DE2809777B2 - Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines PolysaccharideInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines mikrobischen Alginats (Polysaccharids) von bestimmter
Viskosität.
Ein mikrobisches Alginat is! ein Polysaccharid, das durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Spezies
Azotobacter vinelandii. z. B. durch ein Verfahren, wie es in der GB-PS 13 31 771 beschrieben wird, hergestellt
werden kann. Das Produkt ist ein partiell acetyliertes 4> variables Block-Copolymcr von 1 —4-verbundenen
D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäure-Resten. im allgemeinen mit einem Acetylierungsgrad von etwa
20% und. abgesehen von den Acetylgruppen, ist es chemisch ähnlich der Alginsäure, die aus gewissen w
Spezies von braunem Seetang extrahiert werden kann.
Ein Problem bei der Herstellung von mikrobischem Alginat, insbesondere wenn man kontinuierliche Kulturbedingungen
mit hoher Zcllenmasse und hoher PoIysaccharidproduktivität verwendet, ist darin zu sehen, ->-,
daß die erhaltene Polysaccharidlösung eine verminderte Viskosität hat. Dies ist vermutlich das Ergebnis einer
Verminderung des Durchschnittsmolekulargewichtes des Polysaccharids. das durch Abbau durch das Enzym
Alginate-Liase verursacht wird (siehe Haug und Larsen, mi Carbohydrate Research, 17, 1971, S. 297-308. Man
nimmt an, daß dieses Enzym extrazellulär wirkt und der Abbau kann erheblich die Viskosität der Lösung
beeinflussen und damit die kommerzielle Verwendbarkeit des Polysacchardis. tv">
Es wurde nun gefunden, daß man den Abbau des Polysaccharids einstellen und damit die Viskosität des
Produktes erhöhen kann durch Zugabe eines proteolytischen Enzyms zu der Kulturbrühe. Das proteolytische
Enzym kann in das Kulturmedium, in dem die Mikroorganismen wachsen, eingebracht werden, oder
es wird der Kulturbrühe auf irgendeine andere Weise während der Kultivierung der Mikroorganismen zugegeben
oder man gibt es sogar zu der Brühe nach der Kultivierung, aber bevor das Polysaccharid isoliert wird.
Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines
Polysaccharid produzierenden Stammes von Azotobacter vinelandii in einem Nähr-Medium dafür gezeigt,
bei dem die Lösungsviskosität des hergestellten Polysaccharids durch Einverleiben eines proteolytischen
Enzyms mit einer proteolytischen Aktivität bei dem pH der Kulturbrühe während der Kultur und/oder nach der
Kultur, aber vor der Isolierung des PolyEaccharidprodukts
eingestellt wird.
Die Verwendung eines proteolytischen Enzyms bei einer einen lebensfähigen Mikroorganismus enthaltenden
Fermentation ist eine überraschende Neuheit auf dem Gebiet der Polysaccharid-Herstellung mittels
Azotobacter vinelandii. Dies wird ersichtlich wenn man bedenkt, daß bei einer bekannten Verwendung eines
proteolytischen Enzyms, wie alkalischer Protease, Zelltrümmer aus Xanthanharz-Lösungen, die durch
Kultivierung von Mikroorganismusstämmen von Genus Xanthomonas gebildet wurden, entfernt werden. Bei
diesen bekannten Verfahren werden mikrobische Zellen und Zellfragmente, die physikalisch schwer zu entfernen
sind, aus Xanthanharz-Lösungen in situ durch Zugabe des Enzyms abgebaut. Ganz im Gegensatz zu dieser
Verwendung einer Protease für den Abbau von mikrobischen Zellen wurde überraschenderweise festgestellt,
daß ein derartiges Enzym einer Fermentation von A. vinelandii so 'ugesetzt werden kann, daß die Viskosität
des Produ ;es kontrolliert wird, ohne die Lebensfähigkeit
des Mikroorganismus erheblich zu beeinflussen. In einigen Fällen kann ein geringer Verlust der
Polysaccharidkonzentration festgestellt werden, wie dem Anteil derdurch Isopropanol ausgefällt wird, aber
dies wird mehr als ausgeglichen durch die erhöhte Viskosität des Produktes.
