DE2809777A1

DE2809777A1 - Verfahren zur herstellung von polysaccharid 5

Info

Publication number: DE2809777A1
Application number: DE19782809777
Authority: DE
Inventors: Trevor Rodney Jarman; Renton Clive Righelato
Original assignee: Tate and Lyle PLC
Current assignee: Tate and Lyle PLC
Priority date: 1977-03-14
Filing date: 1978-03-07
Publication date: 1978-09-21
Also published as: IT7821133A0; US4234688A; NZ186676A; ZA781472B; FI780797A; IL54259A0; DK111278A; AU3410978A; JPS53113854A; SE7802840L; JPS5632917B2; DE2809777C3; NO780862L; NL7802767A; FR2384020A1; BE864823A; GB1548078A; DE2809777B2; LU79222A1

Description

30 368 o/wa

TÄTE & LYLE LIMITED, LONDON/ENGLAND

Verfahren zur Herstellung von Polysaccharid 5

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines mikrobischen Alginats von bestimmter Viskosität.

Ein mikrobisches Alginat ist ein Polysaccharid, das durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Spezies Azotobacter vinelandii/ z.B. durch ein Verfahren, wie es in der GB-PS 1 331 771 beschrieben wird, hergestellt werden kann. Das Produkt ist ein partiell acetyliertes variables Block-Copolymer von 1-4-verbundenen D-Mannuronsäure- und L-Guluronsäure-Resten, im allgemeinen mit einem Acetylierungsgrad von .etwa 20 % und,

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abgesehen von den Acetylgruppen, ist es chemisch ähnlich der Alginsäure, die aus gewissen Spezies von braunem Seetang extrahiert werden kann.

Ein Problem bei der Herstellung von mikrobischem Alginat, insbesondere wenn man kontinuierliche Kulturbedingungen mit hoher Zellenmasse und ' hoher Polysaccharidproduktivität verwendet, ist darin zu sehen, dass die erhaltene Polysaccharidlösung eine verminderte Viskosität hat. Dies ist vermutlich das Ergebnis einer Verminderung des Durchschnittsmolekulargewichtes des Polysaccharids, das durch Abbau durch das Enzym Alginate-Liase verursacht wird (siehe Haug und Larsen, Carbohydrate Research, V7, 1971, S. 297-308. Man nimmt an, dass dieses Enzym extrazellulär wirkt und der Abbau kann erheblich die Viskosität der Lösung beeinflussen und damit die kommerzielle Verwendbarkeit des Polysaccharids.

Es wurde nun gefunden, dass man den Abbau des Polysaccharids einstellen und damit die Viskosität des Produktes erhöhen kann durch Zugabe eines proteolytischen Enzyms zu der Kulturbrühe. Das proteolytische Enzym kann in das Kulturmedium, in dem die Mikroorganismen wachsen, eingebracht werden, oder es wird der Kulturbrühe auf irgendeine andere Weise während der Kultivierung der Mikroorganismen zugegeben oder man gibt es sogar zu der Brühe nach der Kultivierung, aber bevor das Polysaccharid isoliert wird.

Erfindungsgemäss wird somit ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid produzierenden Stammes von Azotobacter vinelandii in einem neutralen Medium dafür gezeigt, bei dem die Lösungsviskosität des

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hergestellten Polysaccharids durch Einverleiben eines proteolytischen Enzyms mit einer proteolytischen Aktivität bei dem pH der Kulturbrühe während der Kultur und/oder nach der Kultur, aber vor der Isolierung des Polysaccharidprodukts eingestellt wird.

Die Verwendung eines proteolytischen Enzyms bei einer einen lebensfähigen Mikroorganismus enthaltenden Fermentation ist eine überraschende Neuheit auf dem Gebiet der Polysaccharid-Herstellung. Dies wird ersichtlich wenn man bedenkt, dass bei einer bekannten Verwendung eines proteolytischen Enzyms, wie alkalischer Protease, Zelltrümmer aus Xanthanharζ-Lösungen, die durch Kultivierung von Mikroorganismusstämmen von Genus Xanthomonas gebildet wurden, entfernt werden. Bei diesen bekannten Verfahren werden mikrobische Zellen und Zellfragmente, die physikalisch schwer zu entfernen sind, aus Xanthanharζ-Lösungen in situ durch Zugabe des Enzyms abgebaut. Ganz im Gegensatz zu dieser Verwendung einer Protease für den Abbau von mikrobischen Zellen wurde überraschenderweise festgestellt, dass ein derartiges Enzym einer Fermentation von A_^_ vinelandii so zugesetzt werden kann, dass die Viskosität des Produktes kontrolliert wird, ohne die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus erheblich zu beeinflussen. In einigen Fällen kann ein geringer Verlust der Polysaccharidkonzentration festgestellt werden, wie dem Anteil der durch Isopropanol ausgefällt wird, aber dies wird mehr als ausgeglichen durch die erhöhte Viskosität des Produktes.

