KR102583179B1 - 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 - Google Patents
칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102583179B1 KR102583179B1 KR1020200162867A KR20200162867A KR102583179B1 KR 102583179 B1 KR102583179 B1 KR 102583179B1 KR 1020200162867 A KR1020200162867 A KR 1020200162867A KR 20200162867 A KR20200162867 A KR 20200162867A KR 102583179 B1 KR102583179 B1 KR 102583179B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- medium
- keratinocytes
- cells
- present
- growth factor
- Prior art date
Links
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 88
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 239000011575 calcium Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 36
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 title claims abstract description 25
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 20
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 20
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 84
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 23
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000006147 Glasgow's Minimal Essential Medium Substances 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 113
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710156796 Cornifin Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 description 2
- 102100025756 Keratin, type II cytoskeletal 5 Human genes 0.000 description 2
- 108010066321 Keratin-14 Proteins 0.000 description 2
- 108010070553 Keratin-5 Proteins 0.000 description 2
- 102100031784 Loricrin Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000007236 involucrin Human genes 0.000 description 2
- 108010033564 involucrin Proteins 0.000 description 2
- 108010079309 loricrin Proteins 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037084 C4b-binding protein alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 102100028314 Filaggrin Human genes 0.000 description 1
- 101710088660 Filaggrin Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 238000012356 Product development Methods 0.000 description 1
- 101710136733 Proline-rich protein Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
- C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 각질형성세포의 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포의 수립 또는 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 배지를 이용하여 각질형성세포를 배양하는 경우 각질형성 세포를 빠른 시간 내에 효과적으로 증식시킬 수 있어 상기 세포를 이용한 치료제 개발에서 원하는 수의 세포를 보다 빠르게 획득할 수 있으며, 각질형성 세포의 활성도를 향상시키는바, 본 발명의 배양 배지를 각질형성세포 연구 및 치료제 개발 분야에서 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 각질형성세포의 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포의 수립 또는 배양을 위한 배지 조성물에 관한 것이다.
표피의 기저층에 존재하는 각질형성세포 (keratinocyte)는 분열 후 위쪽으로 이동하면서 분화가 일어나기 시작하는데, 이러한 각질형성세포의 분화는 정교하게 조절 받는 유전자 발현 변화의 결과로서 세포주기의 정지 및 현저한 세포 형태의 변화를 수반하게 된다. 이때 분화와 관련되어 발현이 증가 하는 유전자로 transglutaminase 및 involucrin, cornifin, loricrin, filaggrin 그리고 small proline-rich protein (SPR) 등이 대표적이다. 각질형성세포의 분화에 영향을 미치는 인자로는 칼슘, vitamin D, retinoic acid, 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 등이 알려져 있다 (Expert Rev Endocrinol Metab. 2012 Jul; 7(4): 461-472).
이 중 칼슘은 각질형성세포의 분화를 촉진하는 생체 인자로 가장 잘 알려져 있으며, 특히 표피의 위쪽으로 갈수록 칼슘 농도가 증가하는 것으로 알려져 있다. 각질형성세포의 분화가 진행되면 세포 막의 안쪽에 involucrin, cornifin, loricrin, SPR 등의 구조단백질을 transglutamiase와 결합시켜 물에 녹지 않는 단단한 구조물인 각질세포막 (cornified cell envelope)을 형성하게 된다. 특히 칼슘은 세포의 생존과 대사활동에 관여하며, 필요한 에너지를 조절하고 세포의 증식과 분화에 관여하기 때문에 세포 배양에 있어 필수 불가결의 요소 중 하나이다. 기존의 각질형성세포 배지의 경우 칼슘의 농도가 0.03 mM 부터 0.1 mM까지 다양하게 사용되어 왔으며, 이는 각질형성세포를 이용한 연구 및 제품 개발에 있어 치명적이라 할 수 있다.
상피세포성장인자 (Epidermal Growth Factor; EGF)는 미국의 생물학자 스탠리 코헨 박사에 의해 발견되었으며, 피부표면에 있는 수용체와 결합하여 새로운 세포의 성장을 촉진 시키는 단백질의 일종으로 알려져 있다. 실제로 상피세포성장인자의 경우 각질형성세포를 배양하는 많은 연구 및 제품들에서 사용되고 있다. 이 또한 다양한 농도가 사용되고 있지만 최근 문헌에 따르면 고농도의 상피세포성장인자의 경우 전환성장인자 베타 (Transforming Growth Factor-β; TGF-β)를 유도하여 각질형성세포의 성장을 저해시키는 메커니즘을 일으킨다는 결과가 알려져 있다.
상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 각질형성세포의 특성을 유지하면서도 높은 세포 증식률 및 활성도를 갖는 각질형성세포 배양용 배지를 제조하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 첨가제 및 기본 배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제를 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 각질형성세포는 인간 피부 유래 각질형성세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 칼슘은 0.03 내지 0.1mM의 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 상피세포성장인자는 0.001 내지 1ng/ml 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 알부민은 0.001mg/ml 이상 1mg/ml 미만의 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 배양은 증식인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 첨가제 및 기본배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 기본 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); MEM (Minimal Essential Medium); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); 및 MCDB로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 배지 조성물은 적어도 5계대 (passage) 이상 각질형성세포의 집단 배가 시간 (population doubling time; PDT) 연장을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 각질형성제포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 배지를 이용하여 각질형성세포를 배양하는 경우 각질형성 세포를 빠른 시간 내에 효과적으로 증식시킬 수 있어 상기 세포를 이용한 치료제 개발에서 원하는 수의 세포를 보다 빠르게 획득할 수 있으며, 각질형성 세포의 활성도를 향상시키는바, 본 발명의 배양 배지를 각질형성세포 연구 및 치료제 개발 분야에서 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 칼슘 농도가 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 1a는 각질형성세포를 칼슘 농도가 상이 (0.024, 0.07, 0.14, 0.26mM)한 4종류의 배지에서 배양하고 4일째에 세포 형태를 보여주는 현미경 이미지이고, 도 1b는 배양 4일째의 세포 수 및 응집 (aggregation)된 정도를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 2는 상피세포성장인자 (EGF) 및 알부민이 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 2a는 각질형성세포를 상피세포성장인자 및 알부민이 표 2와 같이 각각 다른 농도로 포함된 배지에서 배양하고 4일째에 세포 형태를 보여주는 현미경 이미지이고, 도 2b는 배양 4일째의 세포 수를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 3은 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자 (EGF), 알부민의 성분비를 적용한 본 발명에 따른 혼합배지의 각질형성세포의 수립 성능을 확인한 결과로서, 도 3a는 마우스 피부조직 유래 각질형성세포의 수립을 진행하면서 배양 1일 및 6일째에 양성 대조군인 시판 배지 (Lonza KGM)와 혼합배지로 배양된 세포를 현미경으로 관찰한 이미지이고, 도 3b는 배양 5일차에 상기 각 배지로 배양된 세포의 세포 수, 세포생존율 및 세포 크기를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 4는 인간 피부조직 유래 각질형성세포를 본 발명에 따른 혼합배지 및 시판 배지에서 5 계대까지 배양을 진행한 결과로서, 도 4a는 상기 각 배지에서 배양된 5 계대 세포의 현미경 이미지 결과이고, 도 4b는 1 계대부터 5 계대까지 배양된 세포의 집단 배가 시간 (PDT). 세포 직경 및 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 5는 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 인간 각질형성세포를 이용해 웨스턴 블롯을 수행하여 각질형성세포 특이적 마커 단백질의 발현수준을 분석 및 비교한 결과이다.
도 6은 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 및 5 계대 인간 각질형성세포를 이용해 PCR을 수행하여 각질형성세포 특이적 마커 mRNA의 발현수준을 분석 및 비교한 결과이다.
도 7은 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 인간 각질형성세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 콜로니 형성 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 상피세포성장인자 (EGF) 및 알부민이 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 2a는 각질형성세포를 상피세포성장인자 및 알부민이 표 2와 같이 각각 다른 농도로 포함된 배지에서 배양하고 4일째에 세포 형태를 보여주는 현미경 이미지이고, 도 2b는 배양 4일째의 세포 수를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 3은 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자 (EGF), 알부민의 성분비를 적용한 본 발명에 따른 혼합배지의 각질형성세포의 수립 성능을 확인한 결과로서, 도 3a는 마우스 피부조직 유래 각질형성세포의 수립을 진행하면서 배양 1일 및 6일째에 양성 대조군인 시판 배지 (Lonza KGM)와 혼합배지로 배양된 세포를 현미경으로 관찰한 이미지이고, 도 3b는 배양 5일차에 상기 각 배지로 배양된 세포의 세포 수, 세포생존율 및 세포 크기를 측정하여 나타낸 결과이다.
도 4는 인간 피부조직 유래 각질형성세포를 본 발명에 따른 혼합배지 및 시판 배지에서 5 계대까지 배양을 진행한 결과로서, 도 4a는 상기 각 배지에서 배양된 5 계대 세포의 현미경 이미지 결과이고, 도 4b는 1 계대부터 5 계대까지 배양된 세포의 집단 배가 시간 (PDT). 세포 직경 및 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 5는 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 인간 각질형성세포를 이용해 웨스턴 블롯을 수행하여 각질형성세포 특이적 마커 단백질의 발현수준을 분석 및 비교한 결과이다.
도 6은 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 및 5 계대 인간 각질형성세포를 이용해 PCR을 수행하여 각질형성세포 특이적 마커 mRNA의 발현수준을 분석 및 비교한 결과이다.
도 7은 도 4에서 각 배지를 이용해 배양된 3 계대 인간 각질형성세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 콜로니 형성 정도를 확인한 결과이다.
본 발명은 각질형성세포의 특성을 유지하면서도 높은 세포 증식률 및 활성도를 갖는 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제를 제공한다.
본 발명의 대상 세포인, “각질형성세포 (keratinocyte)”란 피부의 각질층으로 분화하는 과정에서 케라틴을 생성하는 표피와 구강 상피층의 세포를 말하며, 피부 표피 세포의 95%를 차지한다. 본 발명에 있어서, 각질형성세포의 기원은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서, 칼슘은 0.03 내지 0.1mM의 농도로 포함되는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.03 내지 0.7mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상피세포성장인자는 0.001 내지 1ng/ml 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.01 내지 0.1ng/ml의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 알부민은 0.001mg/ml 이상 1mg/ml 미만의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 0.1mg/ml의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 배양은 바람직하게는 각질형성세포를 증식시키는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 배지 첨가제 및 기본배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 기본 배지는 통상의 세포 배양용 배지일 수 있고, 세포 배양에 필수적으로 필요한 성분을 모두 포함할 수 있다. 상기 기본 배지는 예컨대 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); MEM (Minimal Essential Medium); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); 및 MCDB로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민이 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 분석하고, 세포의 형태를 변화시지 않으면서 증식에 유효한 최적의 농도를 도출하였다 (실시예 2 및 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 배지 조성물과 시판되는 기존 각질형성세포 배양 배지를 이용해 각질형성세포를 각각 배양하고, 세포의 수립, 증식, 특징 및 활성을 분석함으로써 본 발명의 배지의 우수한 세포 수립 및 배양 성능을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 각질형성세포의 배양을 위한 배지 조성물 이외의 다른 조건, 예컨대 온도, 이산화탄소 농도, 습도, 배양시간, 배양 용기 등 배양에 필요한 조건들은 구체적으로 한정되지 않으며 당업자가 효율적인 배양을 위해 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인간 각질형성세포의 해동 및 배양
본 발명에서 이용한 인간 피부 각질형성세포는 냉동보존된 상태에서 연구실의 세포 보존 질소탱크로 옮겼다. 냉동보존된 세포를 해동한 후 원심분리하여 상층액을 제거하고, 시판되고 있는 각질형성세포 배양배지 (LONZA, Gold)로 세포 침전물을 현탁하여 T-플라스크에 접종한 다음 37℃ 인큐베이터에서 1계대가 진행되는 동안 세포를 안정화시켰다.
