DE2946898A1

DE2946898A1 - Verfahren zur herstellung von plasminogen-aktivator

Info

Publication number: DE2946898A1
Application number: DE19792946898
Authority: DE
Inventors: Akio Hasegawa; Sadayuki Horiguchi; Hajimu Sakamoto
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1978-11-24
Filing date: 1979-11-21
Publication date: 1980-06-04
Also published as: FR2442269B1; US4328314A; JPS5571496A; GB2037295A; DE2946898C2; JPS575159B2; GB2037295B; FR2442269A1

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator in hohen Ausbeuten unter Verwendung von tierischen Zellen.

Die Isolierung und Reinigung aus menschlichem Urin ist als kommerzielles Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator bekannt und wird von W.F. White in Biochemistry.5 (1966) 2160 beschrieben. Dieses übliche Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die Qualität von menschlichem Urin als Ausgangsmaterial nicht gleichmaßig ist, die Handhabung von Urin ein hygienisches Problem aufwirft und es schwierig ist, große Urintnengen von gesunden Personen zu gewinnen.

Es ist bekannt, Plasminogen-Aktivator aus tierischen Zellen zu gewinnen. Hierüber wird von Bernik et al in J.Lab. & Clin. Med. 70 (1967) 650 berichtet. Das Verfahren nach Bernik ist jedoch für die Großherstellung von Plasminogen-Aktivator auf Grund der niedrigen Ausbeuten unbefriedigend. Es wurde jedoch angenommen, daß, wenn die Ausbeuten verbessert werden könnten, das Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator unter Verwendung von tierischen Zellen in den großtechnischen Maßstab überführt werden könnte und es möglich wäre, große Mengen Ausgangsmaterial von gleichbleibender Qualität ohne die Gefahr einer Verunreinigung zu liefern.

Von der Anmelderin wurde somit die Entwicklung eines Verfahrens angestrebt, das die Verwendung von tierischen Zellen im großtechnischen Maßstab ermöglichen würde.

Eingehende Untersuchungen in dieser Richtung hatten das Ergebnis, daß die Aktivatormenge überraschend stark ansteigt, wenn eine organische Säure aus der aus Fumarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure und Glykolsäure be-

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stehenden Gruppe im wässrigen Nährmedium, mit dem die tierischen Zellen zur Bildung von Plasminogen-Aktivator zusammengeführt werden, vorhanden ist.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von Plasminogen-Aktivator nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man tierische Zellen, die zur Bildung von Plasminogen-Aktivator fähig sind, mit einer wässrigen Nährlösung zusammenführt, die eine organische Säure aus der aus Fumarsäure, Apfelsäure, Bern-IC) steinsäure und Glykolsäure bestehenden Gruppe enthält.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildungen beschrieben.

Fig.l ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse zeigt, die bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch erhalten wurden. In dieser Abbildung sind die organischen Säuren auf der waagerechten Grundlinie genannt und die gebildeten Mengen an Plasminogen-Aktivator als senkrechte Balken dargestellt.

Fig.2 ist eine graphische Darstellung, die die ^rgebnisse zeigt, die bei dem in Beispiel 3 beschriebenen Versuch erhalten wurden, wobei die Konzentrationen der verwendeten organischen Säuren als Abszisse und die gebildeten Mengen an Plasminogen-Aktivator als Ordinate aufgetragen sind.

Fig.3 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse zeigt, die bei dem in Beispiel 4 beschriebenen Versuch erhalten wurden, wobei die Konzentrationen der verwendeten organischen Säuren als Abszisse und die gebildeten Mengen an Plasminogen-Aktiviator als Ordinate aufgetragen sind.

Gemäß der Erfindung werden tierische Zellen verwendet, die die Fähigkeit haben, Plasminogen-Aktivator zu bilden.

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Beispiele solcher Zellen sind Zellen aus den Nieren des afrikanischen Grünaffen, Zellen aus den Nieren des Rnesusaffen, Zellen aus den Wieren von menschlichen Embryos, Zellen aus der Lunge eines menschlichen Fetus, Zellen aus menschlichen Embryos, Zellen aus der Haut eines menschlichen Fetus, Zellen aus der menschlichen Plazenta, Zellen aus der Milz eines Erwachsenen, Zellen aus den Nieren von Erwachsenen, Zellen aus der Lunge von Erwachsenen, Zellen aus der Schilddrüse von Erwachsenen, Zellen aus dem Herzen eines menschlichen Fetus, Zellen aus dem Harnleiter eines menschlichen Fetus, Zellen aus dem Herzen eines Erwachsenen und Zellen aus dem Harnleiter eines Erwachsenen. Von diesen Zellen werden Nierenzellen besonders bevorzugt. Vorzugsweise werden diese Zellen für die Verwendung gemäß der Erfindung geliefert, nachdem sie nach den üblicherweise für die Züchtung von tierischen Zellen angewendeten Methoden kultiviert worden sind, beispielsweise nach der Methode, die in Tissue Culture von Jyunnosuke Nakai et al (herausgegeben von Asakura Shoten, 1976) (japanische Veröffentlichung) und in Tissue Cultures in Biological Research von G.Penso und D.Balducci (Elsevier Publishing Co. 1963) beschrieben wird.

Plasminogen-Aktivator wird bekanntlich durch Zusammenführen von tierischen Zellen mit einer wässrigen Nährlösung gebildet, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und gegebenenfalls anorganische Salze und/oder andere Zusatzstoffe enthält. Repräsentativ ist die von Bernik et al verwendete Nährlösung, deren Zusammensetzung in der später folgenden Tabelle 1 genannt ist. Bei den in den Beispielen beschriebenen Versuchen wurde eine solche Nährlösung als Grundlösung verwendet. Die Zusammensetzung der erfindungsgemäß verwendeten Nährlösung unterliegt keiner Begrenzung, so lange sie die Grundnährstoffe (Kohlenstoff- und Stickstoffquellen), die zum

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Wachstum der Zellen erforderlich sind, und die Säuren enthält, die das charakteristische Merkmal der Erfindung darstellen. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Maltose und Saccharose. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische Stickstoffquellen. Aminosäuregemische und/oder Hydrolysenprodukte von Proteinen werden für diesen Zweck besonders bevorzugt. Als Proteine dieser Art kommen tierische oder pflanzliche Proteine, beispielsweise Kasein, Sojabohnenprotein, Milcheiweiß und tierisches Eiweiß, in Frage.

Als Lalze anorganischer Säuren eignen sich beispielsweise Salze, die aus einem Kation von Calcium, Kalium, Natrium, Eisen usw. und einem Anion von Chlor, Schwefelsäure, Carbonsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure usw. bestehen.

Außer den vorstehend genannten Verbindungen können Vitamincoenzyme und andere organische Zusatzstoffe verwendet werden.

Das neue Merkmal der Erfindung besteht darin, daß eine organische Säure aus der aus Fumarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure und Glykolsäure bestehenden Gruppe der wässrigen Nährlösung zugesetzt wird und die Zugabe dieser speziellen organischen Säuren zu einem überraschenden Anstieg der gebildeten Menge von Plasminogen-Aktiviator führt. Diese Säuren können natürlich in Kombination verwendet werden. Die bloße Zugabe dieser Säuren zur Nährlösung genügt. Im allgemeinen erweisen sich die organischen Säuren als wirksam, wenn sie in einer Menge von 1 bis 120 mMol, vorzugsweise 10 bis 93 mMol pro Liter wässrige Nährlösung zugesetzt werden. Es wurde gefunden, daß bei Verwendung von Fumarsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure oder Glykolsäure jeweils in diesen Mengen die gebildete Menge an Plasminogen-Aktivator mehr als 131%, 177%, 142% bzw. 115% der ohne Zugabe der Säuren erhaltenen Mengen beträgt. Insbesondere ergeben Fumarsäure und Apfelsäure einen starken Anstieg der Menge an Pias-

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minogen-Aktivator von mehr als 269%.

