DE1517752A1 - Verfahren zur Biosynthese zellgebundener Pullulanase durch Aerobacter aerogenes - Google Patents
Verfahren zur Biosynthese zellgebundener Pullulanase durch Aerobacter aerogenesInfo
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Description
4993 A 18. Januar 1966
Dr.Tg/Li
Verfahren zur Biosynthese zellgebundener Pullulanase durch
Aerobacter aerogenes
Das Enzym Pullulanase des Stammes Aerobacter aerogenes ATCC 15050 spaltet bei ti -Glucanen in spezifischer Weise 1,6-glykosidisohe
Bindungen dann, wenn gleichzeitig benachbarte 1,4-Verknüpfungen vorliegen (Bender, H0 und E. Wallenfelsj
Biochem. Zo, 554. -79 (1961)). Substrate für das Enzym sind
das von dem Pilz Pullularia pullulans gebildete *C-Glucan
Pullulan sowie Amylopektin und Glykogen. Während das Pullulan durch Pullulanase vollständig zu Maltotriose abgebaut
wird (DBP 1 193 914), werden bei Amylopektin und Glykogen diei-1,6-Vei'Zweigungen gespalten, wodurch diese Kohlenhydrate
einem vollständigen Abbau durch Amylasen zugänglich gemacht werden,, In seiner Spaltungsspezifität ähnelt das Aerobacter-Enzym
dem pflanzlichen "R-Enzym" „ (HOBSON, Ρ.1Ϊ., V/. J. WHELAH and
S. PEAT: J. Chem. Soc. 1951, S. 1451.)
Die Pullulanase wird bei batchweiser Kultivierung in einfachen
Salzlösungen mit Maltose oder Pullulan als Kohlenstoffquelle
9098Ö5/1300 BAOOBiUiNAL
in der späten logarithm!sehen Wachstumsphase in das Kulturfiltrat
abgeschieden und 18afc sich aus diesem mit bekannten
Methoden abtrennen. Die Anreicherung und Reinigung des zellfreien Enzyms ist aber aus verschiedenen Gründen unbefriedigend!
a) Das Kulturmedium für maximale Enzymauebeuten ist «regen seines Gehaltes an Pepton relativ teuer.
b) Die Produktion größerer Enzymmengen erfordert umständliches
Arbeiten mit großen Flüssigkeitsvolumina von relativ geringem Enzymgehaltο **
c) Der Verbrauch an geeigneten Pällungsmitteln ist groß, W ebenso der apparative Aufwand zur Fällung des Enzyms
bei niederen Temperaturen»
Es wurde nun gefunden, daß man durch Abänderung der Kulturbedingungen
die Ausscheidung der Pullulanase während der Kultivierung verhindern kann. Das Verfahren der Erfindung ist
dadurch gekennzeichnet, daß man entweder
a) die Kultivierung des Stammes Aerobacter aerogenes
ATCC 15050 kontinuierlich vornimmt, oder
b) bei diskontinuierlicher Fermentation gleichzeitig MaI-™
tose und Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet.
a) Bei der kontinuierlichen Fermentation verwendet man als Kulturlösung zweckmäßigerweise eine einfache Salzlösung
nach Czapek-Dox. Als Kohlenstoffquelle dient beispielsweise Maltose oder Pullulan, oder auch Glycerin, dem zur Induktion
der Pullulanase-Synthese etwas Maltose oder Pullulan zugefügt wird* Die Gesamtkonzentratien an Kohlenstoff
quelle beträgt insgesamt etwa 0,1-0,4$ vorzugsweise etwa 0,25$;
bei Verwendung kombinierter Kohlenstoffquellen
soll die Konzentr=.ticx d?s laiiia-jors t/6 bis 1/3, vorzugsweise
e'twa 1/4 der se-ajiisr; Inilfi.ian-sffq'JisLls betragen.
309*35/4300 BAD ORIGINAL
Bei einer optimalen Verdünnungrate erhält man Zellsuspensionen, deren Pullulanase-Aktivität, bezogen auf
das Zelltrookengewicht, mindestens doppelt so hoch ist
wie die bei der bisherigen batch-Kultivierung von der gleichen Zellmenge in das KuIturfiltrat abgeschiedene.
