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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Zellkulturmedium-Formulierungen. Insbesondere stellt
die vorliegende Erfindung Systeme bereit, die definierte Zellkulturmedium-Formulierungen
umfassen und das in vitro-Kultivieren von Epithelzellen, insbesondere
von Keratinozyten, ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren für das Kultivieren
von tierischen Zellen unter Verwendung dieser Systeme bereit.
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Stand der Technik
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Zellkulturmedien
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Zellkulturmedien
liefern die nötigen
Nährstoffe,
um Zellen in einer kontrollierten, künstlichen und in vitro-Umgebung
bestehen und wachsen zu lassen. Die Eigenschaften und Zusammensetzungen
der Zellkulturmedien variieren in Abhängigkeit der besonderen Anforderungen
der Zellen. Wichtige Parameter schließen Osmolarität, pH-Wert
und Nährstoff-Formulierungen
ein.
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Medien-Formulierungen
wurden für
das Kultivieren einer Anzahl von Zellarten, einschließlich tierischer,
pflanzlicher und bakterieller Zellen, verwendet. In Kulturmedien
kultivierte Zellen bauen verfügbare Nährstoffe
ab und stellen nützliche
biologische Stoffe wie monoklonale Antikörper, Hormone, Wachstumsfaktoren
und dergleichen her. Solche Produkte sind therapeutisch anwendbar
und mit Hilfe der entstehenden rekombinanten DNA-Technologie können Zellen
gentechnisch so modifiziert werden, dass sie große Mengen dieser Produkte herzustellen.
Somit ist die Fähigkeit
zur in vitro-Kultivierung von Zellen nicht nur für Studien der Zellphysiologie
von Bedeutung, sondern auch für
die Herstellung von zweckmäßigen Stoffen,
die ansonsten nicht mit kostengünstigen
Mitteln erhalten werden können,
von Nöten.
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Zellkulturmedien-Formulierungen
sind in der Literatur gut dokumentiert und eine Anzahl von Medien ist
im Handel erhältlich.
In frühen
Arbeiten über
Zellkulturen basierten Medien-Formulierungen auf den chemischen
Zusammensetzungen und physiochemischen Eigenschaften von Blut (z.B.
Osmolarität,
pH-Wert, etc.) und wurden als „physiologische
Lösungen" bezeichnet (Ringer,
S., J. Physiol. 3:380–393
(1880); Waymouth, C., In: Cells and Tissues in Culture, Vol. 1,
Academic Press, London, Seiten 99–142 (1965); Waymouth, C.,
In vitro 6:109–127
(1970)). Allerdings sind die Zellen in unterschiedlichen Geweben
des Körpers
von Säugetieren unterschiedlichen
Mikroumgebungen bezüglich
des Sauerstoff/Kohlendioxid-Partialdruckes
und Konzentrationen an Nährstoffen,
Vitaminen und Spurenelementen ausgesetzt; dementsprechend erfordert
eine erfolgreiche in vitro-Kultur
unterschiedlicher Zellarten oftmals die Verwendung unterschiedlicher
Medien-Formulierungen. Übliche Komponenten
von Zellkulturmedien schließen
Aminosäuren,
organische und anorganische Salze, Vitamine, Spurenmetalle, Zucker,
Lipide und Nukleinsäuren
ein, wobei die Arten und Mengen derselben in Abhängigkeit der besonderen Anforderungen
einer bestimmten Zell- oder Gewebeart variieren.
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Üblicherweise
werden Zellkulturmedien-Formulierungen mit einer Reihe von Additiven
ergänzt,
einschließlich
undefinierter Komponenten wie Fötales
Rinderserum (FBS) (10–20%
v/v) oder Extrakten aus tierischen Embryonen, Organen oder Drüsen (0,5–10% v/v).
Obgleich FBS die am häufigsten
angewandte Ergänzung
in tierische Zellkulturmedien ist, werden üblicherweise auch andere Serumquellen
verwendet, einschließlich
neugeborener Kälber,
Pferde und Menschen. Für
die Herstellung von Extrakten für
die Ergänzung
von Kulturmedien verwendete Organe oder Drüsen schließen Unterkieferdrüse (Cohen,
S., J. Biol. Chem. 237:1555–1565
(1961)), Hypophyse (Peehl, D.M., und Ham, R.G., In vitro 16:516–525 (1980);
US-Patent Nr. 4673649),
Hypothalamus (Maciag, T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:56745678
(1979); Gilchrest, B.A., et al., J. Cell. Physiol.120:377–383 (1984)),
Retina (Barretault, D., et al., Differentiation 18:29–42 (1981))
und Gehirn (Maciag, T., et al., Science 211:1452–1454 (1981)) ein. Diese Arten
chemischer, undefinierter Ergänzungen
dienen in Zellkulturmedien mehreren zweckmäßigen Funktionen (Lambert,
K.J. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol. 1, Spier, R.E.
et al., Eds., Academic Press New York, Seite 85–122 (1985)). Beispielsweise liefern
diese Ergänzungen
Trägermittel
oder Chelatoren für
labile oder wasser-unlösliche
Nährstoffe,
sie binden und neutralisieren toxische Teile; sie liefern Hormone
und Wachstumsfaktoren, Proteaseinhibitoren und essentielle, oft
unidentifizierte oder undefinierte Nährstoffe mit niedrigem Molekulargewicht;
und sie schützen die
Zellen vor physikalischem Stress und physikalischer Beschädigung.
Somit werden Serum oder Organ/Drüsen-Extrakt üblicherweise
als relativ kostengünstige
Ergänzungen
für das
Bereitstellen eines optimalen Kulturmediums für das Kultivieren von tierischen
Zellen verwendet.
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Unglücklicherweise
hat die Verwendung von Serum oder Organ/Drüsen-Extrakten in Gewebekultur-Anwendungen
mehrere Nachteile (Lambert, K.J. et al., In: Animal Cell Biotechnology,
Vol 1, Spier, R.E. et al., Eds., Academic Pres New York, Seite 85–122 (1985)).
Beispielsweise kann die chemische Zusammensetzung dieser Ergänzungen
sogar bei einem einzigen Hersteller zwischen den einzelnen Posten
variieren. Die Ergänzungen
können
auch mit infektiösen
Wirkstoffen (z.B. Mykoplasma und Viren) kontaminiert sein, die die Gesundheit
der kultivierten Zellen ernsthaft gefährden können, wenn diese kontaminierten
Ergänzungen
in Zellkulturmedien-Formulierungen
verwendet werden. Die Zelloberflächenchemie,
die für
manche Zellarten ein entscheidender Bereich der in vitro-Mikroumgebung
ist, kann durch Adsorption oder Inkorporation von Serum oder Extraktproteinen
nachteilig verändert
werden. Die Verwendung undefinierter Komponenten wie Serum oder
Tierextrakten verhindert auch die Feststellung und Aufklärung der
eigentlichen Nährstoff-
und Hormonanforderungen der kultivierten Zellen und eliminieren
somit die Möglichkeit,
in einer kontrollierten Art und Weise die Wirkung spezifischer Wachstumsfaktoren
oder Nährstoffe
auf das Zellwachstum und die Differenzierung in Kultur zu untersuchen.
Darüber
hinaus hindern undefinierte Ergänzungen
den Forscher daran, anormales Wachstum und anormale Differenzierung
und die krankheitsbedingten Veränderungen
in kultivierten Zellen zu untersuchen. Für die Verwendung von Zellkulturmedien
in der industriellen Herstellung von biologischen Stoffen ist schlussendlich
am wichtigsten, dass die Ergänzung
von Kulturmedien durch Serum und Organ/Drüsen-Extrakt aufgrund unspezifischer
Reinigung von Serum oder Extraktproteinen die Reinigung der gewünschten
Stoffe der Kulturmedien komplizieren und die Kosten derselben erhöhen. Eine
Anzahl von Kulturmedien wird in Pittelkow et al., J. Cell. Physiol.
Vol 140, Nr. 3, Seite 565–576
und Yang et al., Endocrinology, Vol. 107, Nr. 1, Seite 35–41 beschrieben.
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Definierte Medien
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Um
diese Nachteile der Verwendung von Serum oder Organ/Drüsen-Extrakten
zu überwinden,
wurde eine Anzahl sogenannter „definierter" Medien entwickelt.
Diese oftmals für
die Unterstützung
der Kultur einer einzigen Zellart spezifisch formulierten Medien
enthalten anstelle undefinierter Ergänzungen inkorporierte definierte
Mengen gereinigter Wachstumsfaktoren, Proteine, Lipoproteine und
weiterer Stoffe, die normalerweise die Serum- oder Extrakt-Ergänzung bereitstellt.
Da die Komponenten (und Konzentrationen derselben) in solchen Kulturmedien
genau bekannt sind, werden diese Medien normalerweise als „definierte
Kulturmedien" bezeichnet.
Die Begriffe „serumfreie
Medien" oder „SFM" werden oftmals als
Synonym für „definierte
Kulturmedien" verwendet.
Im Handel ist eine Anzahl von SFM-Formulierungen erhältlich,
wie jene, die für
das Unterstützen
von Endothelialzellen-, Keratinozyten-, Monozyten-/Makrophagen-,
Fibroblasten-, Chondrozyten- oder Hepatozytenkulturen konzipiert
und bei GIBCO/LTI (Gaithersburg, Maryland) erhältlich sind. Allerdings besteht der
Unterschied zwischen SFM und definierten Medien darin, dass SFM
Medien ohne Serum, aber nicht zwingend ohne weitere undefinierte
Komponenten wie Organ/Drüsen-Extrakte
sind. Es wurde hingegen von mehreren SFM berichtet oder diese sind
im Handel erhältlich,
die solche undefinierte Komponenten enthalten, einschließlich mehrerer
Formulierungen, die in vitro-Kulturen von Keratinozyten unterstützen (Boyce,
S.T., und Ham, R.G., J. Invest. Dermatol. 81:33 (1983); Wille, J.J.,
et al., J Cell. Physiol. 121:31 (1984); Pittelkow, M.R., und Scott,
R.E., Mayo Clin. Proc. 61:771 (1986); Pirisi, L., et al., J. Virol.
61:1061 (1987); Shipley, G.D., und Pittelkow, M.R., Arch. Dermatol.
123:1541 (1987); Shipley, G.D., et al., J. Cell. Physiol. 138:511–518 (1989); Daley,
J.P., et al., FOCUS(GIBCO/LTI) 12:68 (1990); US-Patent Nr. 4,673,649
und 4,940,666). Laut der eigentlichen Begriffsdefinition können SFM
somit nicht als definierte Medien angesehen werden.
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Definierte
Medien stellen dem Verwender im Allgemeinen mehrere unterschiedliche
Vorteile bereit. Beispielsweise ermöglicht die Verwendung definierter
Medien die Erforschung der Wirkung eines spezifischen Wachstumsfaktors
oder weiteren Mediumkomponente auf die zelluläre Physiologie, die bei Kultivierung
der Zellen in Serum oder Extrakt enthaltenden Medien verdeckt sein
kann. Zusätzlich
enthalten definierte Medien üblicherweise
geringere Proteinmengen (definierte Medien werden deswegen oftmals
als „proteinarme
Medien" bezeichnet)
als Serum oder Extrakt enthaltende Medien, wodurch die Reinigung
von biologischen, in definierten Medien kultivierten Zellen hergestellten
Stoffen wesentlich einfacher und kostengünstiger wird.
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Einige
extrem einfach definierte Medien, die im Wesentlichen aus Vitaminen,
Aminosäuren,
organischen und anorganischen Salzen und Puffern bestehen, wurden
für die
Zellkultur verwendet. Solchen Medien (oftmals als „Basalmedien" bezeichnet) fehlt
es allerdings normalerweise stark an dem von den meisten tierischen
Zellen benötigten
Nährstoffgehalt.
Dementsprechend inkorporieren die meisten definierten Medien zusätzliche
Komponente in die Basalmedien, um die Medien bezüglich der Nährstoffe komplexer zu gestalten, jedoch
den serumfreien und proteinarmen Inhalt der Medien zu erhalten.
Beispiele solcher Komponenten schließen das Rinderserumalbumin
(BSA) oder das Humane Serumalbumin (HSA); gewisse, aus natürlichen (Tier)
oder rekombinanten Quellen wie EGF oder FGF gewonnene Wachstumsfaktoren;
Lipide wie Fettsäuren, Sterole
und Phospholipide; Lipidderivate und -komplexe wie Phosphoethanolamin,
Ethanolamin und Lipoproteine; Protein- und Steroidhormone wie Insulin, Hydrocortison
und Progesteron; Nukleotid-Prekursoren
und gewisse Spurenelemente ein (vgl. Waymouth, C., in: Cell Culture
Methods for Molecular and Cell Biology, Vol. 1: Methods for Preparation
of Media, Supplements, and Substrata for Serum-Free Animal Cell
Culture, Barnes, D.W., et al., eds., New York: Alan R. Liss, Inc.,
Seite 23–68
(1984), und Gospodarowicz, D., Id., Seite 69–86 (1984)).
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Epithelzellen
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Übersicht
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Das
Epithel bedeckt die inneren und äußeren Organ-
und Drüsenoberflächen höher entwickelter
Organismen. Aufgrund dessen, dass es an der äußeren Schnittstelle zwischen
der Umgebung und dem Organismus (z.B. der Haut) oder an der inneren Schnittstelle
zwischen einem Organ und dem Zwischenraum (z.B. der Darmschleimhaut)
zu finden ist, spielt das Epithel bei der Erhaltung der Homöostase eine
wichtige Rolle. Das Epithel erfüllt
diese Aufgabe beispielsweise durch die Regulierung von Transport
und Permeabilität
von Nähr- und
Abfallstoffen (Freshney, R.I., in: Culture of Epithelial Cells,
Freshney, R.I., ed., New York: Wiley-Liss, Seiten 1–23 (1992)).
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Die
Zellen, die das Epithel bilden, werden normalerweise als Epithelzellen
bezeichnet. Diese Zellen können
in Form einer Schicht wie in der Haut oder in Form mehrerer Schichten
wie in den Lungenbläschen vorliegen.
Erwartungsgemäß sind die
Struktur, die Funktion und die Physiologie von Epithelzellen oftmals
gewebespezifisch. Beispielsweise sind die epidermalen Epithelzellen
der Haut als mehrschichtiges Plattenepithel aufgebaut und dienen
in erster Linie der Bildung einer Schutzbarriere für den Organismus,
während
die sekretorischen Epithelzellen einiger Drüsen oftmals in einzelnen Schichten
kubischer Zellen vorhanden sind, die bei der Herstellung von sekretorischen
Proteinen und Glycoproteinen eine wichtige Rolle spielen. Üblicherweise sind
Epithelzellen unabhängig
von ihrer Position oder Funktion allerdings regenerativ. Das bedeutet,
dass Epithelzellen unter normalen Bedingungen oder infolge einer
Beschädigung
oder weiterer aktivierender Stimuli die Fähigkeit haben, sich zu teilen
oder zu wachsen. Diese regenerative Fähigkeit hat den Umgang mit
Epithelzellen in vitro in einem solchen Maße erleichtert, dass eine Vielfalt
primärer
Epithelzellen und Zelllinien erfolgreich in vitro kultiviert wurde
(Freshney, Id.).
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Keratinozyten
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Die
spezialisierten, in der Hautepidermis vorhandenen Epithelzellen
sind als Keratinozyten bekannt. In den oberen, verhornten Schichten
der Haut (die der Umwelt ausgesetzt sind) wird das Cytoplasma der
Keratinozyten vollständig
durch Keratin ersetzt, und die Zellen sterben. Die in den unteren
Schichten, insbesondere in der basalen Epidermis (Stratum basale),
vorhandenen Keratinozyten allerdings teilen sich aktiv und migrieren
schließlich
durch die oberflächennäheren Schichten
aufwärts,
um jene Zellen, die sich an der externen Oberfläche ablösen, zu ersetzen.
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Dementsprechend
kann die Haut als dynamisches Organ angesehen werden, das Keratinozyten
umfasst, die sich ständig
teilen, reifen und schließlich
sterben.
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Kulturen
menschlicher Keratinozyten werden vermehrt für Untersuchungen der Hautstruktur
und Hautkrankheiten und als in vitro-Modelle für menschliche Haut in toxikologischen
Studien verwendet (Boyce, S.T., und Ham, R.G., in: In vitro-Models
for Cancer Research, vol. III, Webber, M.M., et al., eds., Boca
Raton, FL: CRC Press, Inc., Seiten 245–274 (1985)). Erfolgreiche
Keratinozytenkulturen haben allerdings bewiesen, dass dies in erster
Linie schwierig ist, weil ihre hohen Nährstoffanforderungen erfüllt werden
müssen
(Gilchrest, B.A., et al., J Cell. Physiol. 120:377–383 (1984)).
Beispielsweise wurden in den meisten frühen Studien, die herkömmliche,
mit Serum ergänzte
Kulturmedien verwendeten, die Keratinozyten aus Hautexplanaten rasch von
leichter kultivierbaren und schneller wachsenden, ebenfalls in dem
Gewebe vorhandenen Fibroblasten überwachsen
(Freshney, Id.). Somit wurde beim Versuch, Kulturmedien zu formulieren,
die die Selektion und das erfolgreiche in vitro-Kultivieren menschlicher
Keratinozyten begünstigen,
beachtliche Arbeit geleistet.
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Systeme und Formulierungen
von Keratinozyten-Kulturmedium
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Für das Kultivieren
menschlicher Keratinozyten wurde eine Vielfalt an Systemen entwickelt.
Frühe Arbeiten
auf diesem Gebiet verwendeten spezialisierte Kulturmedien wie das
Medium 199 (Marcelo, C.L., et al., J. Cell Biol. 79:356 (1978))
und NCTC 168 (Price, F.M., et al., In vitro-16:147(1980)) mit Serumergänzung. Alternativ
hat sich gezeigt, dass durch Ausplattieren von letal bestrahlten
3T3-Fibroblasten
mit Zellen und durch Hinzufügen
von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Hydrocortison zu dem Medium
das Keratinozytenwachstum und die Koloniebildung verbessert werden
(Rheinwald, J.G., und Green, H., Cell 6:331 (1975)). Eine der ersten
serumfreien für
Keratinozytenkulturen verwendeten Medium-Formulierungen basierte auf Medium 199
und schloss einen Cocktail von Wachstumsfaktoren ein, der Rindergehirnextrakt
umfasste (Gilchrest, B.A., et al., J. Cell. Physiol. 112:197 (1982)),
und serumfreie Kulturen menschlicher Keratinozyten ohne Verwendung von
3T3 Fibroblasten-Feeder-Schichten (fibroblast feeder layers) wurden
nach der Entwicklung eines spezialisierteren Basalmediums MCDB-153 weitgehend
angenommen (Boyce, S.T., and Ham, R.G., J. Invest. Dermatol. 81:33
(1983); US-Patent Nr. 4,673,649 und 4,940,666). Serumfreies MCDB-153
schließt
Spurenelemente, Ethanolamin, Phospoethanolamin, Hydrocortison, EGF
und Rinderhypophysenextrakt (BPE) ein. Dieses Medium und mehrere
verbesserte Versionen wurden weitgehend für das Kultivieren menschlicher
Keratinozyten verwendet (Pittelkow, M.R:, und Scott, R.E., Mayo
Clin. Proc. 61:771 (1986); Pirisi, L., et al., J. Virol.61:1061(1987);
Shipley, G.D., und Pittelkow, M.R., Arch. Dermatol.123:1541 (1987);
Daley, J.P., et al., FOCUS (GIBCO/LTI) 12:68 (1990)). Die Verwendung
von BPE ist auch vielen im Handel erhältlichen Medien für das Kultivieren
von Keratinozyten gemein, einschließlich KGM (Clonetics Corporation,
San Diego, California), CS-2.0 Keratinozytenzellwachstums-Medium
(Cell Systems, Inc.; Kirkland, Washington), M154 (Cascade Biologicals,
Inc.; Portland, Oregon) und Keratinozyten-SFM (GIBCO/LTI; Gaithersburg,
Maryland).
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Allerdings
hat serumfreies, BPE enthaltendes Medium als primäres Mitogen
wie oben allgemein beschrieben mehrere Nachteile. Beispielsweise
kompliziert die undefinierte BPE-Zusammensetzung experimentelle
Modelle und Ergebnisinterpretationen und kann, abhängig von
den Konzentrationen weiterer Bestandteile in dem Medium, das Wachstum
oder die Differenzierung von Keratinozytenkulturen entweder stimulieren
oder hemmen (Wille, J.J., et al., J. Cell. Physiol. 121:31 (1984)).
Zusätzlich
erfordert BPE in unterschiedlichen Zellsystemen Titration und seine
Stabilität
im Medium ist unter normalen Verwendungs- und Lagerbedingungen auf
ungefähr
vier Wochen beschränkt.
Zumindest ein Bericht behandelte ein vollständig definiertes Medium für die Kultur
von Epidermalzellen, wobei BPE durch den Epidermalen Wachstumsfaktor
(EGF), den insulinähnlichen
Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) und erhöhte Mengen sechs spezieller
Aminosäuren
ersetzt wurde (US-Patent Nr. 5,292,655). Allerdings wurde dieses
Medium für
den speziellen Zweck einer in vitro-Herstellung eines Hautersatzes
ausgestaltet, das differenzierte Keratinozyten umfasst und kann
für das
Unterstützen
kontinuierlicher Kulturen von aktiv wachsenden Zellen nicht ideal
sein.
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Somit
besteht auch weiterhin für
das Kultivieren von tierischen Epithelzellen einschließlich Keratinozyten
ein Bedarf an definierten Kulturmedien, die frei von Serum und Organ-/Drüsen-Extrakt
sind. Solche Kulturmedien ermöglichen
Studien über
die Wirkung von Wachstumsfaktoren und anderer Stimuli auf die Zellphysiologie,
ermöglichen
einfachere und kostengünstigere
Reinigung von biologischen, von kultivierten tierischen Zellen in
der Biotechnologieindustrie hergestellten Stoffen und liefern bei
Verfahren, die das Kultivieren von tierischen Epithelzellen verwenden,
einheitlichere Ergebnisse. Die vorliegende Erfindung stellt solche
definierte Medien bereit.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt definierte Kulturmedien bereit, die
BPE durch wachstumsfördernde Additive
wie Insulin, EGF und weitere Additive ersetzen. In einer bevorzugten
Ausführungsform
stellt die Erfindung ein serumfreies Zellkulturmedium, das Heparin,
Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), einen Fibroblasten Wachstumsfaktor
(FGF) und einen Wirkstoff umfasst, der intrazelluläre Niveaus
von zyklischem Adenosinmonophosphat (CAMP) erhöht, wobei der Wirkstoff aus
der Gruppe ausgewählt
ist, die aus einem β-Adrenorezeptoragonisten,
Choleratoxin, Forskolin, Dibutyryl-cAMP, Isobutylmethylxanthin und
Theophyllin besteht, bereit. In einer weiteren Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Zellkulturmedium bereit, das das in vitro-Kultivieren
einer Tierepithelzelle unterstützen
kann und Insulin, Heparin, EGF und zumindest zwei zusätzliche
Additive aus der Gruppe bestehend aus FGF, einem Wirkstoff, der
intrazelluläre
Niveaus von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöht, und
Ascorbinsäure
umfasst. Das von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Medium
kann in einer 1X Formulierung oder in einer 10X oder einer höheren Formulierung
konzentriert sein. Das Basalmedium der vorliegenden Erfindung umfasst
eine Anzahl von Bestandteilen, einschließlich Aminosäuren, Vitaminen,
organischen und anorganischen Säuren,
Zuckern und weiteren Komponenten, wobei jeder Bestandteil in einer
Menge vorhanden ist, die das in vitro-Kultivieren einer Tierepithelzelle
unterstützt. Das
Medium kann für
das Kultivieren einer Vielfalt von tierischen Epithelzellen, einschließlich Primärzellen (z.B.
Keratinozyten oder zervikalen Epithelzellen) und etablierten Zelllinien
(z.B. HeLa-Zellen), verwendet werden. Durch das Medium der vorliegenden
Erfindung unterstütze
Zellen können
aus jedem beliebigen Lebewesen, bevorzugt einem Säugetier
und noch bevorzugter einem Menschen gewonnen werden. Die vorliegende Erfindung
stellt auch Verfahren für das
Kultivieren von tierischen Epithelzellen unter Verwendung der hierin
offenbarten Kulturmedium-Formulierungen bereit, die die Schritte
des (a) In-Kontakt-Bringens einer tierischen Zelle mit dem Zellkulturmedium
gemäß der vorliegenden
Erfindung; und des (b) Kultivierens der tierischen Zelle unter Bedingungen,
die geeignet sind, die Kultivierung der Zelle in vitro zu unterstützen, umfassen.
Die Erfindung stellt auch Kits für
die Verwendung beim Kultivieren einer Tierepithelzelle bereit. Kits
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen ein Trägermittel,
in dem fest eingeschlossen ein oder mehrere Behälter vorhanden ist/sind, wobei
ein erster Behälter
wie oben beschrieben ein basales Kulturmedium enthält, ein
zweiter Behälter
ein Insulin, ein dritter Behälter
EGF, ein vierter Behälter
FGF, ein fünfter
Behälter
zumindest einen Wirkstoff, der die intrazellulären Niveaus von cAMP erhöht, ein
sechster Behälter
Heparin und ein siebter Behälter Ascorbinsäure enthält. In einer
bevorzugten Ausführungsform
enthält
der zweite Behälter
der Kits Insulin, EGF, FGF, zumindest einen die intrazellulären Niveaus
von cAMP erhöhenden
Wirkstoff, Heparin und Ascorbinsäure gemeinsam
in einer Mischung. Die Erfindung stellt ferner Zellkulturzusammensetzungen
bereit, die die Kulturmedien der vorliegenden Erfindung und eine
Tierepithelzelle umfassen. Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen
bereit, die Heparin, EGF, FGF, zumindest einen die intrazellulären Niveaus
von cAMP erhöhenden Wirkstoff
und optional Ascorbinsäure
umfasst, wobei die Zusammensetzungen für das Ersetzen von Organ- oder
Drüsenextrakt
in serumfreien tierischen Zellkulturmedien verwendet werden können. Die
Kulturmedien der vorliegenden Erfindung sind für die Verwendung sowohl in
der Isolierung und Initiierung von primären Epithelzellkulturen als
auch in der Expansion von etablierten Epithelzellkulturen geeignet.
Zusätzlich
liefern die Medien der vorliegenden Erfindung besseres Wachstum
und besseren Erhalt von morphologischen und physiologischen Kennzeichen
primärer
tierischer Epithelzellen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1. Mikroaufnahme einer Phasenkontrastmikroskopie
menschlicher Keratinozyten. In dem definierten Keratinozyten-SFM
gemäß der vorliegenden
Erfindung (A) oder in einem BPE enthaltenden
Keratinozyten-SFM (B) wurden Zellen
kultiviert. Die Fotografien sind 100fach vergrößert.
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2.
Mikroaufnahme einer Fluoreszenzmikroskopie menschlicher Keratinozyten,
die in dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung
kultiviert und mit gegen Keratin 14 gerichteten fluoreszenten Antikörpern gefärbt wurden.
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3.
Balkendiagramm, das das Wachstum primärer menschlicher Keratinozyten
in dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung
(„Definiertes
Keratinozyten-SFM"),
in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Keratinozyten-SFM") oder in einem von
Hyclone Laboratories (Logan, Utah) erhaltenen Keratinozyten-SFM
(„Zulieferer
A") veranschaulicht.
Sechs Tage nach dem Aussäen
wurde das Wachstum bestimmt und die Werte ergaben Mittelwerte von ± SEM,
wobei n = 7.
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4.
Balkendiagramm, das das Wachstum sekundärer menschlicher Keratinozyten
in dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung
(„definiertes
Keratinozyten-SFM"),
in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Keratinozyten-SFM") oder in einem von
Hyclone Laboratories (Logan, Utah) erhaltenen Keratinozyten-SFM
(„Zulieferer
A") veranschaulicht.
72 Tage nach dem Aussäen
wurde das Wachstum bestimmt und die Werte ergaben von Mittelwerte ± SEM,
wobei n = 7.
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5.
Balkendiagramm, das eine wachstumskinetische Analyse menschlicher
Keratinozyten veranschaulicht. In dem definierten Keratinozyten-SFM
der vorliegenden Erfindung
oder
in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM (☐) wurden
Zellen kultiviert. Die Werte ergeben Mittel von ± SD, wobei n = 2.
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6.
Liniendiagramm, das eine Untersuchung der mittleren Lagerfähigkeit
der primäre
menschliche Keratinozyten verwendenden Medien veranschaulicht. In
dem definierten Keratinozyten-SFM der vorliegenden Erfindung (durchgezogene
Linie) oder in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM (gestrichelte
Linie) wurden über
einen 15-wöchigen
Zeitraum Zellen kultiviert. Die Zellen wurden nach 6 Tagen in Medium,
das über
einen vorgegebenen Zeitraum hinweg gelagert worden war, gezählt und
mit den in frischem Medium kultivierten Kontrollzellen verglichen.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Definitionen
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In
der nachfolgenden Beschreibung wird eine Anzahl üblicherweise auf dem Gebiet
der Zellkulturmedien eingesetzter Begriffe verwendet. Die folgenden
Definitionen dienen dazu, ein eindeutiges und einheitliches Verständnis der
Beschreibung und der Ansprüche
und des Umfanges solcher Begriffe zu liefern.
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Der
Begriff „Bestandteil" bezieht sich auf
jede beliebige Verbindung, ob chemischen oder biologischen Ursprungs,
die in Zellkulturmedien für
den Erhalt oder die Förderung
des Zellwachstums oder der Zellproliferation verwendbar sind. Die
Begriffe „Komponente", „Nährstoff" und „Bestandteil" sind jeweils Synonyme
und beziehen sich allesamt auf solche Verbindungen. Übliche in
Zellkulturmedien verwendete Bestandteile schließen Aminosäuren, Salze, Metalle, Zucker,
Lipide, Nukleinsäuren,
Hormone, Vitamine, Fettsäuren,
Proteine und dergleichen ein. Weitere Bestandteile, die das ex vivo
Kultivieren von Zellen fördern
oder erhalten, können von
Fachleuten gemäß dem speziellen
Bedarf ausgewählt
werden.
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Unter „Zellkultur" oder „Kultur" ist der Erhalt von
Zellen in einer künstlichen
in vitro-Umgebung
zu verstehen. Allerdings handelt es sich bei dem Begriff „Zellkultur" selbstredend um
einen allgemeinen Begriff, der nicht nur verwendet werden kann,
um das Kultivieren einzelner Zellen, sondern auch das Kultivieren
von Geweben, Organen, Organsystemen oder ganzen Organismen einzufassen,
wobei die Begriffe „Gewebekultur", „Organkultur", „Organsystemkultur" oder „organotypische
Kultur" gegebenenfalls
als Synonyme für
den Begriff „Zellkultur" verwendet werden
können.
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Unter „Kultivieren" ist der Erhalt von
Zellen unter in vitro-Bedingungen, die Wachstum, Differenzierung oder
kontinuierliche Zellviabilität
in einem aktiven oder passiven Stadium begünstigen, zu verstehen. In diesem Sinne
kann „Kultivieren" als Synonym für „Zellkultur" oder für jedes
beliebige der oben beschriebenen Synonyme verwendet werden.
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Unter „Kulturgefäß" versteht man einen
Glas-, Plastik- oder Metallbehälter,
der eine aseptische Umgebung für
das Kultivieren von Zellen bereitstellt.
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Die
Ausdrücke „Zellkulturmedium", „Kulturmedium" (in jedem Fall ist
der Plural „Medien") und „Mediumformulierung" beziehen sich auf
eine Nährstofflösung für das Kultivieren
von Zellen und können
als Synonyme verwendet werden.
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Der
Begriff „In-Kontakt-Bringen" bezieht sich darauf,
dass in vitro zu kultivierende Zellen in ein Kulturgefäß mit dem
Medium, in dem die Zellen kultiviert werden sollen, gegeben werden.
Der Begriff „In-Kontakt-Bringen" fasst ein, dass
Zellen mit Medium vermischt werden, dass Medium auf Zellen in einem
Kulturgefäß pipettiert
wird und dass Zellen in Kulturmedium eingetaucht werden.
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Der
Begriff „Kombinieren" bezieht sich auf
das Mischen oder Beimischen von Bestandteilen in einer Zellkulturmedium-Formulierung.
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Ein
Zellkulturmedium setzt sich aus einer Anzahl von Bestandteilen zusammen
und diese Bestandteile variieren von einem Kulturmedium zum anderen.
Unter „1X-Formulierung" ist jegliche wässrige Lösung zu
verstehen, die mehrere oder alle Bestandteile, die in Wirkungskonzentrationen
in einem Zellkulturmedium vorhanden sind, enthält. Die „1X-Formulierung" kann beispielsweise
das Zellkulturmedium oder jegliche Untergruppe von Bestandteilen
für dieses
Medium bezeichnen. Die Konzentration eines Bestandteils in einer
1X-Lösung
ist in etwa gleich wie die Konzentration von dem Bestandteil, der
in einer für
den Erhalt oder das in vitro-Kultivieren verwendeten
Zellkultur-Formulierung vorhanden ist. Ein für das in vitro-Kultivieren verwendetes
Zellkulturmedium ist definitionsgemäß eine 1X-Formulierung. Bei Vorhandensein einer
Anzahl von Bestandteilen weist jeder Bestandteil in einer 1X-Formulierung
eine Konzentration auf, die ungefähr der Konzentration der Bestandteile
in einem Zellkulturmedium entspricht. Beispielsweise enthält RPMI-1640
Kulturmedium neben anderen Bestandteilen 0,2 g/L L-Arginin, 0,05
g/L L-Asparagin und 0,02 g/L L-Asparaginsäure. Eine „1X-Formulierung" dieser Aminosäuren enthält in etwa
dieselben Konzentrationen dieser Bestandteile in Lösung. Somit
soll die Bezugnahme auf eine „1X-Formulierung" so verstanden werden,
dass jeder Bestandteil in Lösung
in derselben oder in etwa derselben Konzentration wie in dem beschriebenen
Zellkulturmedium vorhanden ist. Die Konzentrationen von Bestandteilen
in einer „1X-Formulierung" des Zellkulturmediums
sind Fachleuten gut bekannt. Siehe „Methods For Preparation of
Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture" von Allen R. Liss,
N.Y. (1984), durch Bezugnahme hierin in vollem Umfang eingegliedert.
Allerdings können/kann
die Osmolarität
und/oder der pH-Wert in einer 1X-Formulierung im Vergleich zu dem
Kulturmedium unterschiedlich sein, insbesondere wenn in der 1X-Formulierung weniger
Bestandteile vorhanden sind.
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Unter „10X-Formulierung" ist eine Lösung zu
verstehen, in der jeder Bestandteil in dieser Lösung in etwa 10mal so hoch
konzentriert ist wie derselbe Bestandteil in dem Zellkulturmedium.
Beispielsweise enthält die
10X-Formulierung von RPMI-1640 Kulturmedium neben anderen Bestandteilen
2,0 g/L L-Arginin, 0,5 g/L L-Asparagin und 0,2 g/L L-Asparaginsäure (vgl.
1X-Formulierung oben). Eine „10X-Formulierung" kann eine Anzahl
zusätzlicher
Bestandteile in einer etwa 10mal höheren Konzentration als in
dem 1X-Kulturmedium enthalten. Es ist leicht ersichtlich, dass „25X-Formulierung", „50X-Formulierung", „100X-Formulierung", „500X-Formulierung" und „1000X-Formulierung" Lösungen bezeichnen,
die Bestandteile in jeweils etwa 25-, 50-, 100-, 500- oder 1000-facher
Konzentration der Konzentration eines 1X-Zellkulturmediums enthalten. Es wird
noch einmal erwähnt,
dass die Osmolarität
und der pH-Wert der Medium-Formulierung und der konzentrierten Lösung variieren
können.
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Formulierung von Kulturmedien
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Basalmedien
-
Die
Zellkulturmedien der vorliegenden Erfindung basieren auf Wasser
und umfassen für
die Bildung von „Basalmedien" eine Anzahl von
Bestandteilen in einer Lösung
von entionisiertem, destilliertem Wasser. Bestandteile, die die
Basalmedien der vorliegenden Erfindung einschließen können, sind Aminosäuren, Vitamine,
anorganische Salze, Adenin, Ethanolamin, D-Glucose, Heparin, N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES),
Hydrocortison, Insulin, Liponsäure,
Phenolrot, Phosphoethanolamin, Putrescin, Natriumpyruvat, Triiodothyronin
(T3), Thymidin und Transferrin, Alternativ können Insulin und Transferrin
durch Eisenzitrat oder Eisensulfatchelate ersetzt werden. Jeder
dieser Bestandteile ist beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri)
im Handel erhältlich.
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Aminosäure-Bestandteile,
die in den Medien der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein
können, schließen L-Alanin,
L-Arginin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein, L-Glutaminsäure, L-Glutamin,
Glycin, L-Histidin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Lysin, L-Methionin,
L-Phenylalanin, L-Prolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin
und L-Valin ein. Diese Aminosäuren
sind beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel
erhältlich.
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Vitamin-Bestandteile,
die in den Medien der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sein
können, schließen Biotin,
Cholinchlorid, D-Ca2+-Pantothenat, Folsäure, i-Inositol,
Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Thiamin und Vitamin B12 ein. Diese Vitamine sind beispielsweise
von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich.
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Anorganische
Salz-Bestandteile, die in den Medien der vorliegenden Erfindung
eingeschlossen sein können,
schließen
ein Calciumsalz (z.B. CaCl2), CuSO4, FeSO4, KCl, ein
Magnesiumsalz (z.B. MgCl2), ein Mangansalz
(MnCl2), Natriumacetat, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, Na2SO4 und
Ionen der Spurenelemente Selen, Silizium Molybdän, Vanadium, Nickel, Zinn und
Zink ein. Diese Spurenelemente werden in einer Vielfalt an Formen,
bevorzugt in der Form von Salzen wie Na2SeO3, NA2SiO3, (NH4)6Mo7O24, NH4VO3, NiSO4, SnCl2 und ZnSO4 bereit
gestellt. Diese anorganischen Salze und Spurenelemente sind beispielsweise
von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich.
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Tabelle
1 zeigt die spezielle Kombination der obigen Bestandteile, ihre
Konzentrationsbereiche und die bevorzugten Konzentrationen in den
Basalmedien.
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TABELLE
1. KOMPONENTENKONZENTRATIONEN IN TIERISCHEM EPITHELZELLKULTURBASALMEDIUM
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Komplettmedien
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Die
obigen Bestandteile bilden ein „Basalmedium", wenn sie gemeinsam
einer Lösung
beigemischt werden. Diesem Basalmedium werden für das Formulieren der kompletten
Kulturmedien der vorliegenden Erfindung Heparin, Epidermaler Wachstumsfaktor
(EGF), zumindest ein Wirkstoff, der die intrazellulären Niveaus von
zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) erhöht und zumindest ein Fibroblasten
Wachstumsfaktor (FGF) hinzugefügt.
Heparin, EGF, der/die cAMP-erhöhende/n
Wirkstoff/e und FGF/s können
frisch formuliertem Basalmedium hinzugefügt werden oder können wie
in Beispiel 1 im Detail beschrieben in einer Lösung von Dulbecco phosphatgepufferter
Salzlösung
(DPBS) beigemischt und gefriergelagert werden, bevorzugt bei –20°C bis –70°C, ehe sie
für die
Formulierung des kompletten Mediums der vorliegenden Erfindung dem
Basalmedium hinzugefügt
werden. Diese Beimischung von Heparin, EGF, cAMP-erhöhendem/n
Wirkstoff/en und FGF/s kann als Ersatz für BPE oder weitere Organ-/Drüsen-Extrakte
in tierischen Zellkulturmedien verwendet werden. Die Beimischung
kann auch als eine 1X-1000X-Formulierung
hergestellt werden, am meisten bevorzugt als eine 1X, 100X, 500X
oder 1000X-Formulierung, die anschließend sachgemäß in Kulturmedium
aufgelöst
wird, damit wie in Beispiel 1 beschrieben eine 1X-Formulierung in
den kompletten Medien der vorliegenden Erfindung formuliert werden
kann.
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Heparin
ist beispielsweise von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel erhältlich und
wird bevorzugt aus Schweineschleimhaut gewonnen. Heparin wird den
vorliegenden Medien hinzugefügt,
um in erster Linie die Aktivität
der Wachstumsfaktorenkomponenten, insbesondere FGF, zu stabilisieren
(Gospodarowicz, D., and Cheng, J., J. Cell.Plysiol. 128:475–484 (1986);
EP 0 408 146 ). Für das Formulieren
des Mediums der vorliegenden Erfindung wird Heparin dem in Tabelle
1 gezeigten Basalmedium in einer Konzentration von ungefähr 1–5000 USP-Einheiten/Liter,
bevorzugt ungefähr
5–50 USP-Einheiten/Liter und
am meisten bevorzugt ungefähr
10 USP-Einheiten/Liter hinzugefügt.
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EGF
kann natürlich
oder rekombinant sein und kann entweder menschlich sein oder von
einem Nagetier stammen. EGF ist im Handel erhältlich (z.B. von GIBCO/LTI, Gaithersburg,
Maryland) oder kann aus natürlichen
Quellen isoliert oder mit rekombinanten DNA-Techniken (US-Patent
Nr. 4743679) gemäß den Methoden
im Stand der Technik hergestellt werden. Für das Formulieren des Mediums
der vorliegenden Erfindung wird EGF dem in Tabelle 1 gezeigten Basalmedium
in einer Konzentration von 0,00001–10 mg/L, bevorzugt 0,0001–0,1 mg/L
und am meisten bevorzugt 0,0002 mg/L hinzugefügt.
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Eine
Vielfalt an die intrazellulären
cAMP-Niveaus erhöhenden
Wirkstoffen können
für das
Formulieren der Medien der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eingeschlossen sind Wirkstoffe, die eine direkte Erhöhung der
intrazellulären
cAMP-Niveaus herbeiführen (z.B.
Dibutyryl cAMP), Wirkstoffe, die durch eine Wechselwirkung mit einem
zellulären
G-Protein eine Erhöhung
der intrazellulären
cAMP-Niveaus hervorrufen (z.B. Choleratoxin und Forskolin), Wirkstoffe,
die durch ihre Wirkung als Agonist von β-adrenergen Rezeptoren eine
Erhöhung
der intrazellulären
cAMP-Niveaus hervorrufen (z.B. Isoproterenol) und Wirkstoffe, die
durch Hemmen der Aktivitäten
von cAMP-Phosphodiesterasen eine Erhöhung der intrazellulären cAMP-Niveaus
hervorrufen (z.B. Isobutylmethylxanthin (IBMX) und Theophyllin).
Am meisten bevorzugt für
die Formulierung von Medien der vorliegenden Erfindung wird Isoproterenol
verwendet. Diese cAMP-erhöhenden
Wirkstoffe sind z.B. von Sigma (Saint Louis, Missouri) im Handel
erhältlich
und werden in Konzentrationen verwendet, die den bei Green beschriebenen
Konzentrationen in etwa entsprechen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
15:801–811 (1978)).
Beispielsweise wird Choleratoxin dem oben beschriebenen Basalmedium
in einer Konzentration von 0,000005–1 mg/L, bevorzugt 0,0007–0,1 mg/L
und am meisten bevorzugt ungefähr
0,08 mg/L hinzugefügt.
Dibutyryl cAMP wird den Basalmedien in einer Konzentration von 25–750 mg/L,
bevorzugt 45–500
mg/L und am meisten bevorzugt 148 mg/L hinzugefügt. IBMX wird den Basalmedien
in einer Konzentration von 0,2–25
mg/L, bevorzugt 2–10
mg/L und am meisten bevorzugt ungefähr 7 mg/L hinzugefügt. Am meisten
bevorzugt ist Isoproterenol der Wirkstoff, der für das Erhöhen der intrazellulären Niveaus
von cAMP verwendet wird und in die Basalmedien in einer Konzentration
von 0,01–10
mg/L, bevorzugt 0,1–5
mg/L und am meisten bevorzugt ungefähr 0,25 mg/L formuliert ist.
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Der
für das
Formulieren der Medien der vorliegenden Erfindung verwendete FGF
kann ein beliebiges Mitglied der FGF-Familie von Wachstumsfaktoren
sein, einschließlich
FGF-1 (saurer FGF oder aFGF), FGF-2 (basischer FGF oder bFGF), FGF-3
(int-2), FGF-4 (K-FGF), FGF-5 (hst-1), FGF-6 (hst-2) und FGF-7 (Keratinozytenwachstumsfaktor
oder KGF). Bevorzugt sind aFGF, bFGF und KGF, am meisten bevorzugt
ist aFGF. Es können
natürliche
oder rekombinante FGF verwendet werden, die menschlich sein oder
von Rindern, Schweinen oder Nagetieren stammen können. Am meisten bevorzugt
für das
Formulieren der vorliegenden Medien verwendet wird ein rekombinanter
menschlicher aFGF. aFGF, bFGF und KGF sind im Handel erhältlich (z.B.
von GIBCO/LTI, Gaithersburg, Maryland und R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota)
oder können aus
natürlichen
Quellen isoliert oder mit rekombinanten DNA-Techniken (
EP 0 408 146 und US-Patent Nr. 5,395,756
für aFGF;
US-Patent Nr. 5,189,148 für
bFGF; WO 90/08771 und WO 95/01434 für KGF) gemäß den Methodologien im Stand
der Technik hergestellt werden. Für das Formulieren des Mediums
der vorliegenden Erfindung wird FGF dem in Tabelle 1 gezeigten Basalmedium
in einer Konzentration von 0,0001–10 mg/L, bevorzugt 0,001–0,1 mg/L
und am meisten bevorzugt ungefähr
0,005 mg/L hinzugefügt.
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Das
Basalmedium, Heparin, EGF, cAMP-erhöhender/erhöhende Wirkstoff/e und FGF/s
formulieren zusammen Komplettkulturmedien gemäß der vorliegenden Erfindung.
Wie oben im Detail beschrieben, sind diese kompletten Medien für die Verwendung
für das
Kultivieren einer Vielfalt an tierischen Epithelzellen geeignet.
Es kann allerdings bevorzugt werden, den Nährstoffinhalt der kompletten
Medien weiter anzureichern, um schnelleres Wachstum und verbesserte
Produktion von Biologika durch die kultivierten Zellen zu unterstützen und
ein geeigneteres Umfeld für
das Kultivieren von schwer kultivierbaren tierischen Epithelzellen
bereitzustellen. Um eine solche Anreicherung zu vervollständigen,
kann den kompletten Medien Ascorbinsäure hinzugefügt werden.
Ascorbinsäure
ist in mehreren Formen im Handel erhältlich. Bevorzugt für die Verwendung für das Formulieren
der vorliegenden Medien ist L-Ascorbinsäurephosphat, Magnesiumsalz,
erhältlich
von Wako Pure Chemical Industries, das den Medien in einer Konzentration
von 0,001–10
mg/L, bevorzugt 0,01–5 mg/L
und am meisten bevorzugt ungefähr
0,1 mg/L hinzugefügt
wird.
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Die
Mediumbestandteile können
in einem flüssigen
Trägermittel
aufgelöst
oder in trockener Form erhalten werden. Sind sie in einem flüssigen Trägermittel
bei in Tabelle 1 gezeigten bevorzugten Konzentrationen aufgelöst (z.B.
eine „"1X-Formulierung"), sollte der pH-Wert
des Mediums bei 7,0–7,6,
bevorzugt 7,1–7,5
und am meisten bevorzugt 7,2–7,4
eingestellt werden. Die Osmolarität des Mediums sollte ebenfalls
bei 275–350 mOsm,
bevorzugt 285–325
mOsm und am meisten bevorzugt 280–310 mOsm eingestellt werden.
Die Art des flüssigen
Trägermittels
und das zur Auflösung
der Bestandteile in der Lösung
verwendete Verfahren variieren und können von einem Durchschnittsfachmann,
der lediglich über übliche Erfahrung
verfügt,
bestimmt werden. Üblicherweise
können
die Mediumbestandteile in jeder beliebigen Reihenfolge hinzugefügt werden.
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Bevorzugt
sind die Lösungen,
die Bestandteile umfassen, höher
konzentriert als die Konzentration derselben Bestandteile in einer
1X-Mediumformulierung. Die Bestandteile können 10-fach konzentrierter (10X-Formulierung),
25-fach konzentrierter (25X-Formulierung), 50-fach konzentrierter
(50X-Formulierung) oder 100-fach konzentrierter (100X-Formulierung)
sein. Es können
höher konzentrierte
Formulierungen gebildet werden, vorausgesetzt, die Bestandteile
bleiben löslich
und stabil. Siehe US-Patent Nr. 5,474,931, das auf Verfahren für das Lösen von
Kulturmedienkomponenten bei hohen Konzentrationen gerichtet ist.
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Wenn
die Medienbestandteile als gesondert konzentrierte Lösungen hergestellt
werden, wird für
die Herstellung einer 1X-Formulierung eine angemessene (ausreichende)
Menge jedes Konzentrates mit einem Verdünnungsmittel kombiniert. Normalerweise
ist das verwendete Verdünnungsmittel
Wasser, doch können gemäß der Erfindung
andere Lösungen
einschließlich
wässriger
Puffer, wässriger
Salzlösung
oder weiterer wässriger
Lösungen
verwendet werden.
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Üblicherweise
werden die Kulturmedien der vorliegenden Erfindung sterilisiert,
um ungewollte Kontaminierung zu verhindern. Für die Herstellung von sterilem
Kulturmedium kann die Sterilisierung beispielsweise durch Filtrieren
durch einen proteinbindungsarmen Membranfilter mit 0,1–1,0 μm Porengröße (im Handel
beispielsweise von Millipore, Bedford, Massachusetts erhältlich)
nach Beimischen von konzentrierten Bestandteilen vervollständigt werden.
Alternativ können
konzentrierte Bestandteil-Untergruppen filtersterilisiert und als sterile
Lösungen
gelagert werden. Diese sterilen Konzentrate können dann unter aseptischen
Bedingungen mit einem sterilen Verdünnungsmittel vermischt werden,
um eine konzentrierte sterile 1X-Mediumformulierung herzustellen.
Autoklavieren oder weitere Hochtemperatur-Sterilisierungsverfahren
sind nicht bevorzugt, da mehrere der Bestandteile der vorliegenden
Kulturmedien hitzelabil sind und bei Temperaturen wie jenen, die bei
den meisten Hitzesterilisierungsverfahren erzielt werden, irreversibel
abgebaut werden.
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Tabelle
1 listet die optimalen Konzentrationsbereiche für Basalmediumbestandteile auf.
Diese Bestandteile können
für die
Bildung von tierischen Zellenkulturbasalmedium kombiniert werden,
das anschließend
für die
Formulierung der kompletten Medien der vorliegenden Erfindung wie
oben beschrieben mit Heparin, EGF, zumindest einem Wirkstoff, der
die intrazellulären
cAMP-Niveaus erhöht,
zumindest einem FGF und optional mit Ascorbinsäure ergänzt wird. Wie dem Durchschnittsfachmann
leicht ersichtlich ist, kann die Konzentration eines bestimmten
Bestandteiles außerhalb
des offenbarten Bereiches erhöht
oder reduziert werden und die Wirkung der erhöhten oder reduzierten Konzentration
kann durch Verwendung von üblichen Experimenten
bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Konzentrationen
der Bestandteile des Mediums der vorliegenden Erfindung die in der äußeren rechten
Spalte in Tabelle 1 aufgelisteten Konzentrationen, die wie oben
beschrieben mit Heparin, EGF, aFGF, Isoproterenol und Ascorbinsäure ergänzt werden.
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Es
ist dem Durchschnittsfachmann leicht ersichtlich, dass jede dieser
Komponenten des Kulturmediums mit einer oder mehreren anderen Komponenten
in der Lösung
reagieren kann. Somit steckt die vorliegende Erfindung sowohl die
in Tabelle 1 offenbarten, wie oben beschrieben ergänzten Formulierungen
als auch jegliche Reaktionmischung, die nach dem Kombinieren dieser
Bestandteile gebildet wird, ab.
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Die
Optimierung der vorliegenden Medienformulierungen wurde unter Verwendung
von Methoden, die von Ham (Ham, R.G., Methods for Preparation of
Media, Supplements and Substrata for Serum-Free Animal Culture,
Alan R. Liss, Inc., New York, Seite 3–21 (1984)) und Waymouth (Waymouth,
C., Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrata
for Serum-Free Animal Culture, Alan R. Liss, Inc., New York, Seiten
23–68
(1984)) beschrieben wurden, ausgeführt. Die optimalen endgültigen Konzentrationen
für Mediumbestandteile
werden üblicherweise
entweder durch empirische Studien, in Titrationsstudien von Einzelkomponenten,
oder durch Interpretation von historischer und aktueller wissenschaftlicher
Literatur identifiziert. In Titrationsstudien von Einzelkomponenten
unter Verwendung von tierischen Zellen ist die Konzentration einer
einzelnen Mediumkomponente unterschiedlich, während alle weiteren Elemente
und Variablen konstant gehalten werden und die Wirkung der Einzelkomponente
auf Viabilität,
Wachstum oder kontinuierlicher Gesundheit der tierischen Zellen
gemessen wird.
-
Verwendung von Kulturmedien
-
Zellen,
die in dem Medium der vorliegenden Erfindung wachsen können, sind
tierischen Ursprungs, einschließlich,
aber nicht darauf beschränkt,
Zellen, die von Säugetieren
gewonnen werden. Säugetierzellen, die
insbesondere für
das Kultivieren in den vorliegenden Medien geeignet sind, schließen Zellen
menschlichen Ursprungs ein, die aus einer Gewebeprobe gewonnene
Primärzellen
wie Keratinozyten, zervikale Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen
oder tracheale Epithelzellen oder transformierte Zellen oder etablierte
Zelllinien (z.B. das menschliche Keratinozyt HCAT oder zervikale
Epithelzelllinien HeLa) sein können.
Diese Zellen können
normale Zellen sein oder optional erkrankte oder genetisch veränderte Zellen.
Weitere Säugetierzellen
wie CHO-Zellen, COS-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen (einschließlich BHK-21-Zellen)
und Derivate derselben sind ebenfalls für das Kultivieren in den vorliegenden
Medien geeignet. Insbesondere bevorzugt sind primäre oder
sekundäre
menschliche Keratinozyten, die aus einer Probe von normaler oder
anormaler menschlicher Haut gewonnen werden. Epithelgewebe, Organe
und Organsysteme, die von Tieren gewonnen oder unter Verwendung
von im Stand der Technik üblichen
Verfahren in vitro oder in vivo gebildet werden, können gleichermaßen in den
Kulturmedien der vorliegenden Erfindung kultiviert werden.
-
Isolierung von Zellen
-
Tierische
Zellen für
das Kultivieren durch die vorliegende Erfindung sind im Handel beispielsweise
von ATCC (Rockville, Maryland), Cell Systems, Inc. (Kirkland, Washington),
Clonetics Corporation (San Diego, California), BioWhittaker (Walkersville,
Maryland) oder Cascade Biologicals (Portland, Oregon) erhältlich.
Alternativ können
Zellen direkt von Proben von Tiergewebe, das mittels Biopsie, Autopsie,
Organspende oder anderer chirurgischer oder medizinischer Vorgänge erhalten
wurde, isoliert werden.
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Das
Gewebe sollte unter Verwendung von standardmäßigen sterilen Techniken und
einer Sicherheitswerkbank verarbeitet werden. Bei der Verwendung
und Verarbeitung jedes menschlichen Gewebes sollten die Empfehlungen
des U.S. Department of Health and Human Services (US-Ministerium
für Gesundheit
und Sozialdienste)/Centers for Disease Control and Prevention (Zentren
für Krankheitsbekämpfung und
-verhütung) (Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories, Richmond, J.Y. et
al., Eds., U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 3rd
Edition (1993)) befolgt werden. Das Gewebe sollte unter Verwendung
steriler chirurgischer Instrumente in kleine Teile (z.B. 0,5 × 0,5 cm)
geschnitten werden. Die kleinen Teile sollen zweimal in steriler
Salzlösung,
die wie oben mit Antibiotika ergänzt
wird, gewaschen werden und können
dann optional mit einer enzymatischen Lösung (z.B. Collagenase oder
Trypsinlösungen,
jeweils im Handel erhältlich, beispielsweise
von GIBCO/LTI, Gaithersburg, Maryland) verarbeitet werden, um die
Dissoziation von Zellen aus der Gewebematrix zu fördern.
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Die
Mischung von dissoziierten Zellen und Matrixmolekülen wird
zweimal mit einer geeigneten physiologischen Salzlösung oder
Gewebekulturmedium gewaschen (z.B. Dulbecco phosphatgepufferte Salzlösung ohne
Kalzium und Magnesium). Zwischen den Waschvorgängen werden die Zellen zentrifugiert
(z.B. bei 200 × g)
und dann wieder in serumfreien Gewebekulturmedium suspendiert. Aliquoten
werden unter Verwendung eines elektronischen Zellenzählers (wie
ein Coulter-Zähler)
gezählt.
Alternativ können
die Zellen manuell unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt werden.
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Ausplattieren von Zellen
-
Die
isolierten Zellen können
gemäß den experimentellen,
vom Forscher festgelegten Bedingungen ausplattiert werden. Die nachfolgenden
Beispiele veranschaulichen zumindest einen funktionelle Reihe Kulturbedingungen,
die für
das Kultivieren von bestimmten Säugetierzellen
zweckmäßig sind.
Allerdings kann ein Durchschnittsfachmann unter Verwendung üblicher
Experimente die optimalen Ausplattierungs- und Kulturbedingungen
für eine
vorgegebene tierische Zellenart festlegen. Bei üblichen Kulturbedingungen und
unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können Zellen auf der Oberfläche von
Kulturgefäßen ohne
Anhaftungsfaktoren ausplattiert werden. Alternativ können die
Gefäße mit natürlichen,
rekombinanten oder synthetischen Anhaftungsfaktoren oder Peptidfragmenten
vorbeschichtet werden (z.B. Collagen oder Fibronektin oder natürliche oder
synthetische Fragmente derselben). Isolierte Zellen können auch
in oder auf ein natürliches
oder synthetisches dreidimensionales Trägergerüst wie einem vorgeformten Collagengel
oder einem synthetischen biopolymeren Stoff ausgesät werden.
Die Verwendung von Anhaftungsfaktoren oder einem Trägergerüst mit dem
Medium der vorliegenden Erfindung wird das Kultivieren von einigen
bindungsabhängigen
Zellen in Abwesenheit von der Serumergänzung verbessern.
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Die
Aussaatzelldichten bei jeder Experimentalbedingung können für die speziellen
zu verwendenden Kulturbedingungen optimiert werden. Für das übliche Kultivieren
in Plastikkulturgefäßen ist
eine erste Aussaatdichte von 1–5 × 106 Zellen pro cm2 bevorzugt.
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Säugetierzellen
werden bei etwa 37°C
in einem Zellinkubator kultiviert. Die Inkubatoratmosphäre sollte feucht
sein und 3–10
% Kohlendioxid in der Luft enthalten, obwohl das Kultivieren bestimmter
Zelllinien für
optimale Ergebnisse 20 Kohlendioxid in der Luft erfordert. Der pH-Wert
des Kulturmediums sollte im Bereich von 7,1–7,6, bevorzugt 7,1–7,4 und
am meisten bevorzugt 7,1–7,3
liegen.
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Zellen
in geschlossener Kultur oder Batch-Kultur sollten alle 1–2 Tage
oder mehr oder weniger so häufig,
wie für
die spezielle Zellenart erforderlich, einen kompletten Mediumaustausch
durchlaufen (z.B. Ersetzen der verbrauchten Medien durch frische
Medien). Zellen in Perfusionskulturen (z.B. in Bioreaktoren oder
Fermentern) erhalten auf einer kontinuierlich umlaufenden Basis
frische Medien.
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Zellkulturzusammensetzungen
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Die
Zellkulturmedien der vorliegenden Erfindung können auch für die Herstellung von Zellkulturzusammensetzungen,
die die vorliegenden Medien und eine tierische Epithelzelle umfassen,
verwendet werden. Tierische Epithelzellen, die für das Formulieren der Zellkulturzusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Zellen tierischen
Ursprungs, einschließlich,
aber nicht darauf beschränkt,
Zellen, die aus Säugetieren
gewonnen werden. Insbesondere Säugetierzellen,
die für
das Kultivieren der vorliegenden Zellkulturzusammensetzungen geeignet
sind, schließen
Epithelzellen menschlichen Ursprungs ein, die primäre, aus
einer Gewebeprobe gewonnene Zellen wie Keratinozyten, zervikale
Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen oder tracheale Epithelzellen
oder transformierte Zellen oder etablierte Zelllinien (z.B. das menschliche
Keratinozyt HCAT oder zervikale Epithelzelllinien HeLa) oder Derivate
derselben sein können. Diese
Zellen können
normale Zellen sein oder optional erkrankte oder genetisch veränderte Zellen.
Weitere Säugetierzellen
wie CHO-Zellen,
COS-Zellen, VERO-Zellen, BHK-Zellen (einschließlich BHK-21-Zellen) und Derivate
derselben sind ebenfalls für
das Formulieren der vorliegenden Zellkulturzusammensetzungen geeignet.
Insbesondere bevorzugt sind primäre
oder sekundäre
menschliche Keratinozyten, die aus einer Probe von normaler oder
anormaler menschlicher Haut gewonnen werden. Epithelgewebe, Organe
und Organsysteme, die aus Tieren gewonnen oder in vitro oder in
vivo mit Hilfe von Verfahren, die im Stand der Technik üblich sind, gebildet
werden, können
gleichermaßen
für das
Formulieren von Zellkulturzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Diese Zellkulturzusammensetzungen können in
einer Vielfalt an medizinischen (einschließlich diagnostischen und therapeutischen),
industriellen, forensischen und forschungstechnischen Anwendungen
verwendet werden, die gebrauchsfertige Kulturen tierischer Epithelzellen
in serumfreien Medien erfordern.
-
Nachdem
hierin die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wurde, wird
dieselbe unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verständlicher,
die lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung eingeschlossen sind
und die Erfindung nicht einschränken
sollen.
-
Beispiele
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Materialien und Methoden
-
In
jedem der folgenden Beispiele werden allgemein die folgenden Materialien
und Methoden verwendet.
-
Isolieren und Kultivieren
menschlicher Keratinozyten
-
Falls
nicht anders angegeben stammen alle Medien und Reagenzien von GIBCO/LTI
(Gaithersburg, Maryland). Humane neonatale Präputia wurden in serumfreies
5 μg/ml
Gentamicin enthaltendes Medium (SFM) ohne Wachstumsfaktoren gegeben
und bei 4°C
gelagert. Präputia
können
auf diese Art und Weise für ungefähr fünf Tage
ohne wesentlichen Verlust der Zellviabilität gelagert werden. Die Präputia wurden
kurz in 70%igem Isopropanol gespült
und dann für
60 Minuten in 20 μg/ml
Gentamicin enthaltende Dulbecco phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS)
ohne Ca2+ und MG2+ gegeben.
Die Präputia
wurden dann abhängig
von der Gewebegröße in Hälften oder
Viertel geschnitten und die Teile wurden mit der Hautseite nach
unten in eine 25 Einheiten/ml Dispase enthaltende Petrischale übertragen
und bei 40°C
18–24
Stunden inkubiert. Mit Pinzetten wurden die epidermalen Schichten
von den darunterliegenden Hautschichten abgetrennt, in 60 mm Kulturscheiben,
die 5–7
ml 0,05%iges Trypsin/0,53 mM EDTA enthalten, vereinigt und bei 37°C für 15–20 Minuten durch
leichtes Pipettieren für
das Unterstützen
der Gewebedissoziation inkubiert. Das Vereinigen der Gewebeproben
wird vorgenommen, um die Wirkung der Donor-zu-Donor Wachstumsvariation
zu reduzieren. Trypsin wurde durch Hinzufügen von Sojabohnentrypsininhibitor
(10 mg/ml in DPBS) vervollständigt.
Jegliche verbleibenden Teile der epidermalen Schichten wurden sorgfältig entfernt
und verworfen. Die Zellsuspension wurde in ein steriles Zentrifugenglas übertragen
und die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 40 × g über 5 Minuten
bei 22°C pelletiert
und einmal mit SFM gewaschen. Der Überstand wurde verworfen, der
Zellpellet in einem geeigneten Medium resuspendiert und die Zelldichten
wurden unter Verwendung eines Hämozytometers
bestimmt. Die Zellen wurden in Kulturkolben oder -schalen ausplattiert.
-
Sekundärkulturen
wurden durch Entfernen des verbrauchten Mediums, kurzem Waschen
der Zelleinzelschicht mit Versen (Verdünnung 1:5000) und Hinzufügen eines
geeigneten Volumens von 0,05%igem Trypsin/0,53 mM EDTA etabliert.
Die Zellen wurden bei 37°C
inkubiert, bis sie eine runde Form annahmen (ungefähr 5 Minuten),
Trypsin wurde entfernt und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert,
bis sie sich durch leichtes Abklopfen von der Kulturoberfläche lösten (ungefähr 5 Minuten).
Trypsin wurde durch das Hinzufügen
von 10 mg/ml Sojabohnentrypsininhibitorlösung inaktiviert, die Zellen
wurden durch Zentrifugieren bei 40 × g über 5 Minuten bei 22°C pelletiert,
einmal mit SFM gewaschen und in einem geeigneten Medium resuspendiert.
Sekundäre
Zellkulturen wurden auch aus primären Keratinozyten von Cell
Systems Corporation (Kirkland, Washington) etabliert, wobei die
Ergebnisse mit jenen, die bei aus neonatalem Präputium etablierten Kulturen
erzielt wurden, vergleichbar waren.
-
Die
Trypsinisationszeiten sind für
die Leistung eines beliebigen Keratinozyten-Mediums ausschlaggebend. Menschliche
Keratinozyten, die zu lange in Trypsin verbleiben, weisen geringere
Ausplattierungswirkung auf und können
zur Differenzierung angeregt werden.
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Die
Kulturen wurden bei 37°C
in einer feuchten Atmosphäre,
die zu 5% aus CO2 und zu 95% aus Luft besteht,
inkubiert. Bei einem Teilungsverhältnis von 1:2 bis 1:3 wurden
Stammkulturen erhalten und bei 70 bis 80% Konfluenz subkultiviert.
Für die
experimentelle Untersuchung wurden Keratinozyten bei den Durchlässen 0 bis
4 verwendet.
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Morphologie- und Wachstums-Assays
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In
einem Glaskulturobjektträger
mit 8 Kammern wurden morphologische Analysen und Immunfärbung von
Zellen vorgenommen. Keratinozyten wurden bei 2 × 104 Zellen/cm2 in einem Gesamtvolumen von 400 μl/0,8 cm2 Kammer ausplattiert. Die Zellen wurden
für 24
Stunden inkubiert, danach mit 3,7%igem Formaldehyd fixiert, mit
0,5%igem TRITON X-100 in DPBS durchlässig gemacht und konnten mit
Hase-anti-Cytokeratin-14-Antikörpern
(Verdünnung
1:200) reagieren. Die mit Antikörpern
markierten Zellen wurden durch Verwendung von FITC F(ab')2-konjugierten Ziege-anti-Hase
(Verdünnung
1:50) sichtbar gemacht.
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Assays
bezüglich
des Wachstums menschlicher Keratinozyten wurden in 24-Well Kulturschalen
(2 cm2 Wachstumgebiet) unter Verwendung
einer Saatdichte von 1 × 104 Zellen/cm2 vorgenommen.
6 Tage nach dem Aussäen
von Primärzellen
und 72 Stunden nach dem Aussäen
von Sekundärzellen
wurden Endpunkt-Wachstums-Assays
ausgewertet. Über
96 Stunden hinweg wurden ohne Medienaustausch wachstumskinetische
Assays in 24-Stunden-Intervallen gezählt. Einzelzellklonierungs-Assays
wurden in gewebskulturbehandelten 96-Well-Platten durch Reihenverdünnung von
Zellsuspensionen auf 5 Zellen/ml in dem geeigneten Medium und einer
Ausplattierung von 100 μl/Well
durchgeführt.
Vor der Beobachtung wurden die Platten 5 Tage inkubiert. In Vergleichs-Assays
wurden die Medien der vorliegenden Erfindung auf ihre wachstumsfördernden
Fähigkeiten
bezüglich
einem definierten menschlichen Keratinozyten-Medium, das von Zulieferer
A stammt, und einer BPE enthaltenden Formulierung (Keratinozyten-SFM;
GIBCO/LTI, Gaithersburg, Maryland) hin untersucht.
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Beispiel 1
-
Formulierung von Komplettmedium
-
Formulierung
von Zellkulturbasalmedium. Destilliertes, entionisiertes Wasser
(nachfolgend „ddH2O") wurde
auf 80% des gewünschten
Gesamtvolumens abgemessen. Unter vorsichtigem Rühren mit einem Magnetrührer wurde
folgendes hinzugefügt:
L-Alanin (9,00 mg/L), L-Arginin·HCl (421,40 mg/L), L-Asparagin·HCl (12,20
mg/L), L-Asparginsäure
(4,00 mg/L), L-Cystein·HCl·H2O (42,00 mg/L), L-Glutaminsäure (14,80
mg/L), L-Glutamin (1020,00 mg/L), Glycin (7,60 mg/L), L-Histidin·HCl·H2O (50,40 mg/L), L-Isoleucin (6,00 mg/L), L-Leucin
(131,20 mg/L), Lysin·HCl
(54,90 mg/L), L-Methionin (13,50 mg/L), L-Phenylalanin (10,03 mg/L), L-Prolin
(34,60mg/L), L-Serin (126,20 mg/L), L-Threonin (23,80 mg/L), L-Tryptophan
(9,30 mg/L), L-Tyrosin-Dinatriumsalz (11,68 mg/L), L-Valin (70,20
mg/L), Biotin (0,02 mg/L), D-Ca2+-Pantothenat
(0,30 mg/L), Cholinchlorid (14,00 mg/L), Folsäure (0,8 mg/L), i-Inositol
(18,00 mg/L), Niacinamid (0,04 mg/L), Pyridoxin·HCl (0,06 mg/L), Riboflavin
(0,04 mg/L), Thiamin·HCl
(0,30 mg/L), Vitamin B12 (0,50 mg/L), Putrescin·2HCl (0,20
mg/L), D-Glucose (1500,0 mg/L), KCl (112,0 mg/L), NaCl (6790,0 mg/L),
Thymidin (0,73 mg/L), Adenin (24,00 mg/L), HEPES (3336,20 mg/L),
Liponsäure
(0,20 mg/L), Phenolrot (1,20 mg/L), Natriumpyruvat (55,0 g), Natriumacetat
(301,00 mg/L), Na2HPO4 (284,00
mg/L), Na2SO4 (3,39
mg/L), humanes Insulin (5,00 mg/L) und humanes Transferrin (11,11
mg/L).
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Eine
Stammlösung
von Ethanolamin·HCl
wurde in ddH2O bei 976,00 mg/L/L hergestellt
und 0,615 ml/L dieses Stammes wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine
endgültige
Konzentration von 0,60 mg/L an Ethanolamin·HCl zu erhalten.
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Eine
Stammlösung
von Phophoethanolamin wurde in ddH2O bei
1408,00 mg/L/L hergestellt und 0,1001 ml/L dieses Stammes wurden
der Mediumlösung
hinzugefügt,
um eine endgültige
Konzentration von 0,141 mg/L an Phosphoethanolamin zu erhalten.
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Eine
Stammlösung
von FeSO4·7H2O
(41,70 mg/L), MgCl2·6H2O
(18890 mg/L) und CaCl2·2H2O
(1344 mg/L) wurde in 0,5 ml/L konzentrierten HCl enthaltendem Wasser
hergestellt und 9,660 ml dieser Stammlösung wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um endgültige Konzentrationen
von 0,403 mg/L an FeSO4·7H2O, von
182,48 mg/L an MgCl2·6H2O
und von 12,98 mg/L an CaCl2·2H2O zu erhalten.
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Eine
Stammlösung
von ZnSO4·7H2O
(137,68 mg/L) wurde in Wasser hergestellt und 0,9660 ml dieser Lösung wurden
der Mediumlösung
hinzugefügt,
um eine endgültige
Konzentration von 0,133 mg/L an ZnSO4·7H2O zu erhalten.
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Eine
Stammlösung,
die Na2SeO3 (0,513
mg/L), (NH4)6Mo7O24·4H2O (0,124 mg/L), NaSiO3·9H2O (14,2 mg/L), NiSO4·6H2O (0,013 mg/L), MnCl2·4H2O (0,002 mg/L), SnCl2·2H2O (0,011 mg/L) und NH4VO3 (0,059 mg/L) enthielt, wurde in Wasser
mit 0,5 ml/L konzentriertem HCl hergestellt und 9,660 ml dieser
Stammlösung wurden
der Mediumlösung
hinzugefügt,
um endgültige
Konzentrationen von 0,00496 mg/L an Na2SeO3, 0,00120 mg/L (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,137 mg/L NaSiO3·9H2O, 0,00013 mg/L NiSO4·6H2O, 0,00002 mg/L MnCl2·4H2O, 0,00011 mg/L SnCl2·2H2O und 0,00057 mg/L NH4VO3 zu erhalten.
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Eine
Stammlösung
von Hydrocortison wurde mit 370 mg/L in 95%igem Ethanol hergestellt
und 0,2 ml dieses Stammes wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine
endgültige
Konzentration von 0,074 mg/L an Hydrocortison zu erhalten.
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Eine
Stammlösung
von Triiodothyronin-Lösung
(T3) wurde bei 67,00 mg/L in 70%igem Ethanol hergestellt und 0,1
ml dieses Stammes wurden der Mediumlösung hinzugefügt, um eine
endgültige
Konzentration von 0,0067 mg/L an T3 zu erhalten.
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NaHCO3 (1160 mg/L) wurde der Mediumlösung hinzugefügt und der
pH-Wert der Lösung
wurde anschließend
mit HCl auf 7,2 ± 0,05
eingestellt und das Volumen wurde mit ddH2O
an das gewünschte
Gesamtvolumen angepasst. Die Osmolarität wurde bei 290 ± 15 mOsm
festgelegt.
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Diese
Basalmediumformulierung wurde anschließend durch einen proteinbindungsarmen
Filter gefiltert, in Flaschen gefüllt und bei gedämpften Lichtbedingungen
bei 4°C
bis zur Verwendung gelagert.
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Formulierung
der Wachstumsergänzung.
Unter vorsichtigem Rühren
wurde einer Dulbecco phosphatgepufferten Salzlösung (DPBS) folgendes hinzugefügt: Ascorbinsäurephosphat,
Magnesiumsalz (50 mg/L), aFGF (2,5 mg/L), Heparin (5000 Einheiten/L)
und EGF (0,1 mg/L).
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Eine
Stammlösung
von Isoproterenol (100.000 mg/L) wurde in 50 mg/L Ascorbinsäure enthaltender DPBS
hergestellt und 1,25 ml/L dieser Lösung wurden der obigen hinzugefügt, um eine
500X-Formulierung der Wachstumsergänzung zu bilden.
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Diese
500X-Lösung
wurde anschließend
durch einen proteinbindungsarmen Filter gefiltert und dem Basalmedium
hinzugefügt
oder gleich aufgeteilt und bei –20
bis –80°C bis zur
Verwendung in Epithelzellkulturmedium als Ersatz für ein Organ-
oder Drüsenextrakt
wie BPE gelagert.
-
Herstellung
des Komplettmediums. 1 ml der Wachstumsergänzung wurde 500 ml des Basalmediums hinzugefügt und das
Komplettmedium wurde umgehend verwendet oder bis zur Verwendung
bei 4°C
unter gedämpften
Lichtbedingungen gelagert.
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Beispiel 2
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Wirkung von aFGF
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Um
die Zweckmäßigkeit
des Basalmediums bei der Unterstützung
des Wachstums menschlicher Keratinozyten zu untersuchen und die
Wirkung von FGF zu bestimmen, wurden primäre menschliche Keratinozyten
wie oben beschrieben isoliert und in dem Basalmedium aus Beispiel
1, das mit 10 USP-Einheiten/L Heparin und 0,0002 mg/L EGF ergänzt wurde,
oder in dem Basalmedium, das 10 USP-Einheiten/L Heparin, 0,0002 mg/L EGF
und 0,005 mg/L aFGF enthielt, kultiviert. Tabelle 2 zeigt repräsentative
Ergebnisse von fünf einzelnen
Experimenten, wobei das Wachstum in dem Basalmedium mit und ohne
aFGF mit dem Wachstum in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM
(„Kontrolle") verglichen wird.
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TABELLE
2. WIRKUNG VON aFGF (ZELLEN/ML × 10
5).
-
Diese
Ergebnisse zeigen an, dass das Basalmedium das Wachstum primärer Keratinozyten
unterstützt,
obgleich für
gewöhnlich
in einem geringeren Umfang als das BPE enthaltende Kontrollmedium.
Weiterhin zeigen die Ergebnisse an, dass das Hinzufügen von
aFGF zu dem Basalmedium seine Fähigkeit,
das Wachstum von Keratinozyten zu fördern, verbessert.
-
Beispiel 3
-
Wirkung von Isoproterenol
-
Um
festzustellen, ob die Leistung von dem definierten Kulturmedium
durch Einschluss eines die intrazellulären cAMP-Niveaus erhöhenden Wirkstoffes
weiter verbessert werden könnte,
wurde das Heparin, EGF und aFGF enthaltende Basalmedium aus Beispiel
2 mit und ohne Hinzufügen
von 0,25 mg/L Isoproterenol untersucht. Primäre menschliche Keratinozyten
wurden isoliert und wie in Beispiel 2 beschrieben kultiviert. Tabelle
3 zeigt repräsentative
Ergebnisse von fünf
einzelnen Experimenten, wobei das Wachstum in dem Medium mit und
ohne Isoproterenol mit dem Wachstum in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM
("Kontrolle") verglichen wird.
-
TABELLE
3. WIRKUNG VON ISOPROTERENOL (ZELLEN/ML × 10
5).
-
Diese
Ergebnisse veranschaulichen, dass das Hinzufügen von Isoproterenol zu einem
aFGF enthaltenden Basalmedium der vorliegenden Erfindung seine Fähigkeit,
das Keratinozyten-Wachstum zu fördern, weiter
verbessert. Tatsächlich
hat das aFGF und Isoproterenol enthaltende Medium das Wachstum primärer menschlicher
Keratinozyten stärker
gefördert
als die BPE enthaltende Kontrolle. Somit zeigen diese Ergebnisse
an, dass ein definiertes Medium, das das Basalmedium, Heparin, EGF,
aFGF und Isoproterenol umfasst, eine optimale Formulierung für ein vollständig definiertes
BPE-freies SFM ist, das die Kultivierung unterstützt und das Wachstum menschlicher
Keratinozyten fördert.
Zusätzlich
verdeutlichen diese Ergebnisse, dass eine Zusammensetzung, die Heparin,
EGF, FGF und einen cAMP-aktivierenden Wirkstoff wie Isoproterenol
umfasst, als Ersatz für
ein Organ- oder Drüsenextrakt
wie BPE in SFM für
die Kultur von Epithelzellen wie Keratinozyten verwendet werden
kann.
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Beispiel 4
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Wirkung von Ascorbinsäure
-
Da
einige für
das Keratinozyten-Kulturen verwendete Basalmedien Ascorbinsäure enthalten
(Gilchrest, B.A., et al., J. Cell. Physiol. 120:377–383 (1984)),
wurde die Wirkung bei Hinzufügen
von 50,0 mg/L zu dem EGF/aFGF/Isoptoterenol enthaltenden Medium
aus Beispiel 3 untersucht. Primäre
menschliche Keratinozyten wurden isoliert und wie in Beispiel 2
beschrieben kultiviert. Tabelle 4 zeigt repräsentative Ergebnisse von vier
einzelnen Experimenten, wobei das Wachstum in dem Medium mit und
ohne Ascorbinsäure
mit dem Wachstum in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Kontrolle") verglichen wird.
-
TABELLE
4. WIRKUNG VON ASCORBINSÄURE
(ZELLEN/ML × 10
5).
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Diese
Ergebnisse veranschaulichen, dass das Hinzufügen von Ascorbinsäure zu einem
aFGF/Isoproterenol enthaltenden Medium der vorliegenden Erfindung
seine Fähigkeit,
das Keratinozyten-Wachstum zu fördern,
weiter verbessert. Die Wirkung von Ascorbinsäure allerdings war nicht so
drastisch wie die bei Hinzufügen
entweder von aFGF (Beispiel 2) oder von Isoproterenol (Beispiel
3) beobachtete Wirkung; das Ascorbinsäure enthaltende definierte
Medium wirkte nur geringfügig
besser als das Medium ohne Ascorbinsäure, wodurch vorgeschlagen
wurde, dass der Einschluss von Ascorbinsäure in das definierte Medium
der vorliegenden Erfindung optional sein kann. Allerdings übertrafen
beide definierten Medien deutlich das Kontrollmedium und bestätigten die
in Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse. Gemeinsam zeigen die Ergebnisse
der Beispiele 2–4 an,
dass ein definiertes Medium, das das Basalmedium, Heparin, EGF,
aFGF und Isoproterenol umfasst und optional Ascorbinsäure einschließt, eine
optimale Formulierung für
ein vollständig
definiertes BPE-freies SFM ist, das die Kultivierung unterstützt und
das Wachstum menschlicher Keratinozyten fördert. Zusätzlich veranschaulichen diese
Ergebnisse, dass eine Lösung,
die Heparin, EGF, FGF, einen cAMP-erhöhenden Wirkstoff wie Isoproterenol
und Ascorbinsäure
umfasst, als Ersatz für
ein Organ- oder Drüsenextrakt
wie BPE in SFM für
die Kultur von Epithelzellen wie Keratinozyten verwendet werden
kann.
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Beispiel 5
-
Wachstum primärer menschlicher
Keratinozyten in definiertem SFM
-
Primäre menschliche
Keratinozyten wurden wie oben beschrieben isoliert und entweder
in dem definierten SFM der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel
4, das EGF, aFGF, Isoproterenol und Ascorbinsäure enthält („Definiertes Keratinozyten-SFM"), oder in einem
BPE enthaltenden Keratinozytn-SFM („Keratinozyten-SFM") kultiviert. Nach
mehreren Passagen wurden die Kulturen isoliert, ausplattiert und
für 24
Stunden kultiviert und die Zellen wurden anschließend durch
Phasenkontrastmikroskopie auf ihre Morphologie (1)
hin untersucht oder mit Keratin-14-Antikörpern gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie
auf die Expression des standardmäßigen Kennzeichens
basaler menschlicher Keratinozyten hin untersucht (2).
-
Wie
in 1 gezeigt, besaßen menschliche, in dem definierten
Medium der vorliegenden Erfindung kultivierte Keratinozyten (1A)
dasselbe kontaktgehemmte, morphologisches „Crazy-Paving" Muster, das für kultivierte
primäre Keratinozyten üblich ist
(Daniels, J.T., et al., Exp. Dermatol.4:183 (1995)), wobei dieselbe bei
kultivierten Zellen in den BPE enthaltenden Medien beobachtet wurde
(1B). Einzelschichtkulturen wiesen in beiden Medien
unterschiedliche Grenzen und markante Zellkerne auf, was darauf
hinwies, dass die Kulturen allgemein gesund waren. Wie in 2 veranschaulicht,
färbten
sich bei Keratin 14 die Zellen in dem definierten Keratinozyten-Medium
der vorliegenden Erfindung positiv, was darauf hinwies, dass das
Medium der vorliegenden Erfindung die Retention von keratinozytenspezifischen
Markern durch kultivierte Primärzellen
ermöglicht.
Bei in BPE enthaltendem Medium kultivierten Zellen wurden ähnliche
Ergebnisse erzielt.
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Um
die Zweckmäßigkeit
der Medien bei der Unterstützung
des Wachstums primärer
Keratinozyten zu untersuchen, wurden Zellen 6 Tage lang in dem Medium
der vorliegenden Erfindung („Definiertes
Keratinozyten-SFM"),
in einem BPE enthaltenden Keratinozyten-SFM („Keratinozyten-SFM") oder in einem definierten Keratinozyten-Medium
von Hyclone Laboratories („Zulieferer
A") inkubiert. Wie
aus 3 ersichtlich, zeigten menschliche, in dem Medium
der vorliegenden Erfindung kultivierte primäre Keratinozyten im Vergleich
mit den weiteren Keratinozyten-Medien ein maßgeblich verbessertes Wachstum
(p ≤ 0,05).
Die Verdopplungszeiten der Population der einzelnen Medien lagen
bei: Definiertes Keratinozyten-SFM: 46,3 ± 5,9 Stunden; Keratinozyten-SFM:
66,6 ± 12,8
Stunden und Zulieferer A: 83,5 ± 19,1 Stunden.
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Gemeinsam
zeigen diese Ergebnisse an, dass das definierte serumfreie Medium
der vorliegenden Erfindung das Wachstum primärer menschlicher Keratinozyten
unterstützt
und sogar undefinierte, üblicherweise verwendete
BPE enthaltende Medien übertrifft.
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Beispiel 6
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Wachstum von sekundären menschlichen
Keratinozyten in definiertem SFM
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Um
die Zweckmäßigkeit
der Medien der vorliegenden Erfindung, die auch Sekundärkulturen
von Keratinozyten einschlossen, für das Wachstum sekundärer menschlicher
Keratinozyten in definiertem SFM zu bestimmen, wurden Zellen, die aus
aktiv wachsenden Kulturen gewonnen wurden, oder im Handel erhältliche Isolate
in den drei in Beispiel 5 beschriebenen Medien kultiviert und auf
ihre Wachstumsrate hin untersucht. Wie in 4 veranschaulicht,
war das Wachstum von Sekundärkulturen
in dem Medium der vorliegenden Erfindung und in dem BPE enthaltenden
Medium ähnlich.
Allerdings wurde in dem vorliegenden Medium ein wesentlich besseres
Zellwachstum (p < 0,05)
erzielt als in dem Medium von Zulieferer A. Die Verdopplungszeiten der
Population in diesen sekundären
Keratinozyten lagen bei: Definiertes Keratinozyten-SFM: 25,0 ± 1,1 Stunden;
Keratinozyten-SFM: 29,0 ± 1,6
Stunden; und Zulieferer A: 35,4 ± 4,1 Stunden.
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Tägliche wachstumskinetische
Experimente, die Sekundärkulturen
von Keratinozyten verwendeten, bestätigten, dass in dem Medium
der vorliegenden Erfindung kultivierte Zellen sich bei einer mit
der von BPE enthaltenden Medien vergleichbaren Geschwindigkeit vermehrten
(5). Weiterhin konnten bei menschlichen, in dem
Medium der vorliegenden Erfindung kultivierten Keratinozyten in
Einzelzellklonierungsexperimenten Klonierungswirkungsgrade von ungefähr 40% erzielt
werden, vergleichbar mit jenen, die mit in BPE enthaltenden Medien
gewachsenen Zellen erhalten wurden (Daten nicht aufgeführt). In
den Medien der vorliegenden Erfindung können zweimal pro Woche Sekundärkulturen
für zumindest
sechs Passagen mit Teilungsverhältnissen
von ungefähr
1:2 erhalten werden.
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Gemeinsam
mit den Ergebnissen aus Beispiel 5 zeigen diese Ergebnisse an, dass
das definierte serumfreie Medium der vorliegenden Erfindung das
Wachstum primärer
und sekundärer
menschlicher Keratinozyten unterstützt und beide BPE enthaltenden
undefinierten Medien und zumindest ein weiteres derzeit im Handel
erhältliches
Medium übertrifft.
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Beispiel 7
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Stabilität von definiertem SFM
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Um
die Lagerfähigkeit
des Mediums der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurden primäre menschliche
Keratinozyten sechs Tage lang in den vorliegenden Medien (Definiertes
Keratinozyten-SFM) oder in BPE enthaltendenen Medien (Keratinozyten-SFM)
kultiviert. Nach der Formulierung wurden die Medien über einen
Lagerzeitraum von 15 Wochen einmal pro Woche untersucht und die
Zellzählungen
jedes Zeitpunktes wurden mit jenen von frisch hergestellten Medien
verglichen.
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Wie
in 6 gezeigt, wies das vollständig ergänzte definierte SFM der vorliegenden
Erfindung eine Lagerfähigkeit
von mehr als 14 Wochen auf, was deutlich über der Lagerfähigkeit
des BPE enthaltenden Mediums lag. Diese Ergebnisse zeigen an, dass
das Medium der vorliegenden Erfindung bei sachgemäßer oben beschriebener
Lagerung im Vergleich zu üblicher
verwendeten BPE enthaltenden Medien eine erhöhte Lagerfähigkeit aufweist.
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Allgemeine Erläuterung
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Kultursysteme,
die für
die Vermehrung menschlicher Keratinozyten gestaltet wurden, wurden
entwickelt, um die undefinierten Komponenten zu reduzieren und die
Lagerfähigkeit
der Kultur und die Zellenerträge zu
erhöhen.
Die Ergebnisse der obigen Beispiele veranschaulichen, dass BPE in
SFM durch eine Lösung,
die Heparin, EGF, zumindest einen FGF, zumindest einen die intrazellulären Niveaus
von cAMP erhöhenden
Wirkstoff und umfassend optional Ascorbinsäure enthält, ersetzt werden kann. Weiterhin
kann dieses Ersetzen von BPE ohne gegenteilige Wirkung auf die Zellproliferationsgeschwindigkeit
und die allgemeine Physiologie menschlicher Keratinozyten durchgeführt werden.
Das Entfernen von BPE als einer Mediumkomponente bei gleichzeitigem
Erhalt der Mediumleistung stellt beim Kultivieren menschlicher Keratinozyten
einen Schritt nach vorne dar, indem eine standardisiertere und kontrolliertere
Kulturumgebung bereitgestellt wird, die wie gezeigt bei weiteren
häufig
verwendeten primären
Zellkulturen fehlen (Watson, C.A., et al., Science 268:447–448 (1995)).
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Somit
zeigen die Ergebnisse der Beispiele 1–6 bei gemeinsamer Betrachtung
an, dass die in Tabelle 1 gezeigte Basalmediumformulierung eine
optimale Kulturmediumformulierung für das Unterstützen der
Kultivierung von tierischen Zellen, die zu 5–10 mg/Liter mit EGF, zu ungefähr 5 mg/Liter
mit aFGF, zu ungefähr
0,3 mg/Liter mit Isoproterenol und zu ungefähr 50 mg/Liter mit Ascorbinsäure (obwohl
Ascorbinsäure
bereits durch eine geringe Reduzierung der Wachstumsförderung
eliminiert werden kann) ergänzt
sind, ist.