Die Herstellung von Plasminoqen-Aktivator erfolgt gewöhnlich unter Verwendung von wenigstens 0,2 ml, vorzugsweise 0,3 bis 0,4 ml der wässrigen Nährlösung pro 100.000 Zellen bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, vorzugsweise 25 bis 40°C. Während der Produktion wird die Nährlösung auf pH 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8 eingestellt. Die für die Produktion erforderliche Zeit beträgt gewöhnlich 4 bis 30 Tage, kann jedoch 30 Tage überschreiten. Da die Produktionsgeschwindigkeit in den späteren Phasen der Produktion allmählich abnimmt, wird die Periode, in der der Wirkungsgrad am besten ist, für die Großherstellung gewählt.

Der Plasminogen-Aktivator wird unter den vorstehend genannten Bedingungen aus den Zellen in die wässrige Nährlösung freigegeben. Die gebildete Aktivatormenge wird nach einer Plattenmethode gemessen, die von Nishizaki und Kawamura in "Study of Pharmaceuticals" (eine japanische Veröffentlichung, 5 (1974) 295) und von J.Plong et al in "Biochem. Biophys."Acta" 24 (1957) 278 beschrieben wird. Wenn die gewünschte Menge des Aktivators oder die gewünschte Zeit erreicht ist, wird die wässrige Nährlösung entnommen und der Aktivator isoliert. Die Plattenmethode wird nachstehend kurz beschrieben.

Kontrollösungen, die Plasminogen in verschiedenen Konzentrationen enthalten, und eine Testlösung werden in einer gegebenen Menge auf eine Fibrinplatte getropft, die durch Koagulierung einer Fibrinogenlösung unter Zugabe von Thrombin enthaltendem Plasminogen gebildet worden ist. Nach Bebrütung der Platte für 20 Stunden bei 37°C wird der Durchmesser der hierbei gebildeten gelösten Stellen gemessen. Eine Eichkurve des Quadrats des Durchmessers und der Konzentration von Plasminogen wird auf der Grundlage der Kontroilösungen angefertigt. Die Plasminogenkonzentration in der Testlösung kann bestimmt

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werden, indem die Methode mit der Probe wiederholt und das Ergebnis mit der Eichkurve verglichen wird.

Die Isolierung des Plasminogen-Aktivators kann nach den üblicherweise für die Isolierung des Aktivators angewendeten Methoden, beispielsweise Adsorption, Aussalzen, Dialyse, Chromatographie und Gelfiltration, entweder einzeln oder in Kombination erfolgt. Im einzelnen können beispielsweise eine Adsorptionsmethode unter Verwendung von Hydroxyapatit, Bariumsulfat usw., eine Aussalz— methode unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumchlorid usw., eine chromatographische Methode unter Verwendung von Diäthylaminoäthylcellulose usw., eine Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Acrylamidgel, modifiziertem Dextrangel usw. und die in der japanischen Patentveröffentlichung 10 232/73 und in der US-PS 4 028 187 beschriebenen Methoden angewendet werden. Die hierbei erhaltene Substanz löst ein Fibringel in Gegenwart von Plasminogen, löst es aber nicht in Abwesenheit von Plasminogen. Die Substanz vermag somit das Plasminogen so zu aktivieren, daß es das Fibringel löst, und ist ein Plasminogen-Aktivator (siehe Proteinases in Mammalian Cells and Tissues von A.J.Barrett, North Holland Publishing Co., 1977).

Das Verfahren gemäß der Erfindung vermeidet die Nachteile des üblichen Verfahrens, bei dem die Konzentration im eingesetzten Urin gering, Urin von gleichbleibender Qualität von gesunden Personen schwierig zu erhalten ist und hygienische Probleme aufgeworfen werden. Gemäß der Erfindung wird ein Ausgangsmaterial verwendet, das eine gleichbleibende, gleichmäßige Qualität aufweist und ständig in hohen Konzentrationen und großen Mengen lieferbar ist. Ferner wird durch die Erfindung ein überlegenes Verfahren für die Großherstellung von Plasminogen-Aktivator verfügbar.

