JPH0387174A - 細胞培養基 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞増殖用培地及び系、並びにかかる培地及
び系の製造及び使用方法に係る。

正常な哺乳類細胞の持続性即ち長期間の成長及び増殖に
現在使用されている殆どの培地または系においては、か
かる成長及び増殖の支持に必要なタンパク質を供給する
ために、不確定タンパク質を系に混入するかまたは養育
細胞を使用している。

かかる不確定タンパク質の存在は培養された細胞の所望
の最終用途を妨害するおそれがあるため、不確定タンパ
ク質の存在を最小に抑制できる条件下に細胞を培養する
のが望ましい。例えば、火傷患者の皮膚移植片として使
用される生体皮膚等価物を調製するために用いられた培
養表皮細胞中に不確定タンパク質が存在するとき、かか
るタンパク質が免疫反応を生起する可能性もあるので、
生体皮膚等価物が所望用途に適さないことも予想される
。かかる生体皮膚等価物を与える表皮細胞を培養するた
めにマウス３Ｔ３養育細胞を使用する場合、表皮に捕獲
された残留３Ｔ３細胞またはその一部は種交差免疫反応
（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）を生じる可能性が極めて大きい。かかる生
体皮膚等価物の製造にウシ血清を使用する場合にも同様
の免疫反応が生じ易い。

従って、細胞の持続性成長及び増殖には、不確定タンパ
ク質を極めて低濃度で含むかまたはより好ましくは全く
含まない化学的に確定された細胞培養基及び系が必要で
ある。「確定」なる用語は、成分中に微量の汚染物を含
有してはいるけれども、意図的に添加された特性未決定
の補足添加物を全く含有していない培地を意味する。

上記のごとき要望に応える細胞増殖用の化学的に確定さ
れた細胞培養基が多数開発された。かかる培地としては
、改質イーグル培地（以後ＭＥＭで示す）、Ｈａｍ’　
ｓ　ｆ４２培地、ダルベツコの改質イーグル培地（以後
ＤＭＥＭで示ず）、ＭＣＤＢ　１５３及び培地１９９が
ある。しかしながら、既存の化学的に確定された培地に
おいて多くの細胞の培養を成功させるには、血清または
血清由来の因子のごとき補足タンパク質の添加または養
育細胞の使用が必要であることが知見された。この結果
として培地に不確定成分が導入されることになる。細胞
培養系に補足の複合タンパク質を添加すると不確定タン
パク質が導入されるだけでなく細胞培養のコストも上が
る。

上皮細胞の培養及びときにはその成熟の際に遭遇する問
題は、現在人手てきる培養基及び系の欠点を明らかにす
る。表皮細胞のごとき上皮細胞は、１ 生体皮膚等価物の製造、及び、試験系及び皮膚移植に使
用するための培養表皮シートの製造に使用される。生き
た皮膚及びその他の組織等価物、並びにかかる組織等価
物の製造及び使用方法は米国特許第４，４８５，０９６
号、第４，８３５，１０２号、第４，８３７，３７９号
、１９９０年４月６日出願のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０７１５
０５，６７８．１９８９年９月１５日出願のＵ、Ｓ、Ｓ
、Ｎ、０７／４０８，０５２号に開示されている。これ
らの文献の記載内容は本明細書に含まれるものとし、本
文中では以後「諸特許」と指称する。これらの特許及び
特許出願は培養表皮細胞の多量の増殖を必要としている
が、現在入手できる培地はこの要件を充足できない。

哺乳類表皮は主として、種々の分化段階の単一の細胞型
即ちケラチン細胞から構成されている。

下層の真皮の線維芽細胞から分離した基底層は分裂性ケ
ラチン細胞を含む。これらのケラチン細胞は前駆細胞を
生威し、そ□うちのあるものは最早分裂せず、基底層か
ら外部に移動し、最終分化し２ て角質層を形成し、最終的に表面から剥落する。

いくつかの用途、例えば経皮的吸収の検査に使用される
試験系では、生体皮膚等価物が、十分に発達したケラチ
ン細胞層を含むことが必須であり、従って、培養表皮細
胞の分化及び成熟が必要である。

ｎ　ｖｉｖｏで観察されるケラチン細胞に酷似したケラ
チン細胞シートを形成するためには、既存の細胞増殖培
地及び系が充足させるべき追加の要件が生じる。かかる
シートの形成には、基底細胞の増殖性の小集団を維持し
つつ表皮細胞を分化させより古いより成熟したケラチン
細胞を層化させる十分なカルシウム濃度が必要である。

ケラチン細胞の培養及び成熟は様々な方法で試験され、
補足の血清またはタンパク質を添加したときでもその成
功の度合は一様ではなかった。例えば、化学的に確定さ
れた培地に従来の血清を補充した場合にはケラチン細胞
の増殖要件が充足されないことが知見された。ケラチン
細胞の増殖及び成熟を達成するためには、血清またはそ
の他の不確定因子を殆どまたは全く添加せず同時にマウ
ス胚線維芽細胞（３Ｔ３細胞）のごとき養育細胞も使用
しない化学的に確定された培養基を使用するのが好まし
い。

ケラチン細胞の培養技術の現状を考察するといくつかの
問題点が浮かび上がる（Ｂｒｅｉｄａｈ！他。

八ｕｓ’ｔ、　Ｎ、　Ｚ、　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、　５９（
１９８９）　４８５〜４９７参照）。

Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ及びＧｒｅｅｎは、クローナル増殖
と多重継代とを生じる３Ｔ３養育細胞層を使用したケラ
チン細胞の増殖方法を報告した（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ　
＆　Ｇｒｅｅｎ。

Ｃｅ１ｌ　６（１９７５）　３３１〜３４４）。この方
法では、継代の際にケラチン細胞が、更にクローナル増
殖し得る増殖性または比較的未分化の基底細胞集団を維
持している層化及び分化した培養物を形成できたので、
極めて進歩した方法であると考えられた。

Ｒｈｅｉｒ＋ｕ＋ａｌｄ及び［；ｒｅｅｎの方法のかか
る利点にもかかわらず、養育細胞例えばマウス３Ｔ３細
胞の使用は好ましくない。その理由は、形質転換系であ
る３Ｔ３細胞に由来の不確定タンパク質が培養細胞中に
存在する可能性が生じるからである。３７３細胞及び細
胞フラグメントは０，０２％ＥＤＴ八で除去できると報
告されてはいるが（Ｓｕｎ　＆　Ｇｒｅｅｎ、　Ｃｅ１
ｌ　９（１９７６）５１２〜５２１）、完全な除去はし
はしば難しく、これらの細胞の除去及びその結果として
培養表皮細胞にかかるストレスの作用は望ましくないと
考えられる。また、３Ｔ３養育系は多量の血清（約５％
）を要するので、培養系に不確定タンパク質が更に添加
されることになる。

Ｒｈｅｉｎｕ＋ａｌｄ及びＧｒｅｅｎの著作＜ｒｓ＞発
表後も研究者等は、補足添加物または養育細胞支持体を
存在させずに表皮細胞を培養しケラチン細胞を成熱させ
る方法の開発を続けた。この分野での顕著な進歩は、Ｂ
ｏｙｃｅ及びＨａｍによってＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄ
ｅｒｍａｔ。

８１（１９８３）　３３Ｓ−４０Ｓに報告された。この
方法ではまず、少量の透析ＦＢＳ（２％）を添加したＨ
ａｍ’　ｓ　Ｆ−１２５ （Ｐｅｅｈｌ　＆　Ｈａｍ、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１６
（１９８０）　５２６〜５３８）を基底培地として使用
した。次いで、少量のカルシウムを含む無血清培地中で
ケラチン細胞を増殖させるこの培地のｆ＆適処方を、諸
成分の濃度を変化させることによって開発し、培地ＭＣ
ＤＢ　１５３と命名した（Ｂｏｙｃｅ　＆　ｔｅａｍ　
１９８３、Ｌ是及びＪ、　Ｔｉ５ｓ、　Ｃｕ１ｔ。

Ｍｅｔｂ、　９（１９８５）　８３〜９３）。

ＭＣＤＢ　１５３はケラチン細胞の生物学、毒物学、病
理学の分野並びに表皮細胞移植用細胞の増殖の分野で有
用であると報告された（Ｂｏｙｃｅ　＆　Ｈａｍ　１９
８５、ｊＪＬ）。ＭＣＤＢ　１５３は養育細胞が不要な
無血清培地であるが、いくつかの欠点がある。例えば、
ＭＣＤＢ１５３は、例えばカルシウム及び／または血清
の存在下では極めてフレキシブルな培地でないためその
用途が限定される。

ＭＣＤＢ　１５３中におけるケラチン細胞培養能力は培
地のカルシウム濃度に厳密に左右されるので、この培地
のフレキシビリティが更に限定される。

６ ＭＣＤＢ　１５３中での増殖能力はカルシウム濃度を約
１．０ｍＭ未満に保つことによって維持され、最適カル
シウム濃度は約０．３ｍＭである（Ｂｏｙｃｅ　＆　Ｈ
ａｍ　１９８３゜Ｆｉｇ、１．　ｐ、３５Ｓ、　ｋ糺）
。層化を生起するためにＭＣＤＢ　１５３中に濃度的１
．０ｍＭ以上のカルシウムを添加すると、細胞分裂が停
止し最終分化してそれ以後の培養が不可能になる。即ち
、細胞が該培地中の高カルシウム濃度に耐性でないため
増殖性基底細胞集団が喪失する（Ｂｏｙｃｅ　＆　Ｈａ
ｍ　１９８３、ＩＪＬ）。

粘着性多層表皮シー１〜の適正な層化及び分化には約１
．８ｍＭの生理的濃度のカルシウムが必要であるから、
ＭＣＤＢ　１５３は十分に発達したケラチン細胞層の形
成に適した培地ではない。Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ及び５ｃ
ｏｔｔはＭＣＤＢ　１５３中で培養された細胞を使用し
た移植可能表皮シートの形成を報告しているが（シリ」
□Ｃｌ１ｎ、　Ｐｒｏｃ、　６１（１９８Ｂ）　７７１
〜７７７）、層化を達成し同時に適当な生存力を維持す
るためには高血清（１０％）ＤＭＥＭ培地に戻る必要が
あることを知見した。

ＭＣＤＢ　１５３の限界はまた、ＭＣＤＢ　１５３中で
増殖した細胞が集密まで増殖すると継代能力を劇的に喪
失することにある（Ｂｏｙｃｅ　＆　Ｉｌａｍ　１９８
３、ξ是）。この知見は、大多数の細胞はカルシウム濃
度が１．０ｍＭ未満のときでさえも分化を継続すること
を示唆しており、ＭＣＤＢ　１５３系が極めてカルシウ
ム不耐性である理由の１つであろうと考えられる。何故
なら、カルシウムが関連細胞中の最終分化の最終過程を
誘発することは既知である（Ｒｉｃｅ　＆　Ｇｒｅｅｎ
、　Ｃｅ１ｌ。

Ｖｏｌ、１８．８８１〜８９４．１９７９年１１月）。

更に、ＭＣＤＢ　１５３中ではわずか２〜３世代の継代
で３０％のコロニー形成効率と約２４時間の集団倍加時
間とが達成される。

これらの特性は３世代以後に減退する（Ｂｏｙｃｅ　＆
Ｈａｍ　１９８３、Ｌ亀）。

ＭＣＤＢ　１５３中で増殖した細胞の品質は、表皮細胞
シートの製造に使用できる十分な高品質でなく、現在の
ＭＣＤＢ　１５３系中では、集密層をある程度の期間維
持し得る層化培養物を得ることができないと考えられる
。

別の研究者等は次善の培地を用い、彼等の系に増殖基体
（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を使用することによって最適な
系を得る試みを続け、例えば、Ｋａｒａｓｅｋ及びＣｈ
ａｒｌｔｏｎ（Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｌ、
　５６（１９７１）　２０５〜２１０）並びにＧ１１ｃ
ｈｒｅｓｔ等（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏ１．１１
２（１９８２）　１９７〜２０６）は表皮ケラチン細胞
の培養におけるタンパク質基体の利点を報告したが、主
として培地の処方に欠点があるためわずがな成功しが収
めることができながった。Ｋａｒａｓｅｋ及びＣｈａｒ
ｌｔｏｎ（ｆＪＬ）及びその他の研究者等は、高い血清
濃度（通常は約１０％）の使用が必要であることを知見
した。

Ｇ１１ｃｈｒｅｓｔ等（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、　ｒｎｔ
ｌ、　Ｒｔ、　４（１９８０）１００９〜１０１６）に
よって使用された補充Ｍ１９９培地の欠点は基本栄養素
が欠乏していること、例えばイノシトール濃度が極めて
低いことであった。

Ｅｉｓｉｎｇｅｒの著作（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　５ｋ
ｉｎ　Ｒｅ５ｅａｃｈＥｄｓ、　Ｓｋｅｒｒｏｗ　＆　
Ｓｋｅｒｒｏｗ、　ＣＩ＋ａｐ、　７．　Ｊ、　ｌ’１
ｉｌｅｙ　＆９ Ｓｏｎｓ　Ｌｔｄ、　１９８５）及びＥｉｓｅｎ）（ｅ
ｒ等の著作（ＰｒｏｃＮａｔｌ、八ｃａ、　Ｓｃｉ、　
７６（１９７９）　５３４（１〜５３４４）には、表皮
細胞の増殖方法が報告されている。著者等の記述によれ
ば、彼等の方法の利点は養育細胞及び表皮成分を用いる
ことなく細胞を増殖させることである。しかしながら、
Ｅｉｓｉｎｇｅｒ（、ＪＪＬ）の方法では、平板化のた
めに極めて高い細胞密度が必要である。

更に、増殖速度が緩慢で、細胞総数の倍増率が低い（そ
の理由の１つは平板効率が低いためである）。

従ってこの方法は、所望の目的である単一ソースからの
大規模増殖または持続培養の実用化には適していない。

表皮増殖因子とヒドロコルチゾンとを基底培地に補充す
るとケラチン細胞の増殖及び拡散が増進されることは当
業者に周知である（Ｂａｒｒａｎｄｏｎ　＆Ｇｒｅｅｎ
、　Ｃｅ１ｌ　５０（１９８７）　１１３１〜１１３７
；Ｂｅｒｔｏｌｅｒｏ他。

Ｅｘ　、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１５５（１９８４）　
６４〜８０）。サイクリックＡＭＰレベル向上剤（米国
特許第４，４５６，６８７号〉及び２〇− ウシ中性抽出物（Ｇ１１ｃｈｒｅｓｔ他、　Ｊ、　Ｃｅ
１ｌ　Ｐｈｙｓ、１２０（１９８４）　３７７〜３８３
）または胎盤抽出物（０’Ｋｅｅｆｅ　＆Ｃｈｉｕ、　
Ｓｏｃ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　９
０（１９８８）　；’〜７）も多くの細胞培養系で有利
である。

文献を一覧すると、多くの研究者が、コラーゲン基体（
Ｌｉｕ他、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１５（１９７９）　８
［〜８２２）もしくはフィブロネクチン基体（Ｋｕｂｏ
他、Ｓｏｃ、ＴｎｖｅｓｌＤｅｒｍａｔｏｌ、　８８（
１９８７）　５９４〜６０１）を使用するがまたは種々
の配合培地を使用して上皮細胞の増殖を試みたが、殆ど
の研究では、比較的高い播種密度で短期間の培養しか達
成されながったことが判明する。ＭＣＤ８１５３を含む
これらの改質培地のうちで３Ｔ３養育細胞系を使用して
観察される成功のレベルに近付いたものはない。

しかしながら３Ｔ３養育系は、最適増殖を達成するため
にｃＡＭＰレベル向上剤、典型的にはコレラ毒素の使用
を必要とする（Ｇｒｅｅｎ、Ｃｅ１ｌ　１５（１９７８
）　８０１〜８１１）。この人工的なｃＡＭＰレベルの
向上は実際の増殖因子の作用及びメカニズムの研究を複
雑にする。

細胞の長期成長（ｐｒｏ１２、Ｈａｍ’ｓＦ１０ｎｇｅ
ｄ　ｇｒｏｕ＋ｔｈ）及び増殖を提供したり、場合によ
っては基底細胞を盛んに分裂させつつ所定の細胞を成熟
させる培地及び系が求められている。

免豐汝且（ 本発明の細胞培地及び系における細胞増殖は以下のよう
な多数の長所を有する。但しこれらに限定されない。

（１〉支持または養育細胞が不要である。

（２）血清及び／またはウシ視床下部抽出物の不在下に
も成長速度が大きい。

（３）約１×１０″細胞／ａｍ２またはそれ以上で平板
培養した場合に、ウシ視床下部抽出物の使用はほとんど
または全く有利とならない。

（４）ｅＡＮＰレベル向上剤の不在下にも細胞増殖が迅
速である。

（５）平板効率及びコロニー形成率が、カルシウム濃度
を自由に変更することにより３０％またはそれ以上とな
る。これはおおよそ、３Ｔ３の場合の１０％、及びＭＣ
ＤＢ　１５３−低カルシウムの場合の３０％に匹敵する
。（この特性は微粒子担体培養に対しては極めて望まし
い。〉 （６〉細胞を生体皮膚等価物の製造に容易に使用するこ
とができ、前記の他の方法で増殖させた細胞に勝るとも
劣らぬ多層表皮を形成することがてきる（ＭＣＤＢ　１
５３増殖細胞はうまく生存しない）。

（７）コラーゲン被覆表面上で増殖した表皮細胞は、所
望であれば移植に使用するために、コラゲナーゼを使用
してシート状の表皮細胞として剥離することができる。

（８）Ｃａ＋″濃度範囲、血清要求性及び密度依存性に
おける系の自由度（フレキシビリティ−）は、大量微粒
子担体培養に適合する多数の長所を提供する。

（９）迅速な成長速度によって、細胞が約６０％の集３ 密度（ｃｏｎｆ　Ｉｕｅｎｃｅ）に達したときにほぼ同
調的な細胞集団が生成する。多数の丸味を帯びた分裂細
胞及び本発明に従って増殖させた細胞の高い平板効率は
、ビーズからビーズへの転移が大量微粒子担体培養にお
いても可能となり得ることを示唆する。

本発明の細胞培地（培養基）は、インシュリンまたはイ
ンシュリン様の成長因子、第一鉄イオン、トリヨードチ
ロニンまたはチロキシン、エタノールアミンまたはＯ−
ホスホリル−エタノールアミンの少なくとも一方、カル
シウム及び栄養源を含有する。本発明の好ましい培地は
、 （ａ）約０．５〜約５０１ｙ／ｍｆｆのインシュリン、
（ｂ）約５Ｘ１０−８〜約５Ｘ　１０−”Ｈの第一鉄イ
オンまたはトランスフェリン、 （ｅ）約２〜２００ｐＭのトリヨードチロニン、（ｄ）
約１０−６〜約１０−２Ｍの０−ホスホリル−エタノー
ルアミン及びエタノールアミンの少なくとも一方、（ｅ
）約０．００５〜約２．０ｍＭのカルシウム、及び４ （ｆ）ＤＭＥＭ、ＩＤＭＥＭ、ＭＥＮ、Ｎ１９９、ｌ’
ｌＰＭＩ　　１６４０、Ｈａｍ’　５Ｆ１２、Ｈａｍ’
ｓ　ＦＩＯ，ＮＣＴＣ１０９及びＮＣＴＣ１３５の少な
くとも１つから選択される栄養源 を含有する。

本発明の培地に含有し得る他の成分としては、約０．０
４〜約４．ｈｙ／ｍｆのヒドロコルチゾン；約１〜約５
０ｎｙ／ｍ１の表皮成長因子：約０．０２〜２ｍＭのア
デニン；約０．０５〜約２．００％のｃｈｅｌｅｘｅｄ
血清；約２×１０〜約２ｘ　１０−８Ｍのプロゲステロ
ン：約１Ｏ−９〜約１Ｏ−７Ｎのセレン；約１×１０−
５〜約２Ｘ　１０−’ｇ／＋ｎＮのウシ視床下部抽出物
：約１０−４〜約２×１０−３ＭのスＩ〜ロンチウム；
コレラトキシン、フォレスコリン（ｆｏｒｅｓｋｏｌ　
ｉｎ）、イソプロテレノール、メチルイソブチルキサン
チン、ジブチリルｃ−ＡＭＴ’　、テオフィリン、カフ
ェイン及び百日咳毒素の少なくとも１つから選択される
、約１０−９〜１０−’Ｈの１種以上のｃＡＭＰレベル
向上剤；約１〜５０ｎｌＦ／ｍ１のＥＧＦを挙げること
ができる。第一鉄イオンは約５Ｘ１０−’〜約５Ｘ　１
０−５Ｍの硫酸第二鉄から供給されるが、好ましくは、
約０，０５〜約５０１゜７ｍｌ、即ち約５．６ｘ　１０
−５〜約５．６ｘ　１０−２Ｍのトランスフェリンによ
って供給される。

本発明の系、方法及び培地は種々の細胞型の培養に有効
となり得ることが予想される。本発明の実用化によって
好ましく培養される細胞は上皮細胞である。好ましい上
皮細胞としては表皮細胞または表皮ケラチン細胞を挙げ
ることができる。

本発明の細胞培養系は、前記したような細胞培地と、プ
ラスチック；ガラス；コラーゲン：フィブロネクチン；
ラミニン（Ｉａｍｉｎｉｎ）　：ヘパラン硫酸プロテオ
グリカン；コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンも
しくはヘパラン硫酸プロテオグリカンで被覆された微粒
子担体；または、（ａ）コラーゲン溶液を収縮剤（ｃｏ
ｎｔｒａｃｔｉｌｅ　ａｇｅｎｔ）と、その中に収縮剤
が分散しているゲル混合物を形成する条件下に混合し、 （ｂ）ステップ（、）で調製したゲル混合物を、ゲル混
金物が収縮して組織等価物を形成し得る条件下に維持す
る は基体とも称する〉とからなる。

好ましい種類のコラーゲンはウシ駐由来の天然Ｉ型コラ
ーゲンである。

本発明の上皮細胞を培養する１つの方法は、前記のよう
な増殖支持体に上皮Ｉｌａ胞を接種し、この細胞培養系
を細胞増殖を促進する条件下に維持することを含む。こ
のような方法で得られる細胞増殖は、集団倍加時間が約
１６〜約３３時間であることを特徴とする。更に細胞を
連続的に（継代）培養し、約２０から約５０回の倍加を
達成することができる。

本発明の更に別の実施態様においては、該方法は更に、
カルシウムを約１．０ｍＭ以上の濃度で加えて、約２０
〜約６０％のコロニー形成率を維持しながらにして細胞
の層形成（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、層化ともい
う）及び分化を可能とする。これは、移植用の生体皮膚
等価物及びシート状表皮の形成においては重要である。

更に本発明の実施態様は、細胞のクローン増殖、即ち約
３０〜約ｔｏｏｏ個の細胞密度での播種を提供する。

本発明の実現によって、約２０〜約１００％のコロニー
形成率を有する一次（初代）細胞の迅速な膨張と、５０
回を越える集団倍加の増殖能とを得ることが可能である
。更にカルシウムを１．０ｍＭ以上加えることができ、
約２０〜約６０％のコロニー形成率を維持しながらの細
胞の層形成及び分化が可能となる。

更に本発明は、上皮細胞を前記細胞培養系におけるコラ
ーゲン被覆微粒子担体上に、平板効率約２０〜約４０％
で平板培養し、微粒子担体及び平板培養細胞を細胞増殖
を促進する条件下に維持することを含む、微粒子担体に
おいて上皮細胞を培養する方法を提供する。この方法の
実現により、細胞増殖が集密に達したときでさえ約２０
〜約１００％のコロニー形成率が維持される。更にカル
シウム濃度を、細胞増殖が集密に近づいて増殖が迅速な
期間には約０．０８１１１Ｍから約１８ｍＭまで大きく
し、細胞の微粒子担体への付着性を高め、従って微粒子
担体にかかる剪断力による細胞損失を少なくすることが
できる。

更に、充分に上皮形成された生組織等価物も本発明に従
って製造することができる。この方法は、（、）前記組
織等価物に上皮細胞を接種するステップ、 （ｂ、）得られた細胞培養系を細胞増殖を促進する条件
下に維持するステップ、及び （ｃ）カルシウムを生理学的濃度になるまで加え、この
系を充分なケラチン化上皮層の発生を可能とする条件下
に維持するステップ とを含む。

本発明の培地は、上皮細胞を迅速に増殖することにより
調節され、このように調節された培地は増殖助剤として
も、外傷治癒のような治療用途においても有効である。

免艷型註遍 本発明の化学的に定義された培地は、不確定タンパク質
を培地に与え得る支持細胞、血清または他の成分の不在
下の細胞培養を提供する。

本発明の培地の幾つかの長所は、製造が容易であること
、用途に自由度がある、即ち種々のカルシウム濃度で使
用し得ること、血清濃度を変えられること、種々の成長
因子を加えられること、及び細胞外マトリックス成分を
変えられることである。本発明の培地及び系は、上皮細
胞のｉｎ　ｖｉｔｒ。