Verschiedene proteolytische Enzyme haben optimale Aktivität bei verschiedenen pH-Werten. Diejenigen, deren optimale Aktivität bei einem pH oberhalb des Neutralpunktes liegt, werden als

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alkalische Proteasen bezeichnet und solche, deren optimale Aktivität beim Neutralpunkt vorliegt, werden neutrale Proteasen genannt usw. Jede dieser verschiedenen proteolytischen Enzyme kann, allgemein gesagt, beim erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass sie eine ausreichende Aktivität bei dem pH der Kulturbrühe entwickeln, der im allgemeinen bei etwa 7 liegt. Das proteolytische Enzym kann aus irgendeiner zugänglichen Quelle stammen, jedoch sind bakterielle und Pilz-Proteasen besonders geeignet, beispielsweise solche, die von Novo Industri A/S Copenhagen, Dänemark unter dem Handelsnamen "Alcalase" und "Neutrase" vertrieben werden. Bei kontinuierlichen Kulturen arbeitet man vorzugsweise bei einem pH von etwa 7,4 mit neutraler oder alkalischer Protease.

Die Proteasen sind nicht nur brauchbar um die Viskosität des in der Kultur gebildeten Polysaccharids zu erhöhen, sondern sie sind auch in der Lage, das Polysaccharid in Volumina der Kulturbrühe, die für die Verarbeitung gelagert werden, zu stabilisieren. Dadurch kann man ein Problem überwinden, das besonders bei kontinuierlichen Kulturverfahren auftritt, wenn Ansätze von Kulturbrühen aus dem Fermentationsgefäss entnommen und dann eine beachtliche Zeit gelagert werden, bevor das Polysaccharid isoliert wird und wobei man dann feststellt, dass die Viskosität des Produktes erheblich abgesunken ist. Gemäss dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid produzierenden Stammes von A^ vinelandii in einem Nährmedium dafür in einem Fermentationsgefäss und nachfolgend das Abziehen der Kulturbrühe aus dem Fermentationsgefäss gezeigt, bei dem die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids

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dadurch überwacht wird, dass man zu der Kulturbrühe,nachdem diese vom Fermentationsgefäss abgezogen wurde, aber vor der Isolierung des Polysaccharidproduktes ein proteolytisches Enzym mit proteolytischer Aktivität beim pH der Brühe zugibt. Auf diese Weise kann die eigentliche Kultur in Abwesenheit eines Enzyms durchgeführt werden oder mit niedrigem Enzymniveau und dann wird die Menge des proteolytischen Enzyms in der Kulturbrühe vor der Lagerung erhöht.

Die Menge an proteolytischem Enzym, das bei den Ausführungsformen der Erfindung verwendet wird, hängt natürlich von dem Grad der benötigten Viskositätsüberwachung und der relativen Aktivität des Enzyms ab. Es sollten unnötig hohe Enzymniveaus während der Kultivierung des Mikroorganismus vermieden werden, um jedes Risiko zu vermeiden, die Lebensfähigkeit der Mikroorganismuszellen zu beeinflussen, jedoch können höhere Mengen verwendet werden, wenn das Enzym nach der Kulturbildung zugegeben wird, beispielsweise zu der zum Lagern abgezogenen Brühe, denn dann ist die Lebensfähigkeit des Mikroorganismus nicht mehr wichtig. Im allgemeinen verwendet man vorzugsweise das proteolytische Enzym in einer Menge von 0,005 bis 1,0 Anson-Einheiten pro Liter Brühe, wobei ein Bereich von 0,005 bis 0,5 Anson-Einheiten pro Liter besonders bevorzugt wird für die Anwendung während der Kultur des Mikroorganismus (die Anson-Einheit wird definiert als die Menge eines Enzyms, welche 1 mäq. Tyrosin pro Minute aus denaturiertem Hämaglobin bei 30°C und einem pH von 7,5 frei macht).