Die Schwankung des Enzymgehaltes der Zellen im steady state der kontinuierlichen Fermentation sind gering,
Über lange Zeiträume der Züchtung sind mindestens 60 $>
der ge8amten Pullulanase-Aktivität ^ellgebunden. (Beispiel
D.
Senseiben Effekt erzielt man bei der diskontinuierlichen ^
"Kultivierung, wenn als Kohlenstoffquelle gleichzeitig
Maltose und Glucose angeboten wird. Die Gesamtkonzentration beträgt 0,4 - 1,2, vorzugsweise etwa 0,8 £; das Verhältnis
von Glucose zu Maltose soll zwischen 1 ι 2 und 2:1, vorzugsweise 1 ι 1 betragen. Bei dem diauxisehen Wachstum wird
zuer3t die Glucose verwertet, die J'ullulanase-Synthese ist in
diesem Wachsturasstadium vollständig zurückgedrängt. Die Pullulannaebi
ldunf? setzt mit dem Beginn der Haitoseverwertung ein.
Auch bei dieser Variante des Verfahrens bleibt die Fullulanaee
zu 80 fr zellgebunden. (Beispiel 2).
Verwendet man bei der batch-Anzucht des Aerobacter aerogenes '
die unter a) genannten Kohlenstoffquellen,so muß bei der nachfolgenden
kontinuierlichen Kultivierung gemäß Verfahren a) der Durchlauf der ersten 10 Stunden verworfen werden, da die enzymatieche
Aktivität zunäch* sellfrei ist. Erst nach einigen
Stunden der kontinuierlichen Kultivierung* wird die optimale Menge
zellgebundenen Enzyms produziert. Verwendet man bereits bei der
batch-Anzucht Kohlenstoffquelle annähernd gleiche Teile Maltose
und Glucose gemäß Verfahren b) so kann bei der nachfolgenden kontinuierlichen Kultivierung die Pullulanase von Anfang an zellgebunden
erhalten werden. (Beispiel 3).
909885/ISOO bad original
Sie Isolierung des Enzyms aus dem Zellmaterial kann grundsätzlich nach verschiedenen bekannten Methoden vorgenommen
werden« Besonders vorteilhaft ist es jedoch im vorliegenden Fall, grenzflächenaktive Substanzen, wie ionische oder
nicht ionische Detergentien eowie Invertseifen zu verwenden» Schüttelt man eine konzentrierte Suspension frisch geernteter
Zellen mit einer derartigen Lösung, so wird die gesamte Pullu- ' lanase-Aktivität freigesetzt, während der Gehalt an mitextrahierten anderen Makromolekularen Zellbestandteilen
äußeret niedrig bleibt.
Die^Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Pullulanaee
™ während der Fermentation und bei der Extraktion geschieht
durch Messung des Reduktionewertee der bei der Spaltung von Pullulan' entestehenden Maltotrioseeinheiten. Der Reduktionswert wird zweckmäßigerweiee nach der Methode von lelson (J0
Biol. Chem. 153. 375 (1944)) bestimmt. Die Pullulanaee einheit
ist definiert als diejenige Enzymmonge, welche in meiner Minute bei 30° und einem pH-Wert von 5,0 einem mHmol Maltotriose aus Pullulan abspaltet»
Aub den Lösungen der grenzflUohen—aktiven Stoffen läßt sich
die Pullulanaee nach den bekanntn Methoden der Enzympräzipitation anreichern und durch fraktionierte Fällung bzw.
" durch Säulenchromatographie reinigen. Wach Dialyse gegen
verdünnten Puffer, vom pH-Werten von 6,0 bis 7»2 können durch
Lyophilieation haltbare Trockenpräparate der Pullulanaee hergestellt werden.
