DE2946898C2 - Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-AktivatorInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator in hohen Ausbeuten unter
Verwendung von tierischen Zellen.
Die Isolierung und Reinigung aus menschlichem Urin
ist als kommerzielles Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator bekannt und wird von W. F.
White in Biochemistry, 5 (1966), 2160, beschrieben. Dieses übliche Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß
die Qualität νο·ΐ menschlichem Urin als Ausgangsmaterial
nicht gleichmäßig ist die Hp-.dhabung von Urin ein hygienisches Problem aufwirft und es schwierig ist,
große Urinmengen von gesunder Personen zu gewinnen.
Es ist bekannt, Plasminogen-Aktivator aus tierischen Zellen zu gewinnen. Hierüber wird von Bernik et al. in J.
Lab. & Clin. Med., 70 (1967), 650, berichtet. Das
Verfahren nach Bernik ist jedoch für die Großherstellung von Plasminogen-Aktivator auf Grund der
niedrigen Ausbeuten unbefriedigend. Es wurde jedoch angenommen, daß, wenn die Ausbeuten verbessert
werden könnten, das Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator unter Verwendung von tierischen
Zellen in den großtechnischen Maßstab überführt werden könnte und es möglich wäre, große Mengen
Ausgangsmaterial von gleichbleibender Qualität ohne die Gefahr einer Verunreinigung zu liefern. Von der
Anmelderin wurde somit die Entwicklung eines Verfahrens angestrebt, das die Verwendung von
tierischen Zellen im großtechnischen Maßstab ermöglichen würde.
Eingehende Untersuchungen in dieser Richtung hatten das Ergebnis, daß die Aktivatormenge überraschend
stark ansteigt, wenn eine oder mehrere organische Säuren aus der aus Fumarsäure, Apfelsäure,
Bernsteinsäure und Glykolsäure bestehenden Gruppe im wäßrigen Nährmedium, mit dem die tierischen Zellen
zur Bildung von Plasminogen-Aktivator zusammengeführt werden, vorhanden sind,
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator, wobei man tierische Zellen,
die Plasminogen-Aktivator zu bilden vermögen, mit einer wäßrigen Nährlösung zusammenführt, dadurch
gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Nährlösung verwendet, die eine oder mehrere organische Säuren,
ausgewählt aus Fumarsäure, Apfelsäure. Bernsteinsäure und Glykolsäure, mit einer Gesamtkonzentration von 1
bis 120 mMol/Liter wäßriger Nährlösung enthält.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildungen beschrieben,
-, F i g. 1 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse zeigt, die bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch erhalten wurden. In dieser Abbildung sind die organischen Säuren auf der waagerechten Grundlinie genannt und die gebildeten Mengen an Plasninogen-Aktivator als senkrechte Balken dargestellt;
-, F i g. 1 ist ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse zeigt, die bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Versuch erhalten wurden. In dieser Abbildung sind die organischen Säuren auf der waagerechten Grundlinie genannt und die gebildeten Mengen an Plasninogen-Aktivator als senkrechte Balken dargestellt;
Fig.2 ist eine graphische Darstellung, die die
Ergebnisse zeigt, die bei dem in Beispiel 3 beschriebenen Versuch erhalten wurden, wobei die Konzentrationen
der verwendeten organischen Säuren als Abszisse und die gebildeten Mengen an Plasminogen-Aktivator als
Ordinate aufgetragen sind;
Fig.3 ist eine graphische Darstellung, die die
Ergebnisse zeigt, die bei dem in Beispiel 4 beschriebenen Versuch erhalten wurden, wobei die Konzentrationen
der verwendeten organischen Säuren als Abszisse und die gebildeten Mengen an Plasminogen-Aktivator als
Ordinate aufgetragen sind.
Gemäß der Erfindung werden tierische Zellen verwendet, die die Fähigkeit haben, Plasminogen-Aktivator
zu bilden.
