DE2809777B2

DE2809777B2 - Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharide

Info

Publication number: DE2809777B2
Application number: DE2809777A
Authority: DE
Inventors: Trevor Rodney Jarman; Renton Clive Righelato
Original assignee: Tate and Lyle PLC
Current assignee: Tate and Lyle PLC
Priority date: 1977-03-14
Filing date: 1978-03-07
Publication date: 1980-03-20
Also published as: AU3410978A; LU79222A1; NZ186676A; SE7802840L; NL7802767A; IT7821133A0; FR2384020A1; NO780862L; GB1548078A; JPS5632917B2; JPS53113854A; DE2809777C3; DK111278A; IL54259A0; FI780797A; BE864823A; DE2809777A1; US4234688A; ZA781472B

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines mikrobischen Alginats (Polysaccharids) von bestimmter Viskosität.

Ein mikrobisches Alginat is! ein Polysaccharid, das durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Spezies Azotobacter vinelandii. z. B. durch ein Verfahren, wie es in der GB-PS 13 31 771 beschrieben wird, hergestellt werden kann. Das Produkt ist ein partiell acetyliertes 4> variables Block-Copolymcr von 1 —4-verbundenen D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäure-Resten. im allgemeinen mit einem Acetylierungsgrad von etwa 20% und. abgesehen von den Acetylgruppen, ist es chemisch ähnlich der Alginsäure, die aus gewissen w Spezies von braunem Seetang extrahiert werden kann.

Ein Problem bei der Herstellung von mikrobischem Alginat, insbesondere wenn man kontinuierliche Kulturbedingungen mit hoher Zcllenmasse und hoher PoIysaccharidproduktivität verwendet, ist darin zu sehen, ->-, daß die erhaltene Polysaccharidlösung eine verminderte Viskosität hat. Dies ist vermutlich das Ergebnis einer Verminderung des Durchschnittsmolekulargewichtes des Polysaccharids. das durch Abbau durch das Enzym Alginate-Liase verursacht wird (siehe Haug und Larsen, mi Carbohydrate Research, 17, 1971, S. 297-308. Man nimmt an, daß dieses Enzym extrazellulär wirkt und der Abbau kann erheblich die Viskosität der Lösung beeinflussen und damit die kommerzielle Verwendbarkeit des Polysacchardis. tv">

Es wurde nun gefunden, daß man den Abbau des Polysaccharids einstellen und damit die Viskosität des Produktes erhöhen kann durch Zugabe eines proteolytischen Enzyms zu der Kulturbrühe. Das proteolytische Enzym kann in das Kulturmedium, in dem die Mikroorganismen wachsen, eingebracht werden, oder es wird der Kulturbrühe auf irgendeine andere Weise während der Kultivierung der Mikroorganismen zugegeben oder man gibt es sogar zu der Brühe nach der Kultivierung, aber bevor das Polysaccharid isoliert wird.

Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid produzierenden Stammes von Azotobacter vinelandii in einem Nähr-Medium dafür gezeigt, bei dem die Lösungsviskosität des hergestellten Polysaccharids durch Einverleiben eines proteolytischen Enzyms mit einer proteolytischen Aktivität bei dem pH der Kulturbrühe während der Kultur und/oder nach der Kultur, aber vor der Isolierung des PolyEaccharidprodukts eingestellt wird.

Die Verwendung eines proteolytischen Enzyms bei einer einen lebensfähigen Mikroorganismus enthaltenden Fermentation ist eine überraschende Neuheit auf dem Gebiet der Polysaccharid-Herstellung mittels Azotobacter vinelandii. Dies wird ersichtlich wenn man bedenkt, daß bei einer bekannten Verwendung eines proteolytischen Enzyms, wie alkalischer Protease, Zelltrümmer aus Xanthanharz-Lösungen, die durch Kultivierung von Mikroorganismusstämmen von Genus Xanthomonas gebildet wurden, entfernt werden. Bei diesen bekannten Verfahren werden mikrobische Zellen und Zellfragmente, die physikalisch schwer zu entfernen sind, aus Xanthanharz-Lösungen in situ durch Zugabe des Enzyms abgebaut. Ganz im Gegensatz zu dieser Verwendung einer Protease für den Abbau von mikrobischen Zellen wurde überraschenderweise festgestellt, daß ein derartiges Enzym einer Fermentation von A. vinelandii so 'ugesetzt werden kann, daß die Viskosität des Produ ;es kontrolliert wird, ohne die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus erheblich zu beeinflussen. In einigen Fällen kann ein geringer Verlust der Polysaccharidkonzentration festgestellt werden, wie dem Anteil derdurch Isopropanol ausgefällt wird, aber dies wird mehr als ausgeglichen durch die erhöhte Viskosität des Produktes.