실시예 2. 칼슘 농도에 따른 인체각질형성세포의 형태 및 증식능 비교
다음으로, 본 발명자들은 칼슘농도가 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
이를 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 각질형성세포에 트립신기반 효소 (Gibco™ TrypLE™)를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 이어서 상층액을 버리고 하기 표 1의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™ (chemometec, Denmark)을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 6 웰 (well) 플레이트에 세포를 웰 당 1×104 세포로 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였으며, 배양 4일째 세포 사진을 도 1a에 나타내었다. 이후 배양 4일째 세포에 트립신기반 효소 (Gibco™ TrypLE™)를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 버리고 하기 표 1의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였으며. 세포 수 측정 시 세포의 aggregation 정도를 분석하였고, 결과는 도 1b에 나타 내었다.
실험 결과, 표 1, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 칼슘 농도가 0.1mM 보다 높아질 경우 세포의 형태가 변하며 세포의 회수율도 떨어지는 것으로 나타났다. 또한 칼슘 농도가 0.1mM 보다 높아질 경우 세포의 aggregation 정도가 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 칼슘의 농도는 0.03 - 0.1mM 사이에서 유효한 농도임을 확인 할 수 있었다.
| Group | Detail | |
| Sample | 1 | 0.024mM calcium |
| 2 | 0.07mM calcium | |
| 3 | 0.14mM calcium | |
| 4 | 0.26mM calcium |
실시예 3. 상피세포성장인자 및 알부민 성분비에 따른 인체각질형성세포의 형태 및 증식능 비교
다음으로, 본 발명자들은 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor; EGF) 및 알부민 (albumin)이 인간 각질형성세포의 형태 및 증식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
이를 위해, 상기 실시예 1에서 배양한 각질형성세포에 트립신 기반 효소를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 이어서 상층액을 버리고 하기 표 2의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 6 웰 (well) 플레이트에 세포를 웰 당 1×104 세포로 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였으며, 배양 4일째 세포 사진을 도 2a에 나타내었다. 이후 배양 4일째 세포에 트립신기반 효소를 처리한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 버리고 하기 표 2의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였으며. 결과를 도 2b에 나타 내었다.
그 결과, 표 2, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 상피세포성장인자의 경우 0.01 ~ 0.1ng/ml 농도, 알부민의 경우 10 ~ 100ug/ml 농도에서 세포의 형태와 수득률이 좋아지는 것을 확인하였다. 결과적으로 상피세포성장인자와 알부민의 적정 유효 농도는 각각 0.01 - 0.1ng/ml 및 10 - 100ug/ml임을 알 수 있었다.
| Group | |
| 알부민 (ug/ml) | 상피세포성장인자 (ng/ml) |
| 0 | 0, 0.01, 0.1, 1, 10 |
| 10 | 0, 0.01, 0.1, 1, 10 |
| 100 | 0, 0.01, 0.1, 1, 10 |
| 1000 | 0, 0.01, 0.1, 1, 10 |
실시예 4. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 마우스 피부조직 유래 각질형성세포의 수립 확인
본 발명자들은 상기 실시예 2 및 3의 결과에 근거하여, 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지의 세포 수립 성능을 확인하기 위하여 기사용 제품인 LONZA사의 KGM gold 배지를 양성대조군으로 하여 실험을 진행하였다. 본 실시예에서는 기본배지에 칼슘농도 0.07mM, 알부민 100ug/ml, 상피세포성장인자 0.1ng/ml의 성분비를 가지는 혼합배지를 사용하였다.
