DE69032549T2 - Zellkultursysteme und Medien - Google Patents
Zellkultursysteme und MedienInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft Medien und Systeme für das Zellwachstum und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Medien und Systeme.
- Derzeit weisen die meisten Medien oder Systeme für die verlängerte Anzucht und Proliferation oder Langzeitanzucht und Langzeitproliferation von normalen Säugerzellen undefinierte Proteine oder die Verwendung von Futterzellen auf, um Proteine bereitzustellen, die zur Erhaltung dieses Wachstums und der Proliferation notwendig sind.
- Da das Vorkommen solcher undefinierter Proteine mit der beabsichtigten Endverwendung der kultivierten Zellen wechselwirken kann, ist es erwünscht, daß die Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die das Vorkommen von undefinierten Proteinen minimieren. Als Beispiel wird vorweggenommen, daß die Gegenwart von undefinierten Proteinen in kultivierten Epidermiszellen, die zur Herstellung von lebenden Hautäquivalenten zur Verwendung als Hauttransplantate für Verbrennungsopfer verwendet werden, solche lebenden Hautäquivalente für diese Verwendung unbrauchbar machen können, da solche Proteine eine Immunantwort hervorrufen. Falls 3T3 Mauszellen als Futterzellen verwendet werden, um Epidermiszellen für solche lebenden Hautäquivalente zu kultivieren, ist es äußerst wahrscheinlich, daß restliche 3T3 Zellen oder Teile hiervon, die in der Epidermis eingeschlossen sind, eine Immunreaktion zwischen Arten hervorrufen würden. Die Verwendung von Rinderserum bei der Herstellung von solchen lebenden Hautäquivalenten würde wahrscheinlich ebenfalls eine ähnliche Immunreaktion auslösen.
- Daher besteht ein Bedarf für chemisch definierte Zellkulturmedien und -systeme, die für das verlängerte Wachstum und die verlängerte Proliferation von Zellen entweder eine sehr niedrige Konzentration von undefinierten Proteinen oder noch bevorzugter keine solchen undefinierten Proteine aufweisen. Der Ausdruck "definiert" wird zur Beschreibung eines Mediums verwendet, das keine bewußt zugegebenen uncharakterisierten Zusätze enthält, wobei ein solches Medium Spurenkontaminationen in seinen Bestandteilen enthalten kann.
- Es wurde eine große Vielzahl an chemisch definierten Kulturmedien für die Vermehrung von Zellen in Reaktion auf diesen Bedarf entwickelt. Solche Medien sind unter anderem modifiziertes Eagles Medium (hierin später "MEM"), Ham's F12, Dulbeco's modifiziertes Eagles Medium (Hierin später "DMEM"), MCDB 153 und Medium 199. Jedoch wurde festgestellt, daß eine erfolgreiche Kultur der meisten Zellen in bekannten chemisch definierten Medien immer noch die Zugabe von Proteinzusätzen erfordert, wie Serum oder Faktoren, die aus Serum stammen oder die Verwendung von Fütterzellen, wobei undefinierte Komponenten in die Medien eingeführt werden. Die Verwendung von komplexen Proteinsupplementen in Zellkultursystemen führt nicht nur undefinierte Proteine ein, sondern erhöht auch die Kosten der Zellkultur.
- Probleme, die bei der Kultur und in einigen Fällen bei der Reifung von Epithelzellen auftreten, veranschaulichen die Defizienzen in derzeit erhältlichen Kulturmedien und -systemen. Epithelzellen, wie Epidermiszellen, werden zur Herstellung von lebenden Hautäquivalenten verwendet und bilden Schichten aus kultivierter Epidermis zur Verwendung in Testsystemen und Hauttransplantaten. Lebende Haut- und andere Gewebeäquivalente und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Gewebeäquivalente sind in US-A 4 485 096, US-A 4 835 102, US-A 4 837 379, US Patentanmeldung 07/505 678 vom 6. April 1990 und US-A 5 536 656 beschrieben und werden später als die "Patente" bezeichnet. Diese Anwendungen erfordern die Anzucht von großen Mengen Epidermiszellen in Kultur und derzeit erhältliche Medien erfüllen diesen Bedarf nicht.
- Die Säugerepidermis setzt sich prinzipiell aus einem einzigen Zelltyp, dem Keratinozyten, in verschiedenen Differenzierungsstadien zusammen. Die basale Schicht, die von den Fibroblasten der darunterliegenden Dermis getrennt ist, enthält die sich teilenden Keratinozyten. Diese sorgen für Nachkommen, von denen sich einige nicht länger teilen, sondern aus der basalen Schicht wandern, schließlich unter Bildung des Stratum corneum differenzieren und eventuell von der Oberfläche abgeschält werden. Für bestimmte Anwendungen, beispielsweise Testsysteme zur Untersuchung der perkutanen Absorption, ist es essentiell, daß lebende Hautäquivalente eine voll entwickelte Keratinozytenschicht aufweisen, die die Differenzierung und Reifung der kultivierten Epidermiszellen erfordert.
- Die Bildung von Keratinozytenschichten, die denen in vivo vorkommenden vollkommen gleich sind, liefert zusätzliche Herausforderungen für existierende Wachstumsmedien und Systeme. Die Bildung solcher Schichten erfordert eine Calciumkonzentration, die ausreicht, um die Differenzierung der Epidermiszellen und die Schichtung von älteren, reiferen Keratinozyten zu erlauben, während immer noch eine proliferative, kleine Basalzellpropulation aufrechterhalten wird. Die Kultur und die Reifung von Keratinozyten wurde durch verschiedene Verfahren und mit unterschiedlichem Maß an Erfolg versucht, sogar wenn Serum- oder Proteinzusätze verwendet wurden. Beispielsweise wurde festgestellt, daß die Wachstumserfordernisse von Keratinozyten nicht durch herkömmliche Serumzusätze in chemisch definierte Medien erfüllt wird. In jedem Fall wird das Wachstum und die Reifung von Keratinozyten vorzusweise durch die Verwendung eines chemisch definierten Kulturmediums mit wenig oder keinem zugegebenem Serum oder anderer undefinierter Faktoren und ohne die Verwendung von Fütterzellen, wie Embryomausfibroblasten (3T3 Zellen) erreicht.
- Bei der Zusammenfassung der derzeitigen Techniken zur Kultivierung von Keratinozyten kamen mehrere Probleme ans Licht. Siehe beispielsweise Breidahl et al., Aust. N. Z. J. Surg., 59 (1989) 485-497.
- Rheinwald und Green berichten von einem Verfahren zur Anzucht von Keratinozyten mittels einer 3T3 Fütterzellschicht, die ein klonales Wachstum und eine mehrfache Passage erlaubt (Rheinwald und Green, Cell 6 (1975) 331-344). Diese Arbeit wurde als Durchbruchtechnik betrachtet, da die Keratinozytenzellen zur Bidung von schichtenden, differenzierenden Kulturen fähig sind, wobei immer noch eine proliferative oder relativ undifferenzierte Basalzellpopulation erhalten bleibt, die zu weiterem klonalem Wachstum fähig ist, wenn sie passagiert wird. Trotz der vorhergehenden Vorteile der Rheinwald und Green Methodik, ist die Verwendung von Fütterzellen, beispielsweise 3T3 Mauszellen, aufgrund der Möglichkeit unerwünscht, daß undefinierte Proteine aus den 3T3 Zellen, einer transformierten Zellinie, in den kultivierten Zellinien vorkommen können. Obwohl berichtet ist, (Sun und Green, Cell, 9 (1976) 512-521), daß 3T3 Zellen und Zellfragmente mittels 0,02% EDTA entfernt werden können, ist eine vollständige Entfernung oft schwierig und die Wirkung der Entfernung dieser Zellen und der entstehende Streß auf die kultivierten Epidermiszellen dürfte unerwünscht sein. Darüberhinaus erfordert das 3T3 Füttersystem hohe Mengen an Serum (etwa 5%), das zusätzlich undefinierte Proteine in das Kultursystem einführt.
- Nach der Arbeit von Rheinwald und Green, siehe obige Literaturstelle, fuhren Forscher fort, einen Weg zur Kultivierung von Epidermiszellen und zur Reifung von Keratinozyten in Abwesenheit von Zusätzen oder Fütterzellunterstützung zu finden. Ein Hauptfortschritt in diesem Feld wurde von Boyce und Ham in J. Invest. Dermatol. 81(1983) 33S-40S beschrieben. Die Arbeit begann durch die Verwendung von Ham's F12 als Grundmedium; versetzt mit verringerten Mengen dialysiertem FBS (2%) (Peehl und Ham, In Vitro 16 (1980) 526-538). Eine optimierte Formulierung dieses Mediums, die das Wachstum von Keratinozyten in einem serumfreien Medium erlaubt, das verringerte Calciummengen enthält, wurde anschließend durch Veränderung der Konzentration von mehreren Komponenten entwickelt, um bei einem Medium anzukommen, das als MCDB 153 bezeichnet wurde (Siehe Boyce und Ham 1983, obige Literaturstelle und J. Tiss. Cult. Meth. 9 (1985) 83-93).
- Die berichtete Brauchbarkeit von MCDB 153 liegt in den Bereichen der Zellbiologie, Toxikologie, Pathologie von Keratinozyten und der Anzucht von Zellen für Epidermiszelltransplantate (Boyce und Ham 1985, siehe obige Literaturstelle). Obwohl MCDB 153 ein serumfreies Medium ist, das nicht die Verwendung von Fütterzellen erfordert, leidet es an bestimmten Nachteilen. Beispielsweise ist dessen Verwendung dadurch begrenzt, daß MCDB 153 kein sehr flexibles Medium ist, beispielsweise in Gegenwart von Calcium und/oder Serum.
- Die Fähigkeit, Keratinozyten in MCDB 153 zu kultivieren, hängt entscheidend von der Calciumkonzentration des Mediums ab, was dessen Flexibilität weiter beschränkt. Eine proliferative Fähigkeit wird in MCDB 153 durch das Halten der Calciumkonzentration unter etwa 1,0 mM aufrechterhalten, wobei etwa 0,3 mM optimal ist (Siehe Boyce und Ham 1983, Fig. 1 Seite 35S, obige Literaturstelle). Wenn Calcium in einer Konzentration von etwa 1,0 mM oder darüber in MCDB 153 zugegeben wird, um eine Schichtung zu veranlassen, teilen sich die Zellen nicht mehr, differenzieren nicht aus und sind nicht zu einer weiteren Kultivierung fähig, das heißt die proliferierende Basalzellpopulation geht verloren, da die Zellen nicht den hohen Calciumkonzentrationen in diesem Medium standhalten können (Boyce und Ham 1983, obige Literaturstelle). Da eine physiologische Konzentration von etwa 1,8 mM Calcium für eine gute Schichtung und Differenzierung einer kohärenten mehrfachgeschichteten Epidermislage notwendig ist, ist MCDB 153 nicht das geeignete Medium, um eine voll entwickelte Keratinozytenschicht zu erhalten. Pittelkow und Scott (Mayo Clin. Proc. 61(1986) 771-777) berichten von gebildeten Schichten einer transplantierbaren Epidermis mittels Zellen, die in MCDB 153 kultiviert wurden, aber halten es für erforderlich in DMEM-Hochserummedium (10%) zurückzugehen, um eine Schichtung zu erhalten und gleichzeitig eine adäquate Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten.
- MCDB 153 ist weiter limitiert, da Zellen, die in MCDB 153 angezogen wurden, dramatisch ihre Fähigkeit zur Passage verlieren, wenn sie bis zur Konfluenz angezogen werden (Boyce und Ham 1983, obige Literaturstelle). Diese Feststellung zeigt, daß der Hauptteil der Zellen weiterhin differenziert, obwohl die Calciumkonzentration unter 1,0 mM gehalten wird und ist wahrscheinlich ein Grund, warum das MCDB 153 System auch so intolerant gegenüber Calcium ist, da Calcium bekanntermaßen den schließlichen Prozeß der Enddifferenzierung in übertragenen Zellen induziert (Rice und Green, Cell, Band 18, 681-694, November 1979). Darüberhinaus werden Effizienzen in der Koloniebildung von 30% und Populationsverdopplungszeiten von etwa 24 Stunden mit nur 2-3 Passagen in MCDB 153 erreicht. Diese Eigenschaften nehmen nach der Passage 3 ab (Boyce und Ham 1983, obige Literaturstelle).
- Man glaubt, daß die Qualität der in MCDB 153 angezogenen Zellen nicht ausreichend hoch für die Verwendung bei der Herstellung von Epidermiszellschichten ist und daß geschichtete Kulturen, die für einige Zeit in Konfluenz gehalten werden können, nicht in Gegenwart des MCDB 153 Systems erreicht werden können.
- Obwohl andere Forscher, die mit einem suboptimalen Medium arbeiteten, ihr System durch Wachstumssubstrate zu optimieren versuchten (siehe beispielsweise Karasek und Charlton (J. Invest. Dermal, 56 (1971) 205- 210) und Gilchrest et al., (J. Cell Physiol. 112 (1982) 197-206 berichten die Vorteile eines Proteinsubstrats bei der Kultur von epidermalen Keratinozyten), erreichten diese Forscher nur ein begrenztes Maß an Erfolg, primär aufgrund von Defizienzen in der Mediumformulierung. Karasek und Charlton, siehe obige Literaturstelle, und andere Forscher fanden es als erforderlich, eine hohe Serumkonzentration (gewöhnlich um 10%) zu verwenden. Das supplementierte M199 Medium, das von Gilchrest et al., (Cell Biol. Intl. Rpt., 4 (1980) 1009-1016) verwendet wurde, litt an einer basalen Nährstoffdefizienz, das heißt einer sehr geringen Inositkonzentration.
- In Eisinger (Methods in Skin Research, Herausgeber Skerrow und Skerrow, Kapitel 7, J. Wiley & Sons Ltd., 1985) und Eisinger et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (1979) 5340-5344) wird von einem Verfahren zur Anzucht von Epidermiszellen berichtet, dessen Vorteil die Anzucht der Zellen ohne Futterzellen und ohne einer dermalen Komponente ist. Jedoch beruht das Eisinger Verfahren, siehe obige Literaturstelle, auf einer extrem hohen Zelldichte für die Plattierung. Darüberhinaus ist die Wachstumsrate langsam und die Erhöhung der Gesamtzellzahl ist gering (teilweise aufgrund einer geringen Plattierungseffizienz), was diese Technik für die Vermehrung oder verlängerte Kultivierung aus einer einzigen Quelle im großen Maßstab unpraktikabel macht, was beides erwünschte Ziele sind.
- Es ist dem Fachmann bekannt, daß die Supplementierung des Grundmediums mit einem epidermalen Wachstumsfaktor und Hydrocortison das Wachstum und die Ausbreitung der Keratinozyten fördert (Barrandon und Green, Cell 50 (1987) 1131-1137, Bertolero et al., Exp. Cell. Res. 155 (1984) 64-80). Mittel, die cyclisches AMP erhöhen (siehe beispielsweise US-A 4 456 687) und die Verwendung eines neutralen Rinderextrakts (Gilchrest et al., J. Cell. Phys. 120 (1984) 377-383) oder eines Plazentaextrakts (OKeefe und Chiu, Soc. Invest. Dermatol. 90 (1988) 2-7) sind ebenfalls in mehreren Zellkultursystemen hilfreich.
- Eine Übersicht über die Literatur zeigt, daß obwohl mehrere Forscher die Anzucht von Epithelzellen entweder mit einem Kollagensubstrat (Liu et al., In Vitro 15 (1979) 813-822) oder einem Fibronektinsubstrat (Kubo et al., Soc. Invest. Dermatol. 88 (1987) 594-601) oder mittels verschiedener Medienformulierungen versuchten, erreichten die meisten nur eine kurze Kultur bei relativ hohen Animpfdichten. Keine dieser Modifizierungen, einschließlich MCDB 153, erreichen das Maß an Erfolg, das mit dem 3T3 Fütterzellsystem beobachtet wird.
- Das 3T3 Fütterzellsystem erfordert jedoch die Verwendung eines cAMP erhöhenden Mittels, typischerweise Choleratoxin, um ein optimales Wachstum zu erreichen (Green, Cell 15 (1978) 801-811). Diese künstliche Erhöhung der cAMP Spiegel kompliziert die Untersuchung der tatsächlichen Wachstumsfaktoreffekte und -mechanismen.
- Medien und Systeme, die für das verlängerte Wachstum und die Proliferation von Zellen und in einigen Fällen für die Reifung von bestimmten Zellen sorgen, während aktiv sich teilende basale Zellen erhalten bleiben, werden immer noch gesucht.
- Die erfindungsgemäßen Zellkulturmedien und -systeme weisen mehrere Vorteile auf, unter anderem die folgenden:
- 1. Fehlen einer Fütterzelle.
- 2. Schnelle Wachstumsrate in Abwesenheit von Serum und/oder hypothalamischem Rinderextrakt.
- 3. Falls mit etwa 1 · 10³ Zellen/cm² oder mehr ausplattiert wird, liefert ein hypothalamischer Rinderextrakt nur einen kleinen oder keinen Vorteil.
- 4. Schnelles Zellwachstum in Abwesenheit von cAMP erhöhenden Mitteln.
- 5. Die Plattierungs- und Koloniebildungseffizienz beträgt 30% oder mehr mit einer Fexibilität der Calciumkonzentration. Dies steht im Vergleich zu etwa 10% mit 3T3 und 30% mit MCDB 153 mit wenig Calcium. (Diese Eigenschaft ist für die Mikroträgerkultivierung sehr erwünscht).
- 6. Die Zellen können leicht bei der Herstellung von lebenden Hautäquivalenten verwendet werden und bilden eine mehrfach geschichtete Epidermis, die genauso gut oder besser ist als Zellen, die durch andere beschriebene Verfahren angezogen wurden (MCDB 153 angezogene Zellen überleben nicht gut).
- 7. Epidermiszellen, die auf einer Kollagen-beschichteten Oberfläche angezogen wurden, können als Epidermiszellschicht mittels Kollagenase zur Verwendung bei der Transplantation dieser Schichten abgelöst werden, falls dies erwünscht ist.
- 8. Die Flexibilität der Systeme im Calcium²&spplus;-Konzentrationsbereich und der Dichteabhängigkeit liefern mehrere Vorteile zur Anpassung an eine Mikroträgerkultur im großen Maßstab.
- 9. Die schnelle Wachstumsrate bildet eine nahezu synchrone Population an Zellen, wenn sie etwa 60% Konfluenz erreichen. Die große Anzahl an runden mitotischen Zellen und die hohe Plattierungseffizienz der Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung angezogen wurden, zeigt, daß ein Kügelchen auf Kügelchen Transfer auch bei einer Mikroträgerkultur im großen Maßstab möglich ist.
- Erfindungsgemäßes Medium ist chemisch definiert und enthält:
- a) Insulin von etwa 0,5 bis etwa 50 ug/ml
- b) Eisen-(II)-ionen oder Transferrin von etwa 5 · 10&supmin;&sup8; bis etwa 5 · 10&supmin;&sup5; M.
- c) Triiodthyronin von etwa 2 bis etwa 200 pM,
- d) zumindest eines von o-Phosphorylethanolamin und Ethanolamin von etwa 10&supmin;&sup6; bis etwa 10&supmin;² M,
- e) Calcium von etwa 0,005 bis etwa 2,0 mM, und
- f) eine Nährstoffquelle, die aus mindestens einem von DMEM, IDMEM, MEM, M199, RPMI 1640, Ham's F12, Ham's F10, NCTC 109 und NCTC 135 bei Abwesenheit von undefinierem Protein ausgewählt ist.
- Andere Komponenten, die in erfindungsgemäße Medien eingearbeitet werden können, umfassen Hydrocortison, von etwa 0,04 bis etwa 4,0 ug/ml, Epidermiswachstumsfaktor von etwa 1 bis etwa 50 ng/ml, Adenin von etwa 0,02 bis 2 mM, Progesteron von etwa 2 · 10&supmin;¹&sup0; bis etwa 2 · 10&supmin;&sup8; M, Selen von etwa 10&supmin;&sup9; bis etwa 10&supmin;&sup7; M, Strontium von etwa 10&supmin;&sup4; bis etwa 2 · 10&supmin;³ M, ein oder mehrere cAMP erhöhende Mittel von etwa 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;³ M ausgewählt aus zumindest einem von Choleratoxin, Foreskolin, Isoproterenol, Methylisobutylxanthin, Dibutyryl cAMP, Theophyllin, Koffein und Pertussistoxin, EGF von etwa 1 bis etwa 50 ng/ml und Eisenionen werden durch Eisen-(III)-sulfat von etwa 5 · 10&supmin;&sup8; bis etwa 5 · 10&supmin;&sup5; M bereitgestellt. Eisen-(II)-ionen werden vorzugsweise durch Transferrin von etwa 0,05 bis etwa 50 Nug/ml bereitgestellt, das heißt etwa 5, 6 · 10&supmin;&sup5; bis etwa 5, 6 · 10&supmin;² M.
- Es wird erwartet, daß die erfindungsgemäßen Systeme, Methoden und Medien für die Kultur einer Vielzahl von Zelltypen brauchbar sein können. Zellen, die vorzugsweise durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung kultiviert werden, sind Epithelzellen. Bevorzugte Epithelzellen sind Epidermiszellen oder Keratinozyten.
- Die erfindungsgemäßen Zellkultursysteme umfassen ein oben beschriebenes Zellkulturmedium und ein Substrat für die Zellen, das umfaßt Plastik, Glas, Kollagen, Fibronektin, Laminin, Heparansulfatproteoglycan, Mikroträger, die beschichtet sind mit Kollagen, Fibronektin, Laminin oder Heparansulfatproteoglycan oder ein Gewebeäquivalent, das durch ein Verfahren hergestellt wird, gekennzeichnet durch
- a) Kombination einer Kollagenlösung mit einem kontraktilen Mittel unter Bedingungen, die ein Gelgemisch bilden, das das kontraktile Mittel innerhalb des Gelgemisches dispergiert aufweist,
- b) Aufrechterhalten des in Schritt (a) hergestellten Gelgemisches unter Bedingungen, die eine Kontraktion des Gelgemisches unter Bildung eines Gewebeäquivalents erlauben.
- Ein bevorzugter Kollagentyp ist natives Kollagen vom Typ I, das von Rindersehnen stammt.
- Ein Verfahren zur Kultivierung von Epithelzellen gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Beimpfen eines wie oben beschriebenen Wachstumssubstrats mit Epithelzellen und die Aufrechterhaltung des Zellkultursystems unter Bedingungen, die das Zellwachstum fördern. Das in solchen Verfahren erreichte Zellwachstum ist durch eine Populationsverdopplungszeit von etwa 16 bis etwa 33 Stunden gekennzeichnet. Darüberhinaus können die Zellen seriell kultiviert werden, um etwa 20 bis etwa 50 Populationsverdopplungen zu erhalten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Verfahren ferner die Zugabe von Calcium in einer Konzentration von mehr als etwa 1,0 mM, um eine Schichtung und Differenzierung der Zellen zu ermöglichen, während eine Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis etwa 60% erhalten bleibt. Dies ist bei der Bildung von lebenden Hautäquivalenten und Epidermisschichten für die Transplantation wichtig. Die Durchführung der vorliegenden Erfindung sorgt auch für ein klonales Wachstum von Zellen, das heißt ein Beimpfen mit einer Zelldichte von etwa 30 bis etwa 1000 Zellen.
- Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine schnelle Vermehrung von primären Zellen mit einer Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis etwa 100% und eine proliferative Kapazität von mehr als 50 Populationsverdopplungen zu erreichen. Darüberhinaus kann Calcium mit mehr als 1,0 mM zugegeben werden, um eine Schichtung und Differenzierung der Zellen zu ermöglichen, während eine Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis etwa 60% erhalten bleibt.
- Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Kultivierung von Epithelzellen auf Mikroträgern, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch Plattierung der Epithelzellen auf Kollagen-beschichtete Mikroträger in einem oben beschriebenen Zellkultursystem mit einer Plattierungseffizienz von etwa 20 bis etwa 40% und Halten der Mikroträger und plattierten Zellen unter Bedingungen, die das Zellwachstum fördern. Bei der Durchführung dieses Verfahrens wird eine Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis etwa 100% erhalten, sogar wenn das Zellwachstum Konfluenz erreicht. Darüberhinaus kann die Calciumkonzentration von 0,08 bis etwa 1,8 mM während der schnellen Proliferationsphase erhöht werden, wenn das Zellwachstum die Konfluenz erreicht, um die Haftung der Zellen auf den Mikroträgern zu erhöhen und so den Zellverlust durch die auf die Mikroträger einwirkenden Scherkräfte zu verringern.
- Vollkommen epidermalisierte lebende Gewebeäquivalente können auch mittels erfindungsgemäßer Medien und Zellkultursysteme hergestellt werden.
- Die erfindungsgemäßen Medien werden durch schnell proliferierende Epithelzellen konditioniert und es wird erwartet, daß so konditionierte Medien als Wachstumszusätze und in therapeutischen Anwendungen, wie der Wundheilung, brauchbar sind.
- Erfindungsgemäße chemisch definierte Medien sorgen für die Kultur von Zellen in Abwesenheit von Fütterzellen, Serum oder anderen Komponenten, die undefinierte Proteine in das Medium eintragen würden.
- Einige Vorteile der erfindungsgemäßen Medien sind: Einfache Herstellung, flexible Verwendung, das heißt es kann mit unterschiedlichen Calciumkonzentrationen verwendet werden, unterschiedliche Wachstumsfaktorzusätze und unterschiedliche extrazelluläre Matrixkomponenten. Die erfindungsgemäßen Medien und Systeme versorgen den Zellbiologen und andere für die in vitro Herstellung und/oder Untersuchung von Epithel Interessierte mit einem System, das ihre Anforderungen erfüllt.
- Ein erfindungsgemäßes Medium enthält: Insulin oder einen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor, Transferin oder Eisen-(II)-ionen, Triiodthyronin oder Thyroxin, Ethanolamin und/oder o-Phosphorylethanolamin, Calcium und eine Nährstoffquelle. Es können andere Komponenten zu den Medien gegeben werden in Abhängigkeit von beispielsweise der im einzelnen zu kultivierenden Zelle, einschließlich aber nicht limitiert auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Hydrocortison, Strontium, Progesteron, Selen und cAMP erhöhende Mittel. Von Hydrocortison wurde berichtet, daß es einen Wert bei der Langzeitkultur von normalen humanen Keratinozyten besitzt (Rheinwald und Green, obige Literaturstelle) und daher eine bevorzugte Komponente von komplettem mSBM ist. Wenn eine minimale Supplementierung gewünscht wird ist jedoch Hydrocrotison nicht erforderlich und dessen Abwesenheit kann dann bevorzugt sein.
- Insulin ist in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 50 ug/ml enthalten und eine besonders bevorzugte Konzentration beträgt 5,0 ug/ml. Proinsulin, IGF-I (10&supmin;¹&sup0; bis 10&supmin;&sup8; M) oder andere Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren können anstelle von Insulin verwendet werden, obwohl Insulin aus ökonomischen Gründen derzeit bevorzugt ist. Der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor, wie er hierin verwendet wird, meint Zusammensetzungen, die strukturell zu Insulin ähnlich sind und die Insulin-ähnliche Wachtumsfaktorrezeptoren stimulieren, beispielsweise die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren I und II.
- Eisen-(II)-ionen werden durch Transferrin in einer Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 50 ug/ml zur Verfügung gestellt, wobei eine bevorzugte Konzentration etwa 5 ug/ml ist.
- Triidothyronin wird gegenüber Thyroxin bevorzugt, da festgestellt wurde, daß es eine stärkere Wirkung in den beanspruchten Zellkultursystemen aufweist. Triidothyronin ist vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 2 bis etwa 200 pM, bevorzugter etwa 20 pM enthalten.
- Ethanolamin und/oder o-Phosphorylethanolamin können bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Jedoch ist es bevorzugt, diese Komponenten in Kombination zu verwenden. Ethanolamin ist in einer Konzentration von etwa 10&supmin;&sup6; bis etwa 10&supmin;² M, bevorzugter etwa 10&supmin;&sup4; M enthalten. o-Phosphorylethanolamin ist in einer Konzentration von etwa 10&supmin;&sup6; bis etwa 10&supmin;² M, bevorzugter 10&supmin;&sup4; M enthalten.
- Im Gegensatz zu den derzeit erhältlichen Medien kann die Calciumkonzentration im erfindungsgemäßen Medium über einen weiten Bereich variiert werden, wobei immer eine aktiv proliferierende Zellkultur erhalten bleibt. Obwohl die Zellen im erfindungsgemäßen Medium bei physiologischen Calciumspiegeln von 1,8 mM angezogen werden können, werden das Wachstum und das Fehlen der Enddifferenzierung (das heißt Aufrechterhaltung der proliferierenden Basalzellpopulation) durch eine Caciumkonzentration von etwa 0,005 bis etwa 2,0 mM, bevorzugter von etwa 0,08 bis etwa 1,0 mM optimiert.
- Unter Calciumbedingungen, die für die optimale Wachstumsrate verwendet werden, beobachtet man eine minimale Schichtung. Falls diese Kulturen bei Konfluenz gehalten werden, werden größere Zellen von der Platte abgelöst und die Platte bleibt durch eine dicht gepackte Schicht aus kleinen Zellen besiedelt. Eine Zugabe von Calcium erlaubt eine Schichtung der reiferen Zellen, wobei immer noch eine konfluente Basalzellschicht erhalten bleibt. Falls Calcium vor der Konfluenz auf 1,8 mM zugegeben wird, ähnelt das Erscheinungsbild der Kolonien und die Zellverteilung dem, das mit Fütterzellen unter Fortsetzung der Anzucht der Zellen bis zur Konfluenz beobachtet wird. Es ist wenig Involucrin oder Transglutaminase (Marker für epidermale Zelldifferenzierung) vor der Konfluenz vorhanden, falls das Calcium bei 1,0 mM oder darunter gehalten wird. Calcium ist von etwa 0,005 bis etwa 2,0 mM in Abhängigkeit der Zwecke für die Kultivierung der Zellen enthalten. In manchen Fällen wird das benötigte Calcium durch andere Komponenten im Medium bereitgestellt, anstatt daß es getrennt zugegeben wird.
- Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) ist wahlweise von etwa 1 bis etwa 50 ng/ml, vorzugsweise etwa 10 ng/ml (Maus EGF) und etwa 1 ng/ml (humaner EGF) enthalten. Obwohl EGF bevorzugt ist, kann der transformierende Wachstumsfaktor alpha des Menschen oder der Maus anstelle von EGF verwendet werden, vorzugsweise mit etwa 10 ng/ml (Maus) und etwa 1 ng/ml (Mensch). Obwohl EGF ein optionaler Bestandteil in erfindungsgemäßen Medien ist, kann er für einige Anwendungen bevorzugt sein, beispielsweise Batchkulturen im großen Maßstab.
- Hydrocortison ist wahlweise bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0,04 bis etwa 4,0 ug/ml enthalten, wobei eine besonders bevorzugte Konzentration 0,4 ug/ml beträgt.
- In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße Medium mit zusätzlichen Komponenten versetzt werden.
- In einigen Fällen kann es erwünscht sein, Komponenten einzuarbeiten, die das Fibroblastenwachstum hemmen, wie Choleratoxin.
- Der hypothalamische Rinderextrakt (BHE) wird manchmal in bekannte Medien eingearbeitet, um die Plattierungseffizienz und die Koloniebildung in primären und klonalen dichten Kulturen zu erhöhen, insbesondere wenn die anfängliche Zelldichte weniger als 1 · 10³ Zellen/cm² beträgt. Vertreter der Fibroblastenwachstumsfaktorfamilie, einschließlich saurer FGF, Keratinozytenwachstumsfaktor und basischer FGF (in einer leicht höheren Konzentration) können anstelle von BHE mit ähnlichen Effekten von etwa 10&supmin;¹&sup0; g/ml bis etwa 10&supmin;&sup6; g/ml, vorzugsweise etwa 10&supmin;&sup7; g/ml eingesetzt werden. Typischerweise liefert BHE einen geringen oder keinen Vorteil, wenn die Zellen mit 1 · 10³ Zellen/cm² oder mehr plattiert werden. Andere Komponenten, die zum oben beschriebenen Medium gegeben werden können, umfassen Adenin von etwa 0,02 mM bis etwa 2,0 mM, Progesteron von etwa 2 · 10&supmin;¹&sup0; bis etwa 2 · 10&supmin;&sup8; M, vorzugsweise 2 · 10&supmin;&sup9; M und Selen von etwa 1 · 10&supmin;&sup9; bis etwa 1 · 10&supmin;&sup7; M. Progesteron und Selen können in manchen Fällen zugegeben werden, um ein optimales Wachstum zu erzielen.
- Mittel zur Erhöhung von cyclischem AMP sind nicht notwendig, um Primärzellkulturen zu etablieren und um humane Epidermiszellen in den erfindungsgemäßen Systemen zu passagieren. Frühere Forscher haben gezeigt, daß sowohl die Zugabe von cAMP Spiegel erhöhenden Mitteln als auch die Anwesenheit eines Rinderhypophysenextrakts nützlich, wenn auch nicht essentiell ist, um die primären Kulturen von Epidermiszellen zu etablieren (siehe Green, 1978, obige Literaturstelle und Boyce und Ham, 1985, obige Literaturstelle). Die Daten im späteren Beispiel 9 zeigen, daß weder BHE (der durch Vertreter der FGF Familie in einigen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Medien ersetzt wird) noch cAMP erhöhende Mittel für die primäre Kultur und die anschließende Passage von Epidermiszellen mittels der erfindungsgemäßen Medien notwendig sind. Jedoch können cAMP erhöhende Mittel zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, falls dies erwünscht ist.
- Mittel zur Erhöhung des cyclischen AMP, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Choleratoxin, Foreskolin, β-adrenerge Mittel, wie Adrenalin, Theophyllin, Dibutyryl cyclisches AMP, Methylisobutylxanthin, Isoproterenol, Koffein und Pertussistoxin. Bevorzugte Mittel sind Choleratoxin und Foreskolin. Das Choleratoxin wird vorzugsweise verwendet von etwa 10&supmin;&sup8; bis etwa 10&supmin;&sup5; M und Foreskolin von etwa 10&supmin;&sup9; bis etwa 10&supmin;³ M, vorzugsweise von etwa 10&supmin;&sup7; bis etwa 10&supmin;&sup5; M und noch bevorzugter 10&supmin;&sup6; M.
- Die Verwendung der cAMP erhöhenden Mittel in den erfindungsgemäßen Systemen und Medien können in manchen Fällen nützlich sein, wenn Primärkulturen etabliert oder Primärkulturen oder andere Zellen, die eingefroren waren, erneut etabliert werden. Jedoch können bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung Zellen leicht ohne die Zugabe eines cAMP erhöhenden Mittels oder BHE etabliert werden. Solche Zellen können dann für mehrere Passagen mittels der erfindungsgemäßen Medien ohne ein cAMP erhöhendes Mittel passagiert werden.
- Die Zugabe von Kationenersatzstoffen wird als möglicher Ersatz für den konstitutiven Bedarf an Calcium untersucht. Während alle Zellen eine bestimmte Menge Calcium benötigen, hat Calcium eine differenzierungsfördernde Wirkung auf Keratinozyten. Es wurde vorher gezeigt, daß andere divalente Kationen den konstitutiven Bedarf der Zellen ersetzen können (Rubin, J. Cell. Physiol. 91 (1977) 449-458) ohne zur Induktion der Differenzierung beizutragen (Praeger et al., J. Cell. Physiol. 132 (1987) 81-89, Furakawa et al., J. Invest. Dermatol., 90 (1988) 690-696). Die Wirkungen von Strontium und Magnesium werden in den erfindungsgemäßen Systemen untersucht. Magnesium hat in manchen Fällen eine nützliche Wirkung. Die Strontiumzugabe erhöht die schließliche Zellausbeute und verringert die Populationsverdopplungszeit um etwa 4 Stunden, während sie den Anteil der proliferativen Zellpopulation (9-14 um Verteilung) nicht signifikant verändert. Siehe späteres Beispiel 8.
- Nährstoffquellen, die zur Durchführung der vorliegenen Erfindung brauchbar sind, liefern bekannte essentielle Nährstoffe für kultivierte Zellen, wie: Eine Energiequelle, wie Glucose, Fructose oder Galaktose, sowohl essentielle als auch nicht-essentielle Aminosäuren, sowohl wasserlösliche Vitamine (B-Gruppe, Biotin, Folsäure, Nicotinamid, Panthothensäure, Pyroxidin, Riboflavin und Thiamin) wie auch fettlösliche Vitamine (A, D, E, K und Ubichinon), anorganische Hauptionen, wie Bicarbonat, Calcium, Chlorid, Magnesium, Phosphat, Kalium und Natrium, Spurenelemente, wie As, Co, Cr, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Sn, V und Zn, Lipide, Puffer, wie beispielsweise CO&sub2;/HCO&sub3; und HEPES, Gase (Sauerstoff und Kohlendioxid) und Nukleinsäurevorläufer, wie Adenin, Cytidin, Hypoxanthin und Thymidin.
- Es existieren viele im Handel erhältliche Nährstoffquellen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sein dürften. Diese umfassen die im Handel erhältlichen Nährstoffquellen, die anorganische Salze, eine Energiequelle, Aminosäuren und B-Vitamine bereitstellen, wie Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), Minimum Essential Medium (MEM), M199, RPMI 1640, (alle erhältlich von Flow Laboratories, und Isecove's Modifled Dulbecco's Medium (EDMEM, Gibco Labs). Minimum Essential Medium und M199 erfordern eine zusätzliche Supplementierung mit Phospholipidvorläufern und nicht-essentiellen Aminosäuren. Im Handel erhältliche vitaminreiche Extrakte, die zusätzlich Aminosäuren, Nukleinsäuren, Enzymcofaktoren, Phospholipidvorläufer und anorganische Salze liefern, umfassen Ham's F12, Ham's F10, NCTC 109 (alle von Flow Laboratories) und NCTC 135 (Irvine Scientific).
- Die Komponenten jeder der obigen Nährstoffquellen sind hierin im folgenden angegeben. RPMI 1640 Medium
- Referenz
- 1. G. E. Moore et al., 1967, JAMA, 199, 519
- 2. J. M. Morton 1970, In Vitro 6, 89 Medium 199 (modifiziert) Medium 199 (modifiziert) Fortsetzung
- NCTC Medium 109 und 135
- 1. V. J. Evans, J. C. Bryant, H. A. Kerr und E. L. Schilling, Exp. Cell Res. 36 : 439-474, 1964
- 2. J. Morton, In Vitro, 6, 89-108, 1970
- *NCTC 109 und 135 enthalten dieselben Komponenten (Referenz 2), außer daß NCTC 135 L-Cystein HCl wegläßt. Referenz 1 Seite 466, erwähnt die Toxizität von Cystein als einen Grund, es aus der 135 Formulierung wegzulassen.
- *NCTC109/135 Basismedium (9172 und 9502) läßt die markierten (*) Komponenten weg. Siehe Medieneinführung für zusätzliche Information über dieses Basismedium.
- A Referenz 2 enthält 10,49 mg/l L-Cystin, 250 mg/l L-Cystein HCl, 16,44 mg/l L-Tyrosin
- B Aus pulverisiertem Medium weggelassen
- C Plaquetestmedium (2x) läßt Phenolrot und Glutamin weg und verdoppelt die Menge aller anderen Komponenten
- Selbstverständlich sind alle obigen Nährstoffquellen mit leichten Komponentenvariationen erhältlich sind, von denen einige als Nährstoffquellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
- Eine bevorzugte Nährstoffquelle zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfaßt Ca²&spplus; freies DMEM von etwa 90 bis etwa 10% und Ham's F12 von etwa 10% bis etwa 90% %. Eine besonders bevorzugte Quelle umfaßt Caz+ freies DMEM mit etwa 75% und Ham's F12 mit etwa 25%. Typischerweise umfassen die erfindungsgemäßen Medien zumindest etwa 90% und vorzugsweise mehr als 95% der Nährstoffquelle.
- Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Medium umfaßt:
- Insulin 5 ug/ml
- Transferrin 5 ug/ml
- Triidothyronin 20 pM
- Ethanolamin 1 · 10&supmin;&sup4; M
- o-Phosphorylethanolamin 1 · 10&supmin;&sup4; M
- Adenin 0,18 mM
- Selen 3 · 10&supmin;&sup8; M
- Strontium 1 mM
- Calcium 0,08 mM und
- Nährstoffquelle Ca²&spplus; freies DMEM von etwa 90 bis etwa 10% und Ham's F12 von etwa 10% bis etwa 90 %
- Falls erwünscht können Hydrocortison mit etwa 1, 1 mM, EGF mit 10 ng/ml, Progesteron mit 2 · 10&supmin;&sup9; M und/oder Choleratoxin mit etwa 9 ng/ml zugegeben werden, um die Wachstumsrate weiter zu beschleunigen oder die Lebensspanne weiter zu verlängern. Der pH des Mediums liegt typischerweise um den Neutralpunkt, beispielsweise etwa 6,8-7,4.
- Ein signifikantes Maß für die Effektivität eines Kulturmediums ist die Wachstumsrate eines Zelltyps, wie sie durch Populationsverdopplungen pro Tag angegeben wird. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Kultursysteme können Epithelzellen in Abwesenheit von Fütterzellen und Serum in niedriger Dichte kultiviert werden, um die Ausdehnung der Primärkultur auf über 50 Populationsverdopplungen mit einer Wachstumsrate zu erlauben, die mit der in einem Fütterzellsystem vergleichbar ist. Beispielsweise fallen Keratinozyten aus der Vorhaut eines Neugeborenen selten unter 0,5 Verdopplungen pro Tag in den erfindungsgemäßen Medien und Systemen, wobei sie sich auf eine Verdopplung pro Tag nach der Passage 6 mitteln und Wachstumsraten von 1,3 bis 2,0 Verdopplungen zwischen den Passagen 2 und 5 erreichen können (siehe spätere Tabelle 2). Wachstumsraten in einer solchen Größenordnung zeigen eine Populationsverdopplung alle 12-18 Stunden an.
- Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Systeme und Medien kann Calcium in einer physiologischen Konzentration unter Beibehaltung der basalen Zellschicht zugegeben werden, ein Ergebnis, das bisher nur mit 3T3 Systemen erreicht wurde. Daher erlauben die erfindungsgemäßen Kultursysteme und -medien die Zugabe von Calcium mit mehr als 1,0 mM ohne den Verlust einer proliferativen Zellpopulation und erlauben daher die Verwendung solcher Zellen zur Herstellung von lebenden Hautäquivalenten oder die Bildung von kontinuierlichen Schichten von Epidermiszellen, die zur Transplantation geeignet sind (siehe späteres Beispiel 6). Darüberhinaus ermöglicht es die Fähigkeit, die Calciumkonzentrationen ohne schädliche Wirkungen auf das Zellwachstum nun, Epidermiszellen in einer Mikroträgerkultur in großen Maßstab wachsen zu lassen (siehe späteres Beispiel 7). Beispielsweise muß in MCDB 153 der Calciumspiegel niedrig sein, um ein Zellwachstum zu erhalten, aber wenn der Calciumspiegel niedrig ist, haften die Zellen nicht an der Oberfläche des Mikroträgers, ein Nachteil, wenn der Mikroträger einer Scherkraft ausgesetzt wird. In den Rheinwald und Green 3T3 Systemen, siehe obige Literaturstelle, müßte der Mikroträger erst mit den 3T3 Zellen beschichtet werden und die Epithelzellen müßten dann auf den 3T3 Zellen wachsen.
- Die erfindungsgemäßen Medien werden derzeit aus Komponenten hergestellt, die leicht im Handel erhältlich sind, einschließlich der Nährstoffquelle, die bequemerweise Calcium-frei im Handel erhältlich ist. Darüberhinaus werden die Komponenten der vorliegenden Medien mittels Techniken hergestellt und zusammengesetzt, die dem Fachmann bekannt sind. Im Gegensatz dazu dürfte auf der Grundlage von Untersuchungen mit im Handel erhältlichen Äquivalenten zu MCDB 153 feststehen, daß nur ein begrenzter Erfolg bei der Herstellung dieser Äquivalente erreicht wurde.
- Die erfindungsgemäßen Systeme sind nicht nur mit dem 3T3 System vergleichbar, sondern in einigen Gesichtspunkten deutlich überlegen, einem der erfolgreichsten bisher bekannten Systeme für die Kultur von Epithelzellen. Die vorliegende Erfindung liefert ein Zellwachstumsmedium in Abwesenheiut von undefinierten Proteinen, das chemisch definiert ist und nicht von Serum oder Fütterzellen abhängt, um ein annehmbares Wachstum und eine annehmbare Vermehrung der kultivierten Zellen bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen Medien und Systeme ermöglichen die Etablierung von Primärkulturen mit Populationsverdopplungen (PDL) von etwa 0,5 bis etwa 2,0 pro 24 Stunden.
- Ein Vergleich der oben beschriebenen derzeit erhältlichen Medien mit den beanspruchten Medien und Systemen ist im folgenden gezeigt: Vergleich der Systeme
- PDL = Populationsverdopplung, CFE = Koloniebildungseffizienz, ECM = extrazelluläre Matrix, PDT = Populationsverdopplungszeit
- Es können verschiedene Substrate bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Kollagen, Fibronektin, Laminin, Heparansulfat, Proteoglycan und Gewebeäquivalente, wie sie in den Patenten beschrieben sind. Natives Kollagen Typ I aus der Rindersehne ist ein bevorzugtes Kollagensubstrat. In den beanspruchten Systemen kann das Wachstum unter bestimmten Bedingungen entweder mittels Fibronektin- oder Kollagen-beschichtetem Substrat gefördert werden (siehe Beispiel 3). Es kann vorteilhaft sein, beispielsweise Kollagen bei der Etablierung der Primärkultur oder der Etablierung von Zellen aus gefrorenen Beständen zu verwenden. Falls ein Substrat verwendet wird, muß es von hoher Qualität sein, da festgestellt wurde, daß schlecht beschichtete Platten mit entweder partiell abgebautem Fibronektin oder unebenem Kollagen auch das Zellwachstum und die Ausbreitung hemmen kann.
- Das Vorkommen eines Substrats, beispielsweise einer Matrixkomponente, scheint den Zellen zu erlauben, Kolonien zu etablieren, wenn die Bedingungen nicht optimal oder stringenter sind, beispielsweise eine niedrige Zelldichte bei der Etablierung von Zellen aus Gewebe oder möglicherweise bei einer Anwendung, bei der eine noch höhere Langlebigkeit erforderlich ist.
- Daher wurden Beispiele für neue Medien und Systeme für die Anzucht von Zellen, wie Epithelzellen, beschrieben und bereitgestellt. Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verstanden, die rein exemplarischer Natur sind und die nicht zur Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung verwendet werden sollen.
- In den folgenden Beispielen besteht das als mSBM bezeichnete Grundmedium aus den folgenden Bestandteilen:
- Hydrocortison 1, 1 uM
- Insulin 5 ug/ml
- Transferrin 5 ug/ml
- Triidothyronin 20 pM
- Ethanolamin 1 · 10&supmin;&sup4; M
- o-Phosphorylethanolamin 1 · 10&supmin;&sup4; M
- Adenin 0,18 mM
- Progesteron 2 · 10&supmin;&sup9; M
- Selen 3 · 10&supmin;&sup8; M
- Choleratoxin 9 ng/ml
- epidermaler Wachstumsfaktor 10 ng/ml
- Calcium-freies DMEM 75%
- Ham's F12 25%
- Falls nichts anderes angegeben ist, ist auch chelatbehandeltes fetales Rinderserum (cFBS) in einer Konzentration von 0,3% in mSBM enthalten. Obwohl cFBS keine notwendige Komponente des Mediums ist, wurde es verwendet, da es traditionell im Choleratoxinsupplement verwendet wurde, um eine längere Lagerung im gefrorenen Zustand ohne Aktivitätsverlust des Choleratoxins zu erlauben. Demnach liegen die Medien, die kein cFBS enthalten, innerhalb des Schutzumfangs der beanspruchten Erfindung, die cFBS enthalten, fallen aus der vorliegenden Erfindung heraus.
- Ein weiteres Medium, als emSMB bezeichnet, wird ebenfalls in den folgenden Beispielen verwendet, und besteht aus den oben angegebenen Komponenten mit den im folgenden angegebenen Konzentrationsveränderungen und zusätzlichen Komponenten:
- Triidothyronin Erhöht auf 1,002 · 10&supmin;&sup8; M
- Choleratoxin Erhöht auf 100 ng/ml
- Hypothalamischer Rinderextrakt (BHE) 50 ug/ml
- Im späteren Beispiel 8 wird Strontium (Sr) in bestimmten Fällen zum Medium gegeben und im späteren Beispiel 9 wird in bestimmten Fällen kein cAMP erhöhendes Mittel in das Medium eingearbeitet. Die Zellen werden gemäß Beispiel 10 ohne exogene cAMP erhöhende Mittel, Progesteron, Serum oder hypothalamischen Rinderextrakt angezogen. In Beispiel 11 werden die Zellen ohne EGF angezogen und in Beispiel 13 ohne Hydrocortison.
- Obwohl die Primärkulturen in emSBM etabliert wurden, ist kein cAMP erhöhendes Mittel, Serum, Progesteron, erhöhtes Triidothyronin oder BHE erforderlich, obwohl BHE in einigen Fällen ein verbessertes Wachstum liefert.
- Das oben beschriebene Medium wird typischerweise hergestellt, wie dies im folgenden beschrieben ist. Es sollte jedoch verstanden werden, daß die erfindungsgemäßen Komponenten mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt und zusammengefügt werden können, die mit ihren physikalischen Eigenschaften kompatibel sind. Erfindungsgemäße Medien sind steril. Sterile Komponenten werden gekauft oder durch herkömmliche Techniken nach der Herstellung sterilisiert. Es werden die richtigen Sterilverfahren in den folgenden Beispielen verwendet. Die Stammlösungen aller Komponenten können bei -20ºC gelagert werden, mit Ausnahme der Nährstoffquelle, die bei 4ºC gelagert werden kann.
- Alle Stammlösungen werden in der 500 fachen Konzentration der oben angegebenen Endkonzentration hergestellt. Hydrocortison (Sigma) wird in absolutem Ethanol gelöst und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Eine Stammlösung von Insulin, Transferrin und Triidothyronin (alle von Sigma) werden folgendermaßen hergestellt: Triiodthyronin wird zuerst in absolutem Ethanol : 1 N HCl von 2 : 1 gelöst. Insulin wird in verdünnter HCl (etwa 0,1 N) gelöst und Transferrin wird in Wasser gelöst. Die Drei werden dann gemischt und in Wasser in einer 500 fachen Konzentration verdünnt. Ethanolamin und o-Phosphorylethanolamin (beide von Sigma) werden in Wasser in 500 facher Konzentration gelöst und sterilfiltriert. Progesteron (Sigma) wird in absolutem Ethanol gelöst und mit Wasser verdünnt. Rinderserumalbumin (RSA) kann für eine längere Lagerung zur Erhaltung der Aktivität zugegeben werden. Selen (Sigma) wird wie Ethanolamin präpariert. Das Choleratoxin wird steril von Sigma bezogen und wird in Wasser gelöst. EGF wird steril von Biomedical Technologies Inc. bezogen und in PBS gelöst. Adenin ist schwierig zu lösen, kann aber durch viele dem Fachmann bekannte Verfahren gelöst werden. Steriles Calcium-freies DMEM wird von J. R. Scientific oder Hazelton bezogen. Ham's F 12 wird von M. A. Bioproducts bezogen. BHE (Collaborative Research, das heißt ECGS) wird in DMEM mit niedrigem Calciumgehalt gelöst. RSA kann zur Verlängerung der Lagerzeit der EGF Stammlösung zugegeben werden. DMEM und F12 werden vereinigt und die einzelnen Komponenten werden dann zur Vervollständigung des Mediums zugegeben. Das Medium kann entweder direkt nach der Herstellung verwendet oder bei 4ºC gelagert werden.
- Falls es gefroren gelagert wird, sollte EGF nicht vor der Verwendung zugegeben werden. Das entstehende Medium ist steril.
- Die Aktivitäten sowohl von BHE als auch von EGF werden auf einer Chargengrundlage ermittelt. Das in einem Medium, dem BHE oder EGF fehlt, erzielte Wachstum wird mit dem Wachstum im Medium verglichen, das diese Bestandteile in einem Konzentrationsbereich von etwa 0 bis etwa 50 ng/ml für EGF und von etwa 0 bis etwa 200 ug/ml für BHE enthält, um die Konzentration zu bestimmen, die das Wachstum maximal unterstützt.
- Vorhaut und anderes Gewebe, einschließlich Ohr und Abdomen, erhält man von Routinebiopsien und sie werden für 2 Minuten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, worin Gentamycin mit 50 pig/ml und Fungizon mit 1,25 mÄqu. enthalten ist. Die gesamten Gewebeproben werden dann für 1 min in 95% Ethanol gewaschen, um die Oberflächenkontamination zu entfernen, gefolgt von einem erneuten Waschen in der PBS- Gentamicin-Fungizonlösung. Die subkutanen Gewebe werden aseptisch entfernt und das Gewebe wird in der PBS- Gentamicin-Fungizonlösung gewaschen und in etwa 1 mm² große Stücke zerkleinert. Das zerkleinerte Gewebe wird bei 37ºC mittels einer Kollagenase-Trypsingewebemischung zerteilt. Die Komponenten des verwendeten Kollagenasezerteilungsgemisches sind folgende: Kollagenase 55,5 mg/ml, Trypsin 2,0 mg/ml, Glucose 0,375 mg/ml, Fungizon 1 mÄqu/ml und Gentamicin 50 jig/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Der Überstand des Verdaus wird entfernt und neutralisiert und frisches Enyzm wird zu den verbleibenden verdauten Stücken in Intervallen von 30 Minuten gegeben, bis das Gewebe vollständig zerteilt ist.
- Die Zellfraktionen, die eine gemischte Population an abgelösten Zellen enthalten, werden vereinigt, gezählt und mit 2,6 · 10&sup4;/cm² in T75 Kulturflaschen (mit 5ug/cm² Kollagen-beschichtet) mit einem Gesamtvolumen von 10 ml emSBM gegeben, das kein EGF enthält. Primärkulturen wie diese werden nach 7-17 Tagen konfluent. Einen Tag nach dem Plattieren wird das emSBM abgesaugt und durch frisches emSBM ersetzt, das 10 ng/ml EGF enthält. Die Medienwechsel werden mit den Zellen mittels EGF enthaltendem emSBM jeden dritten Tag durchgeführt, wobei der Tag der Plattierung als Tag 0 angenommen wird. Die Primärkulturen benötigen 7-17 Tage, um konfluent zu werden, wonach die Zellen weiter seriell kultiviert werden können, wie dies später in Beispiel 2 beschrieben ist, oder eingefroren und in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung gelagert werden können. Das Gefriermedium enthält LCDMEM als Grundlage mit 10% fetalem Rinderserum und 10% Dimethylsulfoxid (DMSO). Um eingefroren zu werden, werden die Zellen genauso wie in Beispiel 2 von der Platte abgelöst und gezählt, nach dem Zählen aber erneut herunterzentrifugiert und im Gefriermedium zwischen 2 · 10&sup6; und 5 · 10&sup6;/ml resuspendiert und in 1,8 ml Nunc-Kryoröhrchen aliquotiert. Nach einem Vorfrieren für 18-24 Stunden, werden die Röhrchen in einen Tank mit flüssigem Stickstoff überführt bis sie benötigt werden. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Die Zellebensfähigkeit beträgt normalerweise über 90 %.
- Die in Tabelle 1 verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
- "HEP" steht für humane Epithelzellen, "n" steht für Vorhautzellen von Neugeborenen, "NF" gefolgt von einer Zahl steht für humane Epidermiszellen, die von einer anderen Quelle als der Vorhaut stammen. Tabelle 1 Etablierung von Primärkulturen mittels verbessertem mSBM
- * Berechnet auf der Grundlage der mittleren Koloniebildungseffizienz von 0,5% für Primärzellen, die aus einem gemischten Zellverdau erhalten wurden
- Humane Epidermiszellen in T75 Kulturflaschen, die wie im obigen Beispiel 1 erhalten wurden, werden in eine Impfbank gegeben und das Medium wird abgesaugt und durch 2 ml/60 mm Platte oder 5 m/JT75 Trypsinversen (200 mg Versen (EDTA) und 500 mg Trypsin/Liter in einer ausgeglichenen Salzlösung (ohne Calcium oder Magnesium, M. A. Bioproducts) ersetzt. Die Kulturflaschen werden bei 37ºC für etwa drei Minuten oder bis sich die Zellen von der Oberfläche der Platte ablösen, inkubiert. Dann werden 2 ml/60 mm Platte oder 5 ml/T75 Sojabohnentrypsininhibitor (2,5 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, Gibco) zugegeben. Mittels einer Pipette wird die Oberfläche der Kulturflaschen, wo die Zellen gewachsen sind, angesprüht, um alle haftenden Zellen abzuspülen. Die Zellsuspension wird in ein Röhrchen pipettiert und für fünf Minuten bei 1200 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und läßt nur das Zellpellet zurück. Das Pellet wird in einem bequemen Volumen mSBM ohne EGF zum Zählen suspendiert (gewöhnlich reichen 5 ml). Nach dem Zählen der Zellen werden 8833 Zellen/cm² (2,5 · 10&sup5; /60 mm Platte) in einem Endvolumen von 4 ml/60 mm Platte mittels mSBM ohne EGF ausgebracht. Die Zellen werden bei 37ºC in 10% CO&sub2; inkubiert. Nach 24 h wird EGF bis 10 ng/ml zugegeben. Das Medium wird jeden dritten Tag durch frisches Medium (mit EGF) ersetzt, wobei der Plattierungstag der Tag 0 ist. Die Zellen werden nach 5-7 Tagen konfluent und zu diesem Zeitpunkt werden sie erneut subpassagiert.
- Die in mSBM kultivierten Keratinozyten sind sehr mobil, bilden diffuse Kolonien und daher entspricht die Koloniebildungseffizienz etwa der Plattierungseffizienz. Die Plattierungseffizienzen, wie sie durch Zellzählung 24 Stunden nach dem Animpfen bestimmt wurden, betragen routinemäßig 30% bis 35% bei niedriger Passage (P:3 oder P:4), während 100% Plattierungseffizienz oder mehr häufig nach 24 Stunden wahrscheinlich aufgrund einer besonders kurzen lag-Phase zu diesem Zeitpunkt beobachtet wird (Tabelle 2).
- Keratinozyten, die aus Vorhäuten von Neugeborenen erhalten werden (Stämme FS16, B009 und B013, Tabelle 2) halten eine Population von primären, kleinen, runden Zellen (es wurde von anderen Forschern gezeigt, daß dies eine schnell proliferierende Kultur darstellt) bis zur Passage 6 aufrecht (mehr als 25 Populationsverdopplungen oder 6400 bis 333000 fache Erhöhung der Zellzahl). Ähnlich werden Keratinozyten von einem 2 Jahre alten Spender bis zur Passage 6 aufrechterhalten und ergeben 24 Populationsverdopplungen oder etwa einen 4600 fachen Anstieg der Zellzahl. Tabelle 2
- a) Insgesamt kombiniert P: 1 und P: 2
- b) Zellen von Gewebeexplantaten, Anzahl der Verdopplungen kann nicht bestimmt werden
- c) Mittel aus den kombinierten Passagen 1 und 2
- Humane Keratinozyten werden in mSBM (0,08 mM Calcium) oder mSBM mit 1,8 mM Ca²&spplus; mit jeweils 0,3% und 1,0% Serum gemäß den oben beschriebenen Verfahren kultiviert. Die Zugabe von Calcium zum Medium führt zu einer Veränderung der Morphologie. Wenn viel Calcium vorhanden ist, wachsen die Zellen in dicht gepackten Kolonien, während immer noch ein hoher Anteil an kleinen, proliferativen Zellen erhalten bleibt. Man beobachtet keine deutliche Verringerung der Wachstumsrate, wenn die Serumkonzentration unter 1 % gehalten wird. Die Zellausbeuten bei Konfluenz sind aufgrund der durch das viele Calcium ermöglichten Schichtung signifikant höher als bei den Zellen mit Calcium.
- Die Fähigkeit zur Variation der Calciumkonzentration unter Beibehaltung einer proliferativen Kultur erlaubt die Durchführung von Experimenten, die vorher nicht möglich waren, wie die Untersuchung der Wirkungen von Wachstumsfaktoren und ihre Induktion der Differenzierung, Proliferation oder Wachstumshemmung in Bezug auf Calcium, einem bekannten Induktor der Enddifferenzierung in kompetenten Zellen. Ein Beispiel eines solchen Experiments ist in Tabelle 3 gezeigt, wo die Wirkungen von TGFß in Bezug auf Calcium untersucht wurden. Es wurde beobachtet, daß die Wirkung von TGFß sogar in Gegenwart von Calcium reversibel ist. Tabelle 3
- Die Tabelle zeigt die Daten von 2 getrennten Experimenten, die die Wirkungen von Calcium und TGFß auf humane Keratinozyten in mSBM veranschaulichen.
- a) % env = % durch Ionophoren induzierte Hüllen
- b) Calcium und TGFß werden entfernt und die Zellen werden für weitere 48 h in mSMB kultiviert, um die Gewinnung von Zellen zu zeigen. Anmerkung: Die Unterschiede in % induzierter Hüllen zeigen die Wirkung der TGFß Behandlung ± Ca²&spplus;, die nicht mit dem Wachstum zusammenhängt.
- c) Das Medium enthält 0,3% cFBS, 5 ng/ml TGFß werden zugegeben, wo dies angegeben ist ((+) T), 1,8 mM Calcium wird zugegeben, wo dies angegeben ist ((+) Ca²&spplus;.
- Humane Epidermiszellen (HEP) werden mit 2,7 · 10&sup5; Zellen/28,3 cm² in Kollagen-beschichteten Gewebekulturschalen in mSBM mittels verschiedener Konzentrationen chelatbehandeltem fetalem Rinderserum (cFBS) plattiert und wie hierin oben beschrieben kultiviert. Die 24 h Plattierungseffizienzen, die schließlichen Zellausbeuten, der Prozentsatz an Zellen im Bereich von 9-14 um Duchmesser (bekannt als kleine, proliferative Zellpopulation, Barrandon und Green, siehe obige Literaturstelle) werden gemessen und sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Obwohl eine erhöhte Serumkonzentration die schließlichen Zellausbeuten nicht wesentlich beeinflußt, erhöht sie die Plattierungseffizienz in einem kleinen Ausmaß. Es findet jedoch eine Verringerung im Prozentsatz der kleinen proliferativen Zellen mit der erhöhten Serumkonzentration statt. Diese Veränderung in der Zellpopulation kann auch durch Phasenkontrastmikroskopie gesehen werden. Tabelle 4
- Diese Zellen können in mSBM und emSBM mit verschiedenen Serumkonzentrationen von serumfrei bis zu Serumkonzentrationen von 5% oder höher angezogen werden. Jedoch fördert das Serum die Enddifferenzierung oder Alterung der Zellpopulation, wie dies durch den deutlichen Verlust von Zellen im Bereich von 9-14 um sogar mit einer Erhöhung des Serums auf nur 1% gezeigt wird. Dies tritt trotz der Tatsache auf, daß das Calcium durch Chelatbildung aus dem Serum entfernt wurde. Diese Feststellungen liefern weiter die Erkenntnis, daß das Serum Faktoren enthält, die entweder direkt oder indirekt die Zellproliferation und -differenzierung beeinflussen und die nicht mit Calcium zusammenhängen.
- Ein Substrat entweder Kollagen vom Typ I oder Fibronektin, ist bei der Etablierung von Epidermiszellen als Primärzellen und aus eingefrorenen Vorräten mittels entweder mSBM oder emSBM nützlich. Kollagen wird routinemäßig bei der Kultivierung von humanen epidermalen Keratinozyten mittels mSBM verwendet. Es wurde jedoch eine Untersuchung durchgeführt, um die tatsächliche Substratabhängigkeit und die Wirkung des Substrats auf die Kulturlebensspanne zu bestimmen.
- Gefrorene Vorräte von humanen epidermalen Keratinozyten, die als Primärzellen in emSBM mittels eines Kollagensubstrats angezogen wurden, werden gemäß den hierin oben beschriebenen Verfahren sowohl mit (+CN) als auch ohne Kollagen (-CN) auf Platten ausplattiert und in mSBM angezogen. Bei Konfluenz werden sowohl die +CN Zellen auf Platten mit und ohne Kollagen (siehe Tabelle 5A) als auch die -CN Zellen auf Platten mit und ohne Kollagen (siehe Tabelle 5B) passagiert. Die allgemeine Morphologie, die Plattierungseffizienz nach 4 Stunden und die Zellgrößenverteilung werden bei jeder Passage bestimmt. Die Plattierungseffizienzen über 100% zeigen die ungewöhnlich kurze lag-Periode vor der erneuten Initiierung des Wachstums an, das auftritt, wenn Keratinozyten in die beanspruchten Medien passagiert werden. Zellen aus beiden Bedingungen werden plattiert und unverzüglich geerntet, wobei direkte Vergleiche in den Tabellen vorgenommen werden. Die Prozentsätze an Zellen mit einem Durchmesser von 9-14 um zeigen den Prozentsatz an undifferenzierten, proliferativen Zellen in der Population (Barrandon und Green, siehe obige Literaturstelle).
- Zellen, die aus gefrorenen Primärkulturen ohne Kollagen etabliert werden, zeigen eine leichte Abnahme bei der Plattierungseffzienz gegenüber den Zellen, die auf Kollagen plattiert wurden. Wenn die Zellen ohne Kollagen (-CN) weiter auf Platten mit (+CN) oder ohne (-CN) passagiert werden, ist die Plattierungseffizienz durchweg besser bei der (+CN) Bedingung. Jedoch sind die mit -CN angezogenen Zellen zum Wachstum bis zur Konfluenz und zur Passage fähig (siehe Tabelle 5B).
- Zellen, die mit Kollagen gehalten werden und dann auf Platten mit oder ohne Kollagen passagiert werden, zeigen variable Plattierungseffizienzen ohne klaren Vorteil oder Nachteil gegenüber der Verwendung von oder dem Verzicht auf Kollagen für die anschließende Passage (siehe Tabelle 5A).
- Zellen, die angezogen und bis zur Passage 8 auf Kollagen angezogen werden, zeigen einen Abfall in der Plattierungseffizienz bei Passage 8 (entspricht etwa 29,4 Populationsverdopplungen). Zellen, die in Abwesenheit von Kollagen angezogen werden, zeigen einen Abfall in der Plattierungseffizienz zwischen P6 und P7 (entspricht etwa 19-22 Populationsverdopplungen).
- Ein Stamm Epidermiszellen, der in viel Serum (5%) mit 3T3 Fütterzellen etabliert wurde (siehe beispielsweise Rheinwald und Green, obige Literaturstelle), wird bei P4 aus geforenen Vorräten auf Platten mit und ohne Kollagen plattiert und zeigt keinen signifikanten Unterschied in der Plattierungseffizienz. Darüberhinaus wird beobachtet, daß man eine signifikant niedrigere Plattierungseffizienz in diesem Experiment erhält, wie wenn auf mSBM angezogene Zellen verwendet werden (siehe Tabelle 5A und 5B).
- Kollagen scheint den Prozentsatz der Zellpopulation, die in den Bereich von 9-14 um fällt, das heißt die proliferative Zellpopulation bis zur Passage 7 (-CN) oder Passage 8 (+CN) nicht zu beeinflussen (siehe Tabelle 5C). Tabelle 5: Plattierungseffizienzen für das +/- Kollagenexperiment Tabelle 5A: Plattierunnseffizienzen von +CN/-CN nach der Passage auf die +CN Bedingung Tabelle 5B: Plattierungseffizienzen von +CN/-CN nach der Passage auf die -CN Bedingung Tabelle 5C: HEP 026-7 P4 Plattierungseffizienzen
- Es werden lebende Hautäquivalente mittels auf mSBM angezogenen Keratinozyten mit viel Serum (5%) und viel Calcium (1,8 mM) hergestellt. Zu bemerken ist, daß dies nicht mit auf MCDB 153 angezogenen Keratinozyten durchgeführt werden kann. Die Epidermis entwickelt sich normal mit einer Schichtung und Differenzierung, während eine Basalschicht erhalten bleibt.
- Es wird ein lebendes Hautäquivalent mittels auf mSBM angezogenen Keratinozyten hergestellt, die auf Hautäquivalente gemäß etablierter Verfahren plattiert werden. Das Hautäquivalent kann dann für 2 Tage in mSBM wachsen, wonach Ca²&spplus; zugegeben wird, um die Schichtung zu erlauben. Eine fortgesetzte Kultur des Hautäquivalents in mSBM, 0,3% cFBS und Ca²&spplus; ergibt eine gut organisierte, differenzierte Epidermisschicht.
- Lagen aus geschichteten Epidermiszellen, die zur Transplantation usw. geeignet sind, werden ebenfalls durch die Etablierung der Zellen in mSBM auf Kollagen hergestellt, wobei die Calciumkonzentration bei Konfluenz auf 1,8 mM erhöht wird, 4 Tage unter täglichem Füttern mittels mSBM mit 1,8 mM Ca²&spplus; aufrechterhalten wird, und dann eine Entfernung der kohärenten Zellage mittels Kollagenase erfolgt.
- Humane epidermale Keratinozyten werden erfolgreich auf Kollagen-beschichtete, quervernetzte Gelatinemikroträger mit einer hohen Effizienz mittels mSBM Medium plattiert, das eine Calciumkonzentration von 0,08 mM und BHE mit einer Konzentration von 50 ug/ml aufweist. Mittels eines 250 ml Belcokulturgefäßes mit 30 Upm und zeitweisem Rühren (2 Minuten an, 8 Minuten aus) wird das Animpfen von 5,1 · 10&sup6; humanen epidermalen Keratinozyten (HEPs) mit hoher Effizienz (> 50%) in einem kleinen Mediumvolumen (75 ml) erreicht, das 0,5 g Gelatinekügelchen enthält. Die Gelatinekügelchen werden folgendermaßen hergestellt: Eine Äquilibrierung mit mSBM gefolgt von einer Beschichtung mit etwa 9,5 mg Rindersehnenkollagen über Nacht in 100 ml reinem Wasser und ein anschließendes Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von einem Calciumfreien DMEM. Nach einer Woche werden konfluente Kügelchen mit Trypsin-EDTA geerntet und man erhält 2,1 · 10&sup7; Zellen. Diese Zellen weisen bei einer Plattierung mit Standardkulturbedingungen und mSBM in T25 Kulturflaschen eine Plattierungseffizienz von mehr als 100% auf, wie dies durch Ernten und Zählen 24 Stunden später bestimmt wird.
- Dieses Verfahren wird mittels eines Keratinozytenzellstamms bei Pasaage 5 wiederholt, der als Hep 047 bezeichnet wird. Die Zellen werden mit 6 · 10&sup6; in zwei getrennte Rollkulturflaschen plattiert, die 0,25 Gramm Gelatinekügelchen (etwa 1000 cm² Oberfläche) in 150 ml Medium enthalten. Die Zellausbeuten aus den zwei Kulturflaschen betragen nach 6 Tagen 6,2 · 10&sup7; und 5,8 · 10&sup7;. Daher wird durchschnittlich ein zehnfacher Anstieg der Zellzahl erreicht.
- Ein weiteres Experiment zeigt die Wirksamkeit des Kügelchen auf Kügelchen Transfers von Zellen zur Erleichterung der Passage ohne die Verwendung einer Protease. Ein Stamm, der als Hep 038 bei Passage 4 bezeichnet wird, wird auf runde Kollagen-beschichtete Gelatinekügelchen plattiert. Dann werden nach 4 Tagen un regelmäßig geformte Kollagen-beschichtete Gelatinekügelchen zur Kultur gegeben. Die Kügelchen werden nach zwei weiteren Tagen mikroskopisch untersucht. Die Zellen heften sich sowohl an die runden Gelatinekügelchen als auch an die unregelmäßig geformten Gelatinekügelchen.
- Es werden Strontium mit 1 mM und Magnesium mit 3 mM in mSBM +/- hypothalmischen Rinderextrakt zur Verbesserung des Zellwachstums und der Größenverteilung bei humanen epidermalen Keratinozyten bei Passage 4 verglichen. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse aus dreifach angesetzten Kulturen.
- Eine Strontiumdosis-abhängige Reaktion wird ebenfalls für einen unterschiedlichen Keratinozytenstamm bestimmt. 1 mM Sr erhöht die Zellausbeute von 1,7 · 10&sup6; auf 2,1 · 10&sup6;. Die 9-14 um Verteilung wird von 20% auf 26% erhöht. In einem getrennten Experiment zeigt ein weiterer Stamm eine Verbesserung in der Zellausbeute von 1,45 · 10&sup6; auf 2,66 · 10&sup6; mit 1 mM Sr und eine Verringerung der Verdopplungszeit von 33,9 auf 28,1 Stunden.
- Primäre Explantatkulturen werden mittels der folgenden modifizierten mSBM Formulierung etabliert:
- Hydrocortison 1,1 uM
- Insulin 5 ug/ml
- Transferin 5 ug/ml
- Triiodthyronin 20 pM
- Ethanolamin 1 · 10&supmin;&sup4; M
- o-Phosphorylethanolamin 1 · 10&supmin;&sup4; M
- Adenin 0,18 mM
- Selen 5,26 · 10&supmin;&sup8;M
- Epidermaler Wachstumsfaktor 10 ng/ml
- Ca²&spplus;-freier DMEM 75%
- Hams F 12 25%
- Strontium 1 mM
- Die Modifizierung besteht aus dem Weglassen von Progesteron (das zur Erniedrigung der cAMP Spiegel beitragen könnte) und cAMP erhöhender Mittel und der Zugabe von Strontium, das in mSBM wachstumsfördernde Wirkungen aufweist (siehe Beispiel 8).
- Vorhaut von Neugeborenen wird vom Fett und subkutanem Gewebe befreit und in 1-2 mm² Stücke geschmtten. Explantatkulturen werden im obigen Medium mit der Zugabe von hypothalamischem Rinderextrakt (50 ug/ml) (BHE), außer wo dies angegeben ist, etabliert.
- Die Ausbeuten aus dem Explantatwachstum sind in Tabelle 9A gezeigt.
- Die Zellen werden dann in Kulturschalen mit einem Durchmesser von 100 mm mit 3 · 105 Zellen/Schale passagiert, wobei die Medienbedingungen konstant gehalten werden. Die Ausbeuten aus der Sekundärkultur (etwa nach 1 Woche geerntet) sind in Tabelle 9B gezeigt. Tabelle 9A Etablierung von Primärkulturen in mSBM mittels Wachstum aus Explantaten*
- * Die Zellen stammen aus Explantaten von neonataler Vorhaut. In den meisten Fällen wird nicht die gesamte Vorhaut für die Explantatkultur verwendet, sondern es wird ein Teil zur Derivatisierung von dermalen Fibroblastenstämmen reserviert.
- # Stämme, die ohne hypothalamischen Rinderextrakt (EHE) etabliert wurden Tabelle 9B Wachstum von Sekundärkulturen in mSBM
- * Es wird nur ein kleiner Teil der Zellen aus der Primärkultur ausplattiert. Falls beispielsweise alle primären Keratinozyten von Stamm B050 als sekundäre Zellen plattiert wurden, würde die gesamte Zellausbeute 1,14 · 10&sup9; nach insgesamt 21 Tagen in Kultur betragen.
- # Stamm ohne hypothalamischen Rinderextrakt (BHE) etabliert und kultiviert.
- Humane Epidermiszellen aus drei verschiedenen Quellen werden aus einer Anzucht von Hautexplantaten in Kollagen-beschichteten Gewebekulturschalen in einer Modifizierung des mSBM Grundmediums etabliert, dem Progesteron fehlt und das 1 mM SrCl&sub2; enthält. Es werden Explantate sowohl mit als auch ohne Choleratoxin, einem starken cAMP erhöhenden Mittel, chelatbehandeltem Serum vom neugeborenen Kalb und hypothalamischem Rinderextrakt etabliert, um die Wirkungen dieser drei Mittel auf die Entwicklung von Primärkulturen und die anschließenden Passagen zu untersuchen.
- Zellen, die als Explantatanzuchten entwickelt wurden, werden in allen drei Bedingungen untersucht. Die Zellausbeute wird über sieben serielle Passagen bei allen Bedingungen beobachtet. Die Fig. 1 und 2 zeigen die Ausbeute / Passage, wie sie als Zellzahl errechnet wird, die man erhält, falls alle Zellen einer gegebenen Bedingung passagiert werden. In den Fig. 1 und 2 steht "S" für chelatbehandeltes Serum (0,3%), "CT" steht für Choleratoxin (9 ng/ml) und "BHE" steht für hypothalamischen Rinderextrakt (50 ug/ml).
- Es wird beobachtet, daß weder Serum, Choleratoxin noch hypothalamischer Rinderextrakt für die Etablierung von Primärkulturen und für die serielle Passage von normalen humanen Keratinozyten erforderlich sind. Die Kontrollkulturen, denen diese drei Mittel fehlen, ergeben eine Ausbeute von 1 · 10¹&sup0; nach nur 34 Tagen Kultivierung und sechs aufeinanderfolgenden Passagen. Die Kontrollbedingung zeigt auch ein verbessertes Wachstum gegenüber Kulturen, die in Gegenwart von Serum alleine und Serum mit Choleratoxin etabliert und angezogen werden.
- Während sowohl hypothalamischer Rinderextrakt als auch Choleratoxin bei einer Verwendung ohne Serum zur Erhöhung der schließlichen Zellausbeute fähig sind, ist der hypothalamische Rinderextrakt zur Verbesserung der Zellausbeute in einem größeren Ausmaß wie auch zur Erhöhung der Anzahl an Passagen fähig, während die Populationszeiten linear bleiben. Zusätzlich wird gezeigt, daß der hypothalamische Rinderextrakt zum Ausgleich der negativen Auswirkungen des Serums in einem viel größeren Ausmaß fähig ist, als das Choleratoxin. Choleratoxin scheint keinen nützlichen Effekt zu haben, falls hypothalamischer Rinderextrakt mit oder ohne Serum enthalten ist.
- Daher sind weder Serum, hypothalamischer Rinderextrakt noch cyclisches AMP erhöhende Mittel für die Etablierung und die serielle Passage von humanen Keratinozyten erforderlich.
- Als B063 bezeichnete Keratinozyten werden in der mSBM Formulierung von Beispiel 9 mit BHE etabliert und angezogen und anschließend zur Lagerung am Ende der Passage 2 eingefroren. Diese Zellen werden aufgetaut und in 60 mm Schalen mit 1 · 10&sup5;/Schale im obigen Medium ohne BHE angeimpft. Die Hälfte der Schalen erhält EGF mit 10 ng/ml zwei Stunden nach dem Animpfen. Die Zellen werden geerntet und am Ende der Passage 3 gezählt und diejenigen, die ohne EGF angezogen wurden, werden erneut plattiert und bis zur Konfluenz angezogen. Die Daten (Tabelle 1) zeigen, daß Keratinozyten gewünschtenfalls in mSBM ohne EGF angezogen werden können und daß in manchen Fällen das Wachstum mit dem vergleichbar ist, das man mit EGF beobachtet. Tabelle 11 Wirkung von EGF auf die Zellausbeute von HEp B063
- Wenn eine minimale Supplementierung erwünscht ist, ist Hydrocortison nicht erforderlich und dessen Abwesenheit kann dann bevorzugt sein.
- Dies wird durch Animpfen von Stamm B063 Keratinozyten der Passage 3 mit 1,7 · 10&sup5;/60 mm Schale im Medium von Beispiel 9 mit entweder 0, 0,04,0,2,0,4 oder 0,8 ug/ml Hydrocortison gezeigt. Die Platten werden nach 24 Stunden geerntet, um die mittlere Plattierungseffizienz zu bestimmen und dann erneut nach 5 Tagen, um die Wachstumsrate zu bestimmen. Die Zellausbeuten sind bei allen Bedingungen vergleichbar. Die Verdopplungszeiten werden für die vier Tage zwischen diesen zwei Bestimmungen berechnet (Tabelle 12). Tabelle 12 Wirkung von Hydrocortison auf B063 Keratinozyten der Passage 3
Claims (30)
1. Chemisch definiertes Zellkulturmedium, das enthält
a) Insulin von etwa 0,5 bis etwa 50 ug/ml oder einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor von etwa 10&supmin;¹&sup0; bis etwa
10&supmin;&sup8; M,
b) Transferrin von etwa 0,05 bis etwa 50 ug/ml
c) Triiodothyronin von etwa 2 bis etwa 200 pM,
d) zumindest eines von o-Phosphorylethanolamin und Ethanolamin von etwa 10&supmin;&sup6; bis etwa 10&supmin;² M,
e) Calcium von etwa 0,005 bis etwa 2 mM, und
f) eine Nährstoffquelle, die aus mindestens einem von DMEM, sMEM, MEM, M199, RPMI 1640, Ham's F12,
Ham's F10, NCTC 109 und NCTC 135 bei Abwesenheit von undefiniertem Protein ausgewählt ist.
2. Zellkulturmedium nach Anspruch 1, worin die Nährstoffquelle 75% calciumfreies DMEM und 25% Ham's F12
ist.
3. Zellkulturmedium nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das ferner Hydrocortison von etwa 0,04 bis etwa 4 ug/ml
enthält.
4. Zellkulturmedium nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner einen epidermalen Wachstumsfaktor
von etwa 1 bis etwa 50 ng/ml enthält.
5. Zellkulturmedium nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner ein cyclisches AMP erhöhendes Mittel
enthält, das aus zumindest einem von Choleratoxin, Foreskolin, Isoproterenol, Methylisobutylxanthin, Dibutyryl
cAMP, Theophyllin, Koffein und Pertussistoxin von etwa 10&supmin;&sup9; bis etwa 10&supmin;³ M ausgewählt ist.
6. Zellkulturmedium nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner Adenin von etwa 0,02 bis etwa 2 mM
enthält.
7. Zellkulturmedium nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner Progesteron von etwa 2 · 10&supmin;¹&sup0; bis etwa
2 · 10&supmin;&sup8; M enthält.
8. Zellkulturmedium nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner Selen von etwa 10&supmin;&sup9; bis etwa 10&supmin;&sup7; M
enthält.
9. Zellkulturmedium nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner einen Wachstumsfaktor enthält, der
ausgewählt ist aus saurem Fibroblastenwachstumsfaktor, basischem Fibroblastenwachstumsfaktor und
Keratinozytenwachstumsfaktor von etwa 10&supmin;¹&sup0; bis etwa 10&supmin;&sup6; g/ml.
10. Zellkulturmedium nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Medium für die Kultivierung von
Epithelzellen ist.
11. Zellkulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das Medium für die Kultur von epidermalen
Zellen oder Keratinozyten ist.
12. Zellkultursystem, das ein chemisch definiertes Zellkulturmedium nach Anspruch 1 und ein Substrat für die
Zellen enthält, das umfaßt Plastik, Glas, Kollagen, Fibronektin, Laminin, Heperansulfatproteoglycan, Mikroträger,
die beschichtet sind mit Kollagen, Fibronektin, Laminin oder Heparansulfatproteoglycan oder ein
Gewebeäquivalent, das durch ein Verfahren hergestellt wird, gekennzeichnet durch
a) Kombination einer Kollagenlösung mit einem kontraktilen Mittel unter Bedingungen, die ein Gelgemisch
bilden, das das kontraktile Mittel innerhalb des Gelgemisches dispergiert aufweist,
b) Aufrechterhalten des in Schritt (a) hergestellten Gelgemisches unter Bedingungen, die eine Kontraktion des
Gelgemisches unter Bildung eines Gewebeäquivalents erlauben.
13. System nach Anspruch 12, worin das Kollagen natives Typ 1 Kollagen ist, das von Rindersehnen stammt.
14. Verfahren zur Kultivierung von Epithelzellen, gekennzeichnet durch Versorgen der Epithelzellen mit einem
Wachstumssubstrat eines Zellkultursystems gemäß Anspruch 12 und Aufrechterhalten des Zellkultursystems unter
Bedingungen, die das Zellwachstum fördern.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Zellwachstum durch eine Populationsverdopplungszeit von etwa 16
bis 33 Stunden gekennzeichnet ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Zellen seriell kultiviert werden, um etwa 20 bis etwa 50
Populationsverdopplungen zu erhalten.
17. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Verfahren ferner die Zugabe von Calcium in einer Konzentration von
mehr als etwa 1,0 mM umfaßt, um die Schichtung und Differenzierung der Zellen unter Beibehaltung einer
Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis etwa 60% zu ermöglichen.
18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, worin das Inokulum an Zellen etwa 30 bis etwa 1000 Zellen/cm² enthält.
19. Verfahren zur Kultivierung von Epithelzellen, gekennzeichnet durch Beimpfen eines Mediums nach Anspruch
1 mit Epithelzellen und Halten der Zellen und des Mediums unter Bedingungen, die das Zellwachstum fördern.
20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das Zellwachstum durch eine Populationsverdopplungszeit von etwa 16
bis etwa 33 Stunden gekennzeichnet ist.
21. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Zellen seriell kultiviert werden, um etwa 20 bis etwa 50
Populationsverdopplungen zu erhalten.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, worin das Inokulum an Zellen etwa 30 bis etwa 1000 Zellen enthält.
23. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Zellwachstum die schnelle Ausdehnung der Primärzellen mit einer
Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis etwa 100% und einer Proliferationskapazität von mehr als 50
Verdopplungen umfaßt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, ferner gekennzeichnet durch die Zugabe von Calcium mit mehr als 1,0 mM, um
die Schichtung und Differenzierung der Zellen unter Beibehaltung einer Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis
etwa 60% zu ermöglichen.
25. Verfahren zur Kultivierung von Epithelzellen, gekennzeichnet durch das Plattieren der Epithelzellen auf
Kollagen-beschichtete Mikroträger in einem Zellkultursystem nach Anspruch 12, worin die Zellen mit einer
Plattierungseffizienz von etwa 20 bis etwa 40% plattiert werden und die Mikroträger und plattierten Zellen unter
Bedingungen gehalten werden, die das Wachstum fördern.
26. Verfahren nach Anspruch 25, worin eine Koloniebildungseffizienz von etwa 20 bis etwa 100%
aufrechterhalten wird, wenn das Zellwachstum konfluent wird.
27. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Calciumkonzentration während der Proliferationsphase von 0,08 auf
etwa 1,8 mM erhöht wird, wenn das Zellwachstum die Konfluenz erreicht, um die Haftung der Zellen an die
Mikroträger zu erhöhen.
28. Verfahren zur Herstellung von Keratinozyten, gekennzeichnet durch die Schritte
a) Plattierung eines Substrats in einem Zellkultursystem nach Anspruch 12 mit Keratinozyten,
b) Erhaltung des Wachstumssubstrats von Schritt a) unter Bedingungen, die das Zellwachstum fördern, und
c) Zugabe von Calcium zum Medium in einer physiologischen Konzentration und Erhaltung des Substrats von
Schritt b) unter Bedingungen, die eine Schichtung von Keratinozyten erlauben.
29. Verfahren zur Herstellung einer Keratinozytenschicht, gekennzeichnet durch die enzymatische Ablösung einer
Keratinozytenschicht, die gemäß Anspruch 28 hergestellt wurde.
30. Verfahren zur Epidermisierung einer Dermis, gekennzeichnet dwch
a) Beimpfung eines lebenden Gewebeäquivalents mit Epidermiszellen,
b) Aufrechterhaltung des lebenden Gewebeäquivalents von Schritt a) in einem Zellkulturmedium gemäß Anspruch
1 und unter Bedingungen, die die Entwicklung einer Epidermis fördern, und
c) Zugabe von Calcium, um das Medium etwa auf eine physiologische Konzentration zu bringen und
Aufrechterhaltung des lebenden Gewebeäquivalents von Schritt b) unter Bedingungen, die die Schichtung der Epidermis
erlauben.
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