Verschiedene proteolytische Enzyme haben optimale Aktivität bei verschiedenen pH-Werten. Diejenigen, deren optimale Aktivität bei einem pH oberhalb des Neutralpunktes liegt, werden als alkalische Proteasen bezeichnet und solche, deren optimale Aktivität beim Neutralpunkt vorliegt, werden neutrale Proteasen genannt usw. Jede dieser verschiedenen proteolytischen Enzyme kann, allgemein gesagt, beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß sie eine ausreichende Aktivität bei dem pH der Kulturbrühe entwickeln, der im allgemeinen bei etwa 7 liegt. Das proteolytische Enzym kann aus irgendeiner zugänglichen Quelle stammen, jedoch sind bakterielle und Pilz-Proteascn besonders geeignet, beispielsweise solche, die von Novo Industri A/S Copenhagen, Dänemark unter dem Handelsnamen »Alcalase« und »Neutrase« vertrieben werden. Bei kontinuierlichen Kulturen arbeitet man vorzugsweise bei einem pH von etwa 7,4 mit neutraler oder alkalischer Protease.

Die Proteasen sind nicht nur brauchbar um die Viskosität des in der Kultur gebildeten Polysaccarids zu erhöhen, sondern sie sind auch in der Lage, das Polysaccharid in Volumina der Kulturbrühe, die für die Verarbeitung gelagert werden, zu stabilisieren. Dadurch kann man ein Problem überwinden, das besonders bei

kontinuierlichen Kulturverfahren auftritt, wenn Ansätze von Kulturbrühen aus dem Fermentationsgefäß entnommer, und dann eine beachtliche Zeit gelagert werden, bevor das Polysaccharid isoliert wird und wobei man dann feststellt, daß die Viskosität des Produktes erheblich abgesunken ist. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid produzierenden Stammes von A. vinelandii in einem Nährmedium dafür in einem Fermentationsgefäß und nachfolgend das Abziehen der Kuiturbrühe aus dem Fermentationsgefäß gezeigt, bei dem die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids dadurch überwacht wird, daß man zu der Kulturbrühe, nachdem diese vom Fermentationsgefäß abgezogen wurde, aber vor der Isolierung des Polysaccharidproduktes ein proteolytisches Enzym mit proteolytischer Aktivität beim pH der Brühe zugibt Auf diese Weise kann die eigentliche Kultur in Abwesenheit eines Enzyms durchgeführt werden oder mit niedrigem Enzyrnniveau und dann wird die Menge des proteolytischen Enzyms in der Kulturbrühe vor der Lagerung erhöht.

Die Menge an proteolytischem Enzym, das bei den Ausführungsformen der Erfindung verwendet wird, hängt natürlich von dem Grad der benötigten Viskositätsüberwachung und der relativen Aktivität des Enzyms ab. Es sollten unnötig hohe Enzymniveaus während der Kultivierung des Mikroorganismus vermieden werden, um jedes Risiko zu vermeiden, die Lebensfähigkeit Her Mikroorganismuszellen zu beeinflussen, jedoch können höhere Mengen verwendet werden, wenn das Enzym nach der Kulturbildung zugegeben wird, beispielsweise zu der zum Lagern abgezogenen Brühe, denn dann ist die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus nicht mehr wichtig. Im allgemeinen verwendet man vorzugsweise das proteolytische Enzym in einer Menge von 0,005 bis 1,0 Anson-Einheiten pro Liter Brühe, wobei ein Bereich von 0,005 bis 0,5 Anson-Einheiten pro Liter besonders bevorzugt wird für die Anwendung während der Kultur des Mikroorganismus (die Anson-Einheit wird definiert als die Menge eines Enzyms, welche 1 mäq. Tyrosin pro Minute aus denaturiertem Hämaglobin bei 3O⁰C und einem pH von 7,5 frei macht).

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird die Erhöhung der Lösungsviskosität eines Polysaccharidproduktes, das aus einer kontinuierlichen Kultur von Azotobacter vinelandii erhalten wurde, durch die Zugabe einer Protease zu der Kultur gezeigt.

Drei 2-Liter kontinuierliche Kulturen von Azotobacter vinelandii NCIB 9068 wurden in einem Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung kultiviert.

Rohrzucker
KH₂PO₄
K₂HPO₄
MgSO₄7 H₂O
NaCI
Na₂MoO₄
CaCI₂ 2 H₂O
FeCI₂ 4 H₂O

60 g/l
0,064 g/l
0.26 g/l
1,6 g/l
1.6 g/l
0,008 g/l
0,34 g/l
0,017 g/l

mittels auf Silikonbasis kontrolliert. Unter diesen Bedingungen lag der spezifische Respirationsgrad des Organismus im Bereich von 20 bis 3OmMoI O₂/h/g Zelle.

Die Konzentration der durch Isopropanol ausfälibaren Substanz in der Kuiturbrühe wurde wie folgt bestimmt: Eine Probe der Kulturbrühe (25 ml) wurde zu Isopropanol (75 ml) gegeben, die Mischung würde geschüttelt und der erhaltene Niederschlag wurde durch

ίο Filtern durch ein vorher gewägtes Filtertuch aus Glasfaser gesammelt Das Filtertuch mit dem Niederschlag wurde bei 45° C im Vakuum bis zum konstanten Gewicht getrocknet.

Der Konsistenz-Index der Kulturbrühe wurde durch

!5 Messung der scheinbaren Viskosität der Kuiturbrühe in einem Bereich von Seher-Graden zwischen 1 sek.-' und 1000 sek.-' unter Verwendung eines Wells-BrDokfield-Modells LVT- oder Modell H BT-Kegel- und Platten-Viskosimeters bestimmt. Der Logarithmus der scheinbaren Viskosität wurde dann gegen den Logarithmus des Seher-Grades aufgetragen und die erhaltene Linie wurde extrapoliert zur Bestimmung des Konsistenz-Index (d. h. der scheinbaren Viskosität bei einem Seher-Grad von 1 sek.-').

Im Anschluß an die Zugabe einer Proteasezubereitung (Neutrase, 3 Anson-Einheiten/g von der Novo Industri A/S, Copenhagen, Dänemark) bis zu einer Konzentration von 0,006 g/I bzw. 0,012 g/l in zwei der drei Kulturbrühen (wobei diese Konzentrationen nachfolgend aufrecht erhalten wurden durch weitere Zugabe von Protease zu dem einfließenden Kulturmedium) trat ein merklicher Anstieg der Kulturviskosität in diesen Brühen auf, obwohl die Konzentration an durch Isopropanol ausfällbaren Anteilen abnahm.

j-, Proben der Kulturbrühe wurden nach 6 Verweilzeiten (2 Tage) entfernt. Natrium wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 m zugegeben und die Bakterienzellen wurdsn durch Zentrifugierec mit 25 000 G während 40 Minuten entfernt. Das erhaltene Sediment wurde in destilliertem Wasser resuspendiert, nochmals zentrifugiert und bei 105°C bis zum konstanten Gewicht zur Bestimmung der Zellmasse getrocknet. Die während der ersten Zentrifugierung erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde zu Isopropanol (3 Volumina) gegeben und das ausgefällte Polysaccharid wurde gesammelt und gefriergetrocknet. Es wurde eine l°/oige (GewVVol.) Lösung des gefriergetrockneten zellfreien polyfreien Polysaccharids hergestellt und der Konsistenz-Index der Lösung wurde bestimmt.

Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Luft wurde durch die gerührte Kultur in einer Menge von 1,4 l/iiiin geleitet und die Temperatur betrug 36°C, der Verdünnungsgrad 0,13 h"¹ und der pH 7,4 (eingestellt durch automatische Zugabe von 1 m NaOH) Schaumbildung wurde durch Zugabe eines Antischaum-

Neu-	ZcII-	Gebildetes	Konsi	Konsistenz-Index
trase	masse	Polysac	stenz-	einer l%igen
		charid	Index der	Lösung des zell
			Kultur	freien Poly
				saccharids
(mg/1)	(g/l)	(g/l)	(cp)	(cp)

O	4.1
6	3,5
12	3,1

10,9
8,6
6,2

2500

23,5
76
2030

Beispiel 2

Es wurden zwei kontinuierliche Kulturen des Stammes Azotobacter vinelandii, der entwickelt worden war aus Azotobacter vinelandii NCIB 9068, unter Ver-