製造及び／または研究に携わっている生物学者及び他の
人々に、彼らの必要事項のほとんどを満足する系を提供
する。

本発明の１つの培地は、インシュリンまたはインシュリ
ン様の成長因子、トランスフェリンまたは第一鉄イオン
、１ヘリヨートチロニンまたはチロキシン、エタノール
アミン及び／または０−ホスポリルーエタノールアミン
、カルシウム並びに栄養源を含有する。例えば特定の細
胞を培養するように状況に応じて、限定的ではないが、
表皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ストロン
チウム、ウシ視床下部抽出物、プロゲステロン、セレン
及びｃＡＭＰレベル向上剤といった他の成分を培地に加
えることもできる。ヒドロコルチゾンは、正常のヒト表
皮ケラチン細胞（Ｒｈｅｉｎｕ＋ａｌｄ及びＧ　ｒ　ｅ
　ｅ　ｎ　、　リエ劇）の長期培養において重要である
と報告されており、従って完全なｍ５ＢＨの好ましい成
分である。しがしながら最少の助剤が所望であるならば
ヒドロコルチゾンは必要ではなく、これがなくても好ま
しいであろう。

インシュリンは約０．０５〜約５０Ｊ＋ｙ／ｍＺ、好ま
しくは約０．５〜約５０ｕｙ／ｍｆｆの濃度で存在させ
るが、特に好ましい濃度は５．０μｇ　／　ｍ　（ｌで
ある。インシュリンは１ 目下のところ経済的な理由により好ましいが、プロイン
シュリンＩＧＦ−１（１０−”〜１０−８Ｍ）または他
のインシュリン様の成長因子をインシュリンに代えるこ
とができる。本明細書におけるインシュリン様の成長因
子とは、インシュリンに構造的に類似であり且つインシ
ュリン様の成長因子レセプタを刺激する組成物、例えば
インシュリン様成長因子Ｉ及び■を意味する。

第一鉄イオンは、硫酸第一鉄のような第一鉄塩によって
約５Ｘ１０−８〜約５ｘ　１０−５Ｍ、好ましくは約５
Ｘ１０−６Ｍの濃度で与えることができるが、トランス
フェリンよって約０．０５〜約５０１１？／ｍｆ、好ま
しくは約５１ｇ／ｍｎの濃度で供給されるのがより好ま
しい。

トリヨードチロニンは、本発明の細胞培養系においてよ
り強力な効果を有することが認められたので、チロキシ
ンよりも好ましい。トリヨードチロニンは好ましくは約
２〜約２００ｐＭ、より好ましくは約２０ｐＭの濃度で
存在させる。

２ エタノールアミン及び／または０−ホスホリル−エタノ
ールアミンも本発明の実施態様において使用することが
できる。しかしながら、これらの成分は組み合わせて使
用することが好ましい。エタノールアミンは約１０４〜
約１０−２Ｍ、より好ましくは約１０−’Ｈの濃度で存
在させ、０−ホスホリル−エタノールアミンは約１０−
６〜約１０−２Ｍ、より好ましくは１０−４８の濃度で
存在させる。

現在入手可能な培地と比較して、本発明の培地において
はカルシウム濃度を広範囲に変化させ、しかも増殖の盛
んな細胞培養を維持することができる。細胞は本発明の
培地においては血清濃度５％及び生理学的カルシウム濃
度１．８ｍＭで増殖し得るが、増殖及び最終分化の欠失
（即ち増殖する基底細胞集団（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
ｎｇ　ｂａｓａ１２、Ｈａｍ’ｓＦ１０ｉｄ　ｃｅｌｌ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を維持すること）は、血清を約
０．３％以下、好ましくは０％に減らし且つカルシウム
濃度を約０．００５〜約２．０ｍＭ、より好ましくは約
０．０８〜約１．０ｍＭのカルシウム濃度とすることに
より最適化される。

最適な成長速度に対して使用されるカルシウム条件下で
は最少の層形成が見られる。これらの培養を集密に維持
するならば、より大きな細胞を培養皿から取り出し、皿
には密に詰まった小さな細胞の層によって形成される集
団を残す。カルシウムを追加することにより、集密の基
底細胞層を維持しながらより成熟した細胞を層形成させ
ることができる。もし集密になる前にカルシウムを１．
８ｍＭになるまで加えると、コロニーの外観及び細胞分
布は、細胞が集密になるまで増殖を続ける支持細胞を用
いて見られるものに匹敵する。もしカルシウムを１．０
ｍＭ以下に維持すると、集密になる前にインボルフリン
（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）またはトランスグルタミナー
ゼ（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）　（表皮細胞
分化の標識）はわずかじか見られない。カルシウムは、
細胞を培養する目的に従って約０．００５〜約２．０ｍ
Ｍで存在させる。場合によっては、別々に加えるよりは
必要なカルシウムは培地中の他の成分によって提供する
。

表皮成長因子（ＥＧＦ）は約１〜約５０ｎｇ／ｍ１、好
ましくは約Ｌｏｎｇ／ｍＡ’（マウスＥＧＦ）及び約Ｉ
Ｂ／ｍｆ（ヒトＥＧＦ）で存在させる。ＥＧＦが好まし
いが、ヒトまたはマウスの腫瘍細胞増殖因子−αを好ま
しくは約１０＋＋ｙ／ｍＮ（マウス）及び約１ｎｙ／ｍ
ｆ（ヒト）でＥＧＦに代えることができる。ＥＧＦは本
発明の培地においては任意の成分であるが、大量バッチ
式培養のようなある種の用途に対しては好ましいであろ
う。

ヒドロコルチゾンは約０．０４〜約４．０μｇ７ｍｌの
濃度であるのが好ましいが、特に好ましい濃度は０．４
μｇ／ｒＪである。

本発明の更に別の実施態様においては、本発明の培地は
追加成分を補うことができる。

場合によっては、コレラトキシンのような腺維芽細胞の
成長を阻害する成分を含有することが望ましいであろう
。

特に初期細胞密度が約１×１０３細胞／ｃ］ｎ２以下の
場合には、初代培養及びクローン密度培養の平板効率及
びコロニー形成率を上げるために、ウシ視床下部抽出物
（ＢＨＥ）を約５〜約２００１ｇ／ｍｌ、好ましくは約
５０ｐＨ／ｍｌで含ませてもよい。Ｂ）ＩＥに代えて、
線維芽細胞成長因子に属するもの、例えば酸性ＦＧＦ、
表皮ケラチン成長因子及び塩基性ＦＧＦ（濃度を少し高
くする）を使用してもよく、約１０−”ｇ／ｍｌ〜約１
０−６ｇ／ｎ＋ｌ、好ましくは約１０−’ｇ／ｍｌで同
様の効果が得られる。通常は、細胞を１×１０３細胞／
ｃｍ２以上で平板上に配置した場合には、ＢＨＥを使用
しても効果は殆ど又は全くない。前記培地には別の成分
として、約０．０２ｍＭ〜約２．０ｍＭのアデニン、約
Ｏ％〜約２．００％のｃｈｅｌｅｘｅｄ血清、約２ｘ１
０−ＩＯ〜約２ｘ　１０−８Ｍ、好ましくは２ｘ　１０
−９Ｍのプロゲステロン、約１×１０−’〜約１×１０
−７Ｍのセレンも添加し得る。プロゲステロン、セレン
、ＢＨＥは、場合によっては増殖を最適化するために添
加し得る。

５ 本発明のシステムでは、初代細胞培養を樹立し且つヒト
上皮細胞を継代するのに、サイクリックＡＭＰ増強剤（
ｅｌｅｖａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ、レベル向上剤とも
いう）、血清及びウシ視床下部抽出物は必要ない。

先行技術の研究では、ｃＡＭＰ増強剤の添加及びウシ下
垂体抽出物の存在は、上皮細胞の初代培養を樹立する上
で不可欠ではないまでも効果的であることが示されたく
前出のにｒｅｅｎ　、　１９７８文献並びにＢｏｙｃｅ
及び■ａｍ、１９８５文献参照）。ＢＨＥを添加すると
多少の効果はあり得るが、後述の実施例９のデータが示
すように、本発明の培地を使用して上皮細胞の初代培養
及び継代培養を行う場合にはＢＨＥもｃＡＭＰ増強剤も
必要ない。但し、所望であれば、ｃＡＭＰ増強剤を用い
て本発明を実施してもよい。

本発明の実施に使用し得るサイクリックＡＭＰ増強剤と
しては、コレラ毒素、フォレスコリン（ｆｏｒｅｓｋｏ
ｌ　ｉｎ）、アドレナリンのようなβ−アドレナリン性
物質、テオフィリン、ジブチリルサイクリックＡＭＰ、
メチルイソブチルキサンチン、イソプロテレノール、カ
フェイン及び百日咳毒素が挙げられる。好ましい物質は
コレラ毒素及びフオレスコリンである。コレラ毒素は約
１０−８〜約１．０−５Ｍで使用するのが好ましく、フ
ォレスコリンは約１０−９〜約１０−”Ｍ、好ましくは
約１０−７〜約１０−５８、より好ましくは１０−７Ｍ
で使用する。

本発明のシステム及び培地ではｃＡＭＰ増強剤の使用が
、場合によっては、初代培養の樹立又は凍結しておいた
初代培養物もしくは他の細胞の再樹立において効果をも
たらすこともある。しがしながら本発明では、ｃＡＭＰ
増強剤又はＢＨＥを添加しなくても細胞を容易に樹立す
ることができる。この細胞はその後、ｃＡＭＰ増強剤を
含まない本発明の培地を用いて何代も継代培養すること
ができる。

カルシウムの構成必要成分（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ
　ｎｅｅｄ）に代えて使用できるものとして、陽イオン
性代替物質（ｃａｔｉｏｎ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ）
の添加が研究された。

細胞は総て成る程度のカルシウムを必要とするか、カル
シウムは表皮ケラチン細胞て分化促進効果も示す。分化
の誘導（ＰｒａｃＨｅｒら、とＳ互月ユ共υ」上りユ１
３２（１９８７）８１−８９．Ｆｕｒａｋａｕ＋ａら、
Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、。

９０（１９８８）６９０−６９６）に関与せずに、細胞
の構成必要成分に代えて他の二価陽イオンを使用し得る
ことは既に立証されている（Ｒｕｂｉｎ、　Ｊ、Ｃｅ１
１．Ｐｌ＋　５ｉｏ１．。

９１　（１９７７）４４９−４５８）。本発明のシステ
ムでは、ストロンチウム及びマグネシウムの効果を調べ
た。マグネシウムは場合によっては効果的であることが
判明した。ストロンチウムを添加した場合には、増殖性
細胞集団の割合（９〜１４１ｍ分布）は余り変化しない
が、最終的細胞収率が著しく増加し且つ集団倍加時間が
約４時間短縮された。これについては、後述の実施例８
を参照されたい。

本発明の実施に有用な栄養源は、培養細胞にとって欠か
せない公知の栄養素、例えばグルコース、フルクトース
もしくはガラクトースのようなエネ９ ルギー源；必須アミノ酸及び非必須アミノ酸；水溶性ビ
タミン（Ｂ類、ビオチン、葉酸、ニコチンアミド、パン
トテン酸、ビロキシジン、リボフラビン及びチアミン）
並びに脂溶性ビタミン（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ及びユビキノン
）；重炭酸塩、カルシウム、塩化物、マグネシウム、リ
ン酸塩、カリウム及びナトリウムのような主要無機イオ
ン：八３．　Ｃｏ、Ｃｒ、Ｃｕ、　Ｆ、Ｆｅ、　Ｍｎ、
　Ｍｏ、Ｎｉ、　Ｓｅ、　Ｓｉ、　Ｓｎ、　Ｖ及びＺｎ
のような微量元素；脂質；Ｃ０２／ＨＣＯ３及びＨＥＰ
ＥＳのようなバッファ：ガス（酸素及び二酸化炭素）；
アデニン、シチジン、ヒボキサンチン及びチミジンのよ
うな核酸前駆体を供給する栄養源である。

本発明の実施に有用と思われる栄養源には市販のものが
多数ある。具体例としては、無機塩、エネルギー源、ア
ミノ酸及びビタミンＢ類を供給する市販の栄養源、例え
ばダルベツコの改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必
須培地（ＭＥＮ）、１０９９、ＲＰＭ１１６４０　（い
ずれもＦ１２、Ｈａｍ’ｓＦ１０ｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓから市販）、並０ びに）ｓｃｏｖｅの改質ダルベツコ培地（ＥＤＭＥＭ、
Ｇｉｂｃ。

Ｌａｂｓから市販）が挙げられる。最少必須培地及びＭ
１９９はリン脂質前駆体及び非必須アミノ酸も加える必
要がある。更に別のアミノ酸、核酸、酵素補因子、リン
脂質前駆体及び無機塩を供給するビタミンに富んだ市販
の混合物には、ｌｌａｍのＦ１２、ＩＩ　ａ　ｍのＦＩ
Ｏ１ＮＣＴＣ１０９（いずれもＦ１２、Ｈａｍ’ｓＦ１
０ｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓがら市販）並びにＮ
ＣＴＣ１３５（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
がある。

前記した各栄養源の成分を下の表に示す。

Ｉ？ＰＭ１ １６４０ ｅｄｉｕｍ 明細書の浄書 特開平３ ８７１７４　（１６） （内容に変更なし） Ｍ閉ｆｕｎ １９９　（Ｍｃｘｌｉｆ’ｉｅｄ） ＲＰＭＩ １６４０ ｅｄｉｕｍ 明細書の浄書 特開平３ ８７１７４　（１７） （内容に変更なし） ＭαＪｉｕｍ １９９　（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ） 明細書の浄書（内 ＲＰＭｌ ６４０ ｅｄｉｕｍ 容に変更なし） 特開平３ ８７１７４　（１８） Ｍｅｄ　ｉ　ｕｍ １９９　（Ｍｏｄｉｒｉｅｄ） 明細書の浄書（１ 特開平３ ８７１７４　（１９） Ｊ容に変更なし） ｅｄｉｕｍ １９９　（ＭｏｄＨｉｅｄ） ＣＯＭＰＯＮＥＮＴ ｌＸＭｅｄｉｕｍ１９９ （Ｍｏｄｉｆｉｅｄ） ｗｉｔｈＥａｒｌ’５Ｓａｌｔｓ ｉｑｕｉｄ ｗｉｔｈＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ＰｒｏｃｌｕｃｔＮｏ、＋２−２０３ ＋＋＋ｇ／Ｌ Ｌ−ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ２０．００ Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ ｅｏ、ｏ。

Ｌ−１ｙｓｉｎｅ−Ｈｃ、１） ７０．００ Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ １５．００ Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ２５．００ Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ ４０．００ ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ　： 明細書の浄書（内容に変更４・ ｔ（ａｍ　５ ｐ−ｔ。

ｅｄｉｕｍ に 特開平 ８７１０／４（２１） ａｍ　ｓ −１２ ｅｃＨｕｍ 明細書の浄書（内容に変更ね Ｈａｍ’ｓ −１０ ｅｄｉｕｍ 特開平３ ８７１７４　（２２） ａｍ　ｓ −１２ Ｍｅｄｉυｍ 明細書の浄書（内容に変更なし） Ｈａｌｎｓ −１０ ｅｄｊｕｍ 特開平３−８７１７４　（２３） Ｈａｍ’ｓ −１２ ｅｄｉｕｍ 明細書の浄書（内容に変更な Ｈａｍ　ｓ −１０ ｅｄｉｕｍ Ｈａｍ’ｓ −１２ Ｍｅｄ　ｉ　ｕｍ ｑ４−な 特開平３ ８７１７４　（２５） ＊　ＮＣＴＣ１０９及び１３５は同じ成分をリストして
いるが（Ｒｅｆ、２）、例外としてＮＣＴＣ１３５はＬ
−システィンＨＣＩを除外している。Ｒｅｆ、１．４６
６ページには、１３５組成からシスティンを除去した理
由の１つとしてシスティンの毒性が挙げられている。

＊ＮＣＴＣ１０９／１３５ベース培地（９１７２＆　９
５０２）はマーク（＊）付き成分を含まない。ベース培
地の詳細についてはＭｅｄｉａ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎを参照されたい。

Ａ、Ｒｅｆ、２ではＬ−システィン１０．４９ｍｇ＃！
、Ｌ−システィンＩＣ１２５０Ｂ／ｆ、Ｌ−チロシン１
６．４４Ｂ、＃０Ｂ、粉末培地には含まれていない。

Ｃ、Ｐｌａｑｕｅ　Ａｓ５ａｙ（２ｘ）培地にはフェノ
ールレッド及びグルタミンは含まれず、他の総ての成分
の量が２倍になっている。

＊　ｒｃｒ＾ｍｅｒｉｃａ’ｓ　Ｉｎｃ、の商標。

６ ｚ・ｊ玖 ＣＯＭＰＯＮＥＮＴ ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ５ＡＬＴＳ： Ｃａ　ＣＪＩＩ　２　（ａｎｈｙｄ、）Ｆｅ　（ＮＯ）
　　・　９ＨＯ ３３２ ＣＤ Ｎ０３ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４（ａｎｈｙｄ　−） ＭｇＳ０　　・７Ｈ２０ ＮａＣＤ Ｎ　ａ　ＨＣＯ３ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ Ｎ　ａ　Ｓ　ｅ　Ｏａ　・５Ｈ２０ ０ＴＨＥＲＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ 明細書の浄書（内容に変更なし） ＩＳＣＯＶＥの改質ダルベツコ培地 Ｌｉｑｕｉｄ　（ＬＸ） Ｆｒｏｍ、ＮＯ，７８−０４１５ ｍｇ／Ｌ １６５．００ ３３０．００ ０．０７Ｂ ９７．６７ ４５０５．００ ３０２４．００ １２５．００ ０．０１７８ ｏｗｄｅｒ Ｃａｔ、Ｎｏ、４３０−２２００ ｍｇ／Ｌ ］、６５．００ ３３０．００ （１，０７６ ９７，６７ ４５０５，００ １２５，００ ０，０１７３ Ｄ　−Ｇ　Ｉｕｃｏｓｅ Ｐｈｅｎｏｌ　　ｒｅｄ ＥＰＥＳ Ｓｏｄｉｕｍ　ｐｙｒｕｖａｔｅ ＡＭＩＮＯＡＣＩＤＳ： Ｌ−Ａｌａｎｉｎｅ り７−＋ ４５００．００ １５．００ ５９５８．００ １１０．００ ２５．００ ４５００．００ １５．００ ５９５８．００ １Ｌ０．００ ２５．００ 明細書の浄書 Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　−Ｈ２ Ｌ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ　　−Ｈｃ、Ｑ Ｌ　−Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ Ｌ　−Ｃｙｓｔｉｎｅ Ｌ−Ｃｙｓｔｉｎｃ・２ＨＣρ Ｌ　−Ｇ　ｌｕｉａｍｉｃ　ａｃｉｄ Ｌ−ＧＩｕｔａｍｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ （内容に変更なし） Ｌｉｑｕｉｄ　（ＬＸ） Ｆｒｏｍ、ＮＯ，７８−０４１５ ｍｇ／Ｌ ２８．４０ ８４．００ ｇｏ、ｏ。

９１．２４ ７５．００ ５８４．００ ａｏ、ｏ。

ｏｗｄｅｒ Ｃａｔ、ＮＯ，４３０−２２００ １１１ｇ／Ｌ ２８．４０ ８４．００ ３０．００ １２４ ７５．００ ５８４．００ ａｏ、ｏ。

Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　　Ｈｃ、＋１　”　Ｍ２０Ｌ
　−Ｉ　５ｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｌ　−Ｌ　ｅｕｃｉ　ｎｅ Ｌ　−Ｌｙｓｉｎｅ　Ｈｃ、Ｑ Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｌ　−Ｐ　ｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ｌ　−Ｐ　ｒｏｌ　１ｎｅ Ｌ−５ｅｔｉｎｓ Ｌ−Ｔｈｒｅｏｔ＋４ｎｅ Ｌ　−Ｔ　ｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ Ｌ　−Ｔ　ｙｒｏｓｉｎｅ ９．７−　Ｚ ４Ｚ、ＵＵ １０５．００ １０５．００ １４Ｂ、００ ３０．００ ｅｅ、ｏ。

４０．００ ４２．００ ９５．００ １６．００ ４Ｚ、ＵＵ ＬＯ５，，００ １０５，００ １４Ｂ、００ ３０．００ ｅｅ、ｏ。

４０．００ ４２．００ ９５．００ １６、ｏ。

明細書の浄書 ＣＯＭＰＯＮＥＮＴ Ｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　　（Ｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ
）Ｌ−Ｖａｌｉｎｅ ＶＩＴＡＭＩＮＳ： ｊｏｔｊｎ Ｄ　−Ｃａ　ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅＣｈｏｌｉｎｅ
　ｃｈ１２、Ｈａｍ’ｓＦ１０ｒｉｄｅＦｏｌｊｃ　ａ
ｃｉｄ ｉ　−１ｎｏｓｉｔｏｌ Ｎ　ｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ　　ＨＣＩＩ ＲｉｂｏｒＩａｖｉｎ Ｔｈｉａｍｉｎｅ　ＨＣｊｌ ロン−３ （内容に変更なし） Ｌｉｑｕｉｄ　（ｌｘ） Ｆｒｏｍ、ＮＯ，７８−０４１５ ｍｇ／Ｌ １０４．２０ ９４．００ ０．０１３ ４．００ ４．００ ４．００ ７．２０ ４．００ ４．００ ０．４０ ４．００ ０．０１３ ｏｗｄｅｒ Ｃａｔ、Ｎｏ、４３０−２２００ ｍｇ／Ｌ １０３．７９ ９４．００ ０．０１３ ４．００ ４．００ ４．００ ７．２０ ４．００ ４．００ ０．４０ ４．００ ０．０１３ 尚、前記栄養源はいずれも成分を少し変えたものが市販
されており、その一部は本発明で使用し得る栄養源を構
成する。

本発明で使用する好ましい栄養源の１つは、約９０〜約
１０％のＣａ〜無含有ＤＭＥＭと約１０％〜約９０％の
ＨａｍのＦ１２とを含む。特に好ましい栄養源は、Ｃａ
４４無含有ＤＭＥＭを約７５％含み且っＨａｍのＦ１２
を約２５％含む栄養源である。本発明の培地は通常は、
少なくとも約９０％、好ましくは９５％以上の栄養源を
含む。

下に本発明の好ましい培地組成の一具体例を示す： インスリン　　　　　　５μｇ７ｍ トランスフェリン　　ｈｇ／ｍ トリヨードチロニン　２０ｐＭ エタノールアミン　　　１×１０−７Ｍ０−ホスホリル エタノールアミン　　　１×１０−７Ｍアデニン　　　
　　　０　、１８ｍＭ セレン ３×１０−”Ｍ スｌへロンチウム　　　１ｍＭ カルシウム　　　　　０．０８ｍＭ ９０％。

所望であれば、増殖率を更に増加するが又はライフスパ
ンを長くするために、約１．１ｍＭのヒドロコルチゾン
と、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと、２ｘ　１０−ｇＭのプ
ロゲステロンと、約５０１Ｉｇ／ｍｌのＢｌ（Ｅもしく
は約９ｎｇ／ｍｌのコレラ毒素とを加えてもよい。この
培地のｐｌｌは通常はぼ中性のｐＨ１例えば約６．８〜
７．４である。

培養培地の有効性を測定する上での重要な基準の１つは
、１日当たりの集団倍加数によって示される細胞タイプ
の増殖率である。本発明の培養システムを使用すれば、
養育細胞（ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ）を用いずに且つ
血清濃度を低くして上皮細胞を培養し得るため、初代培
養が養育細胞システムを使用した場合に比肩する増殖率
で集団倍加が５０回を越える勢いで増殖する。例えば、
新生包皮の上皮ケラチン細胞は本発明の培地及びシステ
ムでは倍加が０．５／日以下に落ちることは希であり、
継代６を通して平均１７日の倍加を示し、継代２と５と
の間では倍加１，３〜２．０／日の増殖率に達し得る（
表２参照）。このような増殖率は、集団が１２〜１８時
間毎に倍加することを意味する。

本発明の培地及びシステムを使用すると、細胞基層を維
持しながらカルシウムを生理学的濃度まで加えることが
できる。このような結果は、これまでは３７３システム
だけでしか得られなかった。

本発明の培養システム及び培地では、増殖細胞集団を消
滅させずにカルシウムを１．０ｍＭ以上加えることがで
きるため、このような細胞を、生きた皮膚の等価物の製
造又は移植に適した上皮細胞の連続シートの形成に使用
することができる（実施例６参照）。また、細胞増殖に
悪影響を与えずにカルシウム濃度を変えることができる
ため、上皮細胞０− を微粒子担体培養で大量に増殖させることも可能である
（実施例７参照）。例えばＭｅＯ２１５３では、細胞を
増殖させるのにカルシウム濃度を低くしなければならな
いが、カルシウム濃度が低いと細胞が微粒子担体の表面
に十分に付着しない。これは、微粒子担体を剪断力にか
ける場合には不利な条件である。前記Ｒｈｅｉｎｉｕａ
ｌｄ及びＧｒｅｅｎの３Ｔ３システムの場合には、先ず
微粒子担体を３Ｔ３細胞でコーティングし、次いで上皮
細胞を３７３細胞上で増殖させるようにする必要があろ
う。

本発明の培地は、現時点では、市販のものであってよい
カルシウム無含有栄養源を含む入手の容易な市販の成分
を用いて製造される。また、本発明の培地の成分は当業
者に公知の方法によって製造され且つ組合わせられる。

これに対し、市販のＭｅＯ２１５３等価物を用いて行っ
た培養研究の結果によれば、ＭｅＯ２１５３の等価物の
製造には限界があると思料される。

Ｆ＋＋ 本発明のシステムは、これまで上皮細胞の培養に最も適
したシステムの１つとして知られてきた３Ｔ３システム
に比肩するだけでなく、成る点では３Ｔ３システムを明
らかに凌駕している。本発明は、化学的に定義（確定）
され且つ血清又は養育細胞に依存せずに培養細胞を適切
に増殖させる細胞増殖培地を提供する。本発明の培地及
びシステムを使用すれば、初代培養を約０．５〜２．０
／２４時間の集団倍加（ＰＤＬ）で樹立することができ
る。

現在入手できる前述の培地と本発明の培地及びシステム
との比較を下の表に示す。

乏乙ヱＬ０に教 ｐｄｌ：集団倍加 ａｒｅ　：コロニー形成効率 ＥＣＭ　：細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕ
ｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ）ｐｄｔ　：集団倍加時間 本発明では、種々の特許に記述されているような種々の
基体、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン
、ヘパランスルフェートプロテオグリカン及び組織等傷
物を使用し得る。ウシ鍵に由来する天然工型コラーゲン
は好ましいコラーゲン基体の１つである。本発明のシス
テムでは、成る条件では、フィブロネクチン又はコラー
ゲンでコーティングした基体を用いると増殖が促進され
得る（実施例３参照）。初代培養を樹立する場合又は血
清含有培地を使用する場合には、例えばコラーゲンを約
１％以上の量で使用するが、又は細胞を凍結ストックが
ら樹立すると有利であり得る。

但し、血清濃度を約０．３％以下に下げると、有害な又
は分化促進血清効果が低下して、マトリックス成分が前
述のごとき利点をもたらさなくなる。

基体を使用する場合、その基体は高品質でなければなら
ない。なぜなせら、部分的に変質したフィブロネクチン
又は非均質コラーゲンで質の悪いコ４ −ティングを施した培養皿も細胞増殖を阻害し得るから
である。

基体、例えば７１−リックス成分が存在すると、条件が
最適ではないか又はより厳しい場合、例えば血清因子が
存在する場合、細胞密度が低い場合、組織から細胞を樹
立する場合、又はより長い生存期間が必要とされる場合
にも、細胞がコロニーを形成し得ると思われる。

そこで本明細書では、上皮細胞のような細胞を増殖させ
るための新規の培地及びシステムを記述し、その実施例
を示した。本発明は、以下の非限定的実施例でより明ら
かにされよう。

以下の実施例で使用するベース培地ｍｓＢＭは下記の成
分を含む： ヒドロコルチゾン　　　　　　　１．１１１Ｍインスリ
ン　　　　　　　　　　５μｇ／ｍｌトランスフェリン
　　　　　　　５同／＋ｎトリヨードチロニン　　　　
　　２０ｐＭ５ エタノールアミン　　　　　　　１×１０−７ＭＯ−ホ
スホリルエタノールアミン　１×１０−７Ｍアデニン　
　　　　　　　　　　０．１８ｍＭプロゲステロン　　
　　　　　　２×１０−７Ｍセレン　　　　　　　　　
　　　３×１０−”Ｍコレラ毒素　　　　　　　　　　
９Ｂ／ｍｌ上皮細胞成長因子　　　　　　　１０ｎｇ／
ｍｌカルシウム無含有ＤＭＥＭ　　　　　　７５％Ｈａ
ｍのＦ１２　　　　　　　　　　　　　２５％特に指示
のない限り、ｍＳＢ旧よｃｈｅｌｅｘｅｄウシ胎児血清
（ｃＦＢｓ）も０．３％含む。ｃＦＢｓは培地の必要成
分ではないが、コレラ毒素の活性を失わずに長期間凍結
貯蔵できるようにコレラ毒素サブルメントで伝統的に使
用されているものであるため、ここでも使用した。

以下の実施例では、ｅｍＳＢＭと称する培地も使用した
。この培地は、前記成分を濃度を変えて含むと共に下記
の成分も含む： トリヨードチロニン　　　　１．００２ｘ　１０−８Ｍ
に増加コレラ毒素　　　　　　　　１１００ｎ／ｍｌに
増加ウシ視床下部抽出物＜ＢＩＩＥ）　　５０ｐｇ／ｍ
ｌ実施例８では場合によってはストロンチウム（Ｓｒ）
も培地に加え、実施例９では場合によっては培地にｃＡ
ＭＰ増強剤を加えなかった。実施例１０ではｃＡＭＰ増
強剤、プロゲステロン、血清又はウシ視床下部抽出物を
加えずに細胞を増殖させた。実施例１１ではＥＧＦ無し
で細胞を増殖させ、実施例１３ではヒドロコルチゾン無
しで細胞を増殖させた。

初代培養をｅｍｓＢＭ中で樹立する時には、ｃＡＭＰ増
強剤、血清、プロゲステロン、増強トリヨードチロニン
又はＢＨＥはいずれも不要であるが、場合によってはＢ
ＨＥを使用すると増殖が促進される。

前述の培地は通常、下記の方法で製造される。

但し、本発明の成分はその物理的特性に適合した従来の
方法で製造し且つ組合わせ得ると理解されたい。本発明
の培地は滅菌培地である。滅菌成分は製造後に通常の方
法で滅菌状態にする。以下の実施例ではどの場合も適当
な滅菌プロセスを使用した。総ての成分のストック溶液
は一２０℃で貯蔵し得る。但し、栄養源は４℃で貯蔵し
得る。

ストック溶液は総て前記最註濃度の５００倍の濃度て調
製する。ヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ社は無水エタノ
ールに溶解し、リン酸塩で緩衝した土理的食塩水（ＰＢ
Ｓ）で希釈する。インスリン、トランスフェリン及び１
〜リヨードチロニン（いずれもＳｉｇｍａ社製）のスト
ック溶液は下記のように調製する。

先ずトリヨードチロニンを無水エタノールｌＮｌＩＣに
２」で溶解する。インスリンを希塩酸（約０．ＩＮ）に
希釈し、１〜ランスフエリンを水に溶解する。これら３
つの溶液を混合し、水で５００倍濃度に希釈する。エタ
ノールアミン及びＯ−ホスボリルエタノールアミン（両
方共Ｓｉｇｍａ社製）を５００倍濃度まて水て希釈し、
ｐ過滅菌する。プロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）を無水エ
タノールに溶解し、水で希釈する。長期８ 間貯蔵する場合には活性を維持するためにウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を添加し得る。セレン（Ｓｉｇｍａ社
はエタノールアミンと同様に調製する。コレラ毒素はＳ
ｉｇｍａ社から滅菌状態で市販されている。これを水で
希釈する。ＥＧＦはＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈ
ｎ。

１ｏｇｉｅｓ　、　Ｉｎｃ　、から市販の滅菌したもの
をＰＢＳに溶解する。アデニンは溶解しにくいか、当業
者に公知の多くの方法で溶解し得る。滅菌したカルシウ
ム無含有ＤＭＥＭ８よＪ、Ｒ，５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ又
はｌ１ａｚｅｌｔｏｎから入手する。ＨａｍのＦ１２は
阿、八、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓがら入手する。ＢＩＩ
Ｅ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
即ちＥＣＣ５）はカルシウム濃度の低いＤＭＥＭ４こ溶
解する。ＥＧＦストック溶液の貯蔵時間を長くするには
ＢＳＡを添加し得る。ＤＭＥＭ及びＦ　１．２は互いに
組合わせ、個々の成分を培地に添加する。この培地は調
製後すぐに使用するか、又は４℃で貯蔵し得る。凍結貯
蔵する場合は、使用時までＥＧＦを添加しないでおく。

このようにして得られる培地は滅菌培地である。

９ ＢＩＩＥ及びＥＧＦの活性をロット・パイ・ロットベー
スで評価する。ＢＩＩＥ又はＥＧＦを含まない培地での
増殖と、これらの成分を含む培地での増殖とを、約Ｏ〜
約５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及び約Ｏ〜約２００１ｇ／ｍ
ｌのＢ）ＩＥの濃度範囲から比較して、最大増殖を支持
する濃度を調べる。

例１：　代Ｐ養の　施 耳及び腹部を含む包皮及び他の組織を日常の生検から入
手し、５０ｍｃｇ／ｍｆのゲンタマイシンと１．２５ｍ
ｅｑのフンギシンとを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で
２分間洗浄した。次いで組織試料全体を９５％のエタノ
ールで１分間洗浄して表面の汚染物を除去した。その後
ＰＢＳ−ゲンタマイシンフンギシン溶液で再度洗浄した
。皮下組織を無菌で除去し、組織をＰ［ｌＳ−ゲンタマ
イシンフンギシン溶液で濯ぎ約１ｍｍ２の部分に細分し
た。コラゲナーゼ−トリプシン組織混合物を使用して、
細分した組織を３７℃で解離した。使用したコラゲナー
ゼ解離混合物の成分は以下の通りである。コラゲナーゼ
５５゜５ｍｇ／ｍ１２、トリプシン２．０ｍｇ／ｍ１、
グルコース０．３７５ｍｇ／ｍｆｆ１、フンギシン１ｍ
ｅｑ／ｍｆ及びゲンタマイシン５０ｍｃｇ／ｍｆ（リン
酸緩衝溶液中）。ダイジェスト上澄み液を除去し、中和
して、組織が完全に解離するまで３０分の間隔で残りの
消化した部分に新しい酵素を加えた。

解離細胞の混合集団を含む細胞部分をプールし、カウン
トして、Ｅｃ、Ｆを含まない全容量が１０　ｍ　ｌのｅ
ｍｓＢＭを含む（５ｕｇ／ｃｍ２のコラーゲンで被覆し
た）Ｔ７５フラスコで２．６×１０’個／ｃｍ２を平板
培養した。このような初代培養は７〜１７日で集密的に
なった。

平板培養の１日後にｅｍｓＢＭを吸い出して、１００ｇ
／ｍ１のＥＧＦを含む新しいｅｍＳＢＭと置換した。平
板培養口を０日と考えてＥＧＦを含むｅｍＳＢＭを使用
して３日毎に細胞上で培地を変えた。初代培養が集密的
になるのに７〜１７日を要する。この時点で細胞を実施
例２に記載の如く更に連続的に培養するか又は後日使用
するために冷凍して液体窒素中で貯蔵することができる
。冷凍培地はベースとして１０％のウシ胎児血清と１０
％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とを含むＬＣＤ
ＭＥＭを含んでいる。冷凍するには細胞を皿から除去し
て、実施例２と同様にカウントするが、カウント後に再
度回転沈降させ、２×１０６〜５×１０６／ｍ１の密度
で冷凍培地に再度懸濁し、１．８ｍｆのｎｕｎＱクリオ
バイアルに分は取った。１８〜２４時間予備冷凍した後
にバイアルを必要になるまで液体窒素貯蔵タンクに移動
させる。これらの実験の結果を以下の表１に示す。細胞
生存率は通常９０％を越えていた。

表１で使用する略語の意味は以下の通りである。

”　ＨＥ　Ｐ″“は人間の上皮細胞を示し、“ｎ″は新
生児の包皮細胞を示し、数字が後につ＜：　”ＮＦ”は
包皮以外の源から得た人間の上皮細胞を示す。

ｊＺ ３ 前記の実施例１と同様にして得たＴ７５フラスコ中の人
間の上皮細胞を垂直な層流フート内に置き、培地を吸い
出し、２ｍｆ７６０ｍｍ皿又は５ｍＮ／Ｔ７５のトリプ
シンベルセン（ｖｅｒｓｅｎｅ）　（（カルシウム又は
マグネシウムを含まない、閂、＾、Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）２００ｍｇ／／のベルセン（ＥＤＴ＾）と５００
ｍｇ／ｆのトリプシンとの平衡塩類溶液）と置換した。

約３分間又は細胞が皿の表面に現れるまで３７℃でフラ
スコをインキュベートした。次いで２ｎ＋ｊ！７６０ｍ
ｍ皿又は５ｍｆ／Ｔ７５のダイズトリプシンインヒビタ
ー（リン酸Ｍ％溶液中に２．５ｍｇ／ｍ１、ＧＩＢＣＯ
）を加えた。ピペットを使用して細胞の成長しているフ
ラスコの表面に噴霧して付着細胞を洗い落した。細胞懸
濁液をピペットで管内に移し、１２００ｒｐｍで５分間
回転させた。細胞ペレットのみを残して上澄み液を吸い
出した。カウントのためにＥＧＦを含まない適切な量の
ｍ５ＢＨにぺレットで再度懸濁した（通常５ｍｌあれば
十分である）。細胞をカウントした後に８８３３細胞／
ｃｍ２（２，５ｘ１．０５／６０ｍｍ皿）を最終容量が
４Ｊ７６０ｍｍ皿のＥＧＦを含まないｍ５ＢＨに植え込
んだ。細胞を１０％のｃｏ２中において３７℃でインキ
ュベートした。２４時間後１、　Ｏｎ　ｇ／　ｍ　１！
のＥＧＦを加えた。平板培養口を０日と考えて３日毎に
培地を（ＥＧＦを含む）新しい培地と交換した。細胞は
５〜７日で集密的になり、この点て再度継代を実施した
。

ｍＳ８Ｍ中で培養した表皮ケラチン細胞は移動性が高く
、分散コロニーを形成する。従ってコロニ形成率は平板
効率として概算する。播種がら２４時間後の細胞総数に
より測定した平板効率は低い継代（Ｐ：３又はＰ：４）
では通常３０％〜３５％であったが、恐らくこの段階で
は遅滞期が特に短いために２４時間で１００％以上の平
板効率が頻繁に観察されたく表２〉。

新生児の包皮がら得た表皮ケラチン細胞（細胞６ 株ＦＳ１６．Ｂ００９及びＢＯ１３、表２）は６継代を
通じて（急速に増殖する培養を示すために他の研究者に
より示された）最初は小型の円形細胞の集団を維持して
いた（集団倍加数が２５を越え、又は細胞数が６．４０
０〜３３３，０００倍増加した）。同様に２才児のドナ
ーから得た表皮ケラチン細胞が６継代を通じて維持され
、集団倍加数は２４を越え、又は細胞数が約４，６００
倍増加した。

２ 細胞株継代数　総集団　　１日当たりの　平板効率Ｓ１
６ ＯＯ９ ２１２，８１１Ｏ，７５ｅ ３　　　　１６．７　　　　　１．９９４　　　　２４
．５　　　　　０．９７５　　　　２９゜２　　　　　
１．５７６　　　　３３．３　　　　　０．５９１　　
　　　１０．７　　　　　０．８２２　　　　１５゜７
　　　　　１．２６１０６±３ ４１±７ ７６±８ ７ ３　　　　２１．２　　　　　１．３７　　　　　　　
１２５±１１４　　　　２５．４　　　　　０．８４　
　　　　　　１００１１０１３　　　　１ ２　　　　　４．８　　　　　０．８１３　　　　１０
．７　　　　　１．４８４　　　　１５．６　　　　　
０．６９　　　　　　　　２９±６５　　　　２１１　
　　　　０．４２　　　　　　　　３２±１６　　　　
２７．１　　　　　０．７５　　　　　　　　３０ＴＮ
Ｆ１００　　１　　　　　５．６　　　　　０．８０（
２歳のドナー）２　　　　　　　９．１　　　　　　　
０．３９３　　　　　１２．４　　　　　０．５５４　
　　　１６．０　　　　　０．５１５　　　　２０．３
　　　　　０．８６６　　　　２４．４　　　　　０．
６５ａ）　　Ｐ：１とＰ：２とを合わせた合計。

ｂ）組織の外植片からの細胞、倍加数は測定できない。

Ｃ）継代１と継代２とを合わせた平均。

３：　ルシウム　　の 前述した方法に基づいて人間の表皮ケラチン細胞をｍ５
ＢＮ（０，０８ｍＭのカルシウム）又はＣａ４４濃度が
１．８ｎ＋ＭのｍｓＢＭで血清濃度を０，３％及びｉ、
ｏ％として培養した。培地にカルシウムを加えると形態
が変化した。多量のカルシウムが存在すると細胞は極め
て集密的なコロニーで成長じたが、尚多量の小型増殖細
胞を残していた。血清濃度を１％未満に維持した場合成
長速度はそれほど減少しながった。

多量のカルシウムにより層形成（ｓｔｒａｔｉｆ　１ｃ
ａｔｉｏｎ）されたために集密状態での細胞収率はカル
シウム添加の場合の細胞内でかなり高くなっている。

増殖培養を維持しながらカルシウム濃度を変えることが
できるために、以前は不可能であった実験、例えばコン
ピテント細胞中の最終分化の公知の誘発物質であるカル
シウムに関連しての成長因子の作用及び該成長因子の分
化、増殖又は成長阻害の誘導についての研究を実施する
ことができる。

このような実験の例を表３に示す。この実験ではカルシ
ウムに関連してのＴＧＦβの作用を調べた。

ＴＧＦβの作用がカルシウムの存在下でも可逆的である
ことが観察された。

条件。

（＋）Ｔ、（＋）ｃａ＋＋ （）Ｔ、（−）Ｃａ＋″ ＭＴ、　（”）Ｃａ″＋ （＋）Ｔ、　（）Ｃａ″＋ 衣ユ 尤駿土 細胞数：％ｅｎｖ” ６．５×１０’　；６％ ６．３×１０’　；６％ ５．３×１０５；１５％ ５．８×１０５；１８％ ６．５ｘ１０５・４５％ ６．７×１０５；４７％ ３．１×１０５；３％ 尤駿２ 細胞数゛％ｅｎｖ ５．０×１０’　；１２％ ５．３×１０’　；１０％ ４．１×１０”；３８％ ４．３×１０５；３９％ ３．８×１０５；４９％ ３．６×１０５；５１％ ７．５×１０’　；５％ ２．６×１０５；３０％ （＋）Ｔ、（−）Ｃａ”ｂ　　　７．５×１０”；８０
％２．０×１０５；４５％ ２．４×１０５；１００％ 前記表はｍＳ８Ｍ中の人間の表皮ケラチン細胞へのカ０ ルシウムとＴＧＦβとの作用を示す２つの別個の実験か
ら得たデータを示している。

ａ）　％ｅｎｖ−イオノフオア誘導エンベロープ％ｂ）
　カルシウムとＴＧＦβとを除去し、更に４８時間ｍＳ
ＢＭ中で培養すると、細胞の回復が認められた。

注：　ＴＧＦβ処理とＣａ＋＊との作用を示す誘導エン
ベロープ％の差は成長とは関係がない。

Ｃ）培地は０．３％のｃＦＢｓを含んでいた。５ｒ＋ｇ
／ｍβのＴＧＦβを加えた所は（（＋）Ｔ）で示し、１
．８ｍＭのカルシウムを加えた所は（（＋）Ｃａ”）で
示した。

４：血ゞゝ声の 種々の濃度のｃｈｅｌｅｘｅｄウシ胎児血清（ｃＦＢＳ
）を使用して、ｍｓＢＭを含むコラーゲンで被覆した組
織培養皿２８．３ｃｍ２に人間の上皮細胞（ＨＥＰ）１
．７×１０５個をブレーティングして、前述した如く培
養した。２４７■ 時間平板効率、最終細胞収率、（小型増殖細胞集団であ
ることが知られている（Ｂａｒｒａｎｄｏｎ　ａｎｄＧ
ｒｅｅｎ、ｓｕ上劇〉〉９〜１４ｎＭ直径範囲の細胞の
％を測定し、以下の表４に示す。血清濃度が増してもそ
れほど最終細胞収率に影響しなかったけれども、平板効
率は少し増大した。しかしながら血清濃度か増すと小型
増殖細胞の割合が低減した。細胞集団でのこの変化は更
に位相差顕微鏡検査でも認めることができた。

及１ ｃＦＢＳ％２４時間平板　最終細胞収率　　９〜１４ｎ
Ｍ直径の熟斐００−　　　　　　　　　靴悠較−−−−
０　　５０．８±３．８　　２．１ｘ１０６±０．５　
　　４２．４±０．９０．１　５１．４±２．１　　２
．８×１０６±０．３　　　４１．８±０．２０．３　
５３．３±１．７　　２．８ｘ１０６＋０．２　　　３
９．３±０．３０．５　５２．０±５．１　　２．８ｘ
１０６±０．２’　　　３４．８±０２１．０　５７．
４ｔ１．７　　２．１×１０６ｔ０．３　　　３４．４
±２．３０から５％以上の範囲の種々の血清濃度を使用
して、細胞をｍＳＢＭ及びｅｍＳＢＭ中で成長させるこ
とができる。しかしながら血清濃度を僅か１％に増して
も９〜１４ｎＭの範囲の細胞の明白な損失によりわかる
ように血清は細胞集団の端末分化又は加齢現象を促進す
ることが判明している。

カルシウムを ケレクジング（ｃｈｅｌｅｘｉｎｇ）　して血清から除
去しても同様である。以上のことから血清が細胞の増殖
及び分化に直接的に又は間接的に影響し、またカルシウ
ムとは関係のない因子を含んでいることが明白となる。

え１鮭旦−基体の艷果□ ■型コラーゲン又はフィブロネクチンの基体（ｉ、ｍ　
Ｓ　１１　Ｍ又はｃｍｓｒｌＭを使用して初代として及
び凍結ストックから表皮細胞を樹立するのに有益である
ことが認められている。コラーゲンはｍＳＢＭを使用し
てヒト表皮ケラチン細胞を培養する際に常習的に使用さ
れる。しかしながら、実際の基体依存性及び基体が培養
寿命（ライフスパン）に及はず効果を決定するために調
査を行った。

コラ−ケン基体を使用してｅ　ｍ　Ｓ　Ｂ　Ｍで初代と
して成長させたヒト表皮ケラチン細胞の凍結ストックを
上述の手順に従いコラ−ケンの存在下（＋　ＣＮ）及び
不在下（−ＣＮ）に平板培養し、ｍＳＢＭで増殖させた
。

集密状態に達したら、−１−ＣＮ細胞をコラーゲンの存
在下及び不在下で培養皿に継代しく表５八参照）、同様
に−ＣＮ細胞をコラーゲンの了ｆ在下及び不作下て培養
皿に継代した（表５Ｂ参照）。一般形熊、４１１．’ｊ
間平板効率及び細胞寸法分布を各フ１１：代で試験した
。。

４ １００％を越える平板効率は、ケラチン細胞を本発明の
培地て継代培養する場合に生じる増殖再開以前の杼めて
短い遅延１％間を意味する。各条件からの細胞を平板培
養し、同時に採取し、表に示すように直接比較した１、
Ｙｉ′Ｖ′径９〜１４ｍＭの細胞の百分率は集団中の増
殖細胞の％を示ず（前１」１のＢａｒｒａｎｄｏｎ及び
Ｇ　ｒ　ｅｅ　ｎの文献）。

コラーゲンの不在下で凍結初代培養物がら樹立した細胞
は、コラーゲン」二で培養した細胞に比較して平板効率
がやや低い。コラーゲンの不在下（ＣＮ）の細胞を更に
コラーゲン存在下（−１−ＣＮ）及び不在下（−ＣＮ）
で培養皿に継代した処、平板効率は−ｉ’ｔ　して（４
−ＣＮ）条件のほうが良好てあった。しかしながら、−
ＣＮ増殖細胞は集密状ｇまて増殖し、継代することがで
きた（表５Ｂ参照）。

フラーケンの春作下に維持し、その後、コラーゲンの存
在下又は不在下て培養皿に継代した細胞は種々の平板効
率を示したが、後続継代でコラ−５ ケンの使用又は不使用に明白な利点又は不利点は３忍め
られなかった（表５八参照）。

８継代増殖し、コラーゲンに継代した細胞は、８継伏目
に平板効率の低下を示したく約２９．４集団倍加に相当
）。コラーゲンの不在下に増殖した細胞は１〕６〜１〕
７（約１９〜２２の集団倍加に相当）の間に平板効率の
低下を示した。

３Ｔ３支持細胞（例えば前出のＲｈｅｉｎｕ＋ａｌｄ及
びＧｒｅｅｎの文献参照）と共に高血清（５％）中で樹
立した表皮細胞の株をｐ４て凍結スＩ・ツクからコラー
ゲンの存在及び不在下で培養皿に平板培養した処、平板
効率に顕著な相異は認められなかった。更に、この失職
で得られる平板効率姐ｍ　Ｓ　Ｉｔ　Ｍで増殖させた３
４１１胞を使用する場自よりも著しく低いことか判明し
、た（表５八及び５Ｂ参照）。

コラーゲンは９〜１．４　＋ｎ　ｍのｆｒ、径範囲に該
当する８・ｍ胞集団、即ち７継代（−ＣＮ）又は８継代
（１−ＣＮ）増殖細胞集団の百分率に影響しないことが
判明したく表５Ｃ参照）。

→−ＣＮ　Ｐ２ ００ ＣＮ　Ｐ２ ８ Ｄｅ＋ 上身　腎づり坦男則牲冬 ８３．３　　　　６６％ ５４　、３　　　　５２％ ＋ＣＮ　Ｐ３ ＣＮ　Ｐ３ ５０　　　５（１５０５０ １９１５１６１６，７ ７１％ ３０％ −Ｉ−ＣＮ　Ｐ４ ＣＮ　Ｐ４ ９０　　１．０５　　　１１５　　　１０３．３８５　
　１１０　　　１０５　　　１０１．６４４％ ３７％ ＋ＣＮ　Ｐ５ ＣＮ　Ｐ５ ５ ３０ ５７．５６２．７　　５８．３ １００　　　６５　　　９８．３ ５４％ ６６％ ＋ＣＮ　Ｐ６ ＣＮ　Ｐ６ ６０ ００ ＋４０　　　１−２０　　　１４０ １３０　　　１１０　　　　１３３ １２％ １３％ ＋ＣＮ　Ｐ７ ＣＮ　Ｐ７ ８０　　　７５　　　　７０　　　　７５６５　　　７
５　　　　９５　　　　７８．３１４％ １４％ ＋ＣＮ　Ｐ８ ＣＮ　Ｐ８ ３２　　　４１　　　　３３　　　　３５．６３２　　
　３４　　　３３　　　　３３４３％ ４３％ Ｂ：　　−ＣＮ の の＋ＣＮ ＣＮの平 ｎｅｔ。

＋ＣＮ　Ｐ３ ＣＮ　Ｐ３ ６０ ８ １５５　　　１８８　　　１６７．６ ８３　　　８０　　　　７７ ４２％ ８ 十ＣＮ　Ｐ４ ＣＮ　Ｐ４ ５０　　　４５　　　７０　　　５５ １８　　　１８　　　　２０　　　　１８．７２１％ ３８５％ →ＣＮ　Ｐ５ ＣＮ　Ｐ５ ＋２０ ０ ＋２０　　　　８０　　　１０６．７ １２０　　　１．００　　　１００ ８．５％ １１．６％ ＋ＣＮ　ｆ’６ ＣＮ　Ｐ６ ７５　　　８６、　　４５　　　６８．７２５　　　３
５　　　３５　　　３１．６１６％ １８％ 十ＣＮ　Ｐ７ ＧＮ　Ｐ７ ５ ２ ３２　　　３０　　　２９ ２３　　　２０　　　２１、．６ ３３．６％ ３２％ ｔ５ｃ：　ＩＩＥＩ’　０２６−７　Ｐ４　−効率−１
−ＧＮ　Ｐ４ ＣＮ １ １２　　　１３　　　１１ １２　　　　９　　　１０．６ 実施例６： 生 膚等価物及びケラチン細 ンー ９ ）・の作成 高血清（５％）及び高カルシウノ、（１，８＋ｎＭ）中
ｍ　Ｓ　Ｂ　Ｍで増殖したケラチン細胞を使用して生体
皮膚等価物を作成した。この操作は、ＭＣＤＢ　１５３
で増殖したケラチン細胞を使用すると実施できないこと
に留意すべきである。表皮は基底層を維持しながら層形
成及び分化しつつ正常に発達した。

ｍ　Ｓ　Ｂ　Ｍで増殖したケラチン細胞を常法（例えば
特許方法）に従って作成した皮膚等価物に平板培養して
生体皮膚等価物を作成した。次に皮膚等価物をｍＳＢＭ
中２日間増殖させた後、ｃａ＋＋を加えて層形成させた
。＋ｎ　Ｓ　Ｂ　Ｍ、０．３％ｃＦＩｌｓ及びｃａ４４
中で皮膚等価物を引き続き培養し、十分に組織化した分
化表皮層を得た。

更に、コラーゲン上ｍｓＢＭ中で細胞を樹立し、集密状
態に達したらカルシウム濃度を１．８ｍＭまで増加させ
、ｍ　Ｓ　Ｂ　Ｍを使用して］、、８ｍＭ　Ｃａ”を４
日間毎日供給し、その後、コラゲナーゼを使用して密着
細胞シートを除去することにより、移植等に適する層形
成表皮細胞のシートを作成した。

カルシラノ、濃度０．０８ｍＭ及びＢ　ＩＩ　Ｅ　濃度
５０ｕｇ／ｚ／を有するｍ　Ｓ　Ｂ　Ｍ培地を使用する
と、コラーゲンを被覆した架橋結合ゼラチン微粒子担体
にヒト表皮ケラチン細胞を高効率で首尾よく平板培養す
ることができた。２５０ｎ容１１ｅｌｃｏ培養容器を使
用して断続的（８分置きに２分間ずつ）に３０　ｒ　ｐ
　ｍで撹拌すると、ゲルビーズ０．５ｇを含む小容量培
地（７５ｙ１）内に５．１Ｘ１０６ヒト表皮細胞（ＩＩ
ＥＰ）を高効率（〉５０％）で播種することができた。

ゲルビーズは、ｍｓＢＭで平衡後、純水１００１１ｆ中
でウシ畦コラーケン約９．５ａｙを一晩被覆し、その後
、まずリン酸緩衝溶液で濯ぎ、次にカルシウムを含有し
ないＤＭＥＭで濯ぐことにより調製した。１週間後、集
密状態のビードをトリプジンＥＤ丁へで採取し、２．１
ｘ　１０’個の細胞を得た。標準培蓑条件及び＋ｎ　Ｓ
　１１　Ｍを使用してこれらの、ｆｌＩｌ胞をＴ２５培
養フラスコに平板培養し、２４時間後に採取及び計数に
より平板効率を決定した処、１００％を越えることが判
明した。

継代数５のケラチン細胞株１１ＥＰ　０４７を使用して
この手順を繰り返した。培地１５０ｍＮ中にゲルビーズ
（表面積約１０００ｃ＋ｎ２）Ｏ．２５ｙを含む２つの
撹拌フラスコの各々に細胞６Ｘ１．０６を平板培養した
。６日後の２つのフラスコからの細胞収量は６．２ｘ　
１０７及び５．６ｘ１．０７であった。こうして下ｊす
１０ｆ８の細胞数の増加に辻することができた。

別の実験の結果、プロテアーゼを使用せずに継代を容易
にするために細胞のビーズ間移動が有効であることか判
明した。継代数４の細胞株ＨＥＰ　０３８を球状コラー
ゲン被覆ゲルヒースに平板培養した。

次に、不規則形状のコラーゲン被覆ゼラチンビー１〜を
４日後に培養物に加えた９、更に２０後にビードを顕（
紋鏡で倹杏した。１細■（シ砒球状ゲルピース及び２ 不規則形状のゼラチンビーズの両方に付着していること
力ｉ認められた。

例８　：　ｍＳＢＭ　　のカルシウムの２　カ　オン王
ｌＬ物の添加 継代数４のヒト表皮ケラチン細胞における細胞増殖及び
寸法分布の改良に関して、１ｍＭス）〜ロンヂウノ、及
び３ｍＭマグネシウノ＼をｍＳＢＭ＋／−ウシ視床下部
抽出物で比較した。下表は３種の培養物がらの結果を示
す。

同様に、別のケラチン細胞株でストロンヂウム用量応答
を決定した。１ｍＭ　Ｓｒは細胞収量を１．７×１０６
から２．Ｉ　Ｘ　４０６に増加させることが判明した。

９１４１１１の分布は２０％から２６％に増加した。別
の実験で更に別の株に、１こると、１ｍＭ５＋・で細胞
収率は１．４５×１０６から２．６６Ｘ１０６に改良さ
れ、倍加時間は３３９ｙ、ｊ７間から２　ｓ　、　１ｎ
ｙ７．間に短縮した。

次の改質ｍＳＢＭ組成： ヒドロコルヂゾン インシェリン １〜ランスフエリン トリヨードチロニン エタノールアミン ０−ホスボリルエタノールアミ アデニン セレン １．１μＨ ５μｇ／１ｔ１ ５１１１？／Ｉｌ１ ０ｐＭ ＩＸｌ、Ｏ−７Ｍ ンｌＸｌ０−”Ｍ Ｏ，１８ｍＭ ５．２６Ｘ　１０−６Ｍ ３ 表皮成長因子　　　　　　　　　１０ｒ＋ＦＩ／ｉｎ（
：ａ４４を含まないＤＭＥＭ　　　　　　　７５％１１
ａｍｓ−Ｆ−１２２５％ ストロンチウム　　　　　　　　１ｍＭを使用して初代
外植片培養物を樹立した。改質は、プロゲステロン（ｃ
ＡＭＰレベルを低下させるように機能し得る）及びｃＡ
ＭＰ増進剤を省き、ｍＳ８Ｍ中で成長促進効果を有する
ことが判明したストロンチウム（実施例８）を加えた点
にある。

新生児包皮から脂肪及び皮下組織を剥離し、１〜２　ｍ
　ｍ　２片に細分した。ウシ視床下部抽出物（ＢＨＥ）
（５０μｙ／１ｖｌ）を加えながら」二記培地で外植片
培養物を樹立した。

外植平板副産物からの収量を表９八に示す。

次に、培地条件を一定に維持しながら細胞を直径１００
　ＩＩＩ　＋１１の培養皿に３×１０Ｊ［ｔｌ胞／ｌＴ
１１で継代した。２代培養物（約１週間後に採取〉から
の収量を表９Ｂに示す。

表９へ：外植片＊副産物を使用するＩｌｌ　Ｓ　Ｂ　Ｍ
中初代培養−ｋ」組り 担ＩＬ株− １０４９ ０５０ １０５１ ０５２ Ｏ５３ ０５４ ０５５ Ｏ５６ ［１０５８ ０５９ Ｏ７０ Ｏ７１ ［＋０７５＃ ＢＯ３２＃ 初代収量（Ｘ　１０６） ］、　９　、０ ４１．０ ３８．０ ４．７ ０ ８．２ ３０．０ ９．７ ２６．０ ６０ １１．０ １２．０ ２３．０ ６５．０ 壇１４旧」し １３日 １３日 １３日 １４日 １４日 １３日 １４日 １４日 １４日 １４日 Ｈ日 １１日 １３日 １２日 ６ ＊ａ胞は新生児包皮外植片から得た。はとんどの場合、
完全な包皮を外植片培養に使用したのではなく、皮膚繊
維芽細胞株の誘導のために一部を保存しておいた。

〃ウシ視床下部抽出物（ＢＨＥ）なしに樹立した細胞。

［１０４９ ［１０５０ ０５１ ０５２ ０５５ １１０８２＃ ７日 ７日 ７日 １０日 １０日 ６日 （ｘｌ、０６） ３．０ ０ ０ ３．０ １２．０ １２．０ （×１０６） ７５．０ ２５０．０ ４００ １００．０ ２２０．０ ３１０．０ ＊細胞の一部のみを初代から平板培養したことに留意さ
れたい。例えば全初代ケラチン細胞を２代７ として平板培養したならば、合計２■日培養後に合計収
量は１．１４Ｘ　１０９になる１゜Ｕウシ視床下部抽出
物（ＤＩＩＥ）を使用せずに樹立及び培養した株。

プロゲステロンを含まず且つ１ｍＭ　５ｒＣ１２を含む
改質ｍｓＣＭ基礎培地でコラーゲン被覆組織培養皿で皮
膚外植片の副産物から、３種の異なる起源のヒト表皮細
胞を樹立した。強力なｃＡＭＰ増進剤であるコレラ毒素
、ケレックスｌ□　（ｃｌ＋ｅｌｅｘｅｄ）新生児ウシ
血清及びウシ視床下部抽出物の存在下及び不在下で外植
片を樹立し、これらの３挿の物質が初代培養及び継代培
養の樹立に及ぼず効果を検討した。

試験した全条件で細胞は外植片副産物として分化した。

細胞収量を全条件で７連続継代監視した。

第１図及び第２図は所与の条件の全細胞を継代した場合
に得られる細胞数として計算した収量／継代を示す。第
１図及び第２０中、ＳはケレックスＩ・血清（０，３％
）を表し、ＣＴはコレラ毒素（９ｎｇ／ｘ１）を表し、
ＢＥｌｌはウシ視床下部抽出物（５０μｙ／ｚＮ＞を表
す。

血清、コレラ毒素及びウシ視床下部抽出物のいずれも初
代の樹立及び正常ヒＩ・ケラチン細胞の連続継代に必要
でないことが判明した。これら３種の物質を含まない対
照培養によると、甲、に３４日間培養及び６日間連続継
代後に１×１０１０の収量が得られた。更に対照条件に
よると、血清囃独及び血清とコレラ毒素との存在下に樹
立及び増殖した培養物に比較して改良された増殖を示し
た。

血清の不在下に使用したウシ視床下部抽出物又はコレラ
毒素のいずれも最終細胞収量を増加することがてきたが
、ウシ視床下部抽出物は細胞収量を大幅に改良すると共
に、集団倍加速度が線形に相持される継代数を増加させ
ることができた。更に、ウシ視床下部抽出物はコレラ毒
素よりも著しく大幅に血清の負の効果を平衡させること
が判明した。ウシ視床下部抽出物が血清の存在下又は不
在下に存在する場合、コレラ毒素は有益な効果をもたな
いことが判明した。

従って、血清、ウシ視床下部抽出物又はザイクリックへ
ＭＰ増進剤のいずれも、ヒ１〜ケラチン細胞の１ｆｌｌ
立及び連続継代に不要である。

１１：　ＥＧＦの　　　のｆ立　　び ケラチン細胞ＢＯ６３を樹立し、実施例９のｌｌＩｓＢ
Ｍ４こＢＩＩＥを加えて増殖させ、その後、２継代後に
貯蔵のために凍結させた。これらの細胞を解凍し、Ｂ　
ＨＥ不在下」二記培地中、６０　＋ｎ　ｍ培養皿にｌ、
×１０５／皿で播種した。培養皿の半数には播種後２時
間後に１０ｎｙ／ｖｔｌまてＩＥＧＦを加えた。３継代
後に細胞を採取及び３１数し、ＥＧＦの不在下て増殖し
ノごものを再培其し、再ひ集密状態まて増殖さぜた。デ
ータ（表１１）から０ 明らかなように、必要に応じてケラチン細胞はＥＧＦの
不在下でｍｓＢＭ中て増始することがてき、ＥＧＦ の存在下の増殖に匹敵する場合もある。

最小補充が所望される場合、ヒドロコルチゾンは不要で
あり、この場合、使用しないほうが好適である。

このことは、ヒドロコルチゾン０．０．０４．０．２．
０．４又は０．８μＦＩ／′ＩＩＣと共に実施例９の培
地中１７×］、　Ｏ’　／　６０　ｍ　ｍ皿でＢＯ６３
ケラヂン細胞株を３ｍ代播種することにより立証された
。２４時間後にプレートを採取し、平均平板効率を決定
し、更に５日後に増１ 殖率を決定した。細胞収量は全条件て同等であった。こ
れらの決定の間で４日間倍加時間を計算した（表１２）
。

上記実施例は例示の目的で記載したものであり、上記の
記載に鑑みて当業者に予想されるような種々の変形も本
発明の趣旨及び請求の範囲に含まれるものと理解された
い。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、実施例１０の実験結果を示す細胞
収量−培養期間のグラフである。

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. （１）インシュリンまたはインシュリン様成長因子と、
   トランスフェリンまたは第一鉄イオンと、トリヨードチ
   ロニンまたはチロキシンと、エタノールアミンまたはＯ
   −ホスホリル−エタノールアミンの少なくとも一方と、
   カルシウムと、栄養素源とを含むことを特徴とする細胞
   培養基。
2. （２）（ａ）インシュリンが約０．５〜約５０μｇ／ｍ
   ｌ存在し、 （ｂ）第一鉄イオンが約５×１０＾−＾８〜約５×１０
   ＾−＾５Ｍ存在し、 （ｃ）トリヨードチロニンが約２〜約２００ｐＭ存在し
   、 （ｄ）Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン及びエタノー
   ルアミンの少なくとも一方が約１０＾−＾６〜約１０＾
   −＾２Ｍ存在し、 （ｅ）カルシウムが約０．００５〜約２．０ｍＭ存在し
   、 （ｆ）栄養素源がＤＭＥＭ、ＩＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｍ１
   ９９、ＲＰＭＩ１６４０、Ｈａｍ’ｓＦ１２、Ｈａｍ’
   ｓＦ１０、ＮＣＴＣ１０９及びＮＣＴＣ１３５の少なく
   とも１つから選択されることを特徴とする請求項１に記
   載の細胞培養基。
3. （３）更に、ヒドロコルチゾンを含むことを特徴とする
   請求項１に記載の細胞培養基。
4. （４）ヒドロコルチゾンが約０．０４〜約４．０μｇ／
   ｍｌ存在することを特徴とする請求項３に記載の細胞培
   養基。
5. （５）更に上皮成長因子を含むことを特徴とする請求項
   １に記載の細胞培養基。
6. （６）上皮成長因子が約１〜約５０ｎｇ／ｍｌ存在する
   ことを特徴とする請求項５に記載の細胞培養基。
7. （７）更にサイクリックＡＭＰのレベル向上剤を含むこ
   とを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基。
8. （８）サイクリックＡＭＰのレベル向上剤がコレラ毒素
   、フォレスコリン、イソプロテレノール、メチルイソブ
   チルキサンチン、ジブチリルｃ−ＡＭＰ、テオフィリン
   、カフェイン及び百日咳菌毒素の少なくとも１つから選
   択されることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基
   。
9. （９）サイクリックＡＭＰのレベル向上剤が約１０＾−
   ＾９〜約１０＾−＾３Ｍ存在することを特徴とする請求
   項７に記載の細胞培養基。
10. （１０）更に、約０．０２〜約２．０ｍＭのアデニンを
    含むことを特徴とする請求項１に記載の培養基。
11. （１１）更に、約０．０５％〜約２．００％のｃｈｅｌ
    ｅｘｅｄ血清を含むことを特徴とする請求項１に記載の
    培養基。
12. （１２）更に、約２×１０＾−＾１＾０〜約２×１０＾
    −＾８Ｍのプロゲステロンを含むことを特徴とする請求
    項１に記載の培養基。
13. （１３）更に、約１０＾−＾９〜約１０＾−＾７Ｍのセ
    レンを含むことを特徴とする請求項１に記載の培養基。
14. （１４）更に、約５×１０＾−＾６〜約５×１０＾−＾
    ４ｇ／ｍｌのウシ視床下部抽出物並びに約１０＾−＾１
    ＾０〜約１０＾−＾６ｇ／ｍｌの酸性線維芽細胞成長因
    子、塩基性線維芽細胞成長因子及びケラチン細胞成長因
    子から成る群の少なくとも１つを含むことを特徴とする
    請求項１に記載の培養基。
15. （１５）更に、約１〜約５０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子
    を含むことを特徴とする請求項１に記載の培養基。
16. （１６）第一鉄イオンが約５×１０＾−＾８〜約５×１
    ０＾−＾５Ｍの硫酸第二鉄によって与えられることを特
    徴とする請求項１に記載の培養基。
17. （１７）第一鉄イオンが約０．０５〜約５０μｇ／ｍｌ
    のトランスフェリンによって与えられることを特徴とす
    る請求項１に記載の培養基。
18. （１８）細胞が上皮細胞であることを特徴とする請求項
    １に記載の培養基。
19. （１９）細胞が表皮細胞またはケラチン細胞であること
    を特徴とする請求項１に記載の培養基。
20. （２０）請求項１に記載の細胞培養基と、プラスチック
    、ガラス、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、
    ヘパラン硫酸プロテオグリカン、または、コラーゲン、
    フィブロネクチン、ラミニンもしくはヘパラン硫酸プロ
    テオグリカンで被覆された微粒子担体のごとき細胞基体
    、または、 ａ、収縮剤がゲル混合物に分散したゲル混合物を形成す
    る条件下にコラーゲン溶液と収縮剤とを混合し、 ｂ、段階（ａ）で調製したゲル混合物をゲル混合物が収
    縮して組織等価物を形成し得る条件下に維持する 段階を含む方法で作成された組織等価物とを含むことを
    特徴とする細胞培養系。
21. （２１）コラーゲンが、ウシの鍵に由来の天然 I 型コ
    ラーゲンであることを特徴とする請求項２０に記載の細
    胞培養系。
22. （２２）請求項２０に記載の増殖用基体に上皮細胞を接
    種し、細胞培養系を細胞増殖促進条件下に維持すること
    を特徴とする上皮細胞の培養方法。
23. （２３）請求項２２に記載の方法で得られた上皮細胞。
24. （２４）集団倍加時間約１６〜約３３時間の細胞増殖が
    生じることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
25. （２５）細胞が約２０〜約５０倍の集団倍加を達成する
    ように細胞を連続継代培養することを特徴とする請求項
    ２２に記載の方法。
26. （２６）約２０〜約６０％のコロニー形成効率を維持し
    つつ細胞が層化及び分化し得るように、方法が更に、約
    １．０ｍＭを上回る濃度のカルシウムを添加することを
    特徴とする請求項２２に記載の方法。
27. （２７）細胞接種物が約３０〜約１０００細胞／ｃｍ＾
    ２を含むことを特徴とする請求項２４または２５に記載
    の方法。
28. （２８）請求項１に記載の培地に上皮細胞を接種し、細
    胞及び培地を細胞増殖促進条件下に維持することを特徴
    とする上皮細胞の培養方法。
29. （２９）請求項２８の方法によって得られた上皮細胞。
30. （３０）集団倍加時間約１６〜約３３時間の細胞増殖が
    得られることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
31. （３１）細胞が約２０〜約５０倍の集団倍加を達成する
    ように細胞を連続継代培養することを特徴とする請求項
    ２８に記載の方法。
32. （３２）細胞接種物が約３０〜約１０００細胞／ｃｍ＾
    ２を含むことを特徴とする請求項３０または３１に記載
    の方法。
33. （３３）細胞増殖が、コロニー形成効率約２０〜約１０
    ０％及び集団倍加５０倍以上の増殖能力を示す初代細胞
    の高速増殖を含むことを特徴とする請求項２２に記載の
    方法。
34. （３４）細胞が約２０〜約６０％のコロニー形成効率を
    維持しつつ層化及び分化し得るように、方法が更に、約
    １．０ｍＭを上回る濃度のカルシウムを添加することを
    特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. （３５）請求項２０に記載の細胞培養系中で、コラーゲ
    ン被覆された微粒子担体に、上皮細胞を平板効率約２０
    〜約４０％で平板化し、微粒子担体と平板化細胞とを細
    胞増殖促進条件下に維持することを特徴とする上皮細胞
    の培養方法。
36. （３６）細胞増殖が集密に到達したときに約２０〜約１
    ００％のコロニー形成効率が維持されていることを特徴
    とする請求項３５に記載の方法。
37. （３７）細胞増殖が集密に近付く高速増殖期においては
    、微粒子担体に対する細胞の付着性を強化するためにカ
    ルシウム濃度を０．０８ｍＭから約１．８ｍＭに増加す
    ることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
38. （３８）ａ、請求項２０に記載の増殖用基体にケラチン
    細胞を接種し、 ｂ、系を細胞増殖条件下に維持する段階を含むことを特
    徴とするケラチン細胞の製造方法。
39. （３９）請求項３８で調製されたケラチン細胞を酵素に
    よってシート状に剥離することを特徴とするケラチン細
    胞シートの製造方法。
40. （４０）請求項３８または３９に記載の方法によって製
    造されたケラチン細胞。
41. （４１）ａ、請求項２０に記載の組織等価物に表皮細胞
    を接種し、 ｂ、細胞培養系を細胞増殖促進条件下に維持し、ｃ、カ
    ルシウムを生理的濃度まで添加し、十分にケラチン化し
    た表皮層が発達する条件下に系を維持する段階を含むこ
    とを特徴とする真皮の表皮形成方法。
42. （４２）栄養素源が７５％のカルシウム非含有ＤＭＥＭ
    と２５％のＨａｍ’ｓＦ−１２とから成ることを特徴と
    する請求項２に記載の培養基。