DE2120438B2 - Verfahren zur Erhöhung der Hitze- und pH-Stabilität sowie der optimalen Wirkungstemperatur von Isoamylasen - Google Patents

Verfahren zur Erhöhung der Hitze- und pH-Stabilität sowie der optimalen Wirkungstemperatur von Isoamylasen

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Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.
Die bekannten Enzyme, welche die Alpha- 1,6-glykosidbindungen von Stärke zersetzen, umfassen im allgemeinen die aus Hefe erhaltenen Isoamylase, die mittels Aerobacter aerogenes bereitete PuHulanase und die aus Pflanzenquellen gewonnenen R-Enzyme. Die 4« Hitzestabilität dieser Enzyme ist verhältnismäßig niedrig: die optimalen Temperaturen ihrer Wirkungsbereiche liegen zwischen 30 und 50° C; um 5O0C ist der Inaktivierungsgrad der Enzyme im Laufe verlängerter Einwirkungen bereits recht hoch.
Dementsprechend ist es notwendig, zwecks Verhütung einer Inaktivierung den Stärkeabbau bei einer Temperatur unterhalb 50° C durchzuführen. In diesem Falle ist aber die Reaktionsgeschwindigkeit gering, die ihrerseits gegebenenfalls eine Verlängerung der Reak- so tionsdauer zur Folge hat; letztere kann zusätzlich eine durch andere Bakterien verursachte Verunreinigung bewirken. Diese Umstände stellen ein starkes Hindernis für die industrielle Verwertung solcher Enzyme dar.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Hitze- und pH-Stabilität sowie die optimale Wirkungstemperatur von Isoamylasen zu erhöhen.
Optimale Werte werden beim erfindungsgemäßen Verfahren erreicht, wenn man je 0,5 ml der Enzymlösung 5 mM Kalziumionen anwendet
Zum Nachweis der Wirkungen des Kalziumsalzzusatzes wurden vier Enzymlösungen erhalten mittels folgender Bakterien:
1. Streptomyces diastatochromogenes IFO 3337
2. Nocardia asteroides IFO 3384
3. Micromonospora melanosporea IFO12 515
4. Thermomonospora viridis IFO 12 207
zunächst gegen EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) und destilliertes Wasser dialysiert und dann entionisiert und hierauf die Wirksamkeit von 5 mMol Kalziumionen (pro je 0,5 ml der Enzymlösungen) in Form von Kalziumacetat auf den Hydrolysegrad innerhalb einer Stunde bei verschiedenen Temperaturen unter Benutzung einer l%igen Pullulanlösung als Substrat bestimmt
Die Kurvendiagramme (F i g. 1 bis 4) zeigen die
ίο Ergebnisse der Messung der relativen Aktivität in Abhängigkeit vom pH und der Temperatur, und zwar einerseits die Aktivität in An- oder Abwesenheit von Calciumionen (Ca+ +) und zum Vergleich derjenigen des Pullulanase-Enzyms von Aerobacter aerogenes ATCC 8724.
Die Kurven gemäß F i g. 1 und 2 veranschaulichen die optimalen pH-Werte sowie die Änderung der Enzymstabilität bei Anwesenheit von Calciumionen, die Kurven gemäß den F i g. 3 und 4 dagegen die optimale
Temperatur sowie die Änderung der Hitzestabilität der Enzyme durch Zusatz von Calciumionen.
Die in F i g. 1 wiedergegebenen Versuche erfolgten durch eine einstündige Behandlung der Enzymlösungen bei 30° C; diejenigen nach F i g. 2 dauerten 30 Minuten.
F i g. 1 zeigt, daß die restliche Aktivität durch Calciumionen maximal von 90 auf 100% erhöht wird; gleichzeitig wird der pH-Stabilisierungsbereich auf 2,0 bis 6,0 eiweitert im Vergleich zum Bereich von 5,0 bis 6,0 im Falle der Abwesenheit von Calciumjonen. Fig.2
zeigt demgegenüber keine wesentliche Änderung der optimalen pH-Bereiche.
Wie aus F i g. 4 zu ersehen, werden die Enzymaktivitäten bei Calciumionen-Abwesenheit zwischen 40 und 50° C inaktiviert, wogegen dies bei Zusatz von Calciumionen erst zwischen 50 und 60°C erfolgt; die Hitzestabilität erhöht sich somit um etwa 10° C.
Zusammenfassend ergibt sich, daß durch Zusatz von Calciumionen die pH-Stabilität sich um etwa 10% erhöht und der Stabilitätsbereich sich stark erweitert.
Bei allen Beispielen und Versuchen handelt es sich, soweit nicht anders angegeben, um Gewichtsprozente bzw. Gewichtsteile.
Bestimmung der Enzymaktivität
Die Reaktionsmischungen bestanden aus:
l%ige Pullulan
Pufferlösung vom pH 5,5
Enzymlösung
1,0 ml
0,5 ml
0,5 ml
Die Umsetzung wurde in 1 h bei 40° C durchgeführt.
Die verwendete Pufferlösung enthielt M/10 Natriumacetat und M/5 Essigsäure.
Die angewandten Enzymlösungen bestanden aus der überstehenden Lösung, die beim Schleudern der Kulturbrühen erhalten waren und von denen 0,5 ml zu 2,0 ml der Pufferlösung zugesetzt wurden.
Je 0,5-ml-Fraktionen der Reaktionsmischungen wurden bei Reaktionsbeginn und 1 h danach entnommen, worauf man die Reaktion durch Einrühren der Fraktionen in eine Kupfer(II)-Reagenzlösung gemäß der Somogyi-Nelson-Methode beendete (vgl. J. Biol. Chem. 160/1945,61; Kagaku-no-Rybiki (Japan.) 34/1958, 27—30). Entsprechend dieser Methode vermischte man die 0,5-ml-Fraktionen mit einem Gemisch von 1 ml der Kupferlösung und 0,5 ml Wasser, erhitzte die Mischungen 10 Min. bei 100° C in durch eine Glaskugel verschlossenen Probierröhrchen, kühlte dann diese 3
Min. mit fließendem Wasser und setzte 1 ml der Tabelle I Nelson-Reagenzlösung und hierauf 5 ml Wasser zu.
Sodann schleuderte man aus den beiden Mischungen in 3 Min. das gefällte Pullulan bei 3000 UpM ab und prüfte die überstehenden Flüssigkeiten kolorimetrisch bei 520 ΐημ. Die Ergebnisse drücken die Differenz der Schwärzungsextinktionen zwischen den obengenannten beiden Fraktionen aus. Als Isoamylase-Einheit wurde die Erhöhung der Extinktion um 0,100 durch einstündige Inkubation bei 40° C bestimmt ι ο
Beispiele
Angewandt wurden die oben angegebenen Enzymstämme 1) bis 4) bei der Kulturtemperatur von 30° C (IFO 12 207 jedoch bei 40° C). Das Kulturmedium vom pH 7,0 enthielt:
Lösliche Stärke
Polypeptone
Hefeextrakt
NaCl
K2HPO4
FeSO4 · 7 H2O
2,0%
1,5%
0,5%
0,5%
0,02%
0,002%
15
20
diesem zuvor sterilisierten Medium inokulierte man jeden der Enzymstämme 72 bis 96 h unter Schütteln und Belüften. Die als Enzymlösungen verwendeten überstehenden Flüssigkeiten wurden zuerst gegen 1/1000 M-EDTA-Lösung und dann gegen Wasser zwecks Entionisierung dialysiert, worauf man Calciumacetat bis zur Konzentration von 5 m Mol zusetzte.
Eine Lösung, enthaltend 1 ml l%iges Pullulan und 0,5 ml 0,2 M-Acetatpufferlösung vom pH 5,5, vermischte man mit 0,5 ml Enzymlösung und setzte dann 5 mM Cacliumacetat zu. Nach 1 h Inkubation wurden die Hydrolysegrade von Pullulan nach der Somogyi-Nelson-Methode durch Messung der Schwärzungen bestimmt und die Stabilitätswerte mit der relativen Aktivität in Gegenwart der Substrat verglichen. In Tabelle I sind die für optimale Temperaturen erhaltenen Werte zusammengestellt, während in den F i g. 3 und 4 diese Werte noch mit den unter den gleichen Bedingungen mit der aus dem Stamm Aerobacter aerogenes ATCC 8724 gewonnenen Pullulanase verglichen sind.
Tempe Schwärzung 0,152 Mittel Relative
ratur 0,216 0,155 Aktivität
0C Befunde 0,300 0,216 in%
30 0,158 0,395 0,305 26,8
35 0,216 0,562 0,408 37,3
40 0,310 0,565 0,568 52,6
45 0,420 0,575 0,569 70,5
50 0,574 0,224 0,569 98,2
55 0,593 0,046 0,217 100
60 0,562 0,013 0,041 98,3
65 0,210 0,017 37,5
70 0,036 6,9
75 0,020 2,9
Aus Tabelle I ist ersichtlich, wie die Enzyme ihr Maximum an Hitzestabilität bei Anwendung von Pullulan als Substrat zeigen. Der in F i g. 3 veranschaulichte Vergleich jener Hitzestabilitätswerte mit den Werten, die bei Einwirkung derselben Enzyme ohne Zusatz von Calciumionen auf Pullulan und der aus dem Aerobacter aerogenes gewonnenen Pullulanase auf Pullulan erhalten werden, zeigt, daß die optimale Temperatur für die Pullulanase des Aerobacter aerogenes zwischen 47 und 5O0C, wogegen jene für die Calciumionen enthaltenden Lösungen der 4 Stämme um etwa 10° C höher liegt. Darin ist ein großer Vorteil bezüglich der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Technik zu sehen.
Die verlängerte Enzymumsetzung kann unterhalb 50° C eine Verunreinigung durch andere Bakterien bewirken, wodurch wesentliche Nachteile in den folgenden Arbeitsgängen auftreten. Dagegen verhütet die Erhöhung der Reaktionstemperatur um 10° C die Verunreinigung mit Bakterien fast vollständig und beschleunigt gleichzeitig den Umsetzungspfad, wodurch die Reaktionsdauer verkürzt und die anzuwendende Enzymmenge verringert wird.
Zwecks weiterer Untersuchung der thermischen Enzymstabilität wurden die mit 5 mM Calciumionen versetzten Enzymlösungen 1 h bei pH 5,5 und verschiedenen Temperaturen inkubiert. Nach schneller Kühlung der Reaktionsmischungen im Eisbad führte man die enzymatische Umsetzung in 1 h bei 40° C durch und bestimmte die restlichen Enzymaktivitäten nach Somogyk — Nelson.
Tabelle II
Hitzestabilität
Temperatur
0C
Schwärzung
Befunde
Mittel
Relative
Aktivität
in 0/0
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
Unbehandelt bei 50° C
0,294 0,284
0,300 0,314
0,295 0,280
0,250 0,262
0,285 0,285
0,180 0,176
0,030 0,035
0,020 0,020
0,010 0,016
0,012 0,010
0.290 0.291
0,289
0,307
0,288
0,256
0,285
0,178
0,033
0,020
0,013
0,011
0.291
99,5
105,0
99,0
88,0
96,5
61,2
11,7
6,9
4,5
3,8
100
Wie aus Tabelle Il zu ersehen, bleibt die Hitzestabilität bei Abwesenheit von Substrat bis über 50° C erhalten; die Aktivität wird erst bei 60°C fast vollständig inaktiviert. Dagegen zeigt das Diagramm gemäß F i g. 2, daß die Enzyminaktivierung bei Abwesenheit von Caiciumionen bereits bei 4O0C beginnt und bei 50° C vollständig ist.
Im Einzelnen wurden die optimalen Temperaturen und die Hitzestabilität von Isoamylase-Lösungen der obengenannten 4 Stämme geprüft. Die nachfolgende Tabelle III zeigt, daß das Temperaturoptimum um 5 bis 10° C ansteigt und die Hitzestabilität sich entsprechend erhöht.
Tabelle III
Hitzestabilität und optimale Temperaturen
Enzymstamm Optimale Temperaturen in 0C mit Hitzestabilität in °, 50° C Io mit 6O0C
ohne Ca-Ionen- ohne 10 15
Ca-Ionen- Zusatz
Zusatz Ca-Ionen-Zusatz Ca-lonen-Zusatz
50-60 bei 0 bei 20
Strepiomyces 45-50 35°C 50° C
diastatochromogenes 85 5 97 10
IFO 3337 48-60
Nocardia asteroides 48-52
IFO 3384 50-62 85 10 95 10
Micromonospora 47-52
melanosporea 75 95
IFO 12515 50-60
Thermomonospora 47-50
viridis 80 97
IFO 12207
Zwecks Bestimmung der pH-Stabilität setzte man der Enzymlösung 5 mM Calciumacetat zui behandelte 1 h unter Zusatz von Pufferlösungen bei 30° C, stellte das pH mit 1 N-HCl und 1 N-NaOH auf 5,5 und prüfte gleiche Mengen mittels der oben angegebenen Methode auf ihre Aktivitäten.
Tabelle IV
pH-Stabilität
Angewandt wurden folgende Pufferlösungen:
für pH 2,0 - 3,5 0,2 M-NaOCOCH3 und HCl
3,5-6,0 0,2 M-NaOCOCH3 und CH3COOH
6,0-8,0 0,2 M-Na2HPO4 und NaH2PO4
8,0 -10,0 0,1 M-H3BO3ZKCl und Na2CO3
Schwärzung
Relative Aktivität
in °/o
pH
Schwärzung
Relative Aktivität in %
Schwärzung
Relative Aktivität in %
pH
Schwärzung
Relative Aktivität in %
96,6 3,5 0,420 104 6,0 0,340 82,5 8,0 0,318 77,3
98,3 4,0 0,415 101 6,5 0,340 82,5 8,5 0,295 71,6
103 4,5 0,380 92,2 7,0 0,325 78,8 9,0 0,240 58,2
101 5,0 0,410 99,5 7,5 0,345 83,7 9,5 0,255 61,9
5,5 0,407 98,8 8,0 0,320 77,6 10,0 0,245 59,5
6,0 0,350 85,0
2,0 0,398
2,5 0,405
3,0 0,418
3,5 0,415
Die in Tabelle IV zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß die Stabilitäten oberhalb pH 8,0 stark abfallen, während sie im Bereich von pH 2,5 bis 5,5 sehr hoch liegen. Die Ergebnisse der mit und ohne Calciumionenzusatz geprüften Enzymlösungen, verglichen mit der Caiciumionen nicht enthaltenden Pullulanase aus dem Aerobacter aerogenes ATCC 8724, zeigt die F i g. 1 — nämlich, daß die Erhöhung der Enzymaktivität durch Caiciumionen über 10% beträgt und daß die gleichen Werte mit Pullulanase erzielbar sind.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen die Entbehrlichkeit einer besonderen pH-Einstellung bei Zusatz von Caiciumionen im Falle von Enzymen mit pH-Optimum zwischen 3 und 7, wodurch die Lagerung der Enzyme wesentlich erleichtert wird.
Bezüglich der optimalen pH-Werte wurde kein wesentlicher Unterschied festgestellt. Die pH-Stabilitäten der im Kennzeichen des Anspruchs 1 genannten Stämme zeigen eine maximale Erhöhung von 10%, und der die gleiche Neigung zeigende Stabilitätsbereich ist bei pH-Werten von 3 bis 7 verhältnismäßig beständig.
Im allgemeinen weisen Isoamylasen verhältnismäßig niedrige Hitzestabilitäten auf und erfordern eine Reaktionstemperatur unter 45° C. Wie vorstehend
wi beschrieben, bewirken erfindungsgemäß zugesetzte Caiciumionen eine Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50 bis 600C sowie ermöglichen eine Erweiterung des pH-Stabilitätsbereichs. Entsprechend erhöhen sich bei der Reaktion von 600C die enzymatischen Aktivitäten
tv") auf das 5- bis 7fache. Darüber hinaus begünstigt die Erniedrigung der Enzymmengen in den Fraktionen und die Verkürzung der Reaktionsdauer wesentlich die industrille Anwendung des neuen Verfahrens.
ii 2 liliill Zui

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Erhöhung der Hitze- und pH-Stabilität sowie der optimalen Wirkungstemperatur von Isoamylasen, dadurch gekennzeichnet, daß man Enzymlösungen, die durch Kultivierung der dieses Enzym erzeugenden Stämme Streptomyces diastatochromogenes IFO 3337, Nocardia Asteroides IFO 3384, Micromonospora melanosporea IFO 12 515 oder Thermomonospora viridis IFO 12 207 erhalten wurden, durch Zugabe wasserlöslicher Kalziumsalze Kalziumionen einverleibt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kalziumsalz Kaiziumacetat oder Kalziumchlorid anwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Kalziumsalz in Mengen von 0,5 bis 5 mMoJ je 0,5 ml der Enzymlösung anwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man je 0,5 ml der Enzymlösung 5 mMol Kalziumionen einverleibt.
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