Wendung des Kulturmediums und der Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, angesetzt. Zu einer Kultur wurde eine Protease-Zubereitung Alcalase (von der Novo Industri A/S, 1,5 Anson-Einheiten/g), bis zu einer Endkonzentration von 6 mg/1 gegeben, während zu der anderen Kultur keine Protease gegeben wurde. Nachdem sich in den Kulturansätzen konstante Bedingungen eingestellt hatten, stellte man fest, daß die Viskosität in der mit Protease behandelten Kultur höher war als bei der Kontrollprobe, die nicht mit Protease behandelt worden war, während die Polysaccharidkonzentration der Kulturen gleich war. Darüber hinaus war die Viskosität der Lösungen aus dem zellfreien PoIysaccharid, das aus der mit Protease behandelten Kultur erhalten worden war, höher als bei der Kontrollprobe (Tabelle 2).

Tabelle 2

Alca lase	Zell masse	Gebildetes Polysac- charid	Beis	Kor.si- stenz- Index der Kultur	Konsistenz-Index einer 1^u/f>igen lösung des zell freien Poly saccharids
(mg/1)	(g/l)	(g/l)	(cp)	(cp)
O 6	4,4 3,9	17,6 18,4	30 1100	23 780
		piel 3

Tabe'le 3
Probe

Konsistenz-Index einer
l%igen
Lösung des
zellfreien
Polysaccharids

(cp)

Gehalt an

4.5-unge-

sättigter

Uronsäure

(in % der

Gesamt-

Uronsäure)

als die Probe, die vor der Zugabe der Protease genommen worden war. Es ist ersichtlich, daß die Protease es ermöglicht, ein Produkt mit höherer Viskosität zu erhalten. Der abnehmende Gehalt an 4,5-ungesättigter Uronsäure, die durch die Wirkung der Alginat-Liase in Beispiel 2 erfolgt, scheint anzuzeigen, daß durch die Protease der Abbau des Polysaccharids durch die Alginat-Liase kontrolliert wird. Man erhält deshalb ein Polymer mit höherer Lösungsviskosität.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird der Anstieg der Viskosität des Polysaccharids, das aus einem Kulturansatz von Azotobacter vinelandii, die in Gegenwart von Protease wachsen gelassen wurde, gezeigt.

Azotobacter vinelandii NCIB 9068 wurde in einem Kulturansatz in einem belüfteten gerührten Fermentationstank, enthaltend 8 I des nachfolgenden Mediums, wachsen gelassen:

Ein ähnlicher Versuch wurde unter Verwendung von Alcalase (von der Novo Industri A/S. 6 Anson-Einheiten/g) in einer Menge von 0,01 g/l durchgeführt, wobei der Konsistenz-Index und der Gehalt an 4,5-ungesättigter Uronsäure des zellfreien Polysaccharids vor und nach der Enzymzugabe gemessen wurde.

Das 4,5-ungesättigte Uronsäure-Produkt mit Alginat-Liase-Aktivität wurde bewertet unter Verwendung der Perjodnt-Thiobarbitursäure-Versuchsanordnung, wie sie von Weissbach und Hurwitz (Journal of Biological Chemistry, 234, 1958, 705—709) beschrieben wird: 0,01 μΜο! der 4,5-ungesättigten Uronsäure zeigte eine Extinktion von 0,29 bei einer Wellenlänge von 549 nm (Preiss und Ashwell, Journal of Biological Chemistry. 237, 1*52, .509—316) und des wurde als Standard verwendet; der Gehalt an 4,5-ungesättigten Uronsäure-Resten wurde bestimmt und als Prozentsatz der gesamten Uronsäure-Reste ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 nachfolgend gezeigt.

1. vor der Alcalase- 4,6 0,38
Zugabe

2. nach der Alcalase- 2,5 χ IO³ 0,02
Zugabe

Die Probe des zellfreien Polysaccharids, die nach der Zugabe der Protease zu der Kultur erhalten wurde, ergab Lösungen mit einer sehr viel höheren Viskosität Rohrzucker
KH,PO₄
K₂HPO₄
MgSO₄ 7
NaCl
Na^MoO₄
CaCN 2 H,O
FeCh4 HO

H,O

40 g/l
C.064 g/l
0.25 g/l
0,4 g/i
0,2 g/l
0,008 g/l
0,024 g/I
0.068 g/l

Zu zwei Fermentationsansätzen wurde Alcalase (1,5 Anson-Einheiten/g) bis zu einer Endkonzentration von 0.1 g/l bzw. 0,01 g/l gegeben, während eine gleiche Kultur ohne Zugabe von Protease als Konirolle bei diesem Versuch diente. Die Fermentationsparameter waren die folgenden: Temperatur 36°C, pH 7,4, eingestellt durch automatische Zugabe von 2 m NaOH, Durchflußgeschwindigkeit der Luft 4 l/min. Schaumbildung wurde durch Zugabe eines Silikon-Antischaummittels verhindert. Die Rührgeschwindigkeit betrug anfangs 350 Upm. wurde jedoch im Laufe der Fermentation erhöht, um den spezifischen Respirationsgrad des Organismus 'm Bereich von 6 bis Ά mmol Oj/h/g Zelle zu halten.

Die Fermentation wurde durch Zugabe von 160 ml einer Schüttelflaschenkultur des Organismus eingeleitet und 40 Stunden fortgeführt. Nach 40 Stunden wurde der durch Isopropanol ausfällbare Teil der Kulturbrühe bestimmt. Eine zellfreie Probe des gebildeten Polysaccharids wurde erhalten, und der Konsistenz-Index einer l°/oigcn (Gew./Vol.) Lösung dieser Probe wurde bestimmt (Tabelle 4).

Tabelle 4

Isopropanol·

ausfällbarc

Substanz

(g/l)

Konsistenz-Index

einer l°/oigen Lösung eines

/"cllfreien Polysaccharids

(cp)

Kultur I
keine
Alcalase
zugegeben

hi Kultur 2
0,01 g/l
Alcalase
zugegeben

7.5

6.6

22

46

	beil	Isoprnpann! iiusf.illharc Siihsliin/	K(IIlSlSItIl/ /cllireien I	Im '(ils	μ eines inils
	(f I)	(ep)
	5^U	500

Kultur i 0.1 g/l Akalnse	.le\ I .(»SUM satchi
/tigege

I! ι· ι s ρ ι e I )

In diesem Beispiel wird die Viskosit.itsstabilisien.in>.' Min A/'iiohiiciLT vinelandn Kiillurbrühen beim Lagern in (icfK'rmiirt einer l'rolease ^e/cigl

/ii Proben einer I ernienl.ilicnsbnihe (20 ml) ,ms einer l'ciKsiicchiiriil-hiitlenilen knnüniiieriiL'Men Kniiiir um \/i)lobiicter vinelandii NCIB MOhH wurde eine l.osiini.¹ \(in Akalase {b Alison l.inlieiten g) (0.2 ml) bi-/ii einer I jidkon/eiiii ,iiion tier Akalase von 0.1 g/l gegeben. Min gleiches Volumen Wasser wurde /u der .intlcrcn Probe gegeben, die als unbehandelte Konirollprobe diente. Die Proben wurden bei 30"C inkubiert und die scheinbare Viskosität bei einem Scher-Cinid Min 4b sek periodisch mit einem Wells-Firnokfield Modell I.VT-Kegel- Lind Plattcn-Viskosinieter gemessen. Die scheinbare Viskosität der mit Protease behandelten firiihe lag wahrend des Versuchs im gleichen Uereu'h. u.ihreiul die ilei iinbehanck Ilen !truhe erheb hch abfiel ( I ,ibeüe Ί)

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid-bildenden Stammes von Azotobacter vinelandii in einem Nährmittel dafür, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids überwacht wird durch Einbringen einer Protease mit einer proteolytischen Aktivität beim pH der Kulturbrühe in die Kulturbrühe während der Kultivierung und/oder nach der Kultivierung aber vor der Isolierung des Produktes aus der Brühe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease in einer Menge von 0,005 bis 1,0 Anson-Einheiten pro Liter Brühe verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease während der Kultur in einer Menge von 0,005 bis 0,5 Anson-Einhcitcn pro Liter Brühe eingegeben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kultur in einem Fermentationsgefäß durchgeführt wird, vorzugsweise als kontinuierliche Fermentation und vorzugsweise bei einem pH von etwa 7,4, und die r> Kulturbrühe anschließend von dem Fermentationsgefäß abgezogen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids überwacht wird durch Zugabe von Protease und zwar vorzugsweise einer neutralen oder alkalischen Protease zu der Kulturbrühe, nachdem diese aus dem Fermentationsgefäß abgezogen aber bevor das Polysaccharid daraus isoliert worden ist.