KR20030043313A

KR20030043313A - 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를주재로 한 피부재생촉진제 및 그의 제조방법

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Publication number: KR20030043313A
Application number: KR1020010074398A
Authority: KR
Inventors: 김태운; 이종학; 송지현; 정재득; 박성영; 김노수
Original assignee: 한스바이오메드 주식회사
Priority date: 2001-11-27
Filing date: 2001-11-27
Publication date: 2003-06-02

Abstract

본 발명은 사람의 피부조직 또는 모발에서 분리하여 외부에서 증식한 각질세포 현탁액을 성장인자가 함유된 피브린 접착제와 혼합하여 피부재생촉진제를 제조하는 방법 및 그로부터 제조되는 피부재생촉진제에 관한 것이다. 본 발명의 피부재생촉진제는 성장인자를 통하여 진피조직 내의 신생혈관형성을 활성화하고 사람의 피부조직 또는 모발에서 유래한 각질세포와 피브린 접착제가 표피 재형성을 활성화하여 피부재생을 촉진하므로, 이차감염의 방지와 치료기간의 단축을 통하여 허혈성 및 당뇨성 족부 궤양, 욕창 등의 만성 피부질환과 화상치유에 널리 이용할 수 있을 것이다.

Description

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제 및 그의 제조방법{A Human Keratinocyte- Fibrin- Glue-Suspension Incorporated with Wound Healing Growth Factor for Promotion of Skin Regeneration and a Process for Preparing the Same}

본 발명은 사람 각질세포(human keratinocyte) 및 성장인자(growth factor)가 함유된 피브린 접착제(fibrin glue)를 주재로 한 피부재생촉진제 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 신생아의 포피조직(neonatal foreskin) 또는 자가모발의 모낭(autologous hair follicle)에서 분리한 후 외부에서 배양하여 증식한 각질세포 현탁액과 혼합된 트롬빈 용액을 사람 혈액에서 분리한 피브리노겐과 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, 이하,'VEGF'라 약함), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor, 이하, 'FGF'라 약함), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, 이하, 'PDGF'라 약함), 상피성장인자(epidermal growth factor, 이하, 'EGF'라 약함) 등의 사람 성장인자의 혼합액과 중합하여, 단일각질세포와 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 하는 피부재생촉진제를 제조하는 방법 및 그로부터 제조되는 피부재생촉진제에 관한 것이다.

정상적인 피부조직의 항상성 및 기능유지를 위해서는, 혈관을 통한 충분한 산소와 영양분의 공급이 필수적이다. 특히, 피부조직에 상처가 발생한 경우에 상처치유는 육아조직 형성, 표피 재형성, 흉터 형성 등의 과정을 통하여 상처에 대해 신체가 반응하는 일련의 연속적인 과정으로 진행되는데, 이 과정에서 진피 조직에 퍼져 있는 혈관에서 확산기전으로 영양분과 산소가 지속적으로 공급되어야만, 세포증식, 세포외기질(extracellular matrix)의 합성 및 세포와 세포외기질간의 상호작용이 촉진된다.

혈액공급 부족에 의한 피부질환으로 가장 대표적인 질환은 궤양(ulcer)이다. 특히, 심장에서 가장 멀리 떨어져 있는 발은 가장 흔한 궤양 발생 부위이다. 만성 궤양의 원인은 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer)과 허혈성 궤양(ischemic ulcer)으로 나눌 수 있다. 허혈성 궤양중 정맥성 궤양이 가장 흔한 형태이고, 다음이 동맥성 궤양과 당뇨병성 신경장애에 의한 궤양이다. 만성 족부 궤양에서 나타나는 일반적인 특징은 작은 상처나 무좀균에도 상처가 치유되지 않고, 오히려 심화되어 발이 썩어 들어가서 절단해야 하는 경우가 발생하게 된다. 특히, 당뇨병 환자 중 15 내지 20%에서 족부궤양이 발생하고, 당뇨병으로 인한 입원환자의 약 1/4이 족부 궤양환자이며, 또한 이들 중의 상당수가 족부를 절단해야 한다. 이러한 원인은 상기 예시한 바와 같이, 혈액공급의 부족으로 인하여 상처치유 과정이 원활하지 못하기 때문이다. 당뇨성 족부궤양 환자들의 경우에 혈액 순환이 활발하지 못한 상태에서 발이 심장에서 가장 멀리 있기 때문에 혈액순환이 잘 이뤄지지 않아 혈관부전이 나타나기 쉽고, 또한 혈당이 신경을 파괴하기 때문에 신경병증도 발생하므로 상처가 생겨도 상처 부위에 혈액공급이 정상적으로 이루어지지 않고, 초기 치유가 어려워 궤양으로 발전하는 경우가 많다. 통계에 의하면 비외상성 하지절단의 약 반수가 이러한 당뇨와 관계가 있는 것으로 알려져 있을 정도로, 당뇨병성 족부질환으로 인한 인적, 시간적, 경제적 손실은 매우 크다.

일반적인 궤양 치료법으로는, 상처 발생시 초기에 항생제 투여를 통해 일차적으로 치료하고, 상처 부위의 굳은 살에 피가 나면 궤양의 전단계로 보고 항생제 투여와 함께 굳은 살을 도려낸 다음, 수분유지와 감염방지를 위해 드레싱과 소독을 병행하면서 자연적으로 상처가 치유되도록 관리한다. 궤양 초기 단계엔 항생제를 먹거나 특수 깁스를 해서 고칠 수 있지만 지속적으로 혈액이 공급되지 않고 감염이 되면 심하게 썩어 환부 주위를 절단하는 방법 밖에 없다.

현재 활발하게 이용하고 있는 치료법으로는, 상용화된 재조합 사람상피성장인자(recombinant human epidermal growth factor, 이하, 'rhEGF'라 약함)를 사용하는 방법을 들 수 있다. rhEGF는 각질세포의 증식을 도모하여 상처 부위의 상처치료 과정을 촉진하는데, 치료효과가 기존 치료법에 비해서는 우수한 것으로 알려져 있지만, 표피 재형성에 걸리는 시간이 길어 치료과정 동안 이차 감염의 위험이 남아있고, 상처치유에 필요한 충분한 혈액 공급 문제를 근본적으로 해결할 수 없기 때문에, 효과적인 치료법이 될 수는 없다.

최근에는, VEGF, FGF 등의 신생혈관형성 성장인자의 유전자를 포함한 발현벡터를 생체에 투여하는 유전자 치료요법(gene therapy)이 전술한 EGF를 사용하는 방법을 대체하였으나(참조: Bauters CH et al., J. Vasc. Surg., 21:314-325, 1995; Tsurumi Y et al., Circulation, 94:3281-3290, 1996), 이 방법 역시 아직까지는 안전성 문제와 성장인자가 효과적으로 작용할 수 있을 만큼 필요한 부위에 충분히 오랜 시간동안 남아 있을지 확실하지 않다는 점으로 인하여 인체에 활발하게 적용하기는 어렵다.

또한, 조직배양 기술과 계대배양법(serial subculture)의 향상으로 인해 4 cm²크기의 작은 피부조직으로부터 얻은 각질세포가 1개월 내에 성인 피부 전체를 덮을 수 있을 만큼의 수로 증식하는 것이 가능할 정도로 발전하게 됨에 따라(참조: Boyce ST, J. Invest. Dermatol., 81:33s-40s, 1983), 자가피부를 사용하지 못할 정도로 심한 화상뿐만 아니라 만성 피부질환에 이식용 배양 표피층(cultured epidermal sheet graft)을 하나의 치료법으로서 이용하고 있다(참조: Donaldson DJ et al., J. Cell. Sci., 90:325-330, 1988; Green H et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:5665-5670, 1979). 그러나, 장시간의 배양기간, 변화가 심한 이식율, 낮은 부착도, 낮은 물리적 강도로 인한 취급의 어려움, 피부채취 부위의 만성궤양화, 높은 가격 등의 단점들로 인하여 활발하게 이용되지는 않고 있다.

이에, 이식용 배양 표피층의 상기와 같은 단점들을 극복하고자, 피브린 접착제 기질에 각질세포의 배양액을 혼합하여 만든 현탁액을 상처에 적용하려는 시도가 있었다(참조: Horch RE et al., Cell Transplantation, 7:309-317, 1998). 이 치료법은 적절한 생물학적 운반체를 이용하여 체외에서 대량배양한 활발한 증식 능력이 있는 각질세포를 상처 부위에 이식하는 것이 특징으로 다음과 같은 장점이 있다: 자가 피부조직의 표피에서 분리한 단일 각질세포를 피부 이식에 이용할 경우, 효과적인 유착, 증식, 분화의 특징을 가지므로 표피 재형성 시간을 단축시킬 수 있고, 이식 후 면역거부 반응을 유발하지 않는다(참조: Prunieras M, Matrix, 11:302-305, 1991). 또한, 운반체 기질로서 사용하는 피브린 접착제는 상처가 난 조직에 세포 현탁액의 안전한 부착을 가능하게 하는 기계적 특성을 가지면서 상처치유 초기단계에 표피 및 섬유아세포의 유착과 세포증식의 주형 역할을 하는 등 여러가지 생리적 기능도 수행한다(참조: Donaldson DJ et al., J. Cell. Sci., 90:325-330, 1988; Horch R et al., Burns, 20:23-26, 1994). 그러나, 전술한 피브린 접착제 및 단일 각질세포의 우수한 피부재생 효과에도 불구하고, 상처부위에 혈액이 충분하게 공급되지 못할 경우에는 상처치유 효과가 감소할 수밖에 없고, 단일 각질세포의 분리를 위하여 피부조직을 채취한 부위에 또 다른 만성 궤양이 발생할 수 있는 문제점이 야기되었다.

따라서, 피부채취로 인한 이차감염의 위험이 없고 이식후 면역거부 반응을 최소화할 수 있으며, 상처부위의 혈액공급을 원활히 하여, 효과적인 유착 및 표피재형성 기간의 단축을 기할 수 있는 피부재생촉진제의 개발이 절실히 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자는 이식 후 면역거부 반응과 자가 각질세포 획득으로 인한 피부채취 부위에서의 추가 궤양 발생이 없이 상처가 난 피부조직을 빠른 시간 내에 재생할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 신생아의 포피 또는 자가모발에서 분리한 각질세포와 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 이용하여 제조한 피부재생촉진제가 지속적인 혈관재형성을 촉진하여 상처 부위에 충분한 혈액공급을 가능하게 하고, 각질세포의 획득을 위한 추가적인 자가 피부조직 채취없이 빠른 시간 내에 신생아의 포피 또는 자가모발에서 분리한 각질세포의 증식 및 분화를 통하여 피부재생이 촉진됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 제조되는 피부재생촉진제를 제공하는 것이다.

도 1은 서로 다른 사람 성장인자가 함유된 본 발명의 피브린 접착제를 도포한 후, 표피재형성(상처치유) 기간을 나타낸 그래프이다.

본 발명의 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한피부재생촉진제의 제조방법은 신생아의 포피조직 또는 모낭이 포함된 자가모발을 260 내지 320 mOsm/kg의 삼투압을 가지는 동물세포 배양용 배지에 항생제와 우태혈청(fetal bovine serum, 이하, 'FBS'라 약함)을 첨가한 안정화 용액에 넣어 운반하는 단계; 전기 운반된 신생아 포피 또는 자가모발에서 각질세포를 분리하고, 분리해 낸 각질세포를 배양하여 증식한 후 단일 각질세포 현탁액을 수득하는 단계; 및, 사람 혈액으로부터 분리한 피브리노겐과 성장인자의 혼합액을 단일 각질세포 현탁액과 혼합된 트롬빈(thrombin) 용액으로 중합하여, 단일 각질세포 현탁액과 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 수득하는 단계를 포함한다.

이하, 본 발명의 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법을 각 단계별로 설명하면 다음과 같다.

제 1단계: 신생아의 포피조직 또는 자가모발의 운반

신생아의 포피조직 또는 모낭이 포함된 자가모발을, 260 내지 320 mOsm/kg의 삼투압을 가지는 동물세포 배양용 배지에 항생제와 우태혈청(FBS)을 첨가한 안정화 용액에 넣어 2 내지 8℃의 냉장상태로 운반한다:

신생아의 포피조직 또는 모낭이 포함된 자가모발을 채취하여 운반할 때에는, 미생물에 의한 오염과 조직 손상 등에 의한 세포의 괴사(necrosis) 또는 세포 영양분의 고갈 등으로 인한 세포예정사(apoptosis)가 일어날 수 있으므로, 이를 막기위한 세포 안정화 용액을 사용하여야 한다.

전기 세포 안정화 용액은 삼투압에 의한 조직 및 세포의 손상을 막기 위하여 혈장의 삼투압 범위인 260 내지 320 mOsm/kg의 삼투압을 가져야 하는데, 동물세포 배양 등에 이용하는 상업용 배지의 삼투압이 260 내지 320 mOsm/kg이므로, 상업용 배지를 기본용액으로 하여 여러가지 필요한 성분을 첨가하여 사용한다. 동물세포 배양용 배지는 RPMI1640, MEM, DMEM 또는 MCDB153을 사용할 수 있으나, MCDB153을 사용하는 것이 가장 바람직하고, 세균이나 곰팡이의 오염을 막기 위해서 사용되는 항생제로서는 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin), 가나마이신 (kanamycin), 네오마이신(neomycin), 바시트라신 (bacitracin), 젠타마이신 (gentamicin), 반코마이신(vancomycin) 또는 이들의 2개 이상 전기 물질의 혼합물, 가장 바람직하게는 젠타마이신을 항균제로 사용하거나, 암포테리신-비 (amphotericin-B), 니스타틴(nystatin), 폴리믹신(polymyxin) 또는 이들의 2종이상 혼합물, 가장 바람직하게는 암포테리신-비를 항진균제로 사용한다. 또한, 조직의 운반, 보관과정에서 세포 영양분의 공급부족으로 인하여 세포의 괴사 또는 세포예정사가 일어날 수 있으므로, 세포생존에 필수적인 여러가지 폴리펩티드, 호르몬, 대사물질, 각종 영양소 등의 성분이 포함되어 있는 혈청을 첨가한다. 혈청으로는 사람 혈청, 우태혈청(FBS)이 있으나, 사람 혈청은 공급의 제한과 기증자 선별의 복잡한 과정이 필요하므로 FBS를 사용한다. 상피세포 배양의 경우, 칼슘이온 농도가 높으면 분화가 일어나 세포의 증식이 멈추는 것으로 알려져 있는데, 혈청에는 다량의 칼슘이온이 포함되어 있으므로, 1%(v/v) 이하의 농도로 사용한다. 한편, 피부조직을 운반할 때에는, 인간의 체온인 37℃에서 가장 활성이 강한 각종 효소에 의해 조직 손상이 일어나지 않도록 2 내지 8℃의 냉장상태로 운반해야 한다.

제 2단계: 각질세포 분리 및 증식을 통한 단일 각질세포 현탁액의 수득

전기 제 1단계에서 운반된 신생아의 포피 또는 자가모발에서 각질세포를 분리하고, 분리해 낸 각질세포를 섬유아세포 사육층과 무혈청 배지에서 각각 순차적으로 배양하여 증식한 후 단일 각질세포 현탁액을 수득한다:

피부 생검 조직이나 모발에서 각질세포를 얻고자 할 때에는, 물리적인 절단이나, 단백질 분해효소를 이용한 조직의 분해를 통하여 세포를 분리한다. 물리적으로 세포를 분리할 경우 세포의 손상은 적으나 그 획득 수율이 낮으므로, 단백질 분해효소를 이용하여 세포를 분리하는 것이 효과적이다. 사용되는 효소에 따라 세포분리의 효율과 세포의 증식효율이 달라지며, 빠른 시간 내에 각질세포에 손상을 주지 않는 방법으로 세포를 분리하는 것이 중요하다. 널리 사용되는 단백질 분해효소인 트립신(trypsin), 터모라이신(thermolysin), 디스파아제(dispase) 등을 이용하여 각질세포를 기질과의 결합을 제거하고 세포부유액을 만들어 각질세포를 배양한다. 트립신을 이용하여 분리할 때에는, 0.05 내지 0.25%의 농도로 37℃에서 0.5 내지 2시간 동안 처리한다. 디스파아제는 1 내지 3 U/ml의 농도를 37℃에서 0.5 내지 2시간 동안 처리하며, 터모라이신은 0.1 내지 0.5 mg/ml의 농도로 4℃에서 12 내지 16시간 또는 37℃에서 0.5 내지 1시간 동안 처리하면 된다.

각질세포를 배양하는 방법으로는, 분화를 억제하고 증식을 유도하는 여러가지 인자들이 첨가되어 생리학적 환경을 제공하는 저칼슘 무혈청배지(low-calcium serum-free media)를 사용하는 방법과, 섬유아세포 사육층(fibroblast feeder cell layer)을 이용하는 방법이 있다. 그 중 섬유아세포 사육층을 이용한 배양법은 주로 1차 배양에 사용한다. 1차 배양에서 각질세포는 1 내지 5X10⁴cells/cm²농도의 증식억제된 마우스 3T3 사육세포층위에서 배양하는데, 이 배양법은 마우스 3T3 사육 세포로부터 제공되는 다양한 성장인자로 인해 각질세포수가 적어도 세포 군락(colony)을 효과적으로 형성한다는 장점이 있다. 1차 배양용 혈청배지는 DMEM과 Ham's F12 배지의 3:1(v/v) 혼합액을 기본배지로 하여, 1% FBS, 1 내지 10 ㎍/ml 인슐린(insulin), 0.1 내지 0.5 ㎍/ml 하이드로콜티손(hydrocortisone), 0.135 내지 0.15 mM 아데닌(adenine), 0.1 내지 0.5 nM 콜레라 독소(cholera toxin), 2 내지 10 nM 트리이오도티로닌(triiodothyronin), 10 내지 50 ng/ml EGF, 항생제를 첨가한다. 2차 배양에서는 각질세포 이식 시 혈청에 포함되어 있는 단백질로 인한 면역반응이 발생하지 않도록 무혈청배지를 이용하여 각질세포를 배양한다. 세포배양조건은 MCDB 153 배지를 기본배지로 하여, 칼슘(0.1 내지 0.5 mM), EGF(0.5 내지 5 ng/ml), 하이드로콜티손(0.1 내지 1.0 ㎍/ml), 인슐린(1 내지 10 ㎍/ml), 콜레라 독소(0.1내지 1nM), 레티놀산(retinoic acid, 0.5 내지 5 ㎍/ml), 트랜스페린(transferrin, 2 내지 10 ㎍/ml), 아데닌(10내지 50nM), 에피네프린(epinephrine, 0.1 내지 0.5 mM), 트리이오도티로닌(1 내지 10 nM)을 첨가한다. 또한, 각질세포의 세포군락 형성 효율(colony-forming efficiency, CFE)을 높이기 위해 IV형 콜라겐(collagen type IV), 피브로넥틴, 폴리-엘-라이신(poly-L-lysine)을 세포배양 용기에 도말하여 세포배양할 수도 있다.

제 3단계: 단일 각질세포 현탁액과 성장인자가 함유된 피브린 접착제의 수득

전기 제 2단계에서 수득한 단일 각질세포 현탁액과 혼합된 트롬빈 용액으로사람 혈액으로부터 분리한 피브리노겐과 성장인자를 혼합액을 중합하여, 단일 각질세포와 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 수득한다: 즉, 상업적으로 시판되고 있는 사람의 혈장에서 분리한 피브리노겐과 성장인자가 혼합된 용액과 사람 트롬빈및 단일 각질세포 현탁액을 혼합하여 피브린 접착제를 수득한다. 피브린 접착제에는 인체 이식시 체내에 존재하는 단백질 분해효소에 의한 피브린 및 성장인자의 빠른 분해를 막기 위하여, 바람직하게는 단백질 분해효소 저해제로서 아프로티닌을 포함하고, 피브린이 인자 VIII의 작용에 의해 교차결합 망상으로 중합될 수 있도록 염화칼슘(CaCl₂)을 포함한다.

이와 같이 제조된 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제는 이중 주사기와 연결클립으로 구성된 분무보조기구에 피브리노겐과 성장인자 혼합액및 단일 각질세포 현탁액과 혼합된 트롬빈 용액을 각각 포장하여 보관하는데, 피브리노겐 용액과 트롬빈 용액이 서로 혼합되었을 때 피브린 접착제가 형성된다. 본 발명에서 사용하는 트롬빈은 농도가 500 IU로 매우 높아 피브리노겐과 혼합시 피브린 형성이 매우 빨리 진행되므로, 외부에서 혼합할 경우 수초 내에 굳어지게 되어 상처 부위에 도포할 수 없게 된다. 따라서, 상처 부위에서 직접 피브린이 형성되어야 하므로, 적절한 분무보조기구를 사용하여야 한다. 본 발명에서 사용하고 있는 분무보조기구는 두 개의 주사기와 두 주사기의 피스톤을 고정시킬 수 있는 연결클립으로 구성되어, 도포 시 두 주사액이 동일한 양으로 혼합되어 연결클립을 거쳐 분무기 또는 주사바늘을 통할 수 있게 해주는 장치이다. 상처부위의 넓이 및 적용부위에 따라 분무기를 이용하거나 주사바늘을 이용하여 도포할 수 있다. 분무보조기구내에 포장한 피부재생촉진제는 2 내지 8℃의 멸균된 환경 내에서 36시간까지 보관하였다가 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 신생아 포피 유래 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제의 제조

신생아의 포피조직을 25 mM 헤페스(Hepes, Sigma, 미국) 및 400 U/ml 페니실린(Gibco BRL, 미국), 400 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco BRL, 미국), 1% FBS(Gibco BRL, 미국)가 포함된 MCDB153 배지(Gibco BRL, 미국)에 보관하여 운반하였다. 무균작업대 안에서 인산 완충용액(pH 7.4)으로 2 내지 3회 세척하였다. 포피조직에 3U/ml의 디스파아제(Sigma, 미국)를 37℃에서 2시간 동안 처리하여 각질세포를 분리하였다. 분리된 각질세포를 0.05% 트립신(Sigma, 미국)과 0.02% EDTA(Sigma, 미국)로 37℃에서 30분 동안 처리하여 단일 각질세포 현탁액으로 분리시킨 다음, 1% FBS, 1 ㎍/ml 인슐린, 0.1 ㎍/ml 하이드로콜티손, 0.135 mM 아데닌, 2 nM 트리이오도티로닌, 0.1 nM 콜레라 독소, 10 ng/ml EGF, 항생제가 포함된 DMEM과 Ham's F12 배지의 3:1(v/v) 혼합액으로 구성된 1차 배양용 배지 2 ml을 이용하여 세포현탁액을 수득하였다. 증식억제된 3T3 마우스 섬유아세포(1X10⁴cells/㎠)가 도말된 직경 35mm 배양접시에 2X10³cells/㎠의 농도로 각질세포를 접종한 다음, 37℃, 5%의 CO₂조건에서 1주일에 2회 배지를 갈아주었다. 배양용기 바닥면적의 60 내지 70%로 증식하게 되면 트립신을 이용하여 각질세포를 분리한 다음, 다시 75 ㎠ 조직배양 용기에서 무혈청배지로 2차 배양하여 증식시켰다. 무혈청배지는 MCDB 153(Sigma, 미국) 배지를 기본배지로 하여, 칼슘(0.1 mM, Sigma, 미국), 하이드로콜티손(1.0 ㎍/ml, Sigma, 미국), EGF(0.5 ng/ml, Sigma, 미국), 인슐린(1 ㎍/ml, Sigma, 미국), 콜레라 독소(0.1nM, Sigma, 미국), 트랜스페린(2 ㎍/ml, Sigma, 미국), 아데닌(10nM, Sigma, 미국), 에피네프린(0.1 mM, Sigma, 미국)을 첨가한 것을 사용하였다.

두 번의 계대배양을 통하여 각질세포가 4X10⁶세포수만큼 증식하게 되면 단일각질세포 현탁액으로 분리하였다. 분리한 현탁액을 원심분리한 후 침전된 세포들을 미리 준비한 1 ml의 사람 트롬빈 용액(2 NIH units/ml, 500 IU의 사람 트롬빈 50 mg과 염화칼슘(CaCl_{2 ˙}H₂O) 5.88 mg을 포함)에 재부유(resuspending)시켰다. 한편, VEGF(PeproTech Inc., 미국)를 10 ㎍/ml의 농도로 피브리노겐 용액 1ml(피브리노겐 (70 내지 110 mg)과 플라스미노겐(plasminogen, 40 내지 120 ㎍), 트랜스글루타미나제 인자 VIIIa(transglutaminase factor VIIIa)의 효소원인 혈액응고인자 VIII(10 내지 50 U), 혈장 피브로넥틴(plasma fibronectin, 2 내지 9 mg), 아프로티닌(3000 KIU)을 포함)에 혼합한 다음, 37℃에서 30분간 배양시켰다. VEGF가 혼합된 피브리노겐 용액과 단일 각질세포 현탁액이 혼합된 트롬빈용액을 두 개의 주사기로 구성된 분무보조기구에 포장하여, 상처 부위에 도포하거나 4℃에서 보관하였다가 사용하였다.

실시예 2: 모낭이 포함된 자가모발 유래 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제의 제조

신생아 포피 유래 각질세포 대신 모낭이 포함된 자가모발 유래의 각질세포를 다음과 같이 분리하여 배양하는 단계를 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 모낭이 포함된 자가모발 유래 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린접착제를 제조하였다: 모발에서 모낭을 분리하여 모간(hair shaft)을 제거한 다음, 모낭은 25 mM 헤페스(Sigma, 미국) 및 400 U/ml 페니실린(Gibco BRL, 미국), 400 ㎍/ml 스트렙토마이신(Gibco BRL, 미국), 1% FBS(Gibco BRL, 미국)가 포함된 MCDB153 배지(Gibco BRL, 미국)에 보관하여 운반하였다. 무균작업대 안에서 인산 완충용액(pH 7.4)으로 2 내지 3회 세척하였다. 해부 현미경으로 모근(hair bulb)과 손상되지 않은 외모근초(outer root sheath, ORS)를 확인한 성장기의 모낭을 분리하여 사용하였다. 세척액을 제거한 다음, 직경 35 mm 배양접시에 10 내지 20개 정도의 모낭을 옮겼다. 200 ㎕의 0.1% 트립신 0.02% EDTA를 함유한 인산 완충용액을 37℃에서 10분간 처리하였다. 피펫을 이용하여 1% FBS를 함유한 DMEM 배지로 세포현탁액을 만들고, 분리된 각질세포를 10분 동안 200 g의 원심력으로 원심분리하였다. 원심분리하여 모아진 세포를 1% FBS, 1 ㎍/ml 인슐린, 0.1 ㎍/ml 하이드로콜티손, 0.135 mM 아데닌, 2 nM 트리이오도티로닌, 0.1 nM 콜레라 독소, 10 ng/ml EGF, 항생제를 첨가한 DMEM과 Ham's F12 배지의 3:1(v/v) 혼합액 2 ml을 이용하여 세포현탁액을 만들었다. 각질세포 현탁액을 2X10³cell/㎠의 농도로 마우스 3T3 섬유아세포(1X10⁴cell/㎠) 사육층에서 배양하였다. 마우스 3T3 섬유아세포는 10 ㎍/ml 농도의 미토마이신(mitomycin) C를 8시간 동안 처리하여 증식을 억제시킨 후 사용하며, 37℃, 5%의 CO₂조건에서 1주일에 2회 배지를 갈아주며 배양하였다.

실시예 3: 본 발명의 피부재생촉진제를 이용한 피부전층 손상상처(full-thickness wounds)의 치유효과

실험용 동물로 생후 6 내지 8주가 된 면역결핍 생쥐(athymic nude mouse, Balb/c-nu, SLC, 일본)를 이용하여, 무균작업대 안에서 40마리의 생쥐를 에테르(ether)를 이용하여 마취시킨 다음, 생쥐의 등에 4 cm²의 크기로 근육의 근막 부위까지 사각형의 깊은 상처를 내었다. 자연적으로 발생하는 수축을 방지하기 위하여, 상처부위의 모서리는 비흡수성 나일론 실로 고정시켰다. 생쥐를 각각 도포없이 상처만 낸 그룹, 신생아 포피 유래 각질세포(8X10⁶cells)만이 포함된 피브린 접착제를 도포한 그룹, EGF(10, 50 ㎍/ml)와 신생아 포피 유래 각질세포(8X10⁶cells)가 포함된 피브린 접착제를 도포한 그룹, VEGF(10, 50 ㎍/ml)와 신생아 포피 유래 각질세포(8X10⁶cells)가 포함된 피브린 접착제를 도포한 그룹, FGF(10, 50 ㎍/ml)와 신생아 포피 유래 각질세포(8X10⁶cells)가 포함된 피브린 접착제를 도포한 그룹, PDGF(10, 50 ㎍/ml)와 신생아 포피 유래 각질세포(8X10⁶cells)가 포함된피브린 접착제를 도포한 그룹으로 나누어 실험하였다. 분무보조기구를 이용하여 도포가 끝나면, 상처부위를 반투과성 접착필름(semipermeable adhesive film, Op-site, Smith & Nephew, Largo, 미국)과 바세린 거즈(Johnson & Johnson, New Brunswick, 미국), 마른 면 거즈로 드레싱을 하고, 상처 가장자리는 실로 고정하였다. 매일 드레싱 상태를 확인하면서 육안상으로 상처가 치유되는 기간을 비교하여, 도 1에 그래프로 나타내었다. 도 1에서 보듯이, 도포한 다음 상처 부위에서 표피가 완전히 재형성된 기간은 상처만 낸 그룹에서는 평균 45일까지 상처가 남아있었지만, 각 성장인자와 각질세포, 피브린 접착제를 도포한 실험군에서는 성장인자의 농도에 따라 조금의 차이를 보였고, 평균적으로 15일 후에는 표피가 재형성되는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 사람 각질세포(human keratinocyte) 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제(fibrin glue)를 주재로 한 피부재생촉진제 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제를 상처 부위에 도포하면, 피브린에 의해 안정적으로 부착된 상태에서 성장인자가 지속적인 혈관재형성을 촉진하여, 상처 부위