이를 위해, 마우스의 꼬리 부분의 피부 조직을 분리하였으며, 분리된 꼬리조직은 식염수 또는 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에 넣어 연구실까지 옮겼다. 클린 벤치 내에서 꼬리 조직을 2회 멸균생리식염수로 세척하고, 페트리 디쉬에 세척된 꼬리 조직을 넣고 꼬리의 피부를 벗기는 과정을 진행하였다. 보다 구체적으로, 먼저 블레이드를 이용하여 꼬리의 아래부터 끝까지 가운데를 잘라내고, 가운데 선을 따라 2-3cm 정도의 길이로 피부를 잘라내었다. 이어서 100파이 페트리 디쉬에 상기 잘라낸 피부 조직을 넣고 PBS 15ml을 넣어서 rinsing을 진행하였다. 2ml tube에 각 피부를 넣고 차가운 dispaseII digestion buffer (4mg/ml, 각 배지의 기본배지)로 채운 다음 Rotator 위에 조직이 담긴 tube를 올리고 4℃에서 overnight (12-18h) 배양하였다. 배양 후 DispaseII solution과 각 피부 조직을 함께 100파이 페트리디쉬로 옮기고 PBS 15ml로 잔여 dispaseII를 씻어내었다. 이어서 포셉을 이용하여 피부를 잡고, 표피쪽을 아래로 향하게 하고 진피를 위쪽을 보게 새로운 페트리 디쉬로 옮겨준 후 조심스럽게 피부를 완전히 펴지도록하고, 트립신 기반 효소를 이용하여 세포를 분리하였다. 파이펫을 이용하여 세포 덩어리를 부수어준 후, 100μm cell strain filter를 이용하여 세포를 걸러 50ml conical tube에 담고 100μm cell strain filter를 고정한 채로 180 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 흡입하여 제거한 후 차가운 KC 배양배지를 이용하여 세포 펠렛을 재현탁하고, NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 다음으로, 콜라겐 (Collagen)이 코팅된 6 웰 플레이트에 각 배지를 이용하여 세포를 웰 당 1×104로 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 5일간 배양하였으며, 배양 1일째, 5일째 사진을 도 3a에 나타냈었다. 배양 5일차에 트립신기반 효소를 처리하여 세포를 회수하고 5분 동안 1000rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 버리고 표 2의 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수, 세포의 크기 및 생존율을 분석하여 도 3b에 나타냈다.
실험 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 것처럼 본 발명의 혼합배지를 이용하여 배양한 경우 양성대조군으로 사용한 기사용 배지 (LONZA KGM)와 유사한 세포 형태를 나타내었고, 더 많은 세포 수를 수득할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 인간 피부조직 유래 각질형성세포의 성장 검증
본 발명자들은 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에 의한 인간 피부조직 유래 각질형성세포의 성장능을 확인하기 위하여 기사용 제품인 LONZA사의 KGM gold 배지를 양성대조군으로 하여 passage 1부터 passage 5까지 계대 배양을 진행하였다. 본 실시예에서 이용한 본 발명의 혼합배지는 상기 실시예 4에서와 동일한 조성의 배지를 사용하였다.
구체적으로, 냉동보존된 세포를 해동 후 원심분리하여 상층액을 제거하고, 각 배지로 세포 침전물을 현탁하여 collagen typeIV로 코팅한 25T 플라스크에 7.5 ×104/플라스크 농도로 접종한 후 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양하는 동안 2일 또는 3일에 한 번씩 각 배지를 갈아주었으며, 세포의 밀도가 배양 면적의 80% 이상으로 증식되었을 때마다 계대를 진행하였다. 계대배양 시 트립신 기반 효소를 처리하여 플라스크 바닥에서 각 세포를 떼어낸 후 세포를 원심분리하였고, 상층액을 버리고 남은 세포에 조건별 배지를 첨가하여 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 측정 후 계대 배양은 세포 해동 시 진행한 과정과 동일하게 진행하였다. 세포는 5 계대 (passage 5)까지 계대배양을 진행하였으며, 5 계대 세포의 사진을 도 4a에 나타내었다. 또한, 각 계대에서 획득한 세포 수를 이용하여 집단 배가 시간 (Population Doubling time; PDT), 세포의 크기 및 생존율을 분석하여 도 4b에 나타내었다. 세포의 PDT는 상기 계대 배양시 측정된 세포 수와 배양 시간을 이용하여 아래의 수학식을 통해 계산하였다.
[수학식 1]
PDT (Population Doubling time) = ln(2) X (Δtime between B and A) / ln (count B/ count A)
A= 이전 계대, B= 현 계대
실험 결과, 세포의 형태는 양성 대조군인 기사용 배지 (LONZA KGM)와 유사하게 각질형성세포의 특징인 조약돌 모양을 나타내었다. 또한 5계대까지 배양이 진행되는 동안 세포의 PDT는 양성 대조군 배지에 비해 본 발명의 혼합배지가 더욱 안정적인 것을 확인하였으며, 세포의 크기 및 생존율 또한 안정적이게 유지되는 것을 확인하였다.
실시예 6. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 각질형성세포의 특징 확인
본 발명자들은 상기 실시예 5에서 배양된 세포를 이용하여 본 발명에 따른 혼합배지에서 배양된 각질형성세포의 특징을 검증하였다.
먼저, 웨스턴 블롯을 통해 각질형성세포 마커단백질의 발현수준을 확인하고자 하였다. 실시예 5에서 배양한 세포에 트립신기반 효소를 처리 한 뒤 세포를 회수하여 5분 동안 4000rpm으로 원심분리한 다음, RIPA 용액 (Biosesang, Korea)을 이용하여 단백질을 분리하였고, 단백질 정량 키트 (Thermo fisher scientific, USA)를 사용하여 분리한 단백질을 정량하였다. 이어서 단백질 젤 (Invitrogen, USA)의 웰에 각 단백질을 동일한 양으로 넣은 후 80V 및 100V에서 SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 수행하였다. 다음으로 멤브레인 트랜스퍼 키트 (Invitrogen, USA)를 사용하여 단백질을 멤브레인으로 트랜스퍼한 뒤 1차 및 2차 항체를 순차적으로 넣어 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 HRP-ECL 용액 (Thermo fisher scientific, USA)과 iBright (Thermo fisher scientific, USA)을 이용하여 단백질의 발현 수준을 확인하였으며, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 단백질을 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바왁 같이, 기사용 배지 (LONZA KGM)로 배양한 세포에 비해 본 발명의 혼합배지로 배양한 경우 각질형성세포의 초기 발현 마커인 Cytokeratin 5와 Cytokeratin 14의 발현이 동일하거나 증가한 것을 확인하였다.
이에 더하여, PCR을 통해 각질형성세포 특이적 마커의 mRNA 수준을 비교하기 위해, 실시예 5에서 배양한 세포에 트립신기반 효소를 처리 한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 4000rpm으로 원심분리한 후. easy-BLUE (Intron, Korea)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 이어서 역전사 키트 (Promega, USA)를 이용하여 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하였고, 이를 SimpliAmp Thermal Cycler (Biosystems, Korea)를 이용하여 증폭하였다. 각 PCR 산물들의 양적 차이를 확인하기 위하여 1X TAE buffer로 1% 아가로오스 겔을 만들고 각 웰 당 각각의 프라이머에 해당하는 PCR 산물을 넣은 후 100V에서 전기영동 하였다. 전기영동으로 DNA 분리가 끝난 겔을 iBright (Thermo fisher scientific, USA) 하에서 관찰하여 발현수준을 확인하였으며, 18s ribosomal RNA를 대조군으로 하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 Cytokeratin 5, Cytokeratin 14 및 E-cadherin이 기사용 배지 (LONZA KGM)로 배양한 세포와 동일하게 발현되어있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 혼합배지에서 성장한 세포가 계대 배양하는 동안 안정적으로 세포의 특징을 가진다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 7. 기본배지, 칼슘, 상피세포성장인자, 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 각질형성세포의 활성도 확인
마지막으로, 본 발명자들은 상기 실시예 5에서 배양된 세포를 이용하여 본 발명에 따른 혼합배지에서 배양된 각질형성세포의 활성도를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 실시예 5에서 배양한 세포에 트립신기반 효소를 처리한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 버리고 조건별 배지를 첨가하여 세포를 잘 풀어준 후 NC-250™을 이용하여 세포 수를 측정하였다. 이어서 6 웰 플레이트에 웰 당 5×102개 세포를 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 7일 동안 배양하였다. 7일 후 일정 시간 동안 생성된 세포 군체의 수와 크기를 육안으로 확인하기 위해 배양 배지를 제거 한 후 4% 포르말린 용액으로 실온에서 30분간 세포를 고정시킨 다음 0.1% 크리스탈 바이올렛이 농축된 용액으로 실온에서 30분간 염색하였다. 50개 이상의 세포로 형성된 군체를 하나로하여 각 웰 당 군체 형성 수를 분석하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 기사용 배지 (LONZA KGM)로 배양한 세포보다 본 발명의 혼합배지 조건에서 배양한 세포의 군체 크기가 대체적으로 더욱 컸고, 군체의 수가 더 많이 형성되었음을 확인하였다. 이는 기본배지, 칼슘, 상피 세포 성장인자 (EGF), 알부민의 성분비를 적용한 혼합배지에서 세포의 활성도가 더 증가함을 의미하는 것이다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (10)
