CN86100490B - 利用抗氨固氮菌生产富硒单细胞蛋白, 维生素e和菌肥的方法 - Google Patents

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Abstract

应用人工诱变技术培育出一组抗氨固氮菌８５１黄菌株。该组菌具有明显抗氨固氮能力，能强力固定大气氮，在有化合态氮的培养基中，仍保持相当高的固氮酶活性，用该组菌作为生产菌株，在本发明所设计的培养基（甘露醇－酵母膏培养基，甘露醇培养基，淀粉培养基和废糖蜜培养基）中培养、可分别生产富硒、锌、钙及多种维生素的单细胞蛋白，维生素Ｅ和菌肥，该菌培养液对人类防癌延寿具有进一步的开发利用价值。

Description

利用抗氨固氮菌生产富硒单细胞蛋白, 维生素E和菌肥的方法
本发明是关于工业发酵的一种方法，特别是关于利用一组来自维氏固氮菌（Azotobacter Vinelandii）的人工诱变菌株-抗氨固氮菌：851黄作为工业发酵的生产菌株来进行生产的方法，该抗氨固氮菌能利用大气氮生产富单细胞蛋白、维生素的培养液和细菌肥料。
为了缓和当今世界范围内的蛋白质不足的危机，人们进行过各种尝试，其中采用生物学方法生产单细胞蛋白已取得成功，该方法是用各种微生物在各种基质上培养来生产单细胞蛋白。Donald O.Hitzman，Bartlesville Okla（U.S.Patent Documents4，302，542，1981）利用嗜热细菌进行混合发酵，发酵是以乙醇等醇类化合物作为碳源和能源来生产单细胞蛋白。此外，目前世界各国科学家都在研究生物固氮问题，希望由自生固氮菌来帮助人类将空气中的氮直接变成蛋白质和肥料，以摆脱当今世界人口和食物的矛盾。由于自然界的固氮菌不抗氨，所以不具有推广利用的价值，这一事实是生物界共知的事实（Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，Eighth Edition，253～258）。至今在这一方面未见有突破的报导，也未见到有用固氮菌以大气氮作为氮源生产单细胞蛋白的报告。
本发明的目的是通过培育一种具有抗氨固氮能力的固氮菌（要求这种菌在培养基中或周围环境里虽有化合态形式的氮存在，仍具有相当高的固氮酶活性，能强力固定大气中的氮），及设计出适合于该菌生长的培养基，以达到用培育的菌株作为生产菌株，运用常规的工业发酵的生产方法生产出有工业价值的富硒、锌和多种维生素的单细胞蛋白，维生素E，细菌肥料及其一系列产品的方法。
本发明所涉及的抗氨固氮菌是用遗传学技术，经过人工诱变处理从维氏固氮菌（Azotobacter Vinelandii）中培育出一组具有明显抗氨固氮能力、能强力固定大气氮的变异菌851黄（1985年7月3日送交武汉中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No.85-004）。该组菌与原亲代菌株最根本的区别是在含有化合态氮的培养基中，甚至在有硫酸铵存在的情况下仍保持相当高的固氮酶活性（Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，Eighth Edition，253～258）（见实施例1、2、3）。
在本发明所设计的淀粉培养基中，用851黄作为生产菌种，可生产出富硒、锌和多种维生素的单细胞蛋白，其培养液中全氨基酸的含量为2～20mg/ml、硒1～5ppm、锌5～20ppm，还含有其它多种维生素;851黄还适合生产富含维生素E或与维生素E同样效果的营养液，它用甘露醇作为碳源，在本发明所使用的甘露醇-酵母膏培养基或甘露醇培养基中培养，其每100毫升培养液中维生素E的含量为：8.2～114毫克（试验室结果）;851黄也适于利用废糖蜜作为碳源，主要用于生产富含维生素C的单细胞蛋白，其培养液中全氨基酸的含量为2～5mg/ml。
