DE60037819T2 - Metallbindende verbindungen und deren verwendung in zusammensetzungen für zellkulturmedien - Google Patents

Metallbindende verbindungen und deren verwendung in zusammensetzungen für zellkulturmedien Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf dem Gebiet der Tierzellenbiologie. Die Erfindung betrifft Verfahren zur Kultivierung von Tierzellen, die zumindest eine Metall-bindende Verbindung und/oder die Metall-bindende Verbindung umfassende Übergangsmetallkomplexe einschließen, die Verwendung von bestimmten Verbindungen zur Verabreichung von Übergangsmetallen an Tierzellen, die Metall-bindenden Verbindungen sowie die Verfahren und Verwendung, die nachstehend genauer definiert sind.
  • Zugehöriges Fachgebiet
  • Zellkulturmedien stellen die Nährstoffe bereit, die für das Halten und Züchten von Zellen in einer kontrollierten, künstlichen und in vitro Umgebung notwendig sind. Eigenschaften und Formulierungen der Zellkulturmedien sind in Abhängigkeit von den besonderen zellulären Anforderungen unterschiedlich. Zu wichtigen Parametern zählen die Osmolarität, der pH-Wert und die Nährstoffzusammensetzungen.
  • Medienformulierungen wurden zum Züchten einer Reihe von Zelltypen verwendet, einschließlich tierischer, pflanzlicher und bakterieller Zellen. Gezüchtete Zellen verfügen über viele Verwendungen, einschließlich der Untersuchung von physiologischen Vorgängen und der Herstellung von nützlichen biologischen Substanzen. Beispiele für solche nützlichen Produkte schließen monoklonale Antikörper, Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme und dergleichen ein. Solche Produkte verfügen über viele kommerzielle und therapeutische Anwendungen, und seit der Einführung der rekombinanten DNA-Technologie können Zellen zur Erzeugung großer Mengen dieser Produkte gezielt hergestellt werden. Gezüchtete Zellen werden ferner routinemäßig für die Isolierung, Identifizierung und das Wachstum von Viren verwendet, die als Vektoren und/oder Impfstoffe eingesetzt werden können. Somit ist die Möglichkeit der In-vitro-Züchtung von Zellen nicht nur für die Untersuchung der Zellphysiologie von Bedeutung, sondern auch für die Herstellung nützlicher Substanzen notwendig, die ansonsten nicht durch kosteneffektive Mittel erhalten werden könnten.
  • Zellkulturmediumformulierungen sind in der Literatur gut dokumentiert und eine Reihe von Medien ist im Handel erhältlich. Bei frühen Zellkulturarbeiten waren die Mediumformulierungen auf der Basis der chemischen Zusammensetzung und physikochemischen Eigenschaften (z. B. Osmolalität, pH, usw.) von Blut und wurden als "physiologische Lösungen" bezeichnet (Ringer, S., J. Physiol. 3:380–393 (1880); Waymouth, C., In: Cells and Tissues in Culture, Vol. 1, Academic Press, London, S. 99–142 (1965); Waymouth, C., In Vitro 6:109–127 (1970)). Allerdings sind Zellen in unterschiedlichen Geweben des Säugetierkörpers unterschiedlichen Mikroumgebungen hinsichtlich Sauerstoff/Kohlendioxid-Partialdruck und Konzentrationen von Nährstoffen, Vitaminen und Spurenelementen ausgesetzt; dementsprechend kann eine erfolgreiche in vitro Kultur von unterschiedlichen Zelltypen die Verwendung von unterschiedlichen Mediumformulierungen erfordern. Typische Komponenten von Zellkulturmedien beinhalten Aminosäuren, organische und anorganische Salze, Vitamine, Spurenmetalle, Zucker, Lipide und Nukleinsäuren, von denen die Arten und Mengen sich in Abhängigkeit von den bestimmten Erfordernissen einer gegebenen Zell- oder Gewebeart verändern können.
  • Typischerweise werden Zellkulturmediumformulierungen mit einer Reihe von Additiven ergänzt, einschließlich nicht definierter Komponenten, wie fötales Rinderserum (FBS) (10–20% V/V) oder Extrakte aus tierischen Embryos, Organen oder Drüsen (0,5–10% V/V). Während FBS das am häufigsten eingesetzte Supplement in tierischen Zellkulturmedien ist, werden andere Serumquellen ebenfalls routinemäßig verwendet, einschließlich neugeborene Kälber, Pferde und Menschen. Diese Arten von chemisch nicht definierten Supplementen erfüllen mehrere nützliche Funktionen in Zellkulturmedien (Lambert, K. J. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R. E. et al., Eds., Academic Press New York, S. 85–122 (1985)). Zum Beispiel stellen diese Supplemente Träger oder Chelatoren für labile oder wasserunlösliche Nährstoffe bereit; binden und neutralisieren toxische Gruppierungen; stellen Hormone und Wachstumsfaktoren, Proteaseinhibitoren und essenzielle häufig nicht identifizierte oder nicht definierte niedermolekulare Nährstoffe bereit; schützen Zellen vor physischem Stress und Beschädigung; und stellen Träger (z. B. Transferrin und Ceruloplasmin) für bestimmte essenzielle Metallionen (z. B. Fe++ und Fe+++) bereit. Somit werden Serum- und/oder Tierextrakte häufig als relativ kostengünstige Supplemente verwendet, um ein optimales Kulturmedium für die Züchtung von tierischen Zellen bereitzustellen.
  • Unglücklicherweise besitzt die Verwendung von Serum- oder Tierextrakten in Gewebekulturanwendungen mehrere Nachteile (Lambert, K. J. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol 1, Spier, R. E. et al., Herausg., Academic Press New York, S. 85–122 (1985)). Zum Beispiel kann die chemische Zusammensetzung dieser Supplemente sich zwischen Chargen verändern, und zwar sogar von einem einzigen Hersteller. Zusätzlich können Supplemente tierischen oder menschlichen Ursprungs ferner mit erworbenen Erregern verunreinigt sein (z. B. Mycoplasma, Viren und Prione). Diese Erreger können die Gesundheit der gezüchteten Zellen ernsthaft unterminieren, wenn diese verunreinigten Supplemente in Zellkulturmediumformulierungen verwendet werden. Ferner können diese Erreger ein Gesundheitsrisiko darstellen, wenn Substanzen, die in mit erworbenen Erregern verunreinigten Kulturen hergestellt wurden, bei der Zelltherapie und anderen klinischen Anwendungen verwendet werden. Eine der größten Befürchtungen ist das Vorhandensein von Prionen, die spongiforme Enzephalopathien bei Tieren und die Creutzfeld-Jakob-Krankheit bei Menschen verursachen.
  • Das Vorhandensein von Serum in Kulturmedien kann zusätzliche Schwierigkeiten darstellen. Die Zelloberflächenchemie, die ein entscheidender Teil der in vitro Mikroumgebung für viele Zellarten ist, kann über Adsorption oder Aufnahme von Serum- oder Extraktproteinen nachteilig modifiziert werden. Die Verwendung von nicht definierten Komponenten, wie Serum- oder Tierextrakte, verhindert ferner die genaue Definition und Erläuterung der Nährstoff- und Hormonanforderungen der gezüchteten Zellen, wodurch die Möglichkeit beseitigt wird, die Wirkung von spezifischen Wachstumsfaktoren oder Nährstoffen auf das Wachstum und die Differenzierung von Zellen in Kultur in einer kontrollierten Art und Weise zu untersuchen. Darüber hinaus halten nicht definierte Supplemente den Forscher von der Untersuchung des anomalen Wachstums und Differenzierung und spezifischer erkrankungsbedingter Veränderungen in gezüchteten Zellen ab. Die Verwendung von Zellkulturmedien bei der industriellen Herstellung von biologischen Substanzen, Serum- und Tierextraktergänzung von Kulturmedien kann ferner die Reinigung der gewünschten Substanzen von dem Kulturmedium durch die Notwendigkeit des Entfernens von Serum- oder Extraktproteinen erschweren und die Kosten erhöhen.
  • Serumfreie Medien
  • Zur Überwindung der Nachteile der Verwendung von Serum- oder Tierextrakten wurde eine Anzahl von serumfreien Medien entwickelt. Diese Medien, die häufig für die Unterstützung der Kultur einer einzigen Zellart spezifisch formuliert sind, schließen definierte Mengen gereinigter Wachstumsfaktoren, Lipoproteine und weiterer Proteine ein, die normalerweise von dem Serum- oder Extrakt-Supplement bereitstellt werden. Da die Komponenten (und Konzentrationen davon) in solchen Kulturmedien genau bekannt sind, werden diese Medien im Allgemeinen als "definierte Kulturmedien" und häufig als "serumfreie Medien" oder "SFM" bezeichnet. Eine Anzahl von SFM-Formulierungen ist im Handel erhältlich, zum Beispiel von Life Technologies, Inc. (Rockville, MD), wie diejenigen, die für die Unterstützung der Kultur von Endothelzellen, Keratinozyten, Monozyten/Makrophagen, Fibroblasten, Neuronen, Lymphozyten, Chondrozyten, hämatopoietischen Stammzellen, embryonalen Stammzellen, Insektenzellen, CHO-Zellen, Vero-Zellen, 293-HEK-Zellen, HeLa-Zellen, PER-C6 (menschliche embryonale Epithelzellen der Retina) oder Hepatozyten ausgelegt sind.
  • SFM stellen dem Verwender im Allgemeinen mehrere unterschiedliche Vorteile bereit. Zum Beispiel ermöglicht die Verwendung von SFM die Erforschung der Auswirkungen eines spezifischen Wachstumsfaktors oder einer weiteren Mediumkomponente auf die zelluläre Physiologie, die bei Kultivierung der Zellen in Serum oder Extrakt enthaltenden Medien maskiert sein kann. Zusätzlich können SFM wesentlich geringere Proteinmengen (deswegen werden SFM häufig als "proteinarme Medien" bezeichnet) enthalten als diejenigen Medien, die Serum oder Extrakte enthalten, wodurch die Reinigung von biologischen Substanzen, die von in SFM gezüchteten Zellen hergestellt werden, wesentlich einfacher und kostengünstiger wird.
  • Einige extrem einfache SFM, die im Wesentlichen aus Vitaminen, Aminosäuren, organischen und anorganischen Salzen und Puffern bestehen, wurden für Zellkulturen verwendet. Solchen Medien (häufig als "Basalmedien" bezeichnet) fehlt es allerdings normalerweise stark an dem Gehalt an Nährstoff, Hormon oder Modifizierer der biologischen Antwort, der von den meisten tierischen Zellen benötigt wird. Dementsprechend schließen die meisten SFM zusätzliche Komponenten in die Basalmedien ein, um die Medien bezüglich der Nährstoffe oder Hormone komplexer zu gestalten, während versucht wird, die serumfreie und proteinarme Natur des Inhalts der Medien zu erhalten. Beispiele solcher Komponenten schließen Serumalbumin aus Rindern (BSA) oder aus Menschen (HSA), aus Tieren stammende Lipide, wie menschliches Excyte (Bayer); Sterole, usw., Insulin, Transferrin und bestimmte Wachstumsfaktoren oder Hormone, die sich von natürlichen (tierischen) oder rekombinanten Quellen herleiten, ein.
  • Die Verwendung solcher aus Tieren stammender Supplemente in Zellkulturmedien besitzt jedoch auch bestimmte Nachteile. Zum Beispiel besteht die Gefahr, dass das Kulturmedium und/oder daraus gereinigte Produkte immunogen sein könnten, insbesondere wenn sich die Supplemente von einem Tier herleiten, das sich von der Quelle der zu züchtenden Zellen unterscheidet. Wenn biologische Substanzen, die als Therapeutika eingesetzt werden sollen, aus solchen Kulturmedien gereinigt werden, könnten somit bestimmte Mengen dieser immunogenen Proteine oder Peptide mitgereinigt werden und könnten bei einem Tier, das solche Therapeutika erhält, eine Immunreaktion bis hin zur und einschließlich Anaphylaxe hervorrufen.
  • Zur Überwindung dieses potenziellen Problems könnten Supplemente verwendet werden, die sich von der gleichen Spezies wie die zu züchtenden Zellen herleiten. Zum Beispiel könnte die Züchtung von menschlichen Zellen erleichtert werden, indem HSA als ein Supplement verwendet wird, während in Medien für die Züchtung von Rinderzellen anstelle davon BSA verwendet würde. Dieser Ansatz birgt jedoch die Gefahren der Einbringung von verunreinigenden Stoffen und erworbenen Pathogenen in das Kulturmedium (wie HIV, Creutzfeld-Jakob-Erreger oder Hepatitis-Viren aus HSA-Zubereitungen oder das Prion der bovinen spongiformen Enzephalopathie aus BSA-Zubereitungen), die offensichtlich die Verwendung solcher Medien bei der Herstellung von tierischen und humanen Therapeutika negativ beeinflussen können. Tatsächlich wird aus solchen Sicherheitsgründen die Verwendung von Zellkulturmedien, die sich von Menschen oder Tieren ableitende Produkten enthalten, die solche Pathogene enthalten könnten, durch die biotechnologische Industrie und staatliche Einrichtungen in zunehmendem Maße geregelt, davon abgeraten und sogar verboten.
  • Ungeachtet der potenziellen Schwierigkeiten, die durch den Zusatz von aus Tieren stammenden Supplementen zu Zellkulturmedien aufgeworfen werden, befinden sich solche Supplemente in routinemäßigem Gebrauch. Ein solches Supplement, das häufig zu definierten Medien zugegeben wird, ist Transferrin. Transferrin fungiert in vivo, um Eisen an Zellen zu liefern. Der Mechanismus der Eisenaufnahme durch Säugetierzellen wurde in einem Review veröffentlicht (Qian, Z. M. and Tang, P. L. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1269, 205–214). Da Eisen als ein Cofaktor bei zahlreichen metabolischen Prozessen benötigt wird, die Energieerzeugung und oxidative Atmung einschließen, werden serumfreie Medien häufig mit Transferrin ergänzt, damit das benötigte Eisen für die erfolgreiche Kultivierung der meisten Zellen in vitro geliefert wird. Bedenken über verschiedene potenziell erworbene Erreger in Zubereitungen von Transferrin haben eine Suche nach anderen natürlichen Eisen-Trägerverbindungen angeregt, die als ein Ersatz für Transferrin verwendet werden können. Diese Suche wird durch die Tatsache erschwert, dass sich die natürlichen Eisen-Träger häufig von Serum ableiten und somit den vorstehend beschriebenen Einschränkungen der Serumergänzung unterworfen sind.
  • Metallbindende Verbindungen
  • Zur Überwindung der Einschränkungen der Verwendung von natürlich abgeleiteten Metall-Trägern werden gegenwärtig bestimmte metallbindende Verbindungen zur Verwendung bei der Lieferung von Metallen, insbesondere Zink, Eisen, Mangan und Magnesium, an gezüchtete Zellen erforscht. Für einfache Träger, wie chelatisierende Mittel (z. B. EDTA) und bestimmte Säuren oder Salze davon (z. B. Citrate, Picolinate und Derivate von Benzoesäure oder Hydroxamsäure), wurde gezeigt, dass sie bei bestimmten serumfreien Zuchtmedien nützlich sind (siehe US-Patent Nrn. 5,045,454 und 5,118,513 ; Testa et al., Brit. J. Haematol. 60:491–502, (1985); Ganeshaguru et al., Biochem. Pharmacol. 29:1275–1279 (1980); White et al., Blood 48:923–929 (1976)).
  • Obwohl diese Referenzen einige Metall-Träger offenbaren, ist die Interpretation der Daten durch mehrere experimentelle Faktoren erschwert. Die Daten wurden aus einer begrenzten Anzahl von Zelllinien gesammelt und zeigen Ergebnisse einer einzigen Passage. Außerdem wurden die Medien mit Serum ergänzt. Serum enthält von Natur aus Transferrin und andere potenzielle Eisen-Träger. Es gibt einen "Übertragungseffekt" auf das Wachstum von Zellen, die in einem serumergänzten Medium gezüchtet wurden, sogar nach ein oder zwei Passagen in Abwesenheit von Serum oder Transferrin (siehe zum Beispiel Keenan, J. und Clynes, M. (1996) In Vitro Cell Dev. Biol-Animal 32, 451–453). Andere bekannte metallbindende Verbindungen wurden medizinisch verwendet, um Eisen aus dem Körper zu entfernen und nicht für die Lieferung. Unglücklicherweise stellen viele dieser einfachen Eisen chelatisierenden Verbindungen keine ausreichende Eisen-Verfügbarkeit für oder -Aufnahme durch gezüchtete Zellen bereit.
  • Somit verbleibt ein Bedarf auf dem Fachgebiet nach Verbindungen, die in der Lage sind, Übergangsmetalle für in vitro gezüchtete Zellen zu liefern. Genauer besteht ein Bedarf auf dem Fachgebiet nach Eisen-Trägern für die Verwendung in serumfreien, proteinarmen Kulturmedien, die für die Züchtung von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen geeignet sind. Eine solche Mediumformulierung erleichtert Untersuchungen der Auswirkungen von Wachstumsfaktoren und anderer Stimuli auf die Zellphysiologie, gestattet eine einfachere und kosteneffektivere Reinigung von biologischen Substanzen, die von gezüchteten tierischen Zellen hergestellt wurden, in der biotechnologischen Industrie, und beseitigt vor allem die Gefahr der Einbringung von erworbenen tierischen und menschlichen Pathogenen. Diese Spezifikation offenbart Verbindungen, die in der Lage sind, Übergangsmetalle für in vitro gezüchtete tierische Zellen zu liefern.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung verwendet Verbindungen, die in der Lage sind, Übergangsmetalle für in vitro gezüchtete Zellen zu liefern, indem Kulturmedien bereitgestellt werden, die eine oder mehrere nicht von Tieren stammende metallbindende Verbindungen umfassen, die für die Bereitstellung essenzieller Metalle (z. B. Fe++- oder Fe+++-Ionen) für Zellen verwendet werden können. Die in der Erfindung verwendeten Verbindungen umfassen eine metallbindende Verbindung, wie nachstehend definiert, die einem Medium alleine zugegeben werden kann oder mit einem oder mehreren Übergangselementionen vor der Zugabe zu dem Medium komplexiert werden kann. Die hier beschriebenen Verbindungen wurden verwendet, um die Lieferung von Übergangsmetallen für in vitro gezüchtete Zellen zu erleichtern. Insbesondere wurden die Verbindungen der vorliegenden Offenbarung wegen ihrer Fähigkeit zur Lieferung von Eisen und zur Ersetzung von Transferrin ausgewählt. Die Verbindungen wurden in Abwesenheit von Transferrin für mindestens drei Subkulturen getestet. Diese Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit zur Unterstützung des Wachstums von mindestens drei herkömmlich verwendeten Zelllinien: CHO-, Sp2/0- und 293-HEK-Zellen getestet.
  • Die vorliegende Erfindung verfügt über zwei verschiedene Aspekte, wie als Nächstes detailliert wird. Beiden Aspekten ist gemeinsam, dass sie die Verwendung einer metallbindenden Verbindung, wie hier beschrieben, einschließen, und ein Aspekt schließt explizit die Verwendung eines Zellkulturmediums ein, das zumindest eine solche metallbindende Verbindung oder zumindest einen Komplex aus einem Übergangselement umfasst, wobei der Komplex zumindest ein Übergangselement oder ein Salz oder Ion davon umfasst, das mit einer solchen metallbindenden Verbindung komplexiert ist. Die Identitäten der metallbindenden Verbindungen werden später detailliert.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren für das Kultivieren von tierischen Zellen mittels mehrerer Passagen oder in einer Perfusionskultur. Das Verfahren verwendet ein Zellkulturmedium, wie soeben beschrieben.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung bereit, um für in vitro in einem Zellkulturmedium gezüchtete tierische Zellen Übergangsmetalle einer metallbindenden Verbindung, wie hier beschrieben, zu liefern. Die in der Erfindung verwendeten Zellkulturmedien werden verwendet, um tierische Zellen (insbesondere menschliche Zellen) zu züchten oder zu kultivieren. Somit können die metallbindenden Verbindungen einem beliebigen Typ oder einer beliebigen Art von Kulturmedien für tierische Zellen zugegeben werden, und werden vorzugsweise verwendet, um natürlich abgeleitete Metall-Träger (z. B. aus Tieren stammende Proteine oder Extrakte, wie Transferrin) in solchen Medien zu ersetzen.
  • Die in der Erfindung verwendeten Kulturmedien sind vorzugsweise serumfrei und umfassen zumindest eine metallbindende Verbindung und/oder zumindest einen Komplex aus einem Übergangselement, wobei der Komplex zumindest ein Übergangselement oder ein Salz oder Ion davon umfasst, in einem Komplex mit zumindest einer metallbindenden Verbindung, wobei das Medium in der Lage ist, die Kultivierung einer Zelle in vitro in Abwesenheit von natürlich abgeleiteten Metall-Trägern, wie Transferrin, oder anderen aus Tieren stammenden Proteinen oder Extrakten, zu unterstützen. Die metallbindende Verbindung kann sich in einem Komplex mit einem Übergangsmetall vor der Zugabe der metallbindenden Verbindung zu dem Medium befinden. In anderen Ausführungsformen befindet sich die metallbindende Verbindung nicht in einem Komplex mit einem Übergangsmetall vor der Zugabe der metallbindenden Verbindung zu den Medien.
  • Gemäß der Erfindung wird ein Übergangselement vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Scandium, Titan, Vanadium, Chrom, Mangan, Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer, Zink, Yttrium, Zirkon, Niob, Molybdän, Technetium, Rubidium, Rhodium, Palladium, Silber, Cadmium, Lanthan, Hafnium, Tantal, Wolfram, Rhenium, Osmium, Iridium, Platin, Gold, Quecksilber und Actinium oder Salzen oder Ionen davon besteht, und ist vorzugsweise ein Eisensalz. Geeignete Eisensalze schließen FeCl3, Fe(NO3)3 oder FeSO4 oder andere Verbindungen ein, die Fe+++- oder Fe++-Ionen enthalten, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
  • Metallbindende Verbindungen, die von der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Derivate von Hydroxypyridin, nämlich 2-Hydroxypyridin-N-oxid, 3-Hydroxypyrid-2-on, 3-Hydroxypyrid-4-on, 1-Hydroxypyrid-2-on, 1,2-Dimethyl-3-hydroxypyrid-4-on, 1-Methyl-3-hydroxypyrid-2-on und 2-Hydroxynicotinsäure, und sind vorzugsweise 2-Hydroxypyridin-N-oxid. In besonders bevorzugten Ausführungsformen kann der Komplex aus einem Übergangsmetall ein 2-Hydroxypyridin-N-oxid-Komplex sein. Die metallbindenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ferner zweiwertige Kationen, wie Ca++ und Mg++, binden.
  • Die Erfindung betrifft deshalb die Verwendung von Zellkulturmedien, die zumindest eine metallbindende Verbindung, wie beschrieben, umfassen und ferner einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe von Bestandteilen umfassen, die zumindest aus einer Aminosäure (wie L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Valin, N-Acetyl-cystein), zumindest einem Vitamin (wie Biotin, Cholinchlorid, D-Ca++-Pantothenat, Folsäure, i-Inosit, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin oder Vitamin B12), zumindest einem anorganischen Salz (wie ein Calciumsalz, CuSO4, FeSO4, Fe(NO3)3, FeCl3, KCl, einem Magnesiumsalz, einem Mangansalz, Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, einem Selensalz, einem Siliciumsalz, einem Molybdänsalz, einem Vanadiumsalz, einem Nickelsalz, einem Zinnsalz oder einem Zinksalz), Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, zumindest einem Cytokin, Heparin, Hydrocortison, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, Tri-iodthyronin, Dextransulfat, Pluronic F68 und Thymidin bestehen. Die Kulturmedien, die von der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können wahlweise ein Puffermittel einschließen. Geeignete Puffermittel schließen N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), MOPS, MES, Phosphat, Carbonat und andere Puffermittel ein, die für die Verwendung in Zellkulturanwendungen geeignet sind, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Ein geeignetes Puffermittel ist eines, das Pufferkapazität ohne wesentliche Zytotoxizität für die kultivierten Zellen bereitstellt. Die Auswahl von geeigneten Puffermitteln liegt in dem Bereich durchschnittlichen Könnens auf dem Fachgebiet der Zellkultur.
  • Dementsprechend verwendet die Erfindung eine metallbindende Verbindung, wie hierin beschrieben, in einem Zellkulturmedium, das einen oder mehrere der Bestandteile umfasst, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES), Hydrocortison, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, Tri-iodthyronin, Thymidin, L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin, N-Acetyl-cystein, Biotin, Cholinchlorid, D-Ca++-Pantothenat, Folsäure, i-Inosit, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin, Vitamin B12, ein Calciumsalz, rekombinantes Insulin, Dextransulfat, Pluronic F68, CuSO4, FeSO4, FeCl3, KCl, ein Magnesiumsalz, ein Mangansalz, Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, ein Selensalz, ein Siliciumsalz, ein Molybdänsalz, ein Vanadiumsalz, ein Nickelsalz, ein Zinnsalz und ein Zinksalz, und einen oder mehrere Komplexe aus einem Übergangselement, die zumindest ein Übergangselement oder ein Salz oder Ion davon umfassen, das mit zumindest einer metallbindenden Verbindung komplexiert ist, wobei jeder Bestandteil in einer Menge vorhanden ist, die die Kultivierung einer Zelle in vitro unterstützt. Bevorzugte Übergangselemente, metallbindende Verbindungen und Komplexe aus einem Übergangselement für die Verwendung bei diesem Aspekt der Erfindung schließen diejenigen ein, die hier im Detail beschrieben sind.
  • Ein Medium, das für die Verwendung bei der Bildung der Zellkulturmedien der Offenbarung geeignet ist, kann einen oder mehrere Bestandteile umfassen und kann zum Beispiel erhalten werden, indem ein oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe kombiniert werden, die aus Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, Heparin, einem Puffermittel, Hydrocortison, Liponsäure, Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, Tri-iodthyronin, Thymidin, L-Alanin, L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin, Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin, N-Acetyl-cystein, Biotin, Cholinchlorid, D-Ca++-Pantothenat, Folsäure, i-Inosit, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin, Vitamin 1312, Dextransulfat, Pluronic F68, rekombinantem insulin, einem Calciumsalz, CuSO4, FeSO4, FeCl3, Fe(NO3)3, KCl, einem Magnesiumsalz, einem Mangansalz, Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4, einem Selensalz, einem Siliciumsalz, einem Molybdänsalz, einem Vanadiumsalz, einem Nickelsalz, einem Zinnsalz und einem Zinksalz besteht, wobei jeder Bestandteil in einer Menge zugegeben wird, die die Kultivierung einer Zelle in vitro unterstützt.
  • Die Kulturmedien können 1X Mediumformulierungen sein oder können konzentrierte Mediumformulierungen sein, zum Beispiel 10X, 20X, 25X, 50X, 100X, 500X oder 1000X Mediumformulierungen.
  • Tierische Zellen können in den Medien kultiviert werden, die von der Erfindung verwendet werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Säugetierzellen (einschließlich menschlicher Zellen, die sich von embryonalen Zellen unterscheiden), Vogelzellen, Insektenzellen, Fischzellen, Amphibienzellen und Reptilienzellen, von denen beliebige oder sämtliche normale Zellen oder abnormale Zellen sein können (wie transformierte Zellen, etablierte Zellen oder Zellen, die aus einer erkrankten Gewebeprobe stammen).
  • Die Erfindung betrifft Verfahren zur Kultivierung von Zellen, wie diejenigen Zellen, die vorstehend beschrieben sind, umfassend (a) Kontaktieren der Zelle mit den Zellkulturmedien der Erfindung; und (b) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Kultivierung oder das Wachstum der Zelle zu unterstützen.
  • Andere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden einem Durchschnittsfachmann angesichts der folgenden Zeichnungen und der Beschreibung der Erfindung und der Ansprüche ersichtlich.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Supplement für Mediumformulierungen für das Wachstum von tierischen Zellen. Ein solches Supplement kann bestimmte Bestandteile einer Mediumformulierung ersetzen. Vorzugsweise kann ein solches Supplement Komponenten ersetzen, die aus biologischen Quellen stammen, z. B. tierischen Quellen, pflanzlichen Quellen, bakteriellen Quellen, usw. In einem bevorzugten Aspekt schließen die Komponenten, die durch eine oder mehrere metallbindende Verbindungen der vorliegenden Offenbarung ersetzt werden, Proteine, Zell- oder Gewebeextrakte, Serumlipide, Wachstumsfaktoren und dergleichen ein, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Die Verbindungen der vorliegenden Offenbarung können verwendet werden, um das Wachstum einer beliebigen tierischen Zelle, die zur Unterstützung des Wachstums Übergangsmetalle benötigt, in Kultur zu unterstützen oder zu fördern.
  • Definitionen
  • In der nachfolgenden Beschreibung wird eine Anzahl von Begriffen, die auf den Fachgebieten der Zellbiologie und der Zellkulturmedien herkömmlich verwendet werden, umfangreich eingesetzt. Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um ein eindeutiges und einheitliches Verständnis der Spezifikation und der Ansprüche und des Umfanges, der solchen Begriffen gegeben werden soll, zu liefern.
  • Der Begriff "Bestandteil" bezieht sich auf eine beliebige Verbindung, ob chemischen oder biologischen Ursprungs, die in Zellkulturmedien für den Erhalt oder die Förderung des Wachstums oder der Proliferation von tierischen Zellen verwendet werden kann. Die Begriffe "Komponente", "Nährstoff" und "Bestandteil" können austauschbar verwendet werden und sollen sich alle auf solche Verbindungen beziehen. Typische in Zellkulturmedien verwendete Bestandteile schließen Aminosäuren, Salze, Metalle, Zucker, Lipide, Nukleinsäuren, Hormone, Vitamine, Fettsäuren, Proteine und dergleichen ein. Weitere Bestandteile, die die ex vivo Kultivierung von Zellen fördern oder erhalten, können von Fachleuten gemäß dem speziellen Bedarf ausgewählt werden.
  • Unter "Zellkultur" oder "Kultur" wird der Erhalt von Zellen in einer künstlichen in vitro Umgebung verstanden, wobei es jedoch zu verstehen ist, dass der dem Begriff "Zellkultur" ein allgemeiner Begriff ist und nicht nur verwendet werden kann, um die Kultivierung einzelner Zellen, sondern auch die Kultivierung von Geweben oder Organen zu umfassen, für die die Begriffe "Gewebekultur" oder "Organkultur" gegebenenfalls austauschbar mit dem Begriff "Zellkultur" verwendet werden können.
  • Unter "Kultivierung" ist der Erhalt von Zellen in vitro unter Bedingungen zu verstehen, die Wachstum, Differenzierung oder kontinuierliche Entwicklungsfähigkeit in einem aktiven oder ruhenden Stadium der Zellen begünstigen. In diesem Sinne kann "Kultivierung" austauschbar mit "Zellkultur" oder einem beliebigen der oben beschriebenen Synonyme davon verwendet werden.
  • Unter "Kulturgefäß" wird ein Behälter aus Glas, Plastik oder Metall verstanden, der eine aseptische Umgebung für das Kultivieren von Zellen bereitstellen kann.
  • Die Ausdrücke "Zellkulturmedium", "Gewebekulturmedium", "Kulturmedium" (in jedem Fall ist der Plural "Medien") und "Mediumformulierung" beziehen sich auf eine Nährstofflösung für das Kultivieren von Zellen oder Geweben und können austauschbar verwendet werden.
  • Die metallbindenden Verbindungen der vorliegenden Offenbarung und/oder die Komplexe aus Übergangsmetallen, die mit den metallbindenden Verbindung der vorliegenden Offenbarung gebildet werden, können mit beliebigen Medien für die Kultivierung oder Züchtung von tierischen Zellen, Geweben, Organen, usw. verwendet werden. Solche Medien beinhalten, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI-1640, Ham's F-10, Ham's F-12, αMinimal Essential Medium (aMEM), Glasgow's Minimal Essential Medium (G-MEM) und Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM). Andere im Handel erhältliche Medien (z. B. von Life Technologies, Inc.; Rockville, Maryland) oder diejenigen, die ansonsten auf dem Fachgebiet bekannt sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung äquivalent verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht darauf eingeschränkt, 293 SFM, CDCHO Medium, VP SFM, BGJb Medium, Brinster's BMOC-3 Medium, Zellkultur-Einfriermedium, CMRL Medien, EHAA Medium, eRDF Medium, Fischer's Medium, Gamborg's B-5 Medium, GLUTAMAXTM Medien, Grace's Insektenzellmedien, HEPES Medien, Richter's Modified MEM, IPL-41 Insektenzellmedium, Leibovitz's L-15 Medien, McCoy's 5A Medien, MCDB 131 Medium, Media 199, Modified Eagle's Medium (MEM), Medium NCTC-109, Schneider's Drosophila Medium, TC-100 Insektenmedium, Waymouth's MB 752/1 Medien, William's Media E, proteinfreies Hybridomamedium II (PFHM II), AIM V Medien, Keratinocyte SFM, definiertes Keratinocyte SFM, STEMPRO® SFM, STEMPRO® komplettes Methylcellulosemedium, HepatoZYME-SFM, Neu robasalTM Medium, Neurobasal-A Medium, HibernateTM A Medium, Hibernate E Medium, Endothel-SFM, menschliches Endothel-SFM, Hybridoma-SFM, PFHM II, Sf 900 Medium, Sf 900 II SFM, EXPRESS FIVE® Medium, CHO-S-SFM, AMINOMAX-II komplettes Medium, AMINOMAX-C100 komplettes Medium, AMINOMAX-C100 Basalmedium, PB-MAXTM Karyotyping Medium, KARYOMAX Bone Marrow Karyotyping Medium, KNOCKOUT D-MEM und CO2-unabhängiges Medium. Zusätzliche Beispiele für Medien, die für die Verwendung in der Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, können in den US-Patenten Nrn. 5,135,866 und 5,232,848 sowie in den internationalen Veröffentlichungen Nrn. WO 88/02774 , WO 98/15614 , WO 98/08934 und dem europäischen Patent Nr. 0 282 942 gefunden werden.
  • Der Begriff "In-Kontakt-Bringen" bezieht sich darauf, dass in vitro zu kultivierende Zellen mit dem Medium, in dem die Zellen kultiviert werden sollen, in ein Kulturgefäß gegeben werden. Der Begriff "In-Kontakt-Bringen" umfasst, dass Zellen mit Medium vermischt werden, dass Medium auf Zellen in einem Kulturgefäß pipettiert wird und dass Zellen in Kulturmedium eingetaucht werden.
  • Der Begriff "Kombinieren" bezieht sich auf das Mischen oder Beimischen von Bestandteilen in einer Zellkulturmedium-Formulierung.
  • Ein Zellkulturmedium setzt sich aus einer Anzahl von Bestandteilen zusammen und diese Bestandteile variieren Medium zu Medium. Jeder in einem Zellkulturmedium verwendete Bestandteil verfügt über besondere physikalische und chemische Eigenschaften. Die Kompatibilität und Stabilität von Bestandteilen werden durch die "Löslichkeit" der Bestandteile in wässriger Lösung bestimmt. Die Begriffe "Löslichkeit" und "löslich" betreffen die Fähigkeit eines Bestandteils, eine Lösung mit anderen Bestandteilen zu bilden. Bestandteile sind somit kompatibel, wenn sie in Lösung gehalten werden können, ohne einen messbaren oder erfassbaren Niederschlag zu bilden. Somit betrifft der Begriff "kompatible Bestandteile", wie hier verwendet, die Kombination von bestimmten Bestandteilen von Kulturmedien, die beim Mischen in Lösung entweder als konzentrierte oder 1X Formulierungen "stabil" und "löslich" sind.
  • Unter "kompatiblen Bestandteilen" werden ferner diejenigen Mediennährstoffe verstanden, die zusammen in Lösung gehalten werden können und eine "stabile" Kombination bilden. Eine "kompatible Bestandteile" enthaltende Lösung wird als "stabil" bezeichnet, wenn die Bestandteile im Wesentlichen nicht ausfallen, nicht abgebaut werden oder zerfallen, so dass die Konzentration von einem oder mehreren der Bestandteile, die für die Zellen aus den Medien verfügbar sind, auf ein Niveau herabgesetzt wird, das das optimale Wachstum der Zellen nicht mehr unterstützt. Bestandteile werden ebenfalls als "stabil" betrachtet, wenn ein Abbau nicht erfasst werden kann oder wenn der Abbau sich bei einer langsamen Geschwindigkeit ereignet als im Vergleich der Abbau des gleichen Bestandteils in einer 1X Zellkulturmedium-Formulierung. Zum Beispiel ist es bekannt, dass in 1X Medienformulierungen Glutamin zu Pyrrolidoncarbonsäure und Ammoniak zerfällt. Glutamin in Kombination mit zweiwertigen Kationen wird als "kompatible Bestandteile" betrachtet, da ein geringer oder kein Abbau des Glutamins mit der Zeit in Lösungen oder in Kombinationen erfasst werden kann, in denen sowohl Glutamin als auch zweiwertige Kationen vorhanden sind. Siehe US-Patent 5,474,931 . Es wurde von den Erfindern gezeigt, dass zusätzlich zur Stabilisierung von Glutamin mit FeCl3-komplexiertes Glutamin gegen Transferrin ausgetauscht werden kann.
  • Unter dem Begriff "1X Formulierung" ist eine beliebige wässrige Lösung zu verstehen, die einige oder alle Bestandteile enthält, die in einem Zellkulturmedium bei Arbeitskonzentrationen vorhanden sind. Die "1X Formulierung" kann zum Beispiel das Zellkulturmedium oder eine beliebige Untergruppe von Bestandteilen für dieses Medium bezeichnen. Die Konzentration eines Bestandteils in einer 1X Lösung ist in etwa die gleiche wie die Konzentration von dem Bestandteil, der in einer für den Erhalt oder die in vitro Kultivierung von Zellen verwendeten Zellkulturformulierung vorhanden ist. Ein für die in vitro Kultivierung von Zellen verwendetes Zellkulturmedium ist definitionsgemäß eine 1X Formulierung. Bei Vorhandensein einer Anzahl von Bestandteilen weist jeder Bestandteil in einer 1X Formulierung eine Konzentration auf, die ungefähr der Konzentration der Bestandteile in einem Zellkulturmedium entspricht. Zum Beispiel enthält RPMI-1640 Kulturmedium neben anderen Bestandteilen 0,2 g/l L-Arginin, 0,05 g/l L-Asparagin und 0,02 g/l L-Asparaginsäure. Eine "1X Formulierung" dieser Aminosäuren enthält in etwa die gleichen Konzentrationen dieser Bestandteile in Lösung. Somit soll die Bezugnahme auf eine "1X Formulierung" so verstanden werden, dass jeder Bestandteil in Lösung in der gleichen oder in etwa der gleichen Konzentration wie in dem beschriebenen Zellkulturmedium vorhanden ist. Die Konzentrationen von Bestandteilen in einer "1X Formulierung" eines Zellkulturmediums sind einem Durchschnittsfachmann gut bekannt. Siehe zum Beispiel Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Allen R. Liss, N. Y. (1984), Handbook of Microbiological Media, Zweite Ausg., Ronald M. Atlas, Herausg. Lawrence C. Parks (1997) CRC Press, Boca Raton, FL und Plant Culture Media, Vol. 1: Formulations and Uses E. F. George, D. J. M. Puttock und H. J. George (1987) Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts, BA13 4QG England, von denen jedes durch Bezugnahme hier in vollem Umfang eingegliedert ist. Allerdings kann die Osmolarität und/oder der pH-Wert in einer 1X Formulierung im Vergleich zu dem Kulturmedium unterschiedlich sein, insbesondere wenn in der 1X Formulierung weniger Bestandteile enthalten sind.
  • Unter einer "10X Formulierung" ist eine Lösung zu verstehen, in der jeder Bestandteil in dieser Lösung in etwa 10-mal konzentrierter ist wie der gleiche Bestandteil in dem Zellkulturmedium. Zum Beispiel kann eine 10X Formulierung von RPMI-1640 Kulturmedium neben anderen Bestandteilen 2,0 g/l L-Arginin, 0,5 g/l L-Asparagin und 0,2 g/l L-Asparaginsäure (vgl. 1X Formulierung vorstehend) enthalten. Eine "10X Formulierung" kann eine Anzahl zusätzlicher Bestandteile in einer etwa 10-mal höheren Konzentration als in dem 1X Kulturmedium vorhanden ist enthalten. Es ist leicht ersichtlich, dass "25X Formulierung", "50X Formulierung", "100X Formulierung", "500X Formulierung" und "1000X Formulierung" Lösungen bezeichnen, die Bestandteile in jeweils etwa 25-, 50-, 100-, 500- oder 1000-facher Konzentration im Vergleich zu einem 1X Zellkulturmedium enthalten. Wiederum können die Osmolarität und der pH-Wert der Mediumformulierung und der konzentrierten Lösung variieren.
  • Der Begriff "Spurenelement" oder "Spurenelementrest" betrifft einen Rest, der in einem Zellkulturmedium in nur sehr geringen (d. h. "Spuren") Mengen oder Konzentrationen relativ zu den Mengen oder Konzentrationen von anderen in dem Kulturmedium vorhandenen Resten oder Komponenten vorhanden ist. In der vorliegenden Erfindung umfassen diese Begriffe Ag+, Al3+, Ba2+, Cd2+, Co2+, Cr3+, Ge4+, Se4+, Br–, I–, Mn2+, F–, Si4+, V5+, Mo6+, Ni2 +, Rb+, Sn2+ und Zr4+ und Salze davon. Zum Beispiel können die folgenden Salze als Spurenelemente in den Kulturmedien der Erfindung verwendet werden: AgNO3, AlCl3·6H2O, Ba(C2H3O2)2, CdSO4·8H2O, CoCl2·6H2O, Cr2(SO4)3·1H2O, GeO2, Na2SeO3, H2SeO3, KBr, Kl, MnCl2·4H2O, NaF, Na2SiO3·9H2O, NaVO3, (NH4)6Mo7O24·4H2O, NiSO4·6H2O, RbCl, SnCl2 und ZrOCl2·8H2O. Geeignete Konzentrationen von Spurenelementresten können von einem Durchschnittsfachmann unter Verwendung ausschließlich routinemäßiger Experimente bestimmt werden.
  • Der Begriff "Aminosäure" betrifft Aminosäuren oder ihre Derivate (z. B. Aminosäureanaloga) sowie ihre D- und L-Formen. Beispiele für solche Aminosäuren beinhalten Glycin, L-Alanin, L-Asparagin, L-Cystein, L-Asparaginsäure, L-Glutaminsäure, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Lysin, L-Leucin, L-Glutamin, L-Arginin, L-Methionin, L-Prolin, L-Hydroxyprolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin, N-Acetyl-cystein.
  • Ein "serumfreies Medium" ist ein Medium, das kein Serum enthält (z. B. fötales Rinderserum (FBS), Kälberserum, Pferdeserum, Ziegenserum, menschliches Serum, usw.) und wird im Allgemeinen mit den Buchstaben SFM bezeichnet.
  • Die Begriffe "serumfreie Kulturbedingungen" und "serumfreie Bedingungen" beziehen sich auf Zellkulturbedingungen, die Serum einer beliebigen Art ausschließen, und können austauschbar verwendet werden.
  • Der Ausdruck "proteinfreie" Kulturmedien bezieht sich auf Kulturmedien, die kein Protein enthalten (z. B. Serumproteine, wie Serumalbumin oder Bindungsfaktoren, Nährproteine, wie Wachstumsfaktoren, oder Metallionen-Trägerproteine, wie Transferrin, Ceruloplasmin, usw.) Der Ausdruck "proteinarme" Kulturmedien, wie hier verwendet, bezieht sich auf Medien, die nur geringe Mengen an Protein enthalten (typischerweise weniger als etwa 10%, weniger als etwa 5%, weniger als etwa 1%, weniger als etwa 0,5% oder weniger als etwa 0,1% der Menge oder Konzentration des Gesamtproteins, das in Kulturmedien vorhanden ist, die standardmäßige Mengen an Protein enthalten, wie standardmäßiges Basalmedium, das mit 5–10% Serum ergänzt ist).
  • Unter "Übergangselement" oder "Übergangsmetall" (die austauschbar verwendet werden können) wird ein Element verstanden, bei dem eine Valenzschale der inneren Elektronen an Stelle einer äußeren Schale nur teilweise gefüllt ist, so dass das Element als eine Übergangsverbindung zwischen den stärksten und am wenigsten elektropositiven Elementen in einer gegebenen Reihe von Elementen agiert. Übergangselemente sind typischerweise durch hohe Schmelzpunkte, hohe Dichten, hohe Dipol- oder magnetische Momente, mehrfache Valenzen und die Fähigkeit, stabile Komplexionen zu bilden, gekennzeichnet. Beispiele für solche Übergangselemente beinhalten Scandium (Sc), Titan (Ti), Vanadium (V), Chrom (Cr), Mangan (Mn), Eisen (Fe), Kobalt (Co), Nickel (Ni), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Yttrium (Y), Zirkon (Zr), Niob (Nb), Molybdän (Mo), Technetium (Tc), Rubidium (Ru), Rhodium (Rh), Palladium (Pd), Silber (Ag), Cadmium (Cd), Lanthan (La), Hafnium (Hf), Tantal (Ta), Wolfram (W), Rhenium (Re), Osmium (Os), Iridium (Ir), Platin (Pt), Gold (Au), Quecksilber (Hg) und Actinium (Ac). Von besonderem Interesse als ein Übergangselement für die Verwendung in Kulturmedienzusammensetzungen, einschließlich derjenigen der vorliegenden Erfindung, sind Ionen, Chelate, Salze und Komplexe von Eisen (Fe++ oder Fe+++).
  • Übersicht
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft im Allgemeinen tierische Zellkulturmedium-Zusammensetzungen, die eine oder mehrere metallbindende Verbindungen und/oder eine oder mehrere Komplexe aus einem Übergangselement umfassen, die die metallbindenden Verbindungen umfassen. Die vorliegende Offenbarung betrifft tierische Zellkulturzusammensetzungen, die eine oder mehrere metallbindende Verbindungen und Kationen eines Übergangselements, insbesondere ein oder mehrere mehrwertige Kationen eines Übergangselements (wie Fe+ oder Fe+++-Ionen) umfassen, die für metabolische Prozesse in lebenden Organismen notwendig sind. Die in der Erfindung verwendeten Zusammensetzungen können ein oder mehrere Übergangselement-Ionen umfassen, die mit einer oder mehreren nicht-proteinischen metallbindenden Verbindungen, wie hier beschrieben, komplexiert sind.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen sind in der Lage, das Wachstum von Zellen durch mehrere Passagen zu unterstützen. Das ist von Bedeutung, da diejenigen Verbindungen, die von dem Stand der Technik für die Verwendung in Zellkultur-Anwendungen genannt werden, nicht gezeigt haben, das Zellwachstum für eine Anzahl von Passagen zu erhalten. Der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass mehrere Passagen erforderlich sind, um sämtliche Spuren von aus Serum stammenden Transferrin aus einem Zellkulturmedium zu entfernen.
  • Die Erfindung ist in ihren verschiedenen Aspekten in den Ansprüchen dieser Spezifikation dargelegt.
  • Kulturmediumzusammensetzungen
  • Beliebige Zellkulturmedien können verwendet werden, die das Wachstum von tierischen Zellen unterstützen. Im Allgemeinen können beliebige erhältliche oder auf dem Fachgebiet bekannte Medien gemäß der vorliegenden Offenbarung (d. h. durch Zugabe der metallbindenden Verbindungen und/oder von Komplexen aus Übergangsmetallen davon) modifiziert werden. In einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ersetzen die metallbindenden Verbindungen und/oder Komplexe aus einem Übergangselement davon biologische abgeleitete (z. B. aus Tieren stammende) Übergangselement-Träger, wie Serum, Transferrin, Ceruloplasmin und dergleichen.
  • Beispiele für tierische Zellkulturmedien, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, DMEM, RPMI-1640, MCDB 131, MCDB 153, MDEM, IMDM, MEM, M199, McCoy's 5A, Williams' Media E, Leibovitz's L-15 Medium, Grace's Insect Medium, IPL-41 Insect Medium, TC-100 Insect Medium, Schneider's Drosophila Medium, Wolf & Quimby's Amphibian Culture Medium, zellspezifische serumfreie Medien (SFM), wie diejenigen, die zur Unterstützung der Kultur von Keratinozyten, Endothelzellen, Hepatozyten, Melanozyten, usw. ausgelegt sind, F10 Nährgemisch und F12 Nährgemisch. Andere für die Herstellung durch die Erfindung geeignete Medien sind im Handel erhältlich (z. B. von Life Technologies, Inc.; Rockville, Maryland und Sigma; St. Louis, Missouri). Formulierungen für diese Medien sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können zum Beispiel in dem GIBCO/BRL Katalog und Referenzhandbuch (Life Technologies, Inc.; Rockville, Maryland) und in dem Sigma Tierzellenkatalog (Sigma; St. Louis, Missouri) gefunden werden.
  • Wie der Fachmann es verstehen wird, können beliebige der vorstehenden Medien der Erfindung ferner ein oder mehrere zusätzliche Komponenten einschließen, wie Indikations- oder Selektionsmittel (z. B. Farbstoffe, Antibiotika, Aminosäuren, Enzyme, Substrate und dergleichen), Filter (z. B. Aktivkohle), Salze, Polysaccharide, Ionen, Detergenzien, Stabilisatoren und dergleichen.
  • Metallbindende Verbindungen
  • Die von der vorliegenden Erfindung verwendeten metallbindenden Verbindungen können in eine Mediumformulierung in einer nicht komplexierten Form, d. h. nicht an ein Übergangselement gebunden, eingeschlossen werden. Alternativ können Komplexe aus einem Übergangselement, die für den Einschluss in Medien geeignet sind, vor dem Einschluss in eine Mediumformulierung durch Kombination von einem oder mehreren Übergangselementen oder Ionen davon mit einer oder mehreren metallbindenden Verbindungen gebildet werden. Bei der Komplexierung vor der Zugabe zu einer Mediumformulierung werden die metallbindenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung vorzugsweise mit einem oder mehreren Übergangselementen komplexiert. Bevorzugte Übergangselemente beinhalten Salze oder Ionen von Scandium (Sc), Titan (Ti), Vanadium (V), Chrom (Cr), Mangan (Mn), Eisen (Fe), Kobalt (Co), Nickel (Ni), Kupfer (Cu), Zink (Zn), Yttrium (Y), Zirkon (Zr), Niob (Nb), Molybdän (Mo), Technetium (Tc), Rubidium (Ru), Rhodium (Rh), Palladium (Pd), Silber (Ag), Cadmium (Cd), Lanthan (La), Hafnium (Hf), Tantal (Ta), Wolfram (W), Rhenium (Re), Osmium (Os), Iridium (Ir), Platin (Pt), Gold (Au), Quecksilber (Hg) und Actinium (Ac). Besonders bevorzugte Übergangselemente für die Verwendung in den Komplexen, Zusammensetzungen und Medien der Erfindung sind Eisen (insbesondere Eisen(II)-(Fe++) oder Eisen(III)-(Fe+++) Kationen), Zink (insbesondere Zn++), Kupfer (insbesondere Cu++) und Mangan (insbesondere Mn++). Solche Übergangselemente, Metalle, Salze und Ionen davon sind im Handel erhältlich, zum Beispiel von Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO).
  • Metallbindende Verbindungen, die bei der Herstellung der Komplexe aus einem Übergangselement und den Zusammensetzungen der Offenbarung verwendet werden können, sind Derivate von Hydroxypyridin, nämlich 2-Hydroxypyridin-N-oxid, 3-Hydroxypyrid-2-on, 3-Hydroxypyrid-4-on, 1-Hydroxypyrid-2-on, 1,2-Dimethyl-3-hydroxypyrid-4-on, 1-Methyl-3-hydroxypyrid-2-on, 2-Hydroxynicotinsäure; siehe US-Patente Nm. 4,665,064 ; 4,861,767 ; 4,908,371 ; 5,256,676 ; 5,624,901 und 5,688,815 . Besonders bevorzugt für die Verwendung bei der Formulierung der Komplexe aus einem Übergangselement, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist 2-Hydroxypyridin-N-oxid. Wie in den Beispielen nachstehend im Detail beschrieben ist, wurden diese Verbindungen, insbesondere 2-Hydroxypyridin- N-oxid, erfolgreich verwendet, um Transferrin als Eisen-tragende Verbindungen in Kulturmedien zu ersetzen, die für die Kultivierung von Säugetierzellen nützlich sind. Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten metallbindenden Verbindungen sind im Handel erhältlich (z. B. von Sigma, St. Louis, MO und von anderen wohl bekannten kommerziellen Quellen), oder können gemäß der Anleitung, die von den hier zitierten Fachgebiet- und Patent-Veröffentlichungen bereitgestellt wird, synthetisch hergestellt werden.
  • Die metallbindenden Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, können einer Mediumformulierung zugegeben werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die metallbindenden Verbindungen einer Mediumformulierung bei einer Arbeitskonzentration von etwa 1 µM bis etwa 500 µM zugegeben, die für tierische Zellen ausreichend ist. Komplexe aus einem Übergangselement können durch Vermischen von einem oder mehreren Übergangselementen, Salzen oder Ionen, vorzugsweise Eisen (insbesondere in Form von Fe++- oder Fe+++-Kationen oder -Salzen) mit einer oder mehreren metallbindenden Verbindungen, vorzugsweise 2-Hydroxypyridin-N-oxid, hergestellt werden. Diese Komponenten werden vorzugsweise bei einem Molverhältnis von 1:1 bis 1:6 (Eisen-Träger: Fe++ oder Fe+++) vermischt, obwohl andere geeignete Molverhältnisse ohne weiteres von einem Durchschnittsfachmann bestimmt werden können. Sobald die Komplexe aus einem Übergangselement gebildet wurden, können sie unmittelbar beliebigen Medien zugegeben werden, um die in der Erfindung verwendeten Medien zu bilden. Die Komplexe können mit einer Endkonzentration zugegeben werden, die für die Kultivierung der tierischen Zellen von Interesse geeignet ist. In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Arbeitskonzentration von etwa 1 µM bis etwa 500 µM verwendet, die für die meisten tierischen Zelltypen geeignet ist. Die Bestimmung der optimalen Konzentration für eine gegebene tierische Zelllinie ohne unzumutbares Experimentieren liegt im Können eines Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet der Zellkultur. Alternativ können die in einem Medium zu ergänzenden Komplexe vorteilhaft bei 2–8°C für zumindest 12 Monate vor der Zugabe zu einem Medium gelagert werden.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mediumformulierungen schließen eine oder mehrere metallbindende Verbindungen und/oder eine oder mehrere metallbindende Verbindungen in einem Komplex mit einem Übergangselement ein. Diese kompletten Medien sind für die Verwendung in der Kultur einer Vielfalt von tierischen Zellen geeignet, wie nachstehend detaillierter beschrieben wird. Es kann jedoch bevorzugt sein, den Nährstoffgehalt der gegebenen Medien weiter anzureichern, um das Wachstum und die verbesserte Herstellung von biologischen Substanzen durch die kultivierten Zellen schneller zu unterstützen und eine besser geeignete Umgebung für die Kultur von anspruchsvollen tierischen Zellen bereitzustellen. Für das Erzielen einer solchen Anreicherung können ein oder mehrere zusätzliche aus nicht tierischen Quellen stammende Nährstoffe, wie Extrakte oder enzymatische Abbauprodukte (einschließlich z. B. Peptone) von Hefe- oder Bakterienzellen, pflanzliche Peptide oder Lipide und der gleichen, den Medien der Erfindung zugegeben werden.
  • Die Mediumbestandteile können in einem flüssigen Träger gelöst oder in trockener Form gehalten werden. Sind sie in einem flüssigen Träger bei in der Tabelle 1 gezeigten bevorzugten Konzentrationen aufgelöst (d. h. eine "IX Formulierung"), sollte der pH-Wert des Mediums auf etwa 6,8–7,5, bevorzugt etwa 7,1–7,4 und am stärksten bevorzugt etwa 7,2–7,4 eingestellt werden. Die Osmolarität des Mediums sollte ebenfalls auf etwa 260–450 mOsm, bevorzugt etwa 260–280 mOsm und am stärksten bevorzugt etwa 265–275 mOsm eingestellt werden. Die Art des flüssigen Trägers und das zur Auflösung der Bestandteile in eine Lösung verwendete Verfahren variieren und können von einem Durchschnittsfachmann mit nicht mehr als routinemäßigen Experimenten bestimmt werden. Typischerweise können die Mediumbestandteile in einer beliebigen Reihenfolge zugegeben werden.
  • Die Kulturmedien oder Lösungen oder Zusammensetzungen, die zur Formulierung der Kulturmedien verwendet werden, können mit einer 1X Konzentration formuliert werden. Alternativ können die Lösungen, die die Bestandteile und die Kulturmedien der Erfindung umfassen, höher konzentriert sein als die Konzentration der gleichen Bestandteile in einer 1X Medienformulierung. Zum Beispiel können die Medien oder Bestandteile 10-fach konzentrierter (10X Formulierung), 20-fach konzentrierter (20X Formulierung), 25-fach konzentrierter (25X Formulierung), 50-fach konzentrierter (50X Formulierung), 100-fach konzentrierter (100X Formulierung), 500-fach konzentrierter (500X Formulierung) oder 1000-fach konzentrierter (1000X Formulierung), sein. Es können höher konzentrierte Formulierungen unter der Voraussetzung hergestellt werden, dass die Bestandteile löslich und stabil bleiben. Siehe US-Patent Nr. 5,474,931 , das auf Verfahren für das Lösen von Kulturmedienkomponenten bei hohen Konzentrationen gerichtet ist.
  • Wenn die Medienbestandteile als gesonderte konzentrierte Lösungen hergestellt werden, wird für die Herstellung einer 1X Mediumformulierung eine angemessene (ausreichende) Menge von jedem Konzentrat mit einem Verdünnungsmittel kombiniert. Typischerweise ist das verwendete Verdünnungsmittel Wasser, jedoch können gemäß der Erfindung andere Lösungen, einschließlich wässriger Puffer, wässriger Salzlösung oder weiterer wässriger Lösungen, verwendet werden.
  • Typischerweise werden die Kulturmedien sterilisiert, um ungewollte Kontaminierung zu verhindern. Für die Herstellung eines sterilen Kulturmediums kann die Sterilisierung zum Beispiel durch Filtrieren durch ein Niederprotein bindendes Membranfilter mit etwa 0,1–0,45 μm Porengröße (im Handel zum Beispiel von Millipore, Redford, Massachusetts erhältlich) nach Beimischen der konzentrierten Bestandteile bewerkstelligt werden. Alternativ können konzentrierte Untergruppen von Bestandteilen filtersterilisiert und als sterile Lösungen gelagert werden. Diese sterilen Konzentrate können anschließend unter aseptischen Bedingungen mit einem sterilen Verdünnungsmittel vermischt werden, um eine konzentrierte sterile 1X Mediumformulierung herzustellen. Autoklavieren oder weitere Sterilisierungsverfahren auf der Basis von erhöhter Temperatur sind nicht bevorzugt, da eine Anzahl der Komponenten der vorliegenden Kulturmedien hitzelabil sein kann. Wie es einem Durchschnittsfachmann ohne weiteres ersichtlich ist, kann die Konzentration eines gegebenen Bestandteils über den offenbarten Bereich hinaus erhöht oder verringert werden und die Auswirkung der erhöhten oder verringerten Konzentration kann unter Verwendung von ausschließlich routinemäßigen Experimenten bestimmt werden.
  • Die Optimierung der vorliegenden Medienformulierungen wurde unter Verwendung von Ansätzen durchgeführt, die von Ham (Ham, R. G., Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrats for Serum-Free Animal Culture, Alan R. Liss, Inc., New York, S. 3–21 (1984)) und Waymouth (Waymouth, C., Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrats for Serum-Free Animal Culture, Alan R. Liss, Inc., New York, S. 23–68 (1984)) beschrieben wurden. Die optimalen Endkonzentrationen für Mediumbestandteile werden typischerweise entweder durch empirische Untersuchungen, in Titrationsuntersuchungen von einzelnen Komponenten oder durch Interpretation von historischer und aktueller wissenschaftlicher Literatur genau bestimmt. In Titrationsuntersuchungen von einzelnen Komponenten unter Verwendung von tierischen Zellen wird die Konzentration einer einzelnen Mediumkomponente variiert, während sämtliche andere Bestandteile und Variablen konstant gehalten werden und die Wirkung der einzelnen Komponente auf Entwicklungsfähigkeit, Wachstum oder anhaltende Gesundheit der tierischen Zellen gemessen wird.
  • Die vorliegende Offenbarung bezieht sich ferner auch auf Verfahren für den Austausch oder Ersatz von aus Tieren stammenden Produkten, insbesondere von aus Tieren stammenden Übergangselement-Trägern mit von nicht aus Tieren stammenden Übergangselement-Trägern oder -Komplexen. Typische aus Blut stammende Produkte, die gemäß diesem Aspekt der Erfindung ersetzt werden können, beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Serum (z. B. fötales Rinderserum und Kälberserum, menschliches Serum, usw.), Plasma, Transferrin, Ceruloplasmin, Albumin (z. B. Albumin aus Rinderserum oder Albumin aus menschlichem Serum), Antikörper, Fibrinogen, Faktor VIII, usw. Andere aus Tieren stammende Mediumkomponenten, die durch einen oder mehrere Komplexe gemäß der Erfindung ersetzt werden können, können von einem Durchschnittsfachmann durch Austausch von einem oder mehreren Übergangselement-Trägern, die vorzugsweise mit einem oder mehreren Übergangselementen (insbesondere Eisen, Zink und/oder Mangan) komplexiert sind, an Stelle von einem oder mehreren aus Tieren stammenden Übergangselement-Trägern und Testen der Wirkung eines solchen Austauschs auf das Zellwachstum und die Kultivierung durch Verfahren, mit denen der Durchschnittsfachmann vertraut ist (wie diejenigen Verfahren, die nachstehend in den Beispielen beschrieben sind), einfach bestimmt werden.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet somit Übergangselement-Träger und/oder -Komplexe und Zusammensetzungen für die Verwendung bei der Kultivierung von tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, in vitro. Solche Komplexe und Zusammensetzungen können bei einer Vielzahl von medizinischen (einschließlich diagnostischen und therapeutischen), industriellen, forensischen Anwendungen und Forschungsanwendungen verwendet werden, die zur Verwendung fertige serumfreie Medienzusammensetzungen für die Kultivierung einer Vielzahl von tierischen Zellen benötigen.
  • Die Übergangselement-Träger und/oder -Komplexe können in Verbindung mit einer beliebigen tierischen Zellkulturmedium-Formulierung verwendet werden, die dem Fachmann bekannt ist. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Übergangsmetall-Komplexe mit serumfreien Medienformulierungen verwendet.
  • Zellquellen
  • Zellen, die in Medien, die die nicht-proteinischen metallbindenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten, gezüchtet werden können, sind in einigen bevorzugten Ausführungsformen tierische Zellen, wobei Zellen, die in dem Medium gezüchtet werden können, Zellen einschließen, jedoch nicht darauf eingeschränkt sind, die aus Säugetieren, Vögeln (avian), Insekten, Fischen, Amphibien, Reptilien und dergleichen gewonnen werden. Säugetierzellen, die insbesondere für das Kultivieren in den vorliegenden Medien geeignet sind, schließen diejenigen menschlichen Ursprungs ein (jedoch nicht embryonale Zellen), die Primärzellen sein können, die aus einer Gewebeprobe, diploiden Zellsträngen, transformierten Zellen oder etablierten Zelllinien (z. B. HeLa) stammen, von denen jede wahlweise erkrankt oder genetisch verändert sein kann. Andere Säugetierzellen, wie Hybridomen, CHO-Zellen, COS-Zellen, VERO-Zellen, HeLa-Zellen, 293-Zellen, PER-C6-Zellen, K562-Zellen, MOLT-4-Zellen, M1-Zellen, NS-1-Zellen, MDBK-Zellen, MDCK-Zellen, MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, WEHT-Zellen, SP2/0-Zellen, BHK-Zellen (einschließlich BHK-21-Zellen), primäre und/oder immortalisierte Lymphozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, Keratinozyten, Hepatozyten, neurale Zellen, renale Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen, Tumorzellen, Epithelzellen, hämatopoietische Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, embryonale Stammzellen nicht menschlichen Ursprungs, Stammzellen neuronalen, hepatischen, renalen, dermalen, endothelialen, epithelialen und mesothelialen Ursprungs und Derivate davon, sind ebenfalls für die Kultivierung in Medien geeignet, die die Verbindungen der vorliegenden Offenbarung enthalten. Insbesondere können Stammzellen nicht menschlichen Ursprungs und Zellen, die in der in vitro Herstellung von Viren verwendet werden, können in den Medien kultiviert werden, wobei Insektenzellen, die für die Kultivierung in den vorliegenden Medien besonders geeignet sind, diejenigen einschließen, die sich von Spodoptera Spezies (z. B. Sf9 oder Sf21, die von Spodoptera frugiperda stammen) oder Trichoplusa Spezies (z. B. HIGH FIVETM oder MG1, die von Trichoplusa ni stammen) ableiten. Gewebe und Organe, die aus Tieren stammen oder in vitro unter Verwendung von Verfahren konstruiert wurden, die auf dem Fachgebiet Routine sind, können in den Kulturmedien der vorliegenden Offenbarung gleichermaßen kultiviert werden.
  • Zellkulturen
  • Zellen können gemäß der von dem Forscher festgelegten experimentellen Bedingungen ausplattiert werden. Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht zumindest eine funktionelle Reihe von Kulturbedingungen, die für das Kultivieren von bestimmten Säugetierzellen nützlich sind. Es soll jedoch verstanden werden, dass die optimalen Ausplattierungs- und Kulturbedingungen für eine gegebene Zellenart von einem Durchschnittsfachmann unter Verwendung von ausschließlich routinemäßigen Experimenten festgelegt werden können. Bei routinemäßigen Kulturbedingungen unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können Zellen auf die Oberfläche von Kulturgefäßen ohne Bindungsfaktoren ausplattiert werden. Alternativ können die Gefäße mit natürlichen, rekombinanten oder synthetischen Bindungsfaktoren oder Peptidfragmenten vorbeschichtet sein (z. B. Collagen oder Fibronectin oder natürliche oder synthetische Fragmente davon). Isolierte Zellen können auch in oder auf eine natürliche oder synthetische dreidimensionale Trägermatrix, wie ein vorgeformtes Collagengel oder ein synthetisches biopolymeres Material, oder auf Feeder-Zellschichten ausgesät werden. Die Verwendung von Bindungsfaktoren oder einer Trägermatrix mit dem Medium, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verbessert die Kultivierung von vielen bindungsabhängigen Zellen in Abwesenheit von der Serumergänzung.
  • Die Aussaatdichten der Zellen bei jeder experimentellen Bedingung können für die verwendenden spezifischen Kulturbedingungen optimiert werden. Für die routinemäßige Kultur in Plastikkulturgefäßen ist eine anfängliche Aussaatdichte von 0,1–1,0 × 105 Zellen pro cm2 oder etwa 1,5X der Ausplattierungskonzentration, die routinemäßig für die gleichen Zellen in serumergänzten Medien verwendet wird, bevorzugt.
  • Säugetierzellen werden typischerweise in einem Zellinkubator bei etwa 37°C kultiviert, während die optimalen Temperaturen für die Kultivierung von Vogel-, Nematoden- und Insektenzellen typischerweise etwas niedriger liegen und dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind. Die Inkubatoratmosphäre sollte für die Kultivierung von tierischen Zellen befeuchtet werden und sollte etwa 3–10% Kohlendioxid in der Luft enthalten. Der pH-Wert des Kulturmediums sollte in dem Bereich von etwa 7,1–7,6, bevorzugt etwa 7,1–7,4 und am stärksten bevorzugt etwa 7,1–7,3 liegen.
  • Zellen in geschlossener Kultur oder Batch-Kultur sollten alle 2–3 Tage oder mehr oder weniger so häufig, wie für die spezielle Zellenart erforderlich, einem kompletten Mediumaustausch unterzogen werden (d. h. Ersetzen der verbrauchten Medien durch frische Medien). Zellen in Perfusionskultur (z. B. in Bioreaktoren oder Fermentern) erhalten auf einer kontinuierlich umlaufenden Basis frische Medien.
  • Zellen können ferner in Suspension in einer Schüttelvorrichtung, einem Rührtank, einem Airlift oder einer Perfusionskultur kultiviert werden. Einige Zellarten (z. B. Hybridomen, Zellen lymphoiden und myeloiden Ursprungs) sind von Natur aus in der Lage, in Suspensionskultur zu wachsen. Andere Zellen (z. B. BHK, HeLa, 293, CHO), die ursprünglich in anhaftenden Kulturen kultiviert werden können, können induziert werden, um in Suspensionskultur zu wachsen.
  • Zellkulturzusammensetzung
  • Die Zellkulturmedien der vorliegenden Offenbarung können auch für die Herstellung von Zellkulturzusammensetzungen verwendet werden, die die vorliegenden Medien und Zellen umfassen. Die Zellen sind tierische Zellen. Zellen, die bevorzugt in solchen Zusammensetzungen verwendet werden, beinhalten, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt, aus Säugetieren, Vögeln (avian), Insekten oder Fischen erhaltene Zellen. Säugetierzellen, die für die Verwendung in solchen Zusammensetzungen insbesondere geeignet sind, schließen diejenigen menschlichen Ursprungs ein, die sich von embryonalen Zellen unterscheiden, die Primärzellen sein können, die aus einer Gewebeprobe, diploiden Zellsträngen, transformierten Zellen oder etablierten Zelllinien (z. B. HeLa) stammen, von denen jede wahlweise erkrankt oder genetisch verändert sein kann. Andere Säugetierzellen, wie Hybridomen, CHO-Zellen, COS-Zellen, VERO-Zellen, HeLa-Zellen, 293-Zellen, PER-C6-Zellen, K562-Zellen, MOLT-4-Zellen, M1-Zellen, NS-1-Zellen, COS7-Zellen, MDBK-Zellen, MDCIC-Zellen, MRC-5-Zellen, WI-38-Zellen, SP2/0-Zellen, BHK-Zellen (einschließlich BHK-21-Zellen), primäre und/oder immortalisierte Lymphozyten, Makrophagen, dendritische Zellen, Keratinozyten, Hepatozyten, neurale Zellen, renale Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen, Tumorzellen, Epithelzellen, hämatopoietische Stammzellen, mesenchymale Stammzellen, embryonale Stammzellen nicht menschlichen Ursprungs, Stammzellen neuronalen, hepatischen, renalen, dermalen, endothelialen, epithelialen und mesothelialen Ursprungs und Derivate davon, sind ebenfalls für die Verwendung bei der Bildung der Zellkulturzusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung geeignet. Insektenzellen, die für die Verwendung bei der Bildung solcher Zusammensetzungen besonders geeignet sind, schließen diejenigen ein, die sich von Spodoptera Spezies (z. B. HIGH FIVETM oder MG1, die von Trichoplusa ni stammen) ableiten. Gewebe und Organe, die aus Tieren stammen oder in vitro unter Verwendung von Verfahren konstruiert wurden, die auf dem Fachgebiet Routine sind, können gleichermaßen verwendet werden, um die Zellkulturzusammensetzungen der vorliegenden Offenbarung zu bilden. Diese Zellkulturzusammensetzungen können bei einer Vielzahl von medizinischen (einschließlich diagnostischen und therapeutischen), industriellen, forensischen Anwendungen und Forschungsanwendungen verwendet werden, die zur Verwendung fertige Zellkulturen in Medien benötigen.
  • Kits
  • Die vorliegende Offenbarung schließt ferner Kits für die Verwendung bei der Kultivierung einer Vielzahl von Zellen, einschließlich derjenigen Zellen, die hier beschrieben sind, für eine Anzahl von medizinischen (einschließlich diagnostischen und therapeutischen), industriellen, forensischen Anwendungen und Forschungsanwendungen ein. Kits können einen Träger, wie eine Kiste, einen Karton, ein Rohr oder dergleichen umfassen, die darin sitzfest einen oder mehrere Behälter, wie Phiolen, Röhren, Ampullen, Flaschen, Beutel, Hüllen und dergleichen aufweisen. Die Kits können eine oder mehrere Komponenten ausgewählt aus einer Gruppe umfassen, die aus einem oder mehreren Medien oder Medienbestandteilen, einer oder mehreren metallbindenden Verbindungen, wie hier offenbart, einem oder mehreren Komplexen aus einem Übergangselement, umfassend eine oder mehrere solcher metallbindenden Verbindungen, einer oder mehreren Zusammensetzungen der Offenbarung und einer oder mehreren Zellen und Kombinationen davon besteht. Die eine oder mehreren Komponenten können in dem gleichen Behälter enthalten sein oder können in getrennten Behältern sein, um vor der Verwendung bei der Kultivierung von Zellen vermischt zu werden. Die Kits können ferner eine oder mehrere zusätzliche Komponenten umfassen, die für die Verwendung bei der Kultivierung von Zellen geeignet sind, einschließlich zum Beispiel ein oder mehrere Cytokine, eine oder mehrere extrazelluläre Matrixkomponenten, einen oder mehrere Antikörper, ein oder mehrere Hormone (Peptid oder Steroid), ein oder mehrere Enzyme, eine oder mehrere Wachstumsergänzungen, einen oder mehrere Puffer oder Puffer-Salze und dergleichen. Die Kits können ferner eine oder mehrere Anweisungen oder ein oder mehrere Protokolle für die Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen.
  • Nachdem nun die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wurde, wird dieselbe unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verständlicher, die hiermit lediglich für Zwecke der Veranschaulichung eingeschlossen sind und die Erfindung nicht einschränken sollen.
  • Beispiel 1
  • Semi-konfluente anhaftende Kulturen von 293-Zellen (ATCC, CRL 1573) werden unschwer für die Suspensionskultur angepasst. Die Zellen werden zunächst mit einer Lösung von Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin, 0,53 mM Na4EDTA) getrennt und anschließend in herkömmlichem Medium, das mit 10% FBS ergänzt ist, resuspendiert, um das Trypsin zu hemmen. Die resuspendierten Zellen werden bei 200 × g für fünf Minuten zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 293 SFM (erhältlich von Life Technologies, Rockville, MD) resuspendiert, dessen Formulierung in der WO 98/08934 beschrieben ist, die hier spezifisch durch Bezugnahme mit aufgenommen ist. Alternativ können die Zellen mit Versene (Na4EDTA, 0,53 mM) getrennt und in 293 SFM resuspendiert werden.
  • Die anfängliche Saatdichte der 293-Zellen nach Umwandlung in die Suspensionskultur beträgt 1 × 106 Zellen/ml. Die Zellen werden auf einem Drehschüttler bei 150 Upm in einem 37°C Inkubator geschüttelt, der mit 8% CO2 – 92% Luft äquilibriert wurde. Wenn die Zellen eine Dichte von 1,5 × 106 Zellen/ml erreichen, werden sie mit 293 SFM auf eine Dichte von 3,0 × 105 Zellen/ml verdünnt. Da 293-Zellen zur Aggregation neigen, können die Zellen für etwa 45 Sekunden stark gevortext werden, um eine Suspension aus vorwiegend einzelnen Zellen zu der Zeit der Passierung und Zählung zu erhalten. Nach mehreren Passagen in Suspensionskultur kann die maximal erreichbare Dichte bestimmt werden. Die hier beschriebenen 293-Zellen können in Suspensionskultur auf etwa 3–4 × 106 Zellen/ml wachsen.
  • Die Fähigkeit von metallbindenden Verbindungen, zelluläres Wachstum zu unterstützen, wurde unter Verwendung von 293-Zellen bewertet, die in 293 SFM (Life Technologies, Rockville, MD) ohne Transferrin oder metallbindende Verbindung gehalten wurden. Basiskulturen, enthaltend 5 μg/ml menschliches Holo-Transferrin wurden in 293 SFM hergestellt. Für die Bewertung von metallbindenden Verbindungen wurden 293-Zellen in 125 ml Schüttelflaschen mit einer anfänglichen entwicklungsfähigen Saatdichte von 2 × 105 Zellen/ml in einem Endvolumen von 20 ml etabliert. Sämtliche Kulturen wurden bei 37°C in befeuchteter Luft, enthaltend 8% CO2, gehalten. Zur Beseitigung von Transferrin-Übertragungseffekten wurden Zellen mit Intervallen von 4 Tagen für insgesamt drei Passagen subkultiviert. Bei jeder Subkultivierung wurden die Zellen mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen/ml gesät. Kulturen der positiven Kontrolle enthielten 5 μg/ml menschliches Holo-Transferrin während Kulturen der negativen Kontrolle in Abwesenheit von entweder Transferrin oder metallbindende Verbindung etabliert wurden. Basislösungen für metallbindende Verbindungen wurden mit 0,1 M–0,2 M in ddH2O hergestellt und bei Bedarf unter Verwendung von 5N NaOH oder HCl gelöst. Eisen-Komplexe wurden unter Verwendung von 0,2 M metallbindende Verbindung hergestellt und die Eisen-Basislösungen wurden 1:1 (V/V) vermischt und für 5–10 Minuten bei 22°C inkubiert. Sämtliche metallbindende Verbindungen enthaltende Lösungen wurden unter Verwendung eines 0,22 μm Millex-GV Filters vor der Zugabe zu Transferrin und serumfreien Medien filtersterilisiert.
  • In den meisten Fällen wurden die metallbindenden Verbindungen entweder alleine oder in Kombination mit Eisen(III)-chlorid oder Eisen(II)-sulfat bei 25 µM, 50 µM und 100 µM bewertet. Bei Verwendung in Kombination wurden die metallbindenden Verbindungen in äquimolarer Konzentration mit Eisenionen verwendet. Die Werte in der Tabelle stellen den mittleren Prozentsatz des Kontrollwachstums für Doppelkulturen dar, die bei der dritten Passage bestimmt wurden. Medium, das nicht ergänzt war, d. h. entweder kein Transferrin oder keine metallbindende Verbindung enthielt, konnte das Wachstum der Zellen über drei Passagen nicht unterstützen.
  • Die Ergebnisse der 293-Zellen, die in Gegenwart von verschiedenen metallbindenden Verbindungen gezüchtet wurden, sind in der Tabelle 1 gezeigt. Bei der Zugabe zu der Mediumformulierung in nicht komplexierter Form ist die metallbindende Verbindung alleine aufgeführt, bei der Zugabe als ein Komplex mit einem Übergangsmetall ist die Quelle des Übergangsmetalls mit der metallbindenden Verbindung aufgeführt. Tabelle 1
    AUSWIRKUNG VON METALLBINDENDEN VERBINDUNGEN AUF DAS WACHSTUM VON 293-ZELLEN Konzentration
    Getestete metallbindende Verbindung 25 μM 50 μM 100 μM
    2-Hydroxypyridin-N-oxid (293 getestet bei 10 50 25 µM) 117 150 nicht getestet
    3-Hydroxypyridin-N-oxid 4 4 4
    3-Hydroxypyridin-N-oxid·Eisen(III)-chlorid 77 72 81
    3-Hydroxypyridin-N-oxid·Eisen(II)-sulfat 104 58 0
    2-Hydroxynicotinsäure·Eisen(I II)chlorid (293 getestet bei 100, 150, 200 µM) 0 0 99
    Eisen(II)-sulfat 71 60 41
    Eisen(III)-chlorid 87 91 109
  • Beispiel 2
  • Die Fähigkeit von metallbindenden Verbindungen, zelluläres Wachstum in Abwesenheit von Transferrin zu unterstützen, wurde unter Verwendung von CHO-Zellen bewertet, die in CD CHO Medium (Life Technologies, Rockville, MD, dessen Formulierung in der WO 98/08934 beschrieben ist) gehalten wurden. Basiskulturen, enthaltend 5 μg/ml menschliches Holo-Transferrin wurden in CD CHO Medium hergestellt. Für die Bewertung von metallbindenden Verbindungen wurden CHO-Zellen in 125 ml Schüttelflaschen mit einer anfänglichen entwicklungsfähigen Saatdichte von 1 × 105 Zellen/ml in einem Endvolumen von 20 ml etabliert. Sämtliche Kulturen wurden bei 37°C in befeuchteter Luft, enthaltend 8% CO2, gehalten. Zur Beseitigung von Transferrin-Übertragungseffekten wurden Zellen mit Intervallen von 4 Tagen für insgesamt drei Passagen subkultiviert. Kulturen der positiven Kontrolle enthielten 5 μg/ml menschliches Holo-Transferrin während Kulturen der negativen Kontrolle in Abwesenheit von entweder Transferrin oder metallbindende Verbindung etabliert wurden. Basislösungen für metallbindende Verbindungen wurden mit 0,1 M–0,2 M in ddH2O hergestellt und bei Bedarf unter Verwendung von 5N NaOH oder HCl gelöst. Eisen-Komplexe wurden unter Verwendung von 0,2 M metallbindende Verbindung hergestellt und die Eisen-Basislösungen wurden 1:1 (V/V) vermischt und für 5–10 Minuten bei 22°C inkubiert. Sämtliche metallbindende Verbindungen enthaltende Lösungen wurden unter Verwendung eines 0,22 μm Millex-GV Filters vor der Zugabe zu Transferrin und serumfreien Medien filtersterilisiert.
  • In den meisten Fällen wurden die metallbindenden Verbindungen entweder alleine oder in Kombination mit Eisen(III)-chlorid oder Eisen(II)-sulfat bei 25 µM, 50 µM und 100 µM bewertet. Die Werte in der Tabelle stellen den mittleren Prozentsatz des Kontrollwachstums für Doppelkulturen dar, die bei der dritten Passage bestimmt wurden. Medium, das nicht ergänzt war, d. h. entweder kein Transferrin oder keine metallbindende Verbindungen enthielt, konnte das Wachstum der Zellen über drei Passagen nicht unterstützen.
  • Die Fähigkeit verschiedener metallbindender Verbindungen, Transferrin in der Kultur von CHO-Zellen zu ersetzen, wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Bei der Zugabe zu der Mediumformulierung in nicht komplexierter Form ist die metallbindende Verbindung alleine aufgeführt, bei der Zugabe als ein Komplex mit einem Übergangsmetall ist die Quelle des Übergangsmetalls mit der metallbindenden Verbindung aufgeführt. Tabelle 2
    AUSWIRKUNG VON METALLBILDENEN VERBINDUNGEN AUF DAS WACHSTUM VON CHO-ZELLEN Konzentration
    Getestete metallbindende Verbindung 25 μM 50 μM 100 μM
    2-Hydroxypyridin-N-oxid 127 117 83
    3-Hydroxypyridin-N-oxid·Eisen(III)-chlorid 77 66 101
    Eisen(II)-sulfat 88 79 38
    Eisen(III)-chlorid 56 85 101
  • Beispiel 3
  • Die Fähigkeit von eisenmetallbindenden Verbindungen, zelluläres Wachstum in Abwesenheit von Transferrin zu unterstützen, wurde unter Verwendung von Sp2/0-Zellen bewertet, die in CD Hybridoma Medium (Life Technologies, Rockville, MD) gehalten wurden. Basiskulturen, enthaltend 5 μg/ml menschliches Holo-Transferrin wurden in CD Hybridoma Medium hergestellt. Für die Bewertung von metallbindenden Verbindungen wurden Sp2/0-Zellen mit einer anfänglichen entwicklungsfähigen von 0,5 × 105 Zellen/mL in stationärer Kultur unter Verwendung von 75 cm2 Gewebekulturflaschen in einem Endvolumen von 20 ml etabliert. Sämtliche Kulturen wurden bei 37°C in befeuchteter Luft, enthaltend 8% CO2, gehalten. Zur Beseitigung von Transferrin-Übertragungseffekten wurden Zellen mit Intervallen von 4 Tagen für insgesamt drei Passagen bei der gleichen Saatdichte subkultiviert. Kulturen der positiven Kontrolle enthielten 5 μg/ml menschliches Holo-Transferrin während Kulturen der negativen Kontrolle in Abwesenheit von entweder Transferrin oder metallbindende Verbindung etabliert wurden. Basislösungen für metallbindende Verbindungen wurden mit 0,1 M–0,2 M in ddH2O hergestellt und bei Bedarf unter Verwendung von 5N NaOH oder HCl gelöst. Eisen-Komplexe wurden unter Verwendung von 0,2 M metallbindende Verbindung hergestellt und die Eisen-Basislösungen wurden 1:1 (V/V) vermischt und für 5–10 Minuten bei 22°C inkubiert. Sämtliche metallbindende Verbindungen enthaltende Lösungen wurden unter Verwendung eines 0,22 μm Millex-GV Filters vor der Zugabe zu Transferrin und serumfreien Medien filtersterilisiert.
  • In den meisten Fällen wurden die metallbindenden Verbindungen entweder alleine oder in Kombination mit Eisen(III)-chlorid oder Eisen(II)-sulfat bei 25 μM, 50 μM und 100 μM bewertet. Die Werte in der Tabelle stellen den mittleren Prozentsatz des Kontrollwachstums für Doppelkulturen dar, die bei der dritten Passage bestimmt wurden. Medium, das nicht ergänzt war, d. h. entweder kein Transferrin oder keine metallbindende Verbindungen enthielt, konnte das Wachstum der Zellen über drei Passagen nicht unterstützen.
  • Die Fähigkeit verschiedener metallbindender Verbindungen, Transferrin in der Kultur von Sp2/0-Zellen zu ersetzen, wurde bestimmt und die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zu sehen. Bei der Zugabe zu der Mediumformulierung in nicht komplexierter Form ist die metallbindende Verbindung alleine aufgeführt, bei der Zugabe als ein Komplex mit einem Übergangsmetall ist die Quelle des Übergangsmetalls mit der metallbindenden Verbindung aufgeführt. Tabelle 3
    AUSWIRKUNG VON METALLBINDENDEN VERBINDUNGEN AUF DAS WACHSTUM VON Sp2/0-ZELLEN Konzentration
    Getestete metallbindende Verbindung 25 µM 50 µM 100 µM
    2-Hydroxypyridin-N-oxid 98 93 89
    3-Hydroxypyridin-N-oxid·Eisen(III)-chlorid 55 54 57
    2-Hydroxynicotinsäure·Eisen(III)-chlorid 64 82 85
    Eisen(II)-sulfat 91 103 94
    Eisen(III)-chlorid 55 73 74

Claims (29)

  1. Ein Verfahren für das Kultivieren von tierischen Zellen mittels mehrerer Passagen oder in einer Perfusionskultur, wobei das Verfahren ein Zellkulturmedium verwendet, das zumindest eine metallbindende Verbindung oder zumindest einen Komplex aus einem Übergangselement umfasst, wobei dieser Komplex zumindest ein Übergangselement oder ein Salz oder Ion davon, das mit zumindest einer metallbindenden Verbindung einen Komplex bildet, umfasst, wobei es sich bei dieser metallbindenden Verbindung um ein Derivat von Hydroxypyridin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxypyridin-N-oxid, 3-Hydroxypyrid-2-on, 3-Hydroxypyrid-4-on, 1-Hydroxypyrid-2-on, 1,2-Dimethyl-3-hydroxypyrid-4-on, 1-Methyl-3-hydroxypyrid-2-on und 2-Hydroxynicotinsäure handelt.
  2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Medium ferner einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus zumindest einer Aminosäure, zumindest einem Vitamin, zumindest einem anorganischen Salz, zumindest einem organischen Salz, zumindest einem Spurenmetall, zumindest einem Nukleotid, zumindest einem Puffersalz, zumindest einem Zucker, zumindest einem Lipid und zumindest einem Hormon umfasst.
  3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei den Zellen um Zellen von Säugetieren handelt.
  4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei den Zellen um Zellen von Fischen, Insekten oder Vögeln handelt.
  5. Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zellen ausgewählt werden aus einer Gruppe bestehend aus 293-Zellen, PER-C6-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen und Sp2/0-Zellen.
  6. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Medium um serumfreies Medium handelt.
  7. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem Medium um ein definiertes Medium handelt.
  8. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Medium kein Transferrin enthält.
  9. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei der metallbindenden Verbindung um 2-Hydroxypyridin-N-oxid handelt.
  10. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei der metallbindenden Verbindung um 2-Hydroxynicotinsäure handelt.
  11. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Übergangselement um Eisen handelt.
  12. Das Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Eisen wie in FeCl3 vorliegt.
  13. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich um ein Verfahren für das Kultivieren von tierischen Zellen mittels mehrerer Passagen handelt.
  14. Das Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zellen in Suspension in einer Schüttelvorrichtung, einem Rührkessel, einem Airlift oder einer Perfusionskultur kultiviert werden.
  15. Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Zellen auf die Oberfläche eines Kulturgefäßes ausplattiert sind oder ein Kulturgefäß mit natürlichen, rekombinanten oder synthetischen Bindungsfaktoren oder Peptidfragmenten vorbeschichtet ist.
  16. Die Verwendung eines Derivats von Hydroxypyridin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxypyridin-N-oxid, 3-Hydroxypyrid-2-on, 3-Hydroxypyrid-4-on, 1-Hydroxypyrid-2-on, 1,2-Dimethyl-3-hydroxypyrid-4-on, 1-Methyl-3-hydroxypyrid-2-on und 2-Hydroxynicotinsäure, um in vitro in einem tierischen Zellkulturmedium kultivierten tierischen Zellen Übergangsmetalle zu liefern.
  17. Die Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das Medium ferner einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe von Bestandteilen bestehend aus zumindest einer Aminosäure, zumindest einem Vitamin, zumindest einem anorganischen Salz, zumindest einem organischen Salz, zumindest einem Spurenmetall, zumindest einem Nukleotid, zumindest einem Puffersalz, zumindest einem Zucker, zumindest einem Lipid und zumindest einem Hormon umfasst.
  18. Die Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei den Zellen um Zellen von Säugetieren handelt.
  19. Die Verwendung gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei es sich bei den Zellen um Zellen von Fischen, Insekten oder Vögeln handelt.
  20. Die Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei die Zellen ausgewählt werden aus einer Gruppe bestehend aus 293-Zellen, PER-C6-Zellen, CHO-Zellen, COS-Zellen und Sp2/0-Zellen.
  21. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei es sich bei dem Medium um serumfreies Medium handelt.
  22. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei es sich bei dem Medium um ein definiertes Medium handelt.
  23. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, wobei das Medium kein Transferrin enthält.
  24. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei es sich bei der metallbindenden Verbindung um 2-Hydroxypyridin-N-oxid handelt.
  25. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei es sich bei der metallbindenden Verbindung um 2-Hydroxynicotinsäure handelt.
  26. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 25, wobei es sich bei dem Übergangselement um Eisen handelt.
  27. Die Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei das Eisen wie in FeCl3 vorliegt.
  28. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 27, wobei die Zellen in Suspension in einer Schüttelvorrichtung, einem Rührtank, einem Airlift oder einer Perfusionskultur kultiviert werden.
  29. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 27, wobei die Zellen auf die Oberfläche eines Kulturgefäßes ausplattiert sind oder ein Kulturgefäß mit natürlichen, rekombinanten oder synthetischen Bindungsfaktoren oder Peptidfragmenten vorbeschichtet ist.
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