Beispiele solcher Zellen sind Zellen aus den Nieren des afrikanischen Grünaffen, Zellen aiii' den Nieren des
Rhesusaffen, Zellen aus den Nieren von menschlichen Embryos, Zellen aus der Lunge eines menschlichen
jo Fetus, Zellen aus menschlichen Embryos, Zellen aus der
Haut eines menschlichen Fetus, Zellen aus der menschlichen Plazenta, Zellen aus der Milz eines
Erwachsenen, Zellen aus den Nieren von Erwachsenen, Zellen aus der Lunge von Erwachsenen, Zellen aus der
Schilddrüse von Erwachsenen, Zellen aus dem Herzen eines menschlichen Fetus, Zellen aus dem Harnleiter
eines menschlichen Fetus, Zellen aus dem Herzen eines Erwachsenen und Zellen aus dem Harnleiter eines
Erwachsenen. Von diesen Zellen sind Nierenzellen besonders geeignet. Insbesondere werden diese Zellen
für die Verwendung gemäß der Erfindung geliefert, nachdem sie nach den üblicherweise für die Züchtung
von tierischen Zellen angewendeten Methoden kultiviert worden sind, beispielsweise nach der Methode, die
in Tissue Culture von Jyunnosuke Nakai et al. (herausgegeben von Asakura Shoten, 1976) (japanische
Veröffentlichung) und in Tissue Cultures in Biological Research von G. Penso und D. Balducci (Elsevier
Publishing Co., 1963) beschrieben wird.
ίο Plasminogen-Aktivator wird bekanntlich durch Zusammenführen
von tierischen Zellen mit einer wäßrigen Nährlösung gebildet, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen
und gegebenenfalls anorganische Salze und/oder andere Zusatzstoffe enthält. Repräsentativ ist
die von Bernik et al. verwendete Nährlösung, deren Zusammensetzung in der später folgenden Tabelle 1
genannt ist. Bei den in den Beispielen beschriebenen Versuchen wurde eine solche Nährlösung als Grundlösung
verwendet. Die Zusammensetzung der erfindungsgemäß verwendeten Nährlösung unterliegt keiner
Begrenzung! solange sie die Grundnährstoffe (Kohlenstoff-
und Stickstoffquellen), die zum Wachstum der Zellen erforderlich sind, und die Säuren enthält, die das
charakteristische Merkmal der Erfindung darstellen. Als
h) Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose,
Maltose und Saccharose. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische Stickstoffquellen. Aminosäuregemische
und/oder Hydrolysenprodukte von Pro-
leinen sind für diesen Zweck besonders geeignet. Als
Proteine dieser Art kommen tierische oder pflanzliche Proteine, beispielsweise Kasein, Sojabohnenprotein,
Milcheiweiß und tierisches Eiweiß, in Frage. Als Salze anorganischer Säuren eignen sich beispielsweise Salze,
die aus einem Kation von Calcium, Kalium Natrium, Eisen usw. und einem Anion von Chlor, Schwefelsäure,
Carbonsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure usw. bestehen. Außer den vorstehend genannten Verbindungen
können Vitainincoenzyme und andere organische Zusatzstoffe verwendet werden.
Das neue Merkmal der Erfindung besteht darin, daß eine organische Säure aus der aus Fumarsäure,
Apfelsäure, Bernsteinsäure und Glykolsäure bestehenden Gruppe der wäßrigen Nährlösung zugesetzt wird π
und die Zugabe dieser speziellen organischen Säuren zu einem überraschenden Anstieg der gebildeten Menge
von Plasminogen-Aktivator führt. Diese Säuren können natürlich in Kombination verwendet v/erden. Die bloße
Zugabe dieser Säuren zur Nährlösung genügt Im m allgemeinen erweisen sich die organischen Säuren als
wirksam, wenn sie in einer Menge von 1 bis 120 mMoi,
insbesondere 10 bis 93 mMol pro Liter wäßrige Nährlösung zugesetzt werden. Es wurde gefunden, daß
bei Verwendung von Fumarsäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure oder Glykolsäure jeweils in diesen Mengen
die gebildete Menge an Plasminogen-Aktivator mehr als 131 %, 177%, 142% bzw. 115% der ohne Zugabe der
Säuren erhaltenen Mengen beträgt. Insbesondere ergeben Fumarsäure und Apfelsäure einen starken
Anstieg der Menge an Plasminogen-Aktivator von mehr als 269%.
Die Herstellung von Plasminogen-Aktivator erfolgt gewöhnlich unter Verwendung von wenigstens 0,2 ml,
insbesondere 03 bis 0,4 ml der wäßrigen Nährlösung J5
pro 100 000 Zellen bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, insbesondere 25 bis 400C. Während der
Produktion wird die Nährlösung auf pH 5 bis 9, insbesondere 6 bis 8 eingestellt. Die für die Produktion
erforderliche Zeit beträgt gewöhnlich 4 bis 30 Tage, kann jedocn 30 Tage überschreiten. Da die Produktionsgeschwindigkeit in den späteren Phasen der Produktion
allmählich abnimmt, wird die Periode, ;n der der Wirkungsgrad am besten ist, für die Großherstellung
gewählt.
Der Plasminogen-Aktivator wird unter den vorstehend genannten Bedingungen aus den Zellen in die
wäßrige Nährlösung freigegeben. Die gebildete Aktivatormenge wird nach einer Plattenmethode gemessen,
die von Nishizaki und Kawamura in »Study of Pharmaceuticals« (eine japanische Veröffentlichung, 5
[1974], 295) und von J. Plong et al. in »Biochem. Biophys.
Acta«, 24 (1957), 278, beschrieben wird. Wenn die gewünschte Menge des Aktivators oder die gewünschte
Zeit erreicht ist, wird die wäßrige Nährlösung entnommen und der Aktivator isoliert. Die Plattenmethode
wird nachstehend kurz beschrieben.
Kontrollösungen, die Plasminogen-Aktivator in verschiedenen Konzentrationen enthalten, und eine Testlösung
werden in einer gegebenen Menge auf eine Fibrinplatte getropft, die durch Koagulierung einer
Plasminogen enthaltenden Fibrinogenlösung unter Zugabe von Thrombin gebildet worden ist. Nach
Bebrütung der Platte für 20 Stunden bei 37° C wird der Durchmesser der hierbei gebildeten gelösten Stellen <i5
gemessen. Eine Eichkurve des Quadrats des Durchmessers und der Konzentration von Plasminogen wird auf
der Grundlage der Kojtrollösungen angefertigt. Die Plasminogenkonzentration in der Testlöäung kann
bestimmt werden, indem die Methode mit der Probe wiederhol*, und das Ergebnis mit der Eichkurve
verglichen wird.
Die Isolierung des Plasminogen-Aktivaiors kann nach
den üblicherweise für die Isolierung des Aktivators angewendeten Methoden, beispielsweise Adsorption,
Aussalzen, Dialyse, Chromatographie und Gelfiltration, entweder einzeln oder in Kombination erfolgen. Im
einzelnen können beispielsweise eine Adsorptionsmethode unter Verwendung von Hydroxyapatit, Bariumsulfat
usw., eine Aussalzmethode unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumchlorid
uswn eine chromatographische Methode unter Verwendung von Diäthylaminoäthylce;Iulose
usw., eine Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von
Acrylamidgel, modifiziertem Dextrangel usw. und die in der japanischen Patentveröffentlichung !0 232/73 und
in der US-PS 40 28 187 beschriebenen Methoden angewendet werden. Die hierbei erhaltene Substanz löst
ein Fibringe! in Gegenwart von P'.iminogen, löst es
aber nicht in Abwesenheit von Plasminogen. Die Substanz vermag somit das Plasminogen so zu
aktivieren, daß es das Fibringel löst, und ist ein Plasminogen-Aktivator (siehe Proteinases in Mammalian
CeUs and Tissues von A. J. Barrett, North Holland Publishing Co, 1977).
Das Verfahren gemäß der Erfindung vermeidet die Nachteile des üblichen Verfahrens, bei dem die
Konzentration im eingesetzten Urin gering. Urin von gleichbleibender Qualität von gesunden Personen
schwierig zu erhalten ist und hygienische Probleme aufgeworfen werden. Gemäß der Erfindung wird ein
Ausgangsmaterial verwendet, das eine gleichbleibende, gleichmäßige Qualität aufweist und ständig in hohen
Konzentrationen und großen Mengen lieferbar ist. Ferner wird durch die Erfindung ein überlegenes
Verfahren für die Großherstellung von Plasminogen-Aktivator verfügbar.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Zu einer Lösung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung wurden jeweils Fumarsäure, Apfelsäure,
Bernsteinsäure, Glykolsäure, Glycin, «-Ketoglutarsäure, Oxalessigsäure, Maleinsäure, Brenztraubensäure
und Citronensäure in einer Menge von 60 mMol/l Lösung gegeben. Voll ausgewachsene Nierenzellen von
Rhesusaffen (Flow Laboratories, Inc.) und menschliche Nierenzellen (Flow Laboratories, Inc.) wurden jeweils
20 Tage bei 37°C in jeder Nährlösung in einer Luftatmosphäre, die 5% Kohlendioxidgas entiiielt,
gehalten. Die Menge von Piasminogenaktivator in der Lösung wurde ermittelt. Die Ergebnisse sind in F i g. 1
dargestellt. Diese Abbildung zeigt, daß in Anwesenheit von Apfelsäure, bernsteinsäure, Fumarsäure und Glykolsäure
die gebildete Menge von Plasminogen-Aktivator 160 bis 227% der beim Kontrollversuch, d.h. in
Abwesenheit von organischen Säuren erhaltenen Menge beträgt. Die Mengen an Plasminogen-Aktivator
sind in CTA-Einheiten ausgedrückt, die vom Committee on Thrombolytic Agsnts des National Heart Institute
festgelegt worden sind; siehe A. ). Johnson, Throm. Diath.Haemor.,2l(1989),259.
NaCI
KCI
Na2HPO4 ■ 2 H,O
KH2PO4
MgSO4 · 7 H2O
CaCI2(wasserfrei)
Glucose
MgCl· · 6H2O
NaIICO,
Milcheisveißhvdrolvsat
mg/1
8000.0
400.0
60.0
60.0
100.0
140.0
1000,0 100.0 350.0
5000.0
iNici'ci'i/.cnci'i VOi'i
NaCI
KCl
Na2HPO4 2 H2O
KIl2PO5
MgSO4 7 H2O
CaCI2(W üsserfrei)
Glucose
MgCI2 ■ b H2O
NaIlCO1
Mikheisseißhsdrolssat
I umarsaure
πι ρ I
8000.0
400.0
60.0
bO.O
100.0
140.0
1000.0
100.0
350.0
5000.0
3OmM Tabelle 3
Aktivatormenge (CTA/ml)
Aktivatormenge (CTA/ml)
titrtKtlfiisviiCii
Griinaffen (How Laboratories. Inc.) wurden 15 Tage bei
C in einer Lösung der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung in einer l.ufiatmosphäre. die 5%
Kohlendioxidgas enthielt, gehalten. Der Plasminogen-Aktivator
in der Lösung wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammen mit den
Ergebnissen eines Vergleichsversuchs, bei dem keine l-'umarsiiurc verwende! wurde, genannt. Die Tabelle
zeigt, daß bei Zusatz von Fumarsäure zur Nährlösung die Menge an Plasminogen-Aktivatnr das 1.8- bis
2.1 -fache der beim Vergleichsversuch erhaltenen Menge betrug. Die Aktivatormenge ist ebenso wie in Beispiel 1
in CTA-F.inheitcn ausgedruckt.
Verstrichen': Zeil in lagen
5 Kl 15
5 Kl 15
Fumarsäure anwesend
Fumarsäure abwesend
Fumarsäure abwesend
60
.14
.14
110
60
60
130
62
62
Bernsteinsäure. Apfelsäure und Glvkolsäure wurden jeweils in verschiedenen Konzentrationen zu einer
Lösung der in Tabelle I genannten Zusammensetzung gegeben. Voll ausgewachsene Nicrcnzellen von afrikanischen
Grünaffen (Flow Laboratories. Inc.) wurden jeweils in den erhaltenen Nährlösungen 20 Tage bei
37" C in einer Luftatmosphäre, die 5% Kohlendioxidgas
Lösungen wurde bestimmt.
Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt. Die Abbildung zeigt, daß ein starkei Anstieg der Menge an
Plasminogen-Aktisator erreicht wurde, wenn die
organischen Säuren in einer Konzentration son IO bis 120 mMol verwendet wurden.
Furn -säure. Apfelsäure. Bernsteinsäure und Glskolsäure
wurden jeweils in verschiedenen Konzentrationen zu einer Losung der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung
gegeben. Voll ausgewachsene menschliche Nierenzellen (Floss Laboratories Inc.) wurden jeweils in
den erhaltenen Nährlösungen 18 Tage bei 37 C in einer Luftatmosphäre, die 5% Kohlendioxidgas enthielt,
gehalten. Der Gehall an Plasminogen-Aktivator in den
Lösungen wurde bestimmt. Die l'rgebnissc sind in
F i g. 3 dargestellt. Die Abbildung zeigt, daß ein besonders starker Anstieg der Menge an Plasmmogen-Aktivator
erreicht wird, wenn die organischen Sauren in
einer Konzentration im Bereich von 10 bis Mj niMol
verwendet werden.
Die in Beispiel 4 beschriebenen Versuche ssurden wiederholt, wobei iedoch die Sauren in serschiedenen
Kombinationen, die in Tabelle 4 genannt sind,
verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind
ebenfalls in Tabelle 4 genannt.
lle 4
Fumarsäure
Bernsteinsäure
Bernsteinsäure
Apfelsäure
CiIv kolsäure
CiIv kolsäure
\ktisatormenge
(CTA/ml)
(CTA/ml)
S.iiirjnieniic ι niMoli
10
| 0 | 30 | 30 | 30 | (I | 0 | Ii | 20 | (I | 20 | 20 | 15 |
| 0 | 30 | 0 | 0 | 30 | 30 | 0 | 20 | 20 | 0 | 20 | 15 |
| 0 | 0 | 30 | 0 | 30 | C) | 3;; | 20 | 20 | 2(1 | Il | 15 |
| 0 | 0 | 0 | 30 | 0 | 30 | 30 | 0 | 20 | 20 | 20 | 15 |
| 1 | 141 | 149 | 140 | 138 | 135 | 125 | 135 | 135 | 130 | 125 | 120 |
Kin starker Anstieg der Menge an Plasminogen-Aktivator wird somit sowohl bei Verwendung der Säuren in
Kombination als auch bei Verwendung der Säuren allein erreicht. Ferner wurde eine besonders hohe Menge an
Plasminoeen-Aktivator erreicht, wenn Fumarsäure in Kombination mit Apfelsäure verwende! wurde.
Hier/u 3 Bhitt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Plasminogen-Aktivator, wobei man tierische Zellen, die Plasminogen-Aktivator zu bilden vermögen, mit einer wäßrigen Nährlösung zusammenführt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Nährlösung verwendet, die eine oder mehrere organische Säuren, ausgewählt aus Fumarsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure und Glykolsäure, mit einer Gesamtkonzentration von 1 bis 120 mMol/Liter wäßriger Nährlösung enthält
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|---|---|---|---|
| JP14423478A JPS5571496A (en) | 1978-11-24 | 1978-11-24 | Preparation of living substance |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OAP | Request for examination filed | ||
| OD | Request for examination | ||
| D2 | Grant after examination |