本发明所提供的抗氨固氮菌，克服了固氮菌在有化合态氮存在的情况下，不能固定大气氮的问题，本抗氨固氮菌不仅是生产菌肥的良好菌株，而且，该组菌能直接利用淀粉，凡是含有淀粉的物质均可以作为该组菌生长之碳源（如甘薯、马铃薯、玉米等），用来生产富硒、富锌、多种维生素的单细胞蛋白及维生素E的工业生产菌株。
本发明所设计和使用的培养基为：
1，淀粉培养基
干淀粉 1-2%
含有淀粉的新鲜物质（甘薯，马铃薯等） 10-20%
或
含有淀粉的干物质（玉米粉等） 1-10%
酵母膏 0.04-0.08%
磷酸氢二钾 0.05-0.1%
硫酸镁 0.02-0.04%
氯化钠 0.02-0.04%
钼酸钠 10-20ppm
硼酸 10-20ppm
亚硒酸钠 5-20ppm
硫酸锌 5-20ppm
2，甘露醇培养基
甘露醇 1%
磷酸二氢钾 0.02%
硫酸镁 0.02%
氯化钠 0.02%
硫酸钙 0.02%
碳酸钙 0.5%
3，甘露醇-酵母膏培养基
甘露醇 1%
酵母膏 0.04%
磷酸氢二钾 0.05%
硫酸镁 0.02%
氯化钠 0.02%
钼酸钠 10ppm
硼酸 10ppm
4，废糖蜜培养基
废糖蜜 2-3%
碳酸钙 0.5%
钼酸钠 10ppm
硫酸亚铁 10ppm
该菌种可以用发酵罐进行通气培养，这种罐为一般发酵工业中常用的发酵罐，它带有搅拌和通气装置，可以依需要对所培养的培养物进行搅拌，使其所处的条件一致，也可以按需要通入经过滤的无菌空气，以满足细菌等微生物在发酵过程中对氧气的需要。将抗氨固氮菌851黄作为生产菌株，经过在种子培养基（本发明所设计和/或使用的培养基）中繁殖。即由小种、中种到大种的繁殖培养，再接种到装有预先经过消毒灭菌的生产用培养基（本发明所设计和/或使用的培养基）中培养36～110小时，在培养过程中通入过滤的无菌空气，通气量为1∶0.6～1.2，搅拌速度100～300转/分，培养温度25～30℃，培养结束并收获培养液。
以上所得到的培养液可按其需要，用不同的方法提取该培养液中的各种成分，如根据植物原料提取维生素E的原理，按浓缩维生素E的制造工艺，用环己烷等有机溶剂提取维生素E（见《维生素的制造》〔苏〕А.О施乃德曼著，韦庆昆、吴克文译，食品工业出版社，1956，342-355）。
培养液在80℃下直接烘干，其干物质为4-12%，其中蛋白质含量达15-52%（因培养基不同而有差异），也可以直接使用培养液来进一步的加工成其它产品（见实施例3、4、5）。
用此方法生产的抗氨固氮菌培养液（简称851培养液）喂养果蝇，其寿命比对照组延长一倍以上;用851培养液喂鸡，从5日龄小鸡开始饲喂，试验组鸡健康无病，生长快。
851培养液中含有抗衰老的物质，对小白鼠体内的肝抗脂质过氧化作用试验结果表明，该培养液与维生素E有等同效果，而抗衰老作用甚至超过维生素E（实施例5）
用851培养液对小白鼠几种组织蛋白合成试验结果表明有较好的促进作用。（实施例6）
对小白鼠抗化学致癌试验表明851培养液还有明显的防癌效果。（实施例7、8）
851培养液可用于开发更多的产品，该培养液用于制造鳗鱼、对虾、鸡、鸭、猪各种动物饲料添加剂，它不仅增加了饲料的营养，而且还能解决饲料的粘合问题;用于食品中作为添加剂，如饼干、软糖、面包、饮料、化妆品等。（实施例4）
用851培养液浇作物，植株的地上部分和根部比对照组生长得旺盛，且寿命延长。（实施例9）
本发明不限于以下实施例，其保护范围由权项要求限定。
实施例1
在含400毫升酵母膏的1000毫升固体培养基中分别加入硫酸铵100毫克、200毫克、300毫克，硫酸铵含量不同的培养基分装在接种瓶内，每瓶装10毫升培养基，制成斜面，用接种针挑一环菌落划在斜面上，30℃下培养24小时后乙炔还原法测其固氮酶活性为：
每1000ml培养基中 固氮活力（毫微克分子
含氮物量 乙烯/瓶小时）
400mg酵母膏+100mg（NH4）2SO4 8004
400mg酵母膏+200mg（NH4）2SO4 2425
400mg酵母膏+300mg（NH4）2SO4 690
注：每瓶细菌数为4.7×1014
实施例2
在100立升发酵罐中培养，采用5%玉米粉的淀粉培养基，投料为60立升，其中玉米粉的蛋白含量为10.63%，培养基中含玉米粉3公斤，酵母膏24克，磷酸氢二钾30克，硫酸镁12克，氯化钠12克，钼酸钠0.6克，硼酸0.6克，亚硒酸钠0.3克，硫酸锌0.6克。接菌量为1立升，菌龄为24小时，（小种→中种→大种，均按1%接种量，培养24小时作为种子培养物）培养温度30℃，搅拌速度250转/分，通气量1∶1.2，培养112小时后，培养液体积为52立升，关于851培养液生产过程的有关数据见本实施例表，从本表可看出该抗氨固氮菌在发酵罐中固定大气氮的能力强。培养112小时后放出培养液，每100毫升培养液中干物质为7克，干物质中含氮量为3.99%，蛋白质含量为25%。
实施例3
将该菌在摇瓶中培养24小时，接种于100立升发酵罐（投料60立升），接种量为3.2升。（种子培养物的培养方法同实施例2）接种后培养33小时，其固氮酶活力为52492毫微克分子乙烯/2ml.hr。将60立升的培养液全部接种于2吨发酵罐（投料1吨），接种后的固氮酶活力为521.2毫微克分子乙烯/2ml.hr，接种后12小时的固氮酶活力为3715毫微克分子乙烯/2ml.hr，接种后18小时的固氮酶活力为5344毫微克分子乙烯/2ml.hr，此时将2吨罐的培养液装入20吨空气提升式发酵罐培养（投料5吨），该菌在20吨空气提升式发酵罐中的固氮酶活力见下表。
851黄抗氨固氮菌在20吨发酵罐中发酵产物的固氮酶活力
培养时间（hr） 4 8 12 16 20 24 28 32
固氮酶活力＊ 67 124 449 2942 6743 7491 22232 26752
培养时间（hr） 36 40 44 48 56 60 64 68
固氮酶活力 18184 5016 8566 8630 5046 5016 4772 7084
＊固氮酶活力单位为毫微克分子乙烯/2ml.hr
该生产实例亦是采用淀粉培养基，其玉米粉含量为5%、酵母膏含量0.04%，培养64小时的培养物呈胶状固形物，主要由β羟基丁酸和多糖等构成，加热后溶解，常温下保持胶状固形物态，该胶状固形物泡在常温水中130小时不崩散、不腐败。它可作为鱼饲料的粘合剂、防腐剂，还可以用该胶状培养液加入一般鱼饲料配制成一种新型的胶状饲料，直接投放喂养，降低成本节省人工。
实施例4
以下是分别用5%黄豆饼粉、20%新鲜甘薯为培养基进行中试生产，所得的培养液不经任何处理，取沉淀物经远红外烘干后，用酸水解法测其全氨其酸含量的结果。
样品名称 851豆饼粉培养液 851甘薯培养液
干物质 干物质
含量% 含量%
天门冬氨酸 5.3667 1.976
苏氨酸 2.8352 0.9826
丝氨酸 2.2055 0.7854
谷氨酸 6.6705 2.3929
脯氨酸 1.8177 0.6708
甘氨酸 2.8808 1.0712
丙氨酸 4.2791 1.4937
胱氨酸 0.2301 0.2801
缬草氨酸 3.1889 1.2550
甲硫氨酸 0.9191 0.1765
异亮氨酸 2.8086 0.8444
亮氨酸 4.5656 1.4661
色氨酸 1.9670 0.8977
苯丙氨酸 2.0808 2.9179
赖氨酸 2.0878 0.8640
色氨酸 0.0856 0.0908
组氨酸 1.0669 0.3535
精氨酸 3.0449 0.9265
总氨基酸量 48.817 19.4451
从以上结果可看到，虽然培养物经过酸水解但仍能测出色氨酸含量，可见851培养液中色氨酸含量是相当多的，否则是测不出来的。
851黄抗氨固氮菌在黄豆饼粉培养基中生长良好，它能分解豆科作物的蛋白质。使培养液发出鲜腥味，可用于开发＊油，人造鱼松等产品。
用14.5kg的851甘薯培养液代替4kg鸡蛋所制的桔子饼干中，851培养液占8%，测其全氨基酸含量，与加鸡蛋制的桔子饼干比较还略高些，详见下表：
桔子饼干
样品名称 加鸡蛋 加851
含量% 含量%
天门冬氨酸 0.4498 0.5442
苏氨酸 0.2966 0.3362
丝氨酸 0.4797 0.5612
谷氨酸 3.7541 3.9557
脯氨酸 1.2465 1.1757
甘氨酸 0.4404 0.4163
丙氨酸 0.4096 0.3692
胱氨酸 0.3360 0.2778
缬草氨酸 0.5242 0.5959
甲硫氨酸 0.0756 0.1599
异亮氨酸 0.3418 0.4594
亮氨酸 0.6933 0.7661
色氨酸 0.6507 0.6464
苯丙氨酸 1.4949 1.3174
赖氨酸 0.4328 0.4654
组氨酸 0.2312 0.2358
精氨酸 0.4130 0.4536
总氨基酸量 12.2701 12.7369
用851甘露醇培养液加琼脂、糖、香精制成淡黄色的软糖，脆而可口;用851用甘薯培养液加琼脂、糖、香精制成棕色软糖，有别具一格的风味;用加0.5%葡萄糖，生产出胶状的玉米粉培养液或甘薯培养液可不用琼脂，直接调色、香、味即可制成各式各味的凉糕。
实施例5
为确定851培养液抗衰老效果，在小白鼠体内进行抗肝脂质过氧化的试验，结果如下表所示：
分组 缺维生素E 补维生素E 851甘露培养液
例数 16 ▲18△ ★18
结果 378.2±244.1 161.2±17.2 140.2±28.2
MDAnmol/g肝
（M±S.d）
与缺V.E组比：▲P＜0.01★P＜0.001
与851甘露醇培养液比：△P＜0.02
M±S.d：M为平均数，sd为标准差
由表可见，维生素E组和851甘露醇培养液均使动物肝脂质过氧化产物-一丙二醛下降一半以上;而851甘露醇培养液的作用比V.E更强。
注：①补维生素E的量为100mg/kg·食物，在作四氯化碳攻击小白鼠的前两天，又每天补充肌肉注射维生素E40mg/kg·体重。
②851甘露醇培养液代替水给小白鼠自由饮，同时每天饲料中加入“851”量为2ml/头。
③喂养试验进行12天后用四氯化碳150mg/kg·体重，腹腔注射以造成体内亢进的脂质过氧化状态，16小时后取肝脏，按1979年Hlroshli Ohkawa（Anal.Biochem.1979，95：351～358）等人的方法测定。
851培养液抗衰老效果在人体内进行抗血清脂质过氧化物的试验结果如下表所示：
人体服用851制品血清中脂质过氧化物含量变化
组别 项目 例数（人） 血清MDA nmol/ml（M±S.d）
服用前 服用后
服“851”组 22 3.25±1.04 1.76±0.66＊
对照组 21 2.27±1.20 2.19±0.9
服用前后相比＊P＜0.001
注：①本试验是在疗养院进行，试验者统一饮食，停服降血脂，抗氧化剂（V.tE.V.tC）类药物。
②服“851”组的疗养员每日给20块851饼干，10块851软糖，疗程8～12天。
③851饼干中851培养液占8%;851软糖中851培养液占30%。
从上表可见，“851”培养液制品在作为副食定量服用后，能显著降低人体血清中脂质过氧化物（丙二醛MDA）的含量，有益于抗衰老。
851培养液制品作为副食品定时定量服用后，人体的血清总蛋白和白蛋白水平有升高趋势，虽还不够统计学显著性，但血清总蛋白在小于8克%组＊服851培养液制品后比疗前显著升高（P＜0.025）。说明851培养液制品在机体蛋白营养不足时，可提高血清蛋白合成水平，改善蛋白营养状况。
851培养液制品对人体血清蛋白（＞8克%组和＜8克%组）的影响
分组 ＞8克% ＜8克%
疗前 8.13±0.15%（9例） 7.3±0.44%＊＊（12例）
疗后 8.04±0.45%（9例） 7.88±0.45%（12例）
＊＊本组疗前与疗后P＜0.025
＊：851培养液促进血清总蛋白合成是有限度的，即如果人体血清总蛋白量已超过8%克（＞8克%）它就不起促进作用了，而小于8克%（＜8克%）时就有促进作用，一般我国人的血清蛋白超过8克%的不多，故851培养液对营养不良者是有作用的。
实施例6
851培养液对小白鼠合成肝、小肠、和脑等组织蛋白和血清蛋白有一定的促进作用。详见下列各表。
表Ⅰ：851培养液对小白鼠用〈`;3;`〉H-酪氨酸掺入十二指肠蛋白质的影响
分组 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
例数 15 15 16 15
结果554.1±46.4586.6±173.8622.4±106.8542.2±73.7
（cpm/mg）
（M±S.d）
＊加851玉米培养液组比颗粒饲料组P＜0.05
＊＊cpm/mg：每分钟放射脉冲数/每毫克组织蛋白
表Ⅱ：851培养液对小白鼠用〈`;3;`〉H-酪氨酸掺入肝蛋白质的影响
分组 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
例数 15 15 16 16
结果 151.2±37.2 174.7±30.1 191±50＊ 168±24
（cpm/mg）
（M±S.d）
＊加851玉米培养液饲料组比颗粒饲料组P＜0.025
表Ⅲ：851培养液对各组小白鼠血清蛋白浓度的影响
分组 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
例数 16 16 15 16
结果7.18±0.58 7.33±0.69 7.53±0.51 7.79±0.75＊
g/100ml
＊加851地瓜培养液组与颗粒饲料组比P＜0.025
＊＊g/100ml：每100毫升血液中含有血清蛋白的克数
表Ⅳ：851培养液对小白鼠〈`;3;`〉H-酪氨酸掺入脑蛋白质的影响
分组 Ⅰ Ⅲ Ⅳ
例数 16 16 16
结果77.06±19.59 98.78±22.25＊ 90.57±14.11＊＊
（cpm/mg蛋白质）
M±S.d
＊与颗粒饲料组比P＜0.01 ＊＊与颗粒饲料组比P＜0.05
由表Ⅳ可见851培养液促进了小白鼠脑蛋白的合成。
综上结果可见851培养液对动物合成多种组织蛋白是有益的。
备注：表Ⅰ～表Ⅳ各组的服用方法如下：
Ⅰ组 即对照组，3.5g颗粒饲料/只/天，饮水。
Ⅱ组 即红参对照组，含红参0.25g的3.5g颗粒饲料/只/天，饮水。
Ⅲ组 含玉米培养液的3.5g颗粒饲料/只/天。饮1∶1稀释的培养液代替水。
Ⅳ组 含甘薯培养液的3.5g颗粒饲料/只/天。饮1∶1稀释的培养液代替水。
Ⅲ组与Ⅳ组小白鼠每头每天饮食851培养液的量约为4ml。
实施例7
“851”玉米培养液对乌拉坦（乌拉糖Urethane）诱发小白鼠肺癌有显著抑制作用，减少全组动物的患病病灶总数，能减轻动物发病程度，有利于防癌。
表“851”培养液对乌拉坦致小白鼠肺癌的影响
＊ 发癌动物数 癌瘤数
小白鼠
＊数（发癌率） 总数 瘤数＊小鼠数 瘤数 发瘤鼠数
正常组 38.3（7.9%），4.0 105±0.388＊＊ 1.333±0.577＊＊
致癌对照组 37.28（75.7%） 133 3.892±5.572 5.143±5.892
致癌加“851”
玉米培养液 29.19（65.5%） 44 1.586＊ 2.421±2.219
与致癌对照组比：＊P＜0.05，＊＊P＜0.001
注：致癌加851玉米培养液组的小白鼠每只每天饮食851培养液的量为4毫升。
由上表可见正常组与致癌对照的发癌率和癌瘤数差异都非常显著，说明造型成功。“851”培养液组的发癌率与致癌对照值均无显著差异。但从癌瘤数分析，“851”玉米培养液组为44，仅只有致癌对照组的1/3，两组癌瘤数的平均值之间差异已达统计学的显著性。这种差异说明“851”玉米培养液能减轻乌拉坦致小白鼠肺癌的程度。
实施例8
851培养液的上清液对不同癌细胞有抑制与杀伤作用。
例：对胃癌85FFGC细胞系有抑制与杀伤作用。含10%以上的851上清液的试验组细胞24～72小时出现抑制与杀伤效果，见下面几个图的说明。
图一，851培养基对照组，胃癌85FFGC细胞系，细胞排列紧密，呈多种形状，胞浆透明。
图二，“851”玉米培养液实验组，细胞圆缩、肿胀、胞浆颗粒增多、色泽灰暗、细胞间隙扩大。
图三，851甘薯培养液实验组、细胞呈纤维状交错、胞间似有空泡样结构。
图四，851甘露醇培养液实验组、细胞脱落碎片凝聚。
从上述所见，认为851培养液中含有对胃癌细胞的抑制因子。
实施例9
851黄抗氨固菌作为菌肥的试验。见图五
试验组（±2，000～2，500g）浇三次851培养液，每次100ml，851培养液浇入上后24小时，取该＊15g测其固氨酶活力为38毫微克分子乙烯15克·hr;对照组浇三次851培养基，每次100ml，同样也取10克上测其固氨酶活力为0;（该试验所用的土预先均经过高温灭菌）。
从图五可见，试验组玉米地上部分对照组长得好，不仅这样，而且试验组玉米根部也比对照组玉米发送，该菌液有促进作物根系发达的作用，见图六，左：对照组，右：试验组。

Claims (3)

1、一种利用细菌生产单细胞蛋白、维生素E和菌肥的工业生产方法，其特征是采用经人工诱变处理维氏固氮菌（Azotobacter Vinelandii）而得到的一组命名为851黄的抗氨固氮菌（CCTCC 85-004），利用大气氮作为氮源在本发明所设计的淀粉培养基、废糖蜜培养基及本发明所使用的甘露醇培养基、甘露醇-酵母膏培养基中发酵培养生产培养液，还包括用烘干法由培养液提取单细胞蛋白、用浓缩法提取培养液中的维生素E。
2、如权利要求1所说的淀粉培养基，其特征在于含有干淀粉1-2%，含有淀粉的新鲜物质（甘薯、马铃薯等）10-20%，或含淀粉的干物质1-10%，酵母膏0.04-0.08%，磷酸氢二钾0.05-0.1%，硫酸镁0.02-0.04%，氯化钠0.02-0.04%，钼酸钠10-20PPM，硼酸10-20PPM，亚硒酸钠5-20PPM，硫酸锌5-20PPM。
3、如权利要求1所说的废糖蜜培养基，其特征在于含有废糖蜜2-3%，碳酸钙0.5%，钼酸钠10PPM，硫酸亚铁10PPM。
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