DE3711699C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene wäßrige Medium zur Kultivierung und Proliferation von epithelialen Zelltypen verschiedener Art in Primärkulturen in Gegenwart geeigneter Mitogene, welches außerdem enthält Salze, Zucker, Aminosäuren, Vitamine, Penicillin und Streptomycin. Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieser Erfindung.
Aus der Literatur ist es bekannt, für die Kultur von Zellen verschiedener Art, wie Knochenmarks-, Endothel- und Herzmuskelzellen oder Leukozyten verschiedene Kulturmedien zu verwenden. Diese Medien sind in der Regel wäßrige Lösungen, die eine Vielzahl verschiedener Verbindungen enthalten. Hauptbestandteile sind Salze, Zucker und Metaboliten, Aminosäuren, Nucleotide und Nucleoside, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide und weitere Zustände, wie Tenside, Schwermetallsalze und Farbstoffbestandteile. Beispiele für übliche Kulturmedien sind unter den Bezeichnungen "HAM", "Medium 199" und "NCTC" bekannt (H. J. Morton, in vitro 6 (1970), S. 89 bis 108.
Ein solches vollsynthetisches Zellkulturmedium mit Salz, Zucker, Aminosäure, Nucleosiden und Nucleosidbasen, Vitaminen, Vitaminoiden, Coenzymen, Steroiden und weiteren üblichen Zusätzen in wäßriger Lösung, wobei es zusätzlich mindestens zwei ungesättigte Fettsäuren in einer Menge von 0,1 bis 20 µmol/l und/oder mindestens ein Flavanoid in einer Menge von 0,1 bis 50 µmol/l und/oder mindestens ein Ubichinon in einer Menge von 0,01 bis 20 µmol/l und/oder Vitamin U in einer Menge von 0,1 bis 20 µmol/l und/oder Mevalolacton in einer Menge von 0,5 bis 30 µmol/l enthält, ist aus der DE-PS 31 10 559 bekannt.
Aus der DE-OS 35 17 609 ist ein Verfahren zur Kultivierung normaler Epithelzellen in einem ein Barbitursäure- Derivat enthaltenden Medium bekannt, wobei als normale Epithelzellen primär aus Leber stammenden Zellen verwendet werden, und zwar können es gereifte Ratten-Hepatozyten sein.
Nach dieser Offenlegungsschrift wird als Grundkulturmedium Eagle's MEM-Medium verwendet, ergänzt durch wärmeinaktiviertes Rinderserum zu 20%, Penicillin mit 100 E/ml, Streptomycin mit 100 µg/ml, Kanamycin mit 60 µg/ml und Fungizon mit 1 µg/ml.
Ein weiteres Kulturmedium für Zellen, zu deren Erhaltung und Fortpflanzung durch Inkubieren in einer Suspension unter Zellwachstums- und Zellerhaltungsbedingungen von pH und Temperatur unter Anwendung einer nichttoxischen sauerstoffdurchlässigen Membran, über die Sauerstoff zugeführt wird, ist beschrieben in der DE-PS 24 31 450, wobei ebenfalls von einem bekannten Nährmedium ausgegangen wird oder von einer physiologischen Kochsalzlösung, beispielsweise von Eagle's Basalmedium oder einem phosphatgepufferten Salzmedium PBA.
Die Kultivierung und Proliferation von epithelialen Zelltypen ist bekanntlich ein außerordentlich komplizierter, von vielen Faktoren beeinflußter Vorgang, und die Primärkultur normaler Epithelzellen in vitro würde höchstens eine sehr kurze Überlebensdauer haben, die ein Hindernis für die Untersuchung ihrer physiologischen Funktion oder für die Produktion physiologisch aktiver Substanzen wäre, wenn die Bedingungen für Kultur und Proliferation nicht optimal vorlägen.
Es ist daher erforderlich, ein Kulturmedium zu schaffen, welches in all seinen Komponenten auf optimale Bedingungen der Erhaltung und der Fortpflanzung der Zellen abgestimmt ist.
Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Proliferation von Hepatozyten foetaler, neugeborener und adulter Säuger in einem solchen Medium unter Zusatz von Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin und/oder Insulin Growth Factor, Hydrocortison und Transferrin zu bewirken.
Das Wachstum differenzierter epithelialer Zellen in Primärkulturen ist die Voraussetzung für die Immortalisierung derartiger Zelltypen unter Aufrechterhaltung zelltypischer spezifischer Funktionen und damit für die Darstellung permanent wachsender differenzierter Zellinien.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch die Verwendung eines wäßrigen Kulturmediums folgender Zusammensetzung pro Liter:
a) Aminosäuren
1. L-Alanin|17,1-18,9 mg
2. L-Asparagin 47,5-52,5 mg
3. L-Arginin 20,05-22,15 mg
4. L-Asparaginsäure 28,5-31,5 mg
5. L-Cystin 47,5-52,5 mg
6. L-Glutaminsäure 71,25-78,75 mg
7. L-Glutamin 55,48-61,32 mg
8. L-Glycin 95,0-105,0 mg
9. L-Histidin 39,9-44,1 mg
10. L-Hydroxyprolin 19,0-21,0 mg
11. L-Isoleucin 99,75-110,25 mg
12. L-Leucin 99,75-110,25 mg
13. L-Lysin 138,7-153,3 mg
14. L-Methionin 28,5-31,5 mg
15. L-Phenylalanin 62,7-69,3 mg
16. L-Prolin 32,3-35,7 mg
17. L-Serin 39,9-44,1 mg
18. L-Threonin 90,25-99,75 mg
19. L-Tryptophan 15,2-16,8 mg
20. L-Tyrosin 68,31-75,49 mg
21. L-Valin 89,3-98,7 mg
b) Vitamine
1. Ascorbinsäure|0,047-0,052 mg
2. p-Aminobenzoesäure 0,95-1,05 mg
3. Biotin 0,19-0,21 mg
4. Cholinchlorid 13,3-14,7 mg
5. Dithiothreit 0,95-1,05 mg
6. Ergocalciferol 0,95-1,05 mg
7. Folinsäure 0,57-0,63 mg
8. Glutathion (reduziert) 0,95-1,05 mg
9. Liponsäure 0,19-0,21 mg
10. Menadionbisulfit 0,0095-0,0105 mg
11. Nicotinamid 3,8-4,2 mg
12. Pyridoxal · HCl 3,8-4,2 mg
13. Retinonsäure 0,01425-0,01575 mg
14. Riboflavin 0,38-0,42 mg
15. Tetrahydrofolsäure 0,57-0,63 mg
16. Natriumpenthothenat 4,08-4,515 mg
17. Thiamin · HCl 3,8-4,2 mg
18. Vitamin B₁₂ 0,0047-0,00525 mg
c) Lipide
1. Arachidonsäure|0,057-0,063 mg
2. Cholesterol 0,057-0,063 mg
3. Linolensäure 0,0798-0,0882 mg
4. Sojabohnenlecithin 0,114-0,126 mg
5. Sphingomyelin 0,019-0,021 mg
6. Vitamin E (Tocopherol) 0,00114-0,00126 mg
7. Vitamin E Acetat 0,0038-0,0042 mg
d) Spurenelemente
1. CuSO₄ · 5H₂O|0,00114-0,00126 mg
2. FeCl₃ (0,01%) 0,95-1,05 ml
3. FeSO₄ · 7H₂O 0,2641-0,2919 mg
4. MnCl₂ · 4H₂O 0,00019-0,00021 mg
5. (NH₄)₆ Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,003515-0,003885 mg
6. NiSO₄ · 6H₂O 0,000076-0,000084 mg
7. Na₃VO₄ · 14H₂O 0,00171-0,00189 mg
8. ZnSO₄ · 7H₂O 0,27265-0,30135 mg
9. H₂SeO₃ 0,0019-0,0007 µg
e) Kohlenwasserstoffe, Metabolite
1. Dextrose|4275,0-4725,0 mg
2. D(-)Ribose 0,475-0,525 mg
3. Adenin 0,12825-0,14175 mg
4. Hypoxanthin 23,75-26,25 mg
5. Inosin 9,5-10,5 mg
6. Uracil 0,015-0,315 mg
7. Taurin 3,8-4,2 mg
8. i-Inositol 17,2235-19,0365 mg
9. Dihydroxyaceton 28,5-31,5 mg
10. Malonsäure 95,0-105,0 mg
11. Mevalonsäure 28,5-31,5 mg
12. Oxaloacetat 47,5-52,5 mg
13. Bernsteinsäure 95,0-105,0 mg
14. Ornithin 64,03-70,77 mg
15. Putrescin 0,152-0,168 mg
f) Salze
1. NaCl|6080,0-6720,0 mg
2. KCl 385,7-426,3 mg
3. CaCl₂ · 2H₂O 249,85-276,15 mg
4. MgSO₄ 190,0-210,0 mg
5. NaH₂PO₄ · H₂O 136,8-151,2 mg
6. NaHCO₃ 3503,6-3872,4 mg
Penicillin 37,335-41,265 mg
Streptomycin 59,375-65,625 mg
Phenolrot (1%) 1,425-1,575 mb
CO₂ (in feuchtem Inkubator) 9,5-10,5 mg
Nachfolgend wird dieses obige erfindungsgemäße Kulturmedium mit "MX-83" bezeichnet.
Die Kultivierung von Hepatozyten aus kollagenase- behandelten Lebern foetaler, neugeborener und adulter Säuger in argininfreiem MX-83-Medium plus Epidermal Growth Factor, Insulin, Hydrocortison und Transferrin führt zu deren Proliferation und Vermehrung in Primärkulturen. Infektion der Zellen während der ersten drei Tage nach Kultivierung, entweder mit Polyoma-Virus oder mit SV40-Virus, oder Transfektion der Zellen mit entsprechenden transformierenden Sequenzen dieser Viren führt bei fortlaufender Propagierung der Zellen im oben genannten Kulturmedium unter Zusatz der hepatotrophen Wachstumsfaktoren zur Entstehung klonierbarer immortalisierter Hepatozyten-Linien. Die Zellinien wachsen kontinuierlich im oben genannten Medium mit Insulin, Hydrocortison und Transferrin unter Aufrechterhaltung leberspezifischer Funktionen.
Aus Lebern transgenischer Mäuse verschiedener Entwicklungsstadien, die transformierende SV40-Virusgene in der Keimbahn tragen, welche mittels geeigneter Kontrollelemente (hepatotrophe enhancer-Sequenzen) in Hepatozyten ausgedrückt werden, können permanent wachsende, differenzierte Hepatozyten-Linien etabliert werden, die leberspezifische Funktionen ausdrücken. Dazu werden Lebern geeigneter Mäuse nach Kollagenasebehandlung in MX-83-Medium plus Epidermal Growth Factor, Insulin, Transferrin und Hydrocortison kultiviert und im gleichen Medium plus oben genannter Wachstumsfaktoren propagiert. Lebern transgenischer Mäuse, die das SVΔe-MGH-Fusionsgenkonstrukt 202 enthalten [R. Palmiter et al. Nature 316: 457-460 (1985)] führen zur Darstellung von Hepatozyten-Linien, deren Eigenschaften weitgehend denen von Hepatozyten in vivo entsprechen. Die Zellen sind klonierbar und vermehren sich als permanente Linien in MX-83-Medium plus Insulin plus Hydrocortison.
Herstellung des Kulturmediums MX-83
In einem Liter entmineralisierten-destillierten Wassers werden die Salze und Säuren und sonstigen Bestandteile des oben beschriebenen Kulturmediums gelöst. Diese Lösung kann weitere Bestandteile enthalten, die sich durch die zu kultivierenden Zellen oder Zelltypen ergeben. So können beispielsweise zur Einstellung des erforderlichen pH-Wertes übliche Phosphat- und Carbonatpuffersysteme, aber auch andere Puffer, beispielsweise organische Puffersysteme, wie HEPES, verwandt werden.
Zur Herstellung von Medien dieser Art wird im allgemeinen ein Wasser mit der ASTM-1-Qualität verwandt. Es ist auch üblich, das Wasser vermittels Ultrafiltration an tensidfreien Membranen von möglichen Endotoxin-Kontaminationen zu befreien. Das fertige Medium wird sterilfiltriert und ist bei Temperaturen bei 4°C lagerfähig und längere Zeit haltbar.
Die verfahrensmäßig zu verwendenden Mitogene sind an sich bekannter Art, beispielsweise auch pflanzlichen Ursprungs, wie Phytohämagglutinin oder dgl.
Die Wahl der Temperaturen des Kulturmediums MX 83 hängt von den Zelltypen ab, die fortzupflanzen sind, nämlich der optimalen Temperatur bei der Wachstum und Erhaltung stattfindet. Bei Zellen von Säugetieren würde ein Temperaturbereich von 35 bis 40°C, vorzugsweise etwa 37°C, angewandt, jedoch können auch niedrigere und höhere Temperaturen angewandt werden.
Die mit dem erfindungsgemäßen Medium MX 83 zu kultivierenden und proliferierenden Zellen können verschiedensten Ursprungs sein und einen weiten Bereich überdecken, beispielsweise Leberzellen von Ratten und Mäusen, aber auch Leberzellen humanen Ursprungs sowie epitheliale Zellen des Dünndarms sowie auch endotheliale Zellen. Die Herstellung der Zellen geschieht in an sich bekannter Weise wie beispielsweise in der obengenannten DE-PS 24 31 450 beschrieben.
Beispiel
Für die Kultivierung und Proliferation von Hepatozyten foetaler, neugeborener und adulter Säuger hat sich die nachfolgende Zusammensetzung des Kulturmediums MX 83 mit einem Zusatz von Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin (oder Insulin Growth Factors), Hydrocortison und Transferrin als besonders erfolgreich erwiesen.
Kulturmedium MX 83 in bevorzugter Zusammensetzung
a) Aminosäuren
(mg/Liter)
1. L-Alanin|18 mg
2. L-Asparagin 50 mg
3. L-Arginin 21,1 mg
4. L-Asparaginsäure 30 mg
5. L-Cystin 50 mg
6. L-Glutaminsäure 75 mg
7. L-Glutamin 58,4 mg
8. L-Glycin 100 mg
9. L-Histidin 42 mg
10. L-Hydroxyprolin 20 mg
11. L-Isoleucin 105 mg
12. L-Leucin 105 mg
13. L-Lysin 146 mg
14. L-Methionin 30 mg
15. L-Phenylalanin 66 mg
16. L-Prolin 34 mg
17. L-Serin 42 mg
18. L-Threonin 95 mg
19. L-Tryptophan 16 mg
20. L-Tyrosin 71,9 mg
21. L-Valin 94 mg
b) Vitamine
1. Ascorbinsäure|0,05 mg
2. p-Aminobenzoesäure 1,0 mg
3. Biotin 0,2 mg
4. Cholinchlorid 14 mg
5. Dithiothreit 1 mg
6. Ergocalciferol 1 mg
7. Folinsäure 0,6 mg
8. Glutathion (reduziert) 1 mg
9. Liponsäure 0,2 mg
10. Menadionbisulfit 0,01 mg
11. Nicotinamid 4 mg
12. Pyridoxal · HCl 4 mg
13. Retinonsäure 0,015 mg
14. Riboflavin 0,4 mg
15. Tetrahydrofolsäure 0,6 mg
16. Natriumpanthothenat 4,3 mg
17. Thiamin · HCl 4 mg
18. Vitamin B₁₂ 0,005 mg
c) Lipide
1. Arachidonsäure|0,06 mg
2. Cholesterol 0,06 mg
3. Linolensäure 0,084 mg
4. Sojabohnenlecithin 0,12 mg
5. Sphingomyelin 0,02 mg
6. Vitamin E (Tocopherol) 0,0012 mg
7. Vitamin E Acetat 0,004 mg
d) Spurenelemente
1. CuSO₄ · 5H₂O|0,0012 mg
2. FeCl₃ (0,01%) 1 ml
3. FeSO₄ · 7H₂O 0,278 mg
4. MnCl₂ · 4H₂O 0,0002 mg
5. (NH₄)₆ Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,0037 mg
6. NiSO₄ · 6H₂O 0,00008 mg
7. Na₃VO₄ · 14H₂O 0,0018 mg
8. ZnSO₄ · 7H₂O 0,287 mg
9. H₂SeO₃ 0,0013 µg
e) Kohlenwasserstoffe, Metabolite
1. Dextrose|4500 mg
2. D(-)Ribose 0,5 mg
3. Adenin 0,135 mg
4. Hypoxanthin 25 mg
5. Inosin 10 mg
6. Uracil 0,3 mg
7. Taurin 4 mg
8. i-Inositol 18,13 mg
9. Dihydroxyaceton 30 mg
10. Malonsäure 100 mg
11. Mevalonsäure 30 mg
12. Oxaloacetat 50 mg
13. Bernsteinsäure 100 mg
14. Ornithin 67,4 mg
15. Putrescin 0,16 mg
f) Salze
1. NaCl|6400 mg
2. KCl 406 mg
3. CaCl₂ · 2H₂O 263 mg
4. MgSO₄ 200 mg
5. NaH₂PO₄ · H₂O 144 mg
6. NaHCO₃ 3688 mg
Penicillin 39,3 mg
Streptomycin 62,5 mg
Phenolrot (1%) 1,5 ml
CO₂ (in feuchtem Inkubator) 10 mg
Mit dieser Zusammensetzung des Kulturmediums MX 83 wird bei einer Temperatur von 37°C im CO₂-Inkubator im luftfeuchten Raum gearbeitet.

Claims (2)

1. Wäßriges Medium zur Kultivierung und Proliferation von epithelialen Zelltypen verschiedener Art in Primärkulturen in Gegenwart geeigneter Mitogene, welches ferner enthält Salze, Zucker, Aminosäuren, Vitamine, Penicillin und Streptomycin, gekennzeichnet durch folgende Zusammensetzung pro Liter: a) Aminosäuren 1. L-Alanin|17,1-18,9 mg 2. L-Asparagin 47,5-52,5 mg 3. L-Arginin 20,05-22,15 mg 4. L-Asparaginsäure 28,5-31,5 mg 5. L-Cystin 47,5-52,5 mg 6. L-Glutaminsäure 71,25-78,75 mg 7. L-Glutamin 55,48-61,32 mg 8. L-Glycin 95,0-105,0 mg 9. L-Histidin 39,9-44,1 mg 10. L-Hydroxyprolin 19,0-21,0 mg 11. L-Isoleucin 99,75-110,25 mg 12. L-Leucin 99,75-110,25 mg 13. L-Lysin 138,7-153,3 mg 14. L-Methionin 28,5-31,5 mg 15. L-Phenylalanin 62,7-69,3 mg 16. L-Prolin 32,3-35,7 mg 17. L-Serin 39,9-44,1 mg 18. L-Threonin 90,25-99,75 mg 19. L-Tryptophan 15,2-16,8 mg 20. L-Tyrosin 68,31-75,49 mg 21. L-Valin 89,3-98,7 mg
b) Vitamine 1. Ascorbinsäure|0,047-0,052 mg 2. p-Aminobenzoesäure 0,95-1,05 mg 3. Biotin 0,19-0,21 mg 4. Cholinchlorid 13,3-14,7 mg 5. Dithiothreit 0,95-1,05 mg 6. Ergocalciferol 0,95-1,05 mg 7. Folinsäure 0,57-0,63 mg 8. Glutathion (reduziert) 0,95-1,05 mg 9. Liponsäure 0,19-0,21 mg 10. Menadionbisulfit 0,0095-0,0105 mg 11. Nicotinamid 3,8-4,2 mg 12. Pyridoxal · HCl 3,8-4,2 mg 13. Retinonsäure 0,01425-0,01575 mg 14. Riboflavin 0,38-0,42 mg 15. Tetrahydrofolsäure 0,57-0,63 mg 16. Natriumpenthothenat 4,08-4,515 mg 17. Thiamin · HCl 3,8-4,2 mg 18. Vitamin B₁₂ 0,0047-0,00525 mg
c) Lipide 1. Arachidonsäure|0,057-0,063 mg 2. Cholesterol 0,057-0,063 mg 3. Linolensäure 0,0798-0,0882 mg 4. Sojabohnenlecithin 0,114-0,126 mg 5. Sphingomyelin 0,019-0,021 mg 6. Vitamin E (Tocopherol) 0,00114-0,00126 mg 7. Vitamin E Acetat 0,0038-0,0042 mg
d) Spurenelemente 1. CuSO₄ · 5H₂O|0,00114-0,00126 mg 2. FeCl₃ (0,01%) 0,95-1,05 ml 3. FeSO₄ · 7H₂O 0,2641-0,2919 mg 4. MnCl₂ · 4H₂O 0,00019-0,00021 mg 5. (NH₄)₆ Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,003515-0,003885 mg 6. NiSO₄ · 6H₂O 0,000076-0,000084 mg 7. Na₃VO₄ · 14H₂O 0,00171-0,00189 mg 8. ZnSO₄ · 7H₂O 0,27265-0,30135 mg 9. H₂SeO₃ 0,0019-0,0007 µg
e) Kohlenwasserstoffe, Metabolite 1. Dextrose|4275,0-4725,0 mg 2. D(-)Ribose 0,475-0,525 mg 3. Adenin 0,12825-0,14175 mg 4. Hypoxanthin 23,75-26,25 mg 5. Inosin 9,5-10,5 mg 6. Uracil 0,015-0,315 mg 7. Taurin 3,8-4,2 mg 8. i-Inositol 17,2235-19,0365 mg 9. Dihydroxyaceton 28,5-31,5 mg 10. Malonsäure 95,0-105,0 mg 11. Mevalonsäure 28,5-31,5 mg 12. Oxaloacetat 47,5-52,5 mg 13. Bernsteinsäure 95,0-105,0 mg 14. Ornithin 64,03-70,77 mg 15. Putrescin 0,152-0,168 mg
f) Salze 1. NaCl|6080,0-6720,0 mg 2. KCl 385,7-426,3 mg 3. CaCl₂ · 2H₂O 249,85-276,15 mg 4. MgSO₄ 190,0-210,0 mg 5. NaH₂PO₄ · H₂O 136,8-151,2 mg 6. NaHCO₃ 3503,6-3872,4 mg Penicillin 37,335-41,265 mg Streptomycin 59,375-65,625 mg
2. Medium nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch folgende Zusammensetzung pro Liter: a) Aminosäuren 1. L-Alanin|18 mg 2. L-Asparagin 50 mg 3. L-Arginin 21,1 mg 4. L-Asparaginsäure 30 mg 5. L-Cystin 50 mg 6. L-Glutaminsäure 75 mg 7. L-Glutamin 58,4 mg 8. L-Glycin 100 mg 9. L-Histidin 42 mg 10. L-Hydroxyprolin 20 mg 11. L-Isoleucin 105 mg 12. L-Leucin 105 mg 13. L-Lysin 146 mg 14. L-Methionin 30 mg 15. L-Phenylalanin 66 mg 16. L-Prolin 34 mg 17. L-Serin 42 mg 18. L-Threonin 95 mg 19. L-Tryptophan 16 mg 20. L-Tyrosin 71,9 mg 21. L-Valin 94 mg
b) Vitamine 1. Ascorbinsäure|0,05 mg 2. p-Aminobenzoesäure 1,0 mg 3. Biotin 0,2 mg 4. Cholinchlorid 14 mg 5. Dithiothreit 1 mg 6. Ergocalciferol 1 mg 7. Folinsäure 0,6 mg 8. Glutathion (reduziert) 1 mg 9. Liponsäure 0,2 mg 10. Menadionbisulfit 0,01 mg 11. Nicotinamid 4 mg 12. Pyridoxal · HCl 4 mg 13. Retinonsäure 0,015 mg 14. Riboflavin 0,4 mg 15. Tetrahydrofolsäure 0,6 mg 16. Natriumpenthothenat 4,3 mg 17. Thiamin · HCl 4 mg 18. Vitamin B₁₂ 0,005 mg
c) Lipide 1. Arachidonsäure|0,06 mg 2. Cholesterol 0,06 mg 3. Linolensäure 0,084 mg 4. Sojabohnenlecithin 0,12 mg 5. Sphingomyelin 0,02 mg 6. Vitamin E (Tocopherol) 0,0012 mg 7. Vitamin E Acetat 0,004 mg
d) Spurenelemente 1. CuSO₄ · 5H₂O|0,0012 mg 2. FeCl₃ (0,01%) 1 ml 3. FeSO₄ · 7H₂O 0,278 mg 4. MnCl₂ · 4H₂O 0,0002 mg 5. (NH₄)₆ Mo₇O₂₄ · 4H₂O 0,0037 mg 6. NiSO₄ · 6H₂O 0,00008 mg 7. Na₃VO₄ · 14H₂O 0,0018 mg 8. ZnSO₄ · 7H₂O 0,287 mg 9. H₂SeO₃ 0,0013 µg
e) Kohlenwasserstoffe, Metabolite 1. Dextrose|4500 mg 2. D(-)Ribose 0,5 mg 3. Adenin 0,135 mg 4. Hypoxanthin 25 mg 5. Inosin 10 mg 6. Uracil 0,3 mg 7. Taurin 4 mg 8. i-Inositol 18,13 mg 9. Dihydroxyaceton 30 mg 10. Malonsäure 100 mg 11. Mevalonsäure 30 mg 12. Oxaloacetat 50 mg 13. Bernsteinsäure 100 mg 14. Ornithin 67,4 mg 15. Putrescin 0,16 mg
f) Salze 1. NaCl|6400 mg 2. KCl 406 mg 3. CaCl₂ · 2H₂O 263 mg 4. MgSO₄ 200 mg 5. NaH₂PO₄ · H₂O 144 mg 6. NaHCO₃ 3688 mg Penicillin 39,3 mg Streptomycin 62,5 mg
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