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Zu einer Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung wurden jeweils Fumarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure, Glykolsäure, Glycin, α-Ketoglutarsäure, Oxalessigsäure, Maleinsäure, Brenztraubensäure und Citronensäure in einer Menge von 60 mMol/1 Lösung gegeben. Voll ausgewachsene Nierenzellen von Rhesusαffen (Flow Laborattories, Inc.) und menschliche Nierenzellen (Flow Laboratories, Inc.) wurden jeweils 20 Tage bei 37°C in jeder Nährlösung in einer Luftatmosphäre, die 5% Kohlendioxidgas enthielt, gehalten. Die Menge von Plasminogenaktivator in der Lösung wurde ermittelt. Die Ergebnisse sind in Fig.l dargestellt. Diese Abbildung zeigt, daß in Anwesenheit von Apfelsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure und Glykolsäure die gebildete Menge von Plasminogen-Aktivator 160 bis 227% der beim Kontrollversuch, d.h. in Abwesenheit von organischen Säuren erhaltenen Menge beträgt. Die Mengen an Plasminogen-Aktivator sind in CTA-Einheiten ausgedrückt, die vom Committee on Thrombolytic Agents des National Heart Institute festgelegt worden sind; siehe A.J. Johnson, Throm.Diath .Haenior. 21 (1969) 259.

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- lü -

Tabelle 1	NaC £	ηΐβ/ί.
	KCl	8000,0
Na₂HPO₄-2H₂O	400,0
KIi₂PO₄	60,0
MgSO₄-7H₂O	60,0
CaC£₂ (wasserfrei)	100_;0
Glucose	140,0
UgCl₂.6H₂O	1000,0
VaIICO₃	100,0
"Ii lcheiweinhydrolysat	350,0
Beispiel 2	5000,0

Voll ausgewachsene Nierenzellen von afrikanischen Grünaffen (Flow Laboratories, Inc.) wurden 15 Tage bei 37⁰C in einer Lösung der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung in einer Luftatmosphäre, die 5% Kohlendioxidgas enthielt, gehalten. Der Plasminogen-Aktiviator in der Lösung wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammen mit den Ergebnissen eines Vergleichsversuchs, bei dem keine Fumarsäure verwendet wurde, genannt. Die Tabelle zeigt, daß bei Zusatz von Fumarsäure zur Nährlösung die Menge an Plasminogen-Aktiviator das 1,8- bis 2,1-fache der beim Vergleichsversuch erhaltenen Menge betrug. Die Aktivatormenge ist ebenso wie in Beispiel 1 in CTA-Einheiten ausgedrückt.

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Tabelle 2

NaCi	Tabelle 3	8000,0	10	in Tagen
KC£	Ak tivatormenqe (CTA/ml)	400_f0	110	15
Na₂IlPO₄* 2H₂O	60,0	60	130
KH₂PO₄	60,0		62
MgSO₄-7H₂O	100,0
CaC&2 (wasserfrei)	140,0
Glucose	1000,0
MgC)I₂-OH₂O	100,0
NaIiCO₃	350,0
Milcheiweißhydrolysat	5000,0
Fumarsäure


Verstrichene Zeit
5
Fumarsäure anwesend 60
¹¹ abwesend 34
Beispiel 3

Bernsteinsäure, Apfelsäure und Glykolsäure wurden jeweils in verschiedenen Konzentrationen zu einer Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung gegeben. Voll ausgewachsene Nierenzellen von afrikanischen Grünaffen (Flow Laboratories, Inc.) wurden jeweils in den erhaltenen Nährlösungen 20 Tage bei 37°C in einer Luftatmosphäre, die 5% Kohlendioxidgas enthielt, gehalten. Der Plasminogen-Aktivator in den Lösungen wurde bestimmt.

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Die Ergebnisse sind in Fig.2 dargestellt. Die Abbildung zeigt, daß ein starker Anstieg der Menge an Plasminogen-Aktivator erreicht wurde, wenn die organischen Säuren in einer Konzentration von 10 bis 120 mMol verwendet wurden.

Bei spiel 4

Fumarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure und Glykolsäure wurden jeweils in verschiedenen Konzentrationen zu einer Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung gegeben, Voll ausgewachsene menschliche Nierenzellen (Flow Laboratories, Inc.) wurden jeweils in den erhaltenen Nährlösungen 18 Tage bei 37°C in einer Luftatmosphäre, die 5% Kohlendioxidgas enthielt, gehalten. Der Gehalt an P lasminogen-Aktiviator in den Lösungen wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig.3 dargestellt. Die Abbildung zeigt, daß ein besonders starker Ansbieg der Menge an Plasminogen-Aktivator erreicht wird, wenn die organischen Säuren in einer Konzentration im Bereich von 10 bis 93 mMol verwendet werden.

Beispiel 5

Die in Beispiel 4 beschriebenen Versuche wurden wiederholt, wobei jedoch die Säuren in verschiedenen Kombinationen, die in Tabelle 4 genannt sind, verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 4 genannt.

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	1	2	TabeIl	A	e 4	0	emenqe	C	7	0	(niMol	)	9	0	10	11	12
ürqani sehe	0	30		30	Säur	30	6	30	0	8	20	20	20	15
Säure	0	30	3	0	5	30	0	30	20	20	0	20	15
F u m a r s ä u r e	0	0	30	0	0	30	30	20	20	20	0	15
Bornstein säure	0	0	0	30	138	135	125	20	135	20	20	15
Λ p f e 1 s π u r e	52	IAl	30	IAO			0		130	125	120
Gl ykolsäure		0		135
Λk t:i vdtor- rn enqp (CTA/inf.)		1A9

F. i η starker Anstieg der Menge an P1asminogen-Aktivator v/i rd somit sowohl bei Verwendung der Säuren in Kombination als auch bei Verwendung der Säuren allein erreicht. Ferner wurde eine besonders hohe Menge an Plasminogen-Aktiνiator erreicht, wenn Fumarsäure in Kombination mit Apfelsäure verwendet wurde.

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L e e r s e i t e

Claims

VON KREISLER SCHONWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER PATENTANWÄLTE Dr.-Incj. von Kreisler + 1973 Dr.-Imj. K. Schönwcild, Köln Asahi Kasei KogyoDl>ln<J K w Eisho,d Bod Soden Kabushiki Kaisha, ^/"A^am „■, „. L Dipl.-(.nein. Alek von Kreisltr, Köln No. 2-6, Dojima-hama 1-chOine , Dipl.-Oiem. Carola Keller, Köln Dipl.-In(J. G. Seltincj, Köln Kita-ku, Osaka-shi, Osaka Dr. H.-K. Werner, Köln W/Ax 20. November 1979 H[IOIMAi INH AUS MA IIAUP! HAMt-. HOF D-5000 KÖLN 1 Verfahren zur Herstellung von Plasminoqen-Ak tA vator Paten tanspriiche

1. Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator, wobei man tierische Zellen, die Plasminogen-Aktivator zu bilden vermögen, mit einer wäl5rigen Nährlösung zusammenführt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Nährlösung verwendet, die eine organische Säure aus der aus Fumarsäure, Apfelsäure, F3ernsteinsäure und Glykolsäure bestehenden Gruppe enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die organische Säure in einer Konzentration von 10 bis 93 mMol/Liter wäßrige Nährlösung verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als tierische Zellen Nierenzellen verwendet.

Λ. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure Fumarsäure verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure Apfelsäure verwendet.

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Μ.·!.,η (0? 71) Π 10 41 Up. Rt!8?W fl.ipci d ■ Telegramm Dompatonl Koin

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6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure Bernsteinsäure verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organische Säure Glykolsäure verwendet.

B. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die organischen Säuren in Kombination verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination von Fumarsäure und Apfelsäure verwendet.

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