Beispiel 1

In diesem Beispiel wird die Erhöhung der Lösungsviskosität eines

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Rohrzucker	4	2H₂O
KH₂PO	4	4H₂O
K₂HPO	7H₂O
MgSO₄
NaCl	Na₂MoO₄
CaCl₂
FeCl₂

Polysaccharidproduktes, das aus einer kontinuierlichen Kultur von Azotobacter vinelandii erhalten wurde, durch die Zugabe einer Protease zu der Kultur gezeigt.

Drei 2-Liter kontinuierliche Kulturen Azotobacter vinelandii NCIB 906 8 wurden in einem Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung kultiviert.

60 g/l 0,064 g/l 0,26 g/l 1,6 g/l 1,6 g/l 0,008 g/l 0,34 g/l 0,017 g/l

Luft wurde durch die gerührte Kultur in einer Menge von 1,4 l/min geleitet und die Temperatur betrug 36°C, der Verdünnungsgrad 0,13h und der pH 7,4 (eingestellt durch automatische Zugabe von 1 m NaOH). Schaumbildung wurde durch Zugabe eines Antischaummittels auf Silikonbasis kontrolliert. Unter diesen Bedingungen lag der spezifische Respirationsgrad des Organismus im Bereich von 20 bis 30 inmol O₂/h/g Zelle.

Die Konzentration der durch Isopropanol ausfällbaren Substanz in der Kulturbrühe wurde wie folgt bestimmt: Eine Probe der Kulturbrühe (25 ml) wurde zu Isopropanol (75 ml) gegeben, die Mischung wurde geschüttelt und der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtern durch ein vorher gewägtes Filtertuch aus Glasfaser gesammelt. Das Filtertuch mit dem Niederschlag wurde

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bei 45°C im Vakuum bis zum konstanten Gewicht getrocknet.

Der Konsistenz-Index der Kulturbrühe wurde durch Messung der scheinbaren Viskosität der Kulturbrühe in einem Bereich

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von Seher-Graden zwischen 1'sek. und 1.000 sek. unter Verwendung eines Wells-Brookfield-Modells LVT-oder Modell HBT-Kegel- und . Platten-Viskosimeters bestimmt. Der Logarithmus der scheinbaren Viskosität wurde dann gegen den Logarithmus des Seher-Grades aufgetragen und die erhaltene Linie wurde extrapoliert zur Bestimmung des Konsistenz-Index (d.h. der scheinbaren Viskosität bei einem Seher-Grad von 1 sek. ).

Im Anschluss an die Zugabe einer Proteasezubereitung (Neutrase, 3 Anson-Einheiten/g von der Novo Industri A/S,Copenhagen,Dänemark) bis zu einer Konzentration von 0,006 g/l bzw. 0,012 g/l in zwei der drei Kulturbrühen (wobei diese Konzentrationennachfolgend aufrecht erhalten wurden durch weitere Zugabe von Protease zu dem einfliessenden Kulturmedium) trat ein merklicher Anstieg der Kulturviskosität in diesen Brühen auf, obwohl die Konzentration an durch Isopropanol ausfällbaren Anteilen abnahm.

Proben der Kulturbrühe wurden nach 6 Verweilzeiten (2 Tage) entfernt, Natrium wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 m zugegeben und die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugieren mit 25.000 G während 40 Minuten entfernt. Das erhaltene Sediment wurde in destilliertem Wasser resuspendiert, nochmals zentrifugiert und bei 105⁰C bis zum konstanten Gewicht zur Bestimmung der Zellmasse getrocknet. Die während der ersten Zentrifugierung erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde zu Isopropanol (3 Volumina) gegeben und das ausgefällte Polysaccharid

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wurde gesammelt und gefriergetrocknet. Es wurde eine 1 %-ige (Gew./Vol.) Lösung des gefriergetrockneten zellfreien Polyfreien Polysaccharids hergestellt und der Konsistenz-Index der Lösung wurde bestimmt.

Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Neutrase	Zellmasse	gebildetes	Konsistenz-	Konsistenz-
(g/i)	(g/i)	Polysaccha-	Index der	Index einer
		rid (g/l)	Kultur (cp)	1 %-igen Lö
				sung des zell
				freien Poly
				saccharids (cp)
O	4,1	10,9	18	23,5
6	3,5	8,6	85	76
12	3,1	6,2	2500	2030

Beispiel 2

Es wurden zwei kontinuierliche Kulturen des Stammes Azotobacter vinelandii, der entwickelt worden war aus Azotobacter vinelandii NCIB 9068, unter Verwendung des Kulturmediums und der Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, angesetzt. Zu einer Kultur wurde eine Protease-Zubereitung Alcalase (von der Novo

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Industri A/S, 1,5 Anson-Einheiten/g), bis zu einer Endkonzentration von 6 mg/1 gegeben, während zu der anderen Kultur keine Protease gegeben wurde. Nachdem sich in den Kulturansätzen konstante Bedingungen eingestellt hatten, stellte man fest, dass die Viskosität in der mit Protease behandelten Kultur höher war als bei der Kontrollprobe, die nicht mit Protease behandelt worden war, während die- Polysaccharidkonzentration der Kulturen gleich war. Darüber hinaus war die Viskosität der Lösungen aus dem zellfreien Polysaccharid, das aus der mit Protease behandelten Kultur erhalten worden war, höher als bei der Kontrollprobe (Tabelle 2).

Tabelle 2

Alcalase	Zellmasse	4	,4	gebildetes	Konsistenz-	Konsistenz-	1 %-
(g/i)	(g/i)	3	,9	Polysaccha	Index der	Index einer	des
			rid (g/l)	Kultur (cp)	igen Lösung	PoIy-
					zellfreien	(cp)
					saccharids
O		17,6	30	23
6	18,4	1100	780

Beispiel 3

Ein ähnlicher Versuch wurde unter Verwendung von Alcalase (von der Novo Industri A/S, 6 Anson-Einheiten/g) in einer Menge von

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0,01 g/l durchgeführt, wobei der Konsistenz-Index und der Gehalt an 4,5-ungesättigter Uronsäure des zellfreien Polysaccharids vor und nach der Enzymzugabe gemessen wurde.

Das 4,5-ungesättigte Uronsäure-Produkt mit Alginat-Liase-Aktivität wurde bewertet unter Verwendung der Perjodat-Thiobarbitursäure-Versuchsanordnung, wie sie von Weissbach und Hurwitz (Journal of Biological Chemistry, 234, 1958, 705-709) beschrieben wird: 0,01 umol der 4,5-ungesättigten Uronsäure zeigte eine Extinktion von 0,29 bei einer Wellenlänge von 549 nm (Preiss und Ashwell, Journal of Biological Chemistry, 237, 1962, 309-316) und dies wurde als Standard verwendet; der Gehalt an 4,5-ungesättigten Uronsäure-Resten wurde bestimmt und als Prozentsatz der gesamten Ursonsäure-Reste ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 nachfolgend gezeigt.

Tabelle 3

Probe	vor der Alca-	Konsistenz-Index	Gehalt an	4,5-unge-
	lase-Zugabe	einer 1 %-igen Lö	sättigter	Uronsäure
	nach der Alca-	sung des zellfreien	(in % der	Gesamt-
	lase-Zugabe	Polysaccharids	Uronsäure)
	(cp)
1.
	4,6	0	,38
2.
	2,5 χ 10^J	0	,02

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y< --73

Die Probe des zellfreien Polysaccharids, die nach der Zugabe der Protease zu der Kultur erhalten wurde, ergab" Lösungen mit einer sehr viel höheren Viskosität als die Probe, die vor der Zugabe der Protease genommen worden war. Es ist ersichtlich, dass die Protease es ermöglicht, ein Produkt mit höherer Viskosität zu erhalten. Der abnehmende Gehalt an 4,5-ungesättigter üronsäure, die durch die Wirkung der Alginat-Liase in Beispiel 2 erfolgt, scheint anzuzeigen, dass durch die Protease der Abbau des Polysaccharidsdurch die Alginat-Liase kontrolliert wird. Man erhält deshalb ein Polymer mit höherer Lösungsviskosität.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird der Anstieg der Viskosität des Polysaccharide , das aus einem Kulturansatz von Azotobacter vinelandii, die .in Gegenwart von Protease wachsen gelassen wurde, gezeigt.

Azotobacter vinelandii NCIB 9068 wurde in einem Kulturansatz in einem belüfteten gerührten Fermentationstank, enthaltend 8 1 des nachfolgenden Mediums, wachsen gelassen:

Rohrzucker . 40 g/l

KH₃PO₄ 0,064 g/l

K₂HPO₄ 0,25 g/l

MgSO₄7H₂O 0,4 g/l

NaCl 0,2 g/l

Na₃MoO₄ 0,008 g/l

CaCl₂2H₂O 0,024 g/l

FeCl₂4H₂O . 0,068 g/l

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Zu zwei Fermentationsansätzen wurde Alcalase (1,5 Anson-Einheiten/g) bis zu einer Endkonzentration von 0,1 g/l bzw. 0,01 g/l gegeben, während eine gleiche Kultur ohne Zugabe von Protease als Kontrolle bei diesem Versuch diente. Die Fermentationsparameter waren die folgenden: Temperatur 36°C, pH 7,4, eingestellt durch automatische Zugabe von 2 m NaOH, Durchflussgeschwindigkeit der Luft 4 l/min. Schaumbildung wurde durch Zugabe eines Silikon-Antischaummittels verhindert. Die Rührgeschwindigkeit betrug anfangs 350 Upm, wurde jedoch im Laufe der Fermentation erhöht, um den spezifischen Respirationsgrad des Organismus im Bereich von 6 bis 14 mmol O₂/h/g Zelle zu halten.

Die Fermentation wurde durch Zugabe von 160 ml einer Schüttelflaschenkultur des Organismus eingeleitet und 40 Stunden fortgeführt. Nach 40 Stunden wurde der durch Isopropanol ausfällbare Teil der Kulturbrühe bestimmt. Eine zellfreie Probe des gebildeten Polysaccharids wurde erhalten und der Konsistenz-Index einer 1 %-igen (Gew./Vol.) Lösung dieser Probe wurde bestimmt (Tabelle 4).

Tabelle 4

	Isopropanol- ausfällbare Substanz (g/i)	Konsistenz-Index einer 1 %-igen Lö sung eines zellfreien Polysaccharids (cp)
Kultur 1 keine Alcalase zugegeben	7,5	22

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Fortsetzung Tabelle 4

Beispiel 5

Kultur 2	6,6	46
0,01 g/l Alcalase
zugegeben
Kultur 3	5,9	500
0,1 g/l Alcalase
zugegeben

In diesem Beispiel wird die Viskositätsstabilisierung von Azotobacter vinelandii Kulturbrühen beim Lagern in Gegenwart einer Protease gezeigt.

Zu Proben einer Fermentationsbrühe (20 ml) aus einer PoIysaccharid-bildenden kontinuierlichen Kultur von Azozobacter vinelandii NCIB 9068 wurde eine Lösung von Alcalase (6 Anson-Einheiten/g) (0,2 ml) bis zu einer Endkonzentration der Alcalase von 0,1 g/l gegeben. Ein gleiches Volumen Wasser wurde zu der anderen Probe gegeben, die als unbehandelte Kontrollprobe diente. Die Proben wurden bei 30°C inkubiert und die scheinbare Viskosität bei einem Seher-Grad von 46 sek.~ periodisch mit einem Wells-Brookfield Modell LVT-Kegel- und Platten-Viskosimeter gemessen. Die scheinbare Viskosität der mit Protease behandelten Brühe lag während des Versuchs im gleichen Bereich, während die der unbehandelten Brühe erheblich abfiel. (Tabelle 5).

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	Tabelle 5	(Stunden) 1 2	3 '	' 4 1/2
		35 37 26 20	38 18	40 17
Scheinbare Viskosität bei einem Seher-Grad von 46 sek.~1
Protease-behandelte Brühe unbehandelte Brühe
Zeit 0
39 46

Claims

30 368 o/wa TÄTE & LYLE LIMITED, LONDON/ENGLAND Verfahren zur Herstellung von PoIysaccharid 5 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Polysaccharids durch Kultivieren eines Polysaccharid-bildenden Stammes von Azotobacter vinelandii in einem Nährmittel dafür, dadurch gekennzeichnet , dass die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids überwacht wird durch Einbringen einer Protease mit einer proteolytischen Aktivität beim pH der Kulturbrühe in die Kulturbrühe während der Kultivierung und/oder nach der Kultivierung aber vor der Isolierung des Produktes aus der Brühe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die Protease in einer Menge von 0,005 bis 1,0 Anson-Einheiten pro Liter Brühe verwendet wird.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease während der Kultur in einer Menge von 0,005 bis 0,5 Anson-Einheiten pro Liter Brühe eingegeben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur in einem Fermentationsgefäss durchgeführt wird, vorzugsweise als kontinuierliche Fermentation und vorzugsweise bei einem pH von etwa 7,4, und die Kulturbrühe anschliessend von dem Fermentationsgefäss abgezogen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösungsviskosität des gebildeten Polysaccharids überwacht wird durch Zugabe von Protease und zwar vorzugsweise einer neutralen oder alkalischen Protease zu der Kulturbrühe, nachdem diese aus dem Fermentationsgefäss abgezogen aber bevor das Polysaccharid daraus isoliert worden ist.

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