909885/1300
Die kontinuierliche Kultivierung dee Stammes Aerobaoter
aerogenes ATCO 15050 wird in einem modifizierten Medium nach
Czapek-Doχ mit folgender Zusammensetzung durchgeführtι
JTaIO3 0,3 t, IH2PO4 0,1 Ji, MfßO^^ QfQ5 ^ m ^05 ^
0,05 t Ia-Citrat, PeSO40TH2O 0,0025 *»
Die Zugabe des Citrate erfolgt zur Stabilisierung des für Wachstum und Pullulanase-Synthese notwendigen zweiwertigen
Eisens. Sie Konzentration der Kohlenstoffquelle beträgt
zwischen 0,1 96 — 0,4 ^, vorzugsweise 0,25 £« Verwendung finden
entweder Maltose oder Pullulan allein oder eine kombinierte Kohlenstoffquelle, die 3 Teile Glycerin und ein 1 Teil Maltese
oder Pullulan zur Pullulanase-Induktion enthält* Die Kohlenstoff
quellen werden in konzentrierter Lösung getrennt sterilisiert„
Die bateh-Anzucht erfolgt im gleichen Medium mit 0,6 i» Kohlenstoffquelle,
vorzugsweise Maltose oder Pullulan. Die Züchtungstemperatur beträgt zweckmäfiigmaSigerweise 3O0C, die Kulturbedingungen
für einen 10 ltr-Fermenter sindi Rührer 500 ppm«
luft 600 ltr/Std. Zur Beimpfung dienen 2 ml/100 ml einer 20
Stdo alten Vorkultur des Stammes im gleichen Medium mit 0,6 ^
Kohlenstoffquelle, vorzugsweise Maltose oder Glycerin·
.Es wird bis zu einer Zelldichte von 2 mg Trookenzellen /ml batohweise
kultiviert, dann wird auf kontinuierlichen Betrieb umge- ^ schaltet.,Die Yerdünnungsrate kann zwischen 0,1 - 0,3 Stdo" be- ™
tragen, vorzugsweise 0,2 Std 0 Der Durchlauf der ersten 10
Stunden der kontinuierlichen Züchtung wird verworfen. Die abzentrifugierte Zellmasse wird ohne weitere Behandlung
weiter verarbeitet.
(Enzymausbeutei 0,3 - 0,4 Pullulanase-linheiten/ml bei einer
Zelldichte von 1 - 1,5 mg Trookenzellen/ml» Die zellfreie
Aktivität beträgt maximal 20 ?ί der zellgeb*»undenen) „
Als Medium für die Produktion zellgebundener Pullulanase in
batch-Kultüren dient wiederum die Salzlösung nach Czapek-Dox
gemäß Beispiel 1, Kohlenstoffquelle sind Maltose und Gluooee
909885/130Ö
zu gleichen Teilen in Konzentrationen von je 0,2 H - 0,6 ?ί,
vorzugsweise je 0,4 #, die Sterilization der Zucker erfolgt
separat« Die Züchtung der Vorkultur und de Beimpfung der
Hauptkultur geschieht gemäß Beispiel 1. Sie Hauptkultur
wird 16-24 Std., vorzugsweise 20 Std„ bei 3O0C unter optimaler
Belüftung kultivfert. Me abzentrifugierte Zellmasee
wird ohne weitere Behandlung weiter verarbeitet. (Enzymausbeutent 0,4 bis 0,5 Pullulanaae-Einheiten/ml bei
einer Zelldichte von 3 - 4 mg Trockenzellen/ml. Die zellfreie
Aktivität beträgt maximal 20 H der zellgebundenen.)
Die Batch-Anzucht für die kontinuierliche Kultivierung erfolgt
entsprechend Beispiel 1, als Kohlenetoffquellen dienen je 0,4 i» Maltose und 0,4 i» Glucose Am Ende der logarithm!sehen
Wachstumsphase wird auf kontinuierlichen Betrieb umgeschaltet,
Der Durchlauf wird von Beginn an verwertet. Die Enzymausbeute entspricht der in Beispiel 1 angegebenen.
a) 10-20 g;vorzugsweise 15g, der friechen Bakterienzellmasse
werden in 100 ml einer 0,1 - 0,2 ^igen, vorzugsweise
0,15 Jiigen Lösung von Hatriuml aurylaulf at in HgO desto
suspendiert und bei 300C 12-18 Std· lang, vorzugsweise
15 Stdo lang in einem 1 ltr-Kolben geschüttelte Die Teilen
werden dann abzentrifugiert und die Pullulanase-haltige, überstehende klare Lösung bis zur Weiterverarbeitung bei
0 - 40C aufbewahrt.
(Enzymausbeuten: Von der gesamten messbaren Pullulanase werden
95 # extrahiert. 6-8 Pullulanase-Einheiten/ml Überstand/
0a130 - 0,150 mg Protein«
b) Gemäß Beispiel 4a), jedoch werden die Zellen in einer 0,4 10 ^igen, vorzugsweise 0,5 5*igen wässrigen Lösung von Triton
1-100 (Octylphenoldeoaäthylenglykoläther) geschüttelt.
909885/1300
(Enzymausbeuteni Yon der gesamten messbaren Pullulanase
werden 95 i> extrahiert· 6-8 Pullulanase-Einheiten/ml
überstand/O,130 - 0,150 mg Protein»)
c) Gemäß Beispiel 4a) r jedoch werden die Zellen in eins*
1 - 4x10" mol, voreugsweise 2x10 mol wässrigen Lösung
von n-Cetyl-pyridiniue-chlorid geschüttelt.
(Ensymausbeutent Von der gesamten messbaren Pullulanase
werden 72 i» extrahiert. 5-6 Pullulanase-Einheiten/ml
d) Gemäß Beispiel 4a), jedoch werden die Zellen in einer 1 -4x10 J mol, vorzugsweise 2x10 mol wässrigen Lösung
von H-Cetyl-KyHfl-triBethylammoniumbroiBid geschüttelt.
(Ensymausbeuteni Von der gesamten messbaren Pullulanase
werden 72 i» extrahiert.. 5-6 Pullulanase-Elnhäten/ml
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Claims (1)
1) Verfahren-zur Herstellung zellgotundener Pullulanase
durch Züchtung von Aerobacter aerogcne.: AT':C 15050, dadurch
gekennzeichnet, daß r.an
a) daß Bakterium kontinuierlich in Gegenwart einer Maltose
und/oder Pullulan enthaltenden xlrhlen3 te i"f ;\;ellu
kultiviert, oder daß man
b) die Kultivierung diskontinuierlich unter gleichzeitiger
Verwendung von Glucose und Maltese als Kohlenstoffquelle
vornimmt
und das hnzym aur ά-.τ: I! ι llnuter: -ti isoliert.
J) Verfahren nach An.-rruch 1a, dadurch ^..kennzeichnet, dai? man
aiii Kohlenstoffquelle ont.veler "aitoae oder · uli.uian oder
:;;it »:Ii:·.·:.: iehalt <ai I'altOoO oJor ."uilulan v.-rv/ondot.
3) Verfahren nach Anorruch 2, di-.iurch gekennzeichnet, daß die
•;]psa!ntkonzontrat"! on an Kohl-^iütoff quelle 0,1 - 0,4 "', vor- ·
.:ugsv;eise etwa 0,"5 J-, betragt.
4) Verfahren nach An.3prr.cii 1b, dadurch gekonnzeichnet, da3
die Geaantkonzontration an Jlucose plus iualtose 0,4 - 1,2,
vorzugsweise etwa 0,S^ beträgt.
5) Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß das
Verhältnis vcn Glucose zu "altose zwischen 2:1 und 1:2, vorco
ο zugsweise bei 1:1 liegt.
ο zugsweise bei 1:1 liegt.
^n C) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man
2^ das Zellraaterial :.n kenzentrierter -wässriger Suspension in
Gegenwert vor gre'-.zfliiohenaktiven Substanzen isoliert.
7} Verfahren ]::.c?.. Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man
al; grenzfläch-n.-.ikt:vo Substanzen ionische oder nicht-ionJsche
Detergentien o,i.-r Invertseifen verwendet.
SAP ORKaINAL
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |