 9S,9 14,2 82,7 14,8 100,0
Oa(OuOCH,) ο 15,6 86,4 12,3 75,0 0,9 6,1
MgSO^ 15,1 120,0 11,1 64,2 0,3 2,1
13,2 32,4 9,8 2,0 2,6 1|7
ZnS(Xj- 18,4 107,2 0,3 93,9 O O
GuSO 5,0 Ί00 13,9 95,5 1,0 6,8
BaCl-, 16,4 — 14,1 100,0 2,4 15,9
kein Zusatz 15,5 14,8 14,8 100,0
unbehandelt
Wie aus der Tabelle zu ersehen, verblieb bei den mit den Calcium salzen GaCIp und Ca(OCOCH )^ versetzten Enzymlösungen eine nahezu 100%ige Aktivität, wogegen bei den Metallsulfate enthaltenden Fraktionen die Aktivität weitgehend (bei CuSO^ sogar
109848/1709
BAD ORIGINAL
vollständig) verloren ging, während die metallionenfreie Fraktion nur eine Aktivität von rund Λ6% aufwies. Demnach werden Actinomycetes-Stämme überraschenderweise ausgesprochen selektiv durch Galciumionen stabilisiert. Die optimal zuzusetzende Me tall salzmenge beträgt etwa 5 nJM· Es wurde aber gefunden, daß auch bei Anwendung von 0,5 mM Metallsalz noch eine Aktivität von etwa 80% verbleibt. Somit ergibt sich, daß auch Konzentrationen unterhalb etwa 5 mM an Metallsalzen wirksam sind.
Hieraus ergibt sich, daß die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst wird, daß man den aus Stämmen der Actinomycetes-Gattungen erhaltenen Enzymlösungen durch Zugabe wasserlöslicher Oalciumsalze Calciumionen einverleibt.
Als Oalciumsalz wendet man vorzugsweise Calciumacetat und Calciumchlorid an.
Der Galciumsalzzusatz bewirkt nicht nur die Erhaltung der enzymatischen Aktivität, somit die Enzym Stabilität, sondern erhöht auch das Temperaturoptimum der Wirksamkeit und verbreitert damit den Bereich der Hitzestabilität.
Zum Nachweis dessen wurden sechs typische Enzymlösungen( erhal-, ten mittels folgender Bakterien:
1) Isoamylase bildenden Actinomycetes-Stämmen wie Nr. 250
109848/170
2) Streptomyces diastatoehromogenes (IFO 3337)
3) Nocardia asteraides (IFO 3384)
4) Micromonospora meranospora (IFO 12515)
5) Thermomonospora viridis (IFO 12207)
6) Micromonospora echinospora (IFO 12574),
zunächst gegen EDTA und destilliertes Wasser dialysiert und dann entionisiert und hierauf die Wirksamkeit yon 5 m Mol CaI-ciumionen (je 0,5 ml Enzymlösung) in Form von Calciumacetat auf den Hydrolysegrad innerhalb einer Stunde bei verschiedenen Temperaturen unter Benützung einer 1%igen Pullulanlösung als Substrat bestimmt.
Die Ergebnisse steigt·*» daß die optimale Temperatur für den Enzymstamm Nr. 250 ohne Calciumionenzusatz 500O betrug und diese Temperatur die obere Grenze war, wogegen durch Zusatz von Oalciumionen die optimale Temperatur sich um 5 bis 10°0 auf 55 bis 60°0 erhöhen ließ.
Andererseits beobachtete man, nachdem die Enzyme - mit oder ohne Zusatz von Oalciumionen - beim pH 5»5 und bei verschiedenen Temperaturen 1 Stunde behandelt waren, die HitzeStabilität der Enzyme durch Bestimmung ihrer Hydrolysegrade nach einer zusätzlichen einstündigen Behandlung bei 40°0.
Die beiliegenden Kurvendiagramme (Fig. 1 bis 4) zeigen die Ergebnisse der Messung der relativen Aktivität in Abhängigkeit vom pH und der Temperatur und zwar einerseits die Aktivität
1098A8/1709 '"6
von Actinomycetes-Enzym in. An- oder Abwesenheit von Calciumionen (Ca++) und zum Vergleich derjenigen des Enzyms von Aerobacter aerogenes.
Die Kurven gemäß Figur 1 und 2 veranschaulichen die optimalen pH-Werte sowie die Änderung der Enzym Stabilität bei Anwesenheit von Oalciumionen, die Kurven gemäß den Figuren 3 und 4-dagegen die optimale Temperatur sowie die Änderung der Hitze- \ Stabilität der Enzyme durch Zusatz von Calciumionen.
Die in Figur 1 wiedergegebenen Versuche erfolgten durch eine einstündige Behandlung der Enzymlösungen bei 3O°C} diejenigen nach Figur 2 dauerten 30 Minuten. Figur 1 zeigt, daß die restliche Aktivität durch Calciumionen maximal von 90 auf 100% erhöht wird} gleichzeitig wird der pH-Stabilisierungsbereich auf 2,0 bis 6,0 erweitert im Vergleich zum Bereich von 5»O bis 6,0 im Falle der Abwesenheit von Calciumionen. Figur 2 zeigt demgegenüber keine wesentliche Änderung der optimalen pH-Bereiche.
Wie aus Figur 4 zu ersehen, werden die Enzymaktivitäten bei Calciumionen-Abwesenheit zwischen 4-0 und 50°G inaktiviert, wogegen dies bei Zusatz von Galciumionen erst zwischen 50 und 600C erfolgt; die Hitzebtabilität erhöht sich somit um etwa 100C.
Zusammenfassend ergibt sich, daß be. Actinomycetes-Enzymen durch Zusatz von Calciumionen die pH-Stabilität sich um etwa erhöht und der Stabilitätsbereich sich stark erweitert.
...7 109848/170 9
Entsprechend verhielten sich die oben genannten 5 anderen Enzymarten.
Bei allen Beispielen und Versuchen handelt es sich, soweit nicht anders angegeben, um Gewichtsprozente bzw. Gesiehtsteile,
Bestimmung der Enzymaktivität.
Die Reaktionsmischungen bestanden aus:
1%ige Pullulan 1,0 ml
Pufferlösung vom pH 5»5 0,5
Enzymlösung 0,5 ml.
Die Umsetzung wurde in 1 h bei 40° 0 durchgeführt.
Das benutzte Pullulan gewann man durch Kultivierung und dessen Lösung dialysierte man 2 Tage gegen destillierte Wasser in einem Kühlapparat.
Die verwendete Pufferlösung enthielt M/10 Natriumacetat und M/5 Essigsäure.
Die angewandten Enzymlösungen bestanden aus der überstehenden Lösung, die beim Schleudern der Kulturbrühen erhalten waren und von denen 0,5 ml zu 2,0 ml der Pufferlösung zugesetzt wurden .
Je 0,5 ml-Fraktionen der Beaktionsmischungen wurden bei Reaktionsbeginn und 1 h danach entnommen, worauf man die Reaktion
...8 109848/1709
·■" \j "™* ,
durch Einrühren der Fraktionen in eine Kupfer (II)-Reagenzlösung gemäß der Somogyi-Nelson-Methode beendete (vgl. J.Biol. Ghem. ^160/194-5, 61; Kagaku-no-Eyoiki (Japan.) J?V1958, 27-JO). Entsprechend dieser Methode vermischte man die 0,5-Fraktionen mit einem Gemisch von 1 ml der Kupferlösung und 0,5 ml Wasser, erhitzte die Mischungen 10 min bei 1000C in durch eine Glaskugel verschlossenen Probierröhrchen, kühlte dann diese 5 min mit fließendem Wasser und setzte 1 ml der NeIson-Reagenzlösung W und hierauf 5 ml Wasser zu.
Sodann schleuderte man aus den beiden Mischungen in 5 min das gefällte Pullulan bei 5000 U/min ab und prüfte die überstehenden Flüssigkeiten kolorimetrisch bei 520 mu. Die Ergebnisse drücken die Differenz der Schwärzungsextinktionen (optical density absorbancies) zwischen den oben genannten beiden Fraktionen aus. Als Isoamylase-Einheit wurde die Erhöhung der Extinktion um 0,100 durch einstündige Inkubation bei 40°C bestimmt.
Beispiele:
Angewandt wurden die oben angegebenen Enzym stamme 2) bis 6) bei der KuIturtemperatür von 500O (IFO 12207 bei 400O). Das Kulturmedium vom pH 7»0 enthielt:
lösliche Stärke 2,0%
Polypeptone 1,5%
Hefeextrakt 0,5%
NaGl 0,5%
K2HPO4 0,02%
FeSO, .7H2O 0,0ü;!%.
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In diesem zuvor sterilisierten Medium inokulierte man jeden der Enzymstämme 72 bis 96 h unter Schütteln und Belüften. Die als Enzymlösungen verwendeten überstehenden Flüssigkeiten wurden zuerst gegen 1/1000 M-EDTA-Lösung und dann gegen Wasser zwecks Entionisierung dialysiert, worauf man Calciumacetat bis zur Konzentration von 5 m Mol zusetzte.
A). Optimale Temperatur und HitzeStabilität.
Eine Lösung, enthaltend 1 ml 1%iges Pullulan und 0,5 ml 0,2 M-Acetatpufferlösung vom pH 5»5> vermischte man mit 0,5 ml Enzymlösung und setzte dann 5 mJM Oalciumacetat zu. Nach 1 h Inkubation wurden die Hydrolysegrade von Pullulan nach der Somogyi-Nelson-Methode durch Messung der Schwärzungen bestimmt und die Stabilitätswerte mit der relativen Aktivität in Gegenwart der Substrate verglichen. In Tabelle II sind die mit Actinomycetes-Stämmen Nr. 250 für optimale Temperaturen erhaltenen V/erte zusammengestellt, während auf den Figuren 3 und diese Werte mit den unter den gleichen Bedingungen mit der aus dem Stamm Aerobacter aerogenes gewonnenen Pullulanase verglichen sind.
Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß die Stämme Nr. 250 ihr' Maximum an HiiüzeStabilität bei Anwendung von Pullulan als Substrat zeigen. Der in Figur 3 veranschaulichte Vergleich jener Hitzestabilitätswerte mit den Werten, die bei Einwirkung der Enzyme ohne Zusatz von öalciumionen auf Pullulan und der aus
109848/1709 ...10
Tabelle II
Optimale Temperaturen für Actinomycetes-Stämme Sr. 250.
Temperatur
• 0G		 B e f Schwärzung Mittel Relative
Aktivität
in %
30 O ,158 u η d e 0,155 26,8
35 O ,216
•		 0,152 0,216 37,3
40 O ,310 0,216 0,305 52,6
45 O ,420 0,300 0,408 70,5
50 O ,574 0,395 0,568 98,2
55 O ,593 0,562 0,569 100
60 O ,562 0,565 0,569 98,3
65 O ,210 0,575 0,217 37,5
70 O ,036 0,224 0,041 6,9
75 O ,020 0,046 0,017 2,9
0,013
Aerobacter aerogenes gewonnenen Pullulanase auf Pullulan erhalten werden, zeigt, daß die optimale Temperatur für Pullulanase zwischen 47 und 50°0, wogegen jene für die Caleiumionen enthaltenden Stämme Nr. 250 um 10°C höher liegt. Darin ist ein großer Vorteil bezüglich der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Technik zu sehen.
Wie "bereits erwähnt, bewirkt die verlängerte Enzymumsetzung unterhalb 500G eine Verunreinigung durch andere Bakterien,
1Q9848/1709 ..."■
wodurch wesentliche Nachteile in den folgenden Arbeitsgängen auftreten. Dagegen verhütet die Erhöhung der Reaktionstemperatur um 1O°G die Verunreinigung fast vollständig und beschleunigt gleichzeitig den Umsetzungsgrad, wodurch die Reaktionsdauer verkürzt und die anzuwendende Enzymmenge verringert wird.
Zwecks weiterer Untersuchung der thermischen Enzymstabilität wurdendie mit 5 mJM Oalciumionen versetzten Enzymlösungen 1 h bei pH 5,5 und verschiedenen Temperaturen inkubiert. Nach schneller Kühlung der Reaktionsmischungen im Eisbad führte man die enzymatische Umsetzung in 1 h bei 400O durch und bestimmte die restlichen Enzymaktivitäten nach Somogyi-Nelson. Wie aus Tabelle III zu ersehen, bleibt die HitzeStabilität bei Abwesenheit von Substrat bis über 5O°C erhalten; die Aktivität wird erst bei 600C fast vollständig inaktiviert. Dagegen zeigt das Diagramm gemäß Figur 2, daß die Enzyminaktivierung bei Abwesenheit von Galciumionen bereits bei 4-00O beginnt und bei 5O°G vollständig ist.
In gleicher vfeise wurden die optimalen Temperaturen und die HitzeStabilität der oben genannten 5 Stämme der Actinomycetes-Gruppe geprüft. Die nachfolgende Tabelle IY zeigt, daß die Ergebnisse denjenigen der Stämme Nr. 250 ähnlich sind, indem das Temperaturoptimum um 5 bis 100G ansteigt und die Hitzestabilität sich entsprechend erhöht.
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!Tabelle III Hitzestabilität.
Temperatur
°σ 		S' chwärzung * Mittel Relative
Aktivität
in %
30 B e f u η d e 0,289 99,5
35 0,294 0,284 0,307 105,0
40 0,300 0,314 0,288 99,0
<*5 0,295 0,280 0,256 88,0
50 0,250 0,262 0,285 96,5
55 0,285 0,285 0,178 61,2
60 0,180 0,176 0,033 11,7
65 0,030 0,035 0,020 6,9
70 0,020 0,020 0,013 4,5
75 0,010 0,016 0,011 3,8
unbehandelt
bei 50°C		 0,012 0,010 0,291 100
0,290 0,291
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IY
Hitzestabilität und optimale Temperaturen.
Enzymstamm Optimale ÜJemperattiren in "0 35( HitzeStabilität in % ' mit
-Zusatz		 bei
j mit
rlonen-Zusatz		 85 ohne
Ca-Ionen		 50°ö 60°σ
ohne
Ca-		 85 y0 5O°ö 97 15
75 10 95 20
Streptomyces
diastatochro-
mogeiies		 45-50 80 0 95 10
Hocardia
asteroides		 48-52 80 5 97 10
Micromono-
spora
meranospora		 47-52 10 95 15
ÜJhermomono-
spora
viridis		 47-5O 5
Micromono-
spora
echinospora		 48-50 50-60
48-60
50-62
50-60
50-62
109848/1709
B). Wirkung der Calciumionen auf pH-Stabilität und optimale Temperaturen.
Zwecks Bestimmung der pH-Stabilität setzte man der Enzyinlösraig 5 m^K Oalciumacetat zu, "behandelte 1 Ii unter Zusatz von Pufferlösungen bei 3O0O, stellte das pH mit; 1 IT-HGl und 1 K-UaOH auf 5» 5 und prüfte gleiche Mengen mittels der oben angegebenen Methode auf ihre Aktivitäten.
Angewandte wurden folgende Pufferlösungen:
für pH 2,0- 3,5 0,2 H-MaOCOGH5 und HCl
3,5-6,0 0,2 M-FaOGOGH5 " GH3COOH
6,0-8,0 0,2 M-Ka2HPQ^ n FaH2PO4
8,0-10,0 0,1 M-H5BO5-ECl » Ma2GO5 .
daß Die in tabelle Y zusammengestellten Ergebnisse zeigen,/die
Stabilitäten oberhalb pH 8,0 stark abfallen» während sie im k Bereich von pH 2,5 bis 5»5 sehr hoch liegen. Bie Ergebnisse der mit und ohne Calciumionenzusatz geprüften Enzymlösungen, verglichen mit der Calciumionen nicht enthaltenden Pullulanase aus Aerobacter aerogenes, zeigt die Figur 1, - nämlich, daß die Erhöhung der Enzymaktivität durch Oalciumionen über 10^ beträgt und daß die gleichen Werte mit Pullulanase erzielbar sind.
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!Tabelle V
pH-Stabilität
pH Schwär
zung		 !
Relative
Aktivität
in#		 PH Schwär
zung		 Relative
Aktivität
in % 		pH i
r
t		 Schwär
zung		 Relative
Aktivität
in % 		pH 1
Schirär-
zung		 Relative
Aktivität
in %
2,0 0,398 96,6 3,5 0,420 104 6,0 ' 0,340 82,5 8,0 0,318 77,3
2,5 0,405 98,3 4,0 0,415 101 6,5 0,340 82,5 8,5 0,295 71,6
3,0 0,418 103 4,5 0,380 92,2 7,0 0,325 78,8 9,0 0,240 58,2
3,5 0,415 101 5,0 0,410 99,5 7,5 0,345 83,7 9,5 0,255 61,9
5,5 0,407 98,8 8,0 0,320 77,6 10,0 0,245 59,5
6,0 0,350 85,0
Die vorstechenden Ergebnisse zeigen die Entbehrlichkeit einer besonderen pH-Einstellung bei Zusatz von Calciumionen im Falle von Enzymen mit pH-Optimum zwischen 3 und 7 j wodurch die Lagerung der Enzyme wesentlich erleichtert wird.
Bezüglich der optimalen pH-Werte wurde kein wesentlicher Unterschied festgestellt. Die pH-Stabilitäten der genannten Actinomycetes-Stämme zeigen eine maximale Erhöhung von 10% und der die ™ gleiche Neigung zeigende Stabilitätsbereich ist bei pH-Werten von 3 bis 7 verhältnismäßig beständig.
Im allgemeinen weisen Isoamylasen (Alpha-1,6-glukosidasen) verhältnismäßig niedrige HitzeStabilitäten auf und erfordern eine Reaktionstemperatur unter 45°C. Wie vorstehend beschrieben, bewirken Calciumionen eine Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50 bis 600O sowie ermöglichen eine Erweiterung des pH-Stabilitätsbereichs. Entsprechend erhöhen sich bei der Reaktion von 600G die enzymatischen Aktivitäten auf das 5 bis 7fache. Darüber hinaus begünstigt die Erniedrigung der Enzymmengen in den Fraktionen und die Verkürzung der Reaktionsdauer wesentlich die industrielle Anwendung des neuen Verfahrens.
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Claims (3)

Prit··"· *'· ' ZELLEN IN u. .. 800Θ Mi.;,che ι 22 Zweibruckenstr. & 26. April 1971 SJ/Hu khO 7153 Patentansprüche
1. Verfahren zur Verbesserung der Eigenschaften von Isoamylasen (Alpha-1,6-glukosidasen), dadurch gekennzeichnet , daß man den durch Kultivierung von Stämmen der Actinomycetes-Gattungen erhaltenen Enzymlösungen durch Zugabe wasserlöslicher Galciumsalze Oalciumionen einverleibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ali Calciumsalz öalciumacetat oder -Chlorid anwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man je 0,5 ml Enzymlösung 5 mM Oalciumionen einverleibt.
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