Verschiedene proteolytische Enzyme haben optimale Aktivität bei verschiedenen pH-Werten. Diejenigen,
deren optimale Aktivität bei einem pH oberhalb des Neutralpunktes liegt, werden als alkalische Proteasen
bezeichnet und solche, deren optimale Aktivität beim Neutralpunkt vorliegt, werden neutrale Proteasen
genannt usw. Jede dieser verschiedenen proteolytischen Enzyme kann, allgemein gesagt, beim erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß sie eine ausreichende Aktivität bei dem pH
der Kulturbrühe entwickeln, der im allgemeinen bei etwa 7 liegt. Das proteolytische Enzym kann aus
irgendeiner zugänglichen Quelle stammen, jedoch sind bakterielle und Pilz-Proteascn besonders geeignet,
beispielsweise solche, die von Novo Industri A/S Copenhagen, Dänemark unter dem Handelsnamen
»Alcalase« und »Neutrase« vertrieben werden. Bei kontinuierlichen Kulturen arbeitet man vorzugsweise
bei einem pH von etwa 7,4 mit neutraler oder alkalischer Protease.
Die Proteasen sind nicht nur brauchbar um die Viskosität des in der Kultur gebildeten Polysaccarids zu
erhöhen, sondern sie sind auch in der Lage, das Polysaccharid in Volumina der Kulturbrühe, die für die Verarbeitung
gelagert werden, zu stabilisieren. Dadurch kann man ein Problem überwinden, das besonders bei
kontinuierlichen Kulturverfahren auftritt, wenn Ansätze von Kulturbrühen aus dem Fermentationsgefäß
entnommer, und dann eine beachtliche Zeit gelagert werden, bevor das Polysaccharid isoliert wird und wobei
man dann feststellt, daß die Viskosität des Produktes erheblich abgesunken ist. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung
eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid produzierenden Stammes von A. vinelandii in
einem Nährmedium dafür in einem Fermentationsgefäß und nachfolgend das Abziehen der Kuiturbrühe aus dem
Fermentationsgefäß gezeigt, bei dem die Lösungsviskosität
des gebildeten Polysaccharids dadurch überwacht wird, daß man zu der Kulturbrühe, nachdem diese
vom Fermentationsgefäß abgezogen wurde, aber vor der Isolierung des Polysaccharidproduktes ein proteolytisches
Enzym mit proteolytischer Aktivität beim pH der Brühe zugibt Auf diese Weise kann die eigentliche
Kultur in Abwesenheit eines Enzyms durchgeführt werden oder mit niedrigem Enzyrnniveau und dann wird
die Menge des proteolytischen Enzyms in der Kulturbrühe vor der Lagerung erhöht.
Die Menge an proteolytischem Enzym, das bei den Ausführungsformen der Erfindung verwendet wird,
hängt natürlich von dem Grad der benötigten Viskositätsüberwachung und der relativen Aktivität des
Enzyms ab. Es sollten unnötig hohe Enzymniveaus während der Kultivierung des Mikroorganismus vermieden
werden, um jedes Risiko zu vermeiden, die Lebensfähigkeit Her Mikroorganismuszellen zu beeinflussen,
jedoch können höhere Mengen verwendet werden, wenn das Enzym nach der Kulturbildung zugegeben
wird, beispielsweise zu der zum Lagern abgezogenen Brühe, denn dann ist die Lebensfähigkeit des
Mikroorganismus nicht mehr wichtig. Im allgemeinen verwendet man vorzugsweise das proteolytische Enzym
in einer Menge von 0,005 bis 1,0 Anson-Einheiten pro Liter Brühe, wobei ein Bereich von 0,005 bis 0,5 Anson-Einheiten
pro Liter besonders bevorzugt wird für die Anwendung während der Kultur des Mikroorganismus
(die Anson-Einheit wird definiert als die Menge eines Enzyms, welche 1 mäq. Tyrosin pro Minute aus denaturiertem
Hämaglobin bei 3O0C und einem pH von 7,5 frei
macht).
In diesem Beispiel wird die Erhöhung der Lösungsviskosität eines Polysaccharidproduktes, das aus einer
kontinuierlichen Kultur von Azotobacter vinelandii erhalten wurde, durch die Zugabe einer Protease zu der
Kultur gezeigt.
Drei 2-Liter kontinuierliche Kulturen von Azotobacter vinelandii NCIB 9068 wurden in einem Kulturmedium
der folgenden Zusammensetzung kultiviert.
Rohrzucker
KH2PO4
K2HPO4
MgSO47 H2O
NaCI
Na2MoO4
CaCI2 2 H2O
FeCI2 4 H2O
KH2PO4
K2HPO4
MgSO47 H2O
NaCI
Na2MoO4
CaCI2 2 H2O
FeCI2 4 H2O
60 g/l
0,064 g/l
0.26 g/l
1,6 g/l
1.6 g/l
0,008 g/l
0,34 g/l
0,017 g/l
0,064 g/l
0.26 g/l
1,6 g/l
1.6 g/l
0,008 g/l
0,34 g/l
0,017 g/l
mittels auf Silikonbasis kontrolliert. Unter diesen Bedingungen
lag der spezifische Respirationsgrad des Organismus im Bereich von 20 bis 3OmMoI O2/h/g
Zelle.
Die Konzentration der durch Isopropanol ausfälibaren
Substanz in der Kuiturbrühe wurde wie folgt bestimmt: Eine Probe der Kulturbrühe (25 ml) wurde zu
Isopropanol (75 ml) gegeben, die Mischung würde geschüttelt und der erhaltene Niederschlag wurde durch
ίο Filtern durch ein vorher gewägtes Filtertuch aus Glasfaser
gesammelt Das Filtertuch mit dem Niederschlag wurde bei 45° C im Vakuum bis zum konstanten
Gewicht getrocknet.
Der Konsistenz-Index der Kulturbrühe wurde durch
!5 Messung der scheinbaren Viskosität der Kuiturbrühe in
einem Bereich von Seher-Graden zwischen 1 sek.-' und
1000 sek.-' unter Verwendung eines Wells-BrDokfield-Modells
LVT- oder Modell H BT-Kegel- und Platten-Viskosimeters
bestimmt. Der Logarithmus der scheinbaren Viskosität wurde dann gegen den Logarithmus
des Seher-Grades aufgetragen und die erhaltene Linie wurde extrapoliert zur Bestimmung des Konsistenz-Index
(d. h. der scheinbaren Viskosität bei einem Seher-Grad von 1 sek.-').
Im Anschluß an die Zugabe einer Proteasezubereitung (Neutrase, 3 Anson-Einheiten/g von der Novo
Industri A/S, Copenhagen, Dänemark) bis zu einer Konzentration von 0,006 g/I bzw. 0,012 g/l in zwei der drei
Kulturbrühen (wobei diese Konzentrationen nachfolgend aufrecht erhalten wurden durch weitere Zugabe
von Protease zu dem einfließenden Kulturmedium) trat ein merklicher Anstieg der Kulturviskosität in diesen
Brühen auf, obwohl die Konzentration an durch Isopropanol ausfällbaren Anteilen abnahm.
j-, Proben der Kulturbrühe wurden nach 6 Verweilzeiten
(2 Tage) entfernt. Natrium wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 m zugegeben und die Bakterienzellen
wurdsn durch Zentrifugierec mit 25 000 G während
40 Minuten entfernt. Das erhaltene Sediment wurde in destilliertem Wasser resuspendiert, nochmals
zentrifugiert und bei 105°C bis zum konstanten Gewicht
zur Bestimmung der Zellmasse getrocknet. Die während der ersten Zentrifugierung erhaltene überstehende
Flüssigkeit wurde zu Isopropanol (3 Volumina) gegeben und das ausgefällte Polysaccharid wurde gesammelt und
gefriergetrocknet. Es wurde eine l°/oige (GewVVol.) Lösung des gefriergetrockneten zellfreien polyfreien
Polysaccharids hergestellt und der Konsistenz-Index der Lösung wurde bestimmt.
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
Luft wurde durch die gerührte Kultur in einer Menge von 1,4 l/iiiin geleitet und die Temperatur betrug 36°C,
der Verdünnungsgrad 0,13 h"1 und der pH 7,4 (eingestellt
durch automatische Zugabe von 1 m NaOH) Schaumbildung wurde durch Zugabe eines Antischaum-
Neu- | ZcII- | Gebildetes | Konsi | Konsistenz-Index |
trase | masse | Polysac | stenz- | einer l%igen |
charid | Index der | Lösung des zell | ||
Kultur | freien Poly | |||
saccharids | ||||
(mg/1) | (g/l) | (g/l) | (cp) | (cp) |
O | 4.1 |
6 | 3,5 |
12 | 3,1 |
10,9
8,6
6,2
8,6
6,2
2500
23,5
76
2030
76
2030
Es wurden zwei kontinuierliche Kulturen des Stammes Azotobacter vinelandii, der entwickelt worden
war aus Azotobacter vinelandii NCIB 9068, unter Ver-
Wendung des Kulturmediums und der Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, angesetzt. Zu einer Kultur
wurde eine Protease-Zubereitung Alcalase (von der Novo Industri A/S, 1,5 Anson-Einheiten/g), bis zu einer
Endkonzentration von 6 mg/1 gegeben, während zu der anderen Kultur keine Protease gegeben wurde.
Nachdem sich in den Kulturansätzen konstante Bedingungen eingestellt hatten, stellte man fest, daß die
Viskosität in der mit Protease behandelten Kultur höher war als bei der Kontrollprobe, die nicht mit Protease
behandelt worden war, während die Polysaccharidkonzentration der Kulturen gleich war. Darüber hinaus war
die Viskosität der Lösungen aus dem zellfreien PoIysaccharid, das aus der mit Protease behandelten Kultur
erhalten worden war, höher als bei der Kontrollprobe (Tabelle 2).
Alca lase |
Zell masse |
Gebildetes Polysac- charid |
Beis | Kor.si- stenz- Index der Kultur |
Konsistenz-Index einer 1u/f>igen lösung des zell freien Poly saccharids |
(mg/1) | (g/l) | (g/l) | (cp) | (cp) | |
O 6 |
4,4 3,9 |
17,6 18,4 |
30 1100 |
23 780 |
|
piel 3 |
Tabe'le 3
Probe
Probe
Konsistenz-Index einer
l%igen
Lösung des
zellfreien
Polysaccharids
l%igen
Lösung des
zellfreien
Polysaccharids
(cp)
Gehalt an
4.5-unge-
sättigter
Uronsäure
(in % der
Gesamt-
Uronsäure)
als die Probe, die vor der Zugabe der Protease genommen worden war. Es ist ersichtlich, daß die Protease
es ermöglicht, ein Produkt mit höherer Viskosität zu erhalten. Der abnehmende Gehalt an 4,5-ungesättigter
Uronsäure, die durch die Wirkung der Alginat-Liase in Beispiel 2 erfolgt, scheint anzuzeigen, daß durch die
Protease der Abbau des Polysaccharids durch die Alginat-Liase kontrolliert wird. Man erhält deshalb ein
Polymer mit höherer Lösungsviskosität.
In diesem Beispiel wird der Anstieg der Viskosität des
Polysaccharids, das aus einem Kulturansatz von Azotobacter vinelandii, die in Gegenwart von Protease
wachsen gelassen wurde, gezeigt.
Azotobacter vinelandii NCIB 9068 wurde in einem Kulturansatz in einem belüfteten gerührten Fermentationstank,
enthaltend 8 I des nachfolgenden Mediums, wachsen gelassen:
Ein ähnlicher Versuch wurde unter Verwendung von
Alcalase (von der Novo Industri A/S. 6 Anson-Einheiten/g) in einer Menge von 0,01 g/l durchgeführt,
wobei der Konsistenz-Index und der Gehalt an 4,5-ungesättigter Uronsäure des zellfreien Polysaccharids vor
und nach der Enzymzugabe gemessen wurde.
Das 4,5-ungesättigte Uronsäure-Produkt mit Alginat-Liase-Aktivität
wurde bewertet unter Verwendung der Perjodnt-Thiobarbitursäure-Versuchsanordnung, wie
sie von Weissbach und Hurwitz (Journal of Biological Chemistry, 234, 1958, 705—709) beschrieben wird:
0,01 μΜο! der 4,5-ungesättigten Uronsäure zeigte eine
Extinktion von 0,29 bei einer Wellenlänge von 549 nm (Preiss und Ashwell, Journal of Biological Chemistry.
237, 1*52, .509—316) und des wurde als Standard verwendet; der Gehalt an 4,5-ungesättigten Uronsäure-Resten
wurde bestimmt und als Prozentsatz der gesamten Uronsäure-Reste ausgedrückt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 3 nachfolgend gezeigt.
1. vor der Alcalase- 4,6 0,38
Zugabe
Zugabe
2. nach der Alcalase- 2,5 χ IO3 0,02
Zugabe
Zugabe
Die Probe des zellfreien Polysaccharids, die nach der
Zugabe der Protease zu der Kultur erhalten wurde, ergab Lösungen mit einer sehr viel höheren Viskosität
Rohrzucker
KH,PO4
K2HPO4
MgSO4 7
NaCl
Na^MoO4
CaCN 2 H,O
FeCh4 HO
KH,PO4
K2HPO4
MgSO4 7
NaCl
Na^MoO4
CaCN 2 H,O
FeCh4 HO
H,O
40 g/l
C.064 g/l
0.25 g/l
0,4 g/i
0,2 g/l
0,008 g/l
0,024 g/I
0.068 g/l
C.064 g/l
0.25 g/l
0,4 g/i
0,2 g/l
0,008 g/l
0,024 g/I
0.068 g/l
Zu zwei Fermentationsansätzen wurde Alcalase (1,5 Anson-Einheiten/g) bis zu einer Endkonzentration
von 0.1 g/l bzw. 0,01 g/l gegeben, während eine gleiche Kultur ohne Zugabe von Protease als Konirolle bei
diesem Versuch diente. Die Fermentationsparameter waren die folgenden: Temperatur 36°C, pH 7,4, eingestellt
durch automatische Zugabe von 2 m NaOH, Durchflußgeschwindigkeit der Luft 4 l/min. Schaumbildung
wurde durch Zugabe eines Silikon-Antischaummittels verhindert. Die Rührgeschwindigkeit betrug
anfangs 350 Upm. wurde jedoch im Laufe der Fermentation erhöht, um den spezifischen Respirationsgrad
des Organismus 'm Bereich von 6 bis Ά mmol Oj/h/g
Zelle zu halten.
Die Fermentation wurde durch Zugabe von 160 ml
einer Schüttelflaschenkultur des Organismus eingeleitet und 40 Stunden fortgeführt. Nach 40 Stunden
wurde der durch Isopropanol ausfällbare Teil der Kulturbrühe bestimmt. Eine zellfreie Probe des gebildeten
Polysaccharids wurde erhalten, und der Konsistenz-Index einer l°/oigcn (Gew./Vol.) Lösung dieser
Probe wurde bestimmt (Tabelle 4).
Isopropanol·
ausfällbarc
Substanz
(g/l)
Konsistenz-Index
einer l°/oigen Lösung eines
/"cllfreien Polysaccharids
(cp)
Kultur I
keine
Alcalase
zugegeben
keine
Alcalase
zugegeben
hi Kultur 2
0,01 g/l
Alcalase
zugegeben
0,01 g/l
Alcalase
zugegeben
7.5
6.6
22
46
beil | Isoprnpann! iiusf.illharc Siihsliin/ |
K(IIlSlSItIl/ /cllireien I |
Im '(ils |
μ eines inils |
|
(f I) | (ep) | ||||
5U | 500 | ||||
Kultur i 0.1 g/l Akalnse |
.le\ I .(»SUM satchi |
||||
/tigege | |||||
I! ι· ι s ρ ι e I )
In diesem Beispiel wird die Viskosit.itsstabilisien.in>.'
Min A/'iiohiiciLT vinelandn Kiillurbrühen beim Lagern
in (icfK'rmiirt einer l'rolease ^e/cigl
/ii Proben einer I ernienl.ilicnsbnihe (20 ml) ,ms
einer l'ciKsiicchiiriil-hiitlenilen knnüniiieriiL'Men Kniiiir
um \/i)lobiicter vinelandii NCIB MOhH wurde eine
l.osiini.1 \(in Akalase {b Alison l.inlieiten g) (0.2 ml) bi-/ii
einer I jidkon/eiiii ,iiion tier Akalase von 0.1 g/l gegeben.
Min gleiches Volumen Wasser wurde /u der .intlcrcn Probe gegeben, die als unbehandelte Konirollprobe
diente. Die Proben wurden bei 30"C inkubiert und die scheinbare Viskosität bei einem Scher-Cinid
Min 4b sek periodisch mit einem Wells-Firnokfield
Modell I.VT-Kegel- Lind Plattcn-Viskosinieter gemessen.
Die scheinbare Viskosität der mit Protease behandelten
firiihe lag wahrend des Versuchs im gleichen Uereu'h. u.ihreiul die ilei iinbehanck Ilen !truhe erheb
hch abfiel ( I ,ibeüe Ί)
1I1 hem!-. ■ ■.■ \ --
l'i'oie.ise-nenaiKieiie
Bnihe
ι I iiibeh,iikle!'e hruhe
Bnihe
ι I iiibeh,iikle!'e hruhe
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2h 20 IH
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid-bildenden
Stammes von Azotobacter vinelandii in einem Nährmittel dafür, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids überwacht wird durch Einbringen einer
Protease mit einer proteolytischen Aktivität beim pH der Kulturbrühe in die Kulturbrühe während der
Kultivierung und/oder nach der Kultivierung aber vor der Isolierung des Produktes aus der Brühe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease in einer Menge von 0,005
bis 1,0 Anson-Einheiten pro Liter Brühe verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Protease während der Kultur in einer Menge von 0,005 bis 0,5 Anson-Einhcitcn pro
Liter Brühe eingegeben wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kultur in einem Fermentationsgefäß durchgeführt wird, vorzugsweise
als kontinuierliche Fermentation und vorzugsweise bei einem pH von etwa 7,4, und die r>
Kulturbrühe anschließend von dem Fermentationsgefäß abgezogen wird, dadurch gekennzeichnet, daß
die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids überwacht wird durch Zugabe von Protease und
zwar vorzugsweise einer neutralen oder alkalischen Protease zu der Kulturbrühe, nachdem diese aus
dem Fermentationsgefäß abgezogen aber bevor das Polysaccharid daraus isoliert worden ist.
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