- 칼슘, 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor) 및 알부민을 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제로서,
상기 칼슘은 0.03 내지 0.1 mM의 농도로 포함되고,
상기 상피세포성장인자는 0.001 내지 1 ng/ml 농도로 포함되고,
상기 알부민은 0.001 내지 1 mg/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 첨가제.
- 제1항에 있어서,
상기 각질형성세포는 인간 피부 유래 각질형성세포인 것을 특징으로 하는, 배지 첨가제.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 배양은 증식인 것을 특징으로 하는, 배지 첨가제.
- 제1항의 배지 첨가제 및 기본배지를 포함하는, 각질형성세포의 수립 또는 배양용 배지 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 기본배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium); MEM (Minimal Essential Medium); BME (Basal Medium Eagle); RPMI 1640; DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10); DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12); a-MEM (a-Minimal essential Medium); G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium); IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium); KnockOut DMEM (GIBCO, USA); 및 MCDB로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 배지 조성물은 적어도 5계대 (passage) 이상 각질형성세포의 집단 배가 시간 (population doubling time; PDT)의 연장을 억제하는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
- 제7항의 배지 조성물에서 각질형성세포를 배양하는 단계를 포함하는, 각질형성세포의 배양방법.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200162867A KR102583179B1 (ko) | 2020-11-27 | 2020-11-27 | 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 |
| PCT/KR2021/017263 WO2022114727A1 (ko) | 2020-11-27 | 2021-11-23 | 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 |
| US18/039,033 US20240002790A1 (en) | 2020-11-27 | 2021-11-23 | Culture medium composition for establishing or culturing keratinocytes comprising calcium, epideral growth factor, and albumin |
| EP21898553.9A EP4239057A1 (en) | 2020-11-27 | 2021-11-23 | Culture medium composition for establishing or culturing keratinocytes comprising calcium, epideral growth factor, and albumin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200162867A KR102583179B1 (ko) | 2020-11-27 | 2020-11-27 | 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220074399A KR20220074399A (ko) | 2022-06-03 |
| KR102583179B1 true KR102583179B1 (ko) | 2023-09-26 |
Family
ID=81756209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200162867A KR102583179B1 (ko) | 2020-11-27 | 2020-11-27 | 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240002790A1 (ko) |
| EP (1) | EP4239057A1 (ko) |
| KR (1) | KR102583179B1 (ko) |
| WO (1) | WO2022114727A1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006113629A1 (en) * | 2005-04-15 | 2006-10-26 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Chemically defined culture media for expansion and differentiation of epidermal cells and uses thereof for in vitro growth of hair follicles |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL94611A (en) * | 1989-06-05 | 1994-12-29 | Organogenesis Inc | Medium for cell cultures containing insulin or growth factor similar to insulin, transferrin or iron ion, triiodothyronine or thyroxine and method of use |
| EP0780469B1 (fr) * | 1995-12-21 | 2001-02-28 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Lignées immortalisées de cellules dérivés de tissus cutanés humains normaux et milieux de culture sans sérum adaptés à leur culture |
| CA2439899C (en) * | 2001-03-02 | 2015-09-29 | Stratatech Corporation | Improved skin substitutes and uses thereof |
| KR20030043313A (ko) * | 2001-11-27 | 2003-06-02 | 한스바이오메드 주식회사 | 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를주재로 한 피부재생촉진제 및 그의 제조방법 |
| JP2010537626A (ja) * | 2007-09-04 | 2010-12-09 | クイーンズランド ユニバーシティ オブ テクノロジー | フィーダ細胞を含まない培地および培養系 |
-
2020
- 2020-11-27 KR KR1020200162867A patent/KR102583179B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-11-23 EP EP21898553.9A patent/EP4239057A1/en active Pending
- 2021-11-23 WO PCT/KR2021/017263 patent/WO2022114727A1/ko active Application Filing
- 2021-11-23 US US18/039,033 patent/US20240002790A1/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006113629A1 (en) * | 2005-04-15 | 2006-10-26 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Chemically defined culture media for expansion and differentiation of epidermal cells and uses thereof for in vitro growth of hair follicles |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4239057A1 (en) | 2023-09-06 |
| US20240002790A1 (en) | 2024-01-04 |
| KR20220074399A (ko) | 2022-06-03 |
| WO2022114727A1 (ko) | 2022-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102344906B (zh) | 一种毛囊干细胞的分离培养方法 | |
| WO2012096461A2 (ko) | 줄기세포의 부유배양용 조성물 | |
| JP2012527890A (ja) | 茄子科の形成層由来植物幹細胞及びこれの分離培養方法 | |
| CN112852716B (zh) | 一种大黄鱼精巢组织细胞系及其应用 | |
| CN112877277B (zh) | 一种大黄鱼卵巢组织细胞系及其应用 | |
| DE69919531T2 (de) | Aus normalem menschlichem hautgewebe immortalizierte zellinien | |
| KR102583179B1 (ko) | 칼슘, 상피세포성장인자 및 알부민을 포함하는 각질형성세포 수립 또는 배양용 배지 조성물 | |
| CN109475582A (zh) | 基因递送的改进方法 | |
| US5756094A (en) | Methods for stimulating follicular growth | |
| CN104094117B (zh) | 用于评估能够保持上皮干细胞的功能的活性剂的方法 | |
| CN106350519A (zh) | 一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA及其应用 | |
| Vanoni et al. | Effects of temperature on the yeast cell cycle analyzed by flow cytometry | |
| CN112725377B (zh) | 白藜芦醇在电穿孔转染细胞中的应用及电转液 | |
| CN116024159A (zh) | 构建鼠类皮肤类器官的方法 | |
| JP2020063192A (ja) | 真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物およびその製造方法 | |
| KR101984227B1 (ko) | 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법 | |
| US20190161737A1 (en) | Process for continuous cell culture of cancer cells and cancer stem cells | |
| WO2018179374A1 (ja) | 真皮線維芽細胞の培養上清液を含む化粧用組成物およびその製造方法 | |
| KR102025517B1 (ko) | 에티오나마이드를 이용한 줄기세포 이동성 향상 방법 | |
| JP7074908B2 (ja) | シート状細胞培養物の製造方法 | |
| CA2216870C (en) | Compositions and methods for regulating hair growth | |
| KR20240067279A (ko) | 인간 골수-유래 중간엽 줄기세포 시트 및 이의 생산 방법 | |
| CN117568271A (zh) | 一种间充质干细胞亚群及其应用 | |
| WO2023224923A3 (en) | Engineered cells and methods of use | |
| KR20190059886A (ko) | 줄기세포의 층분리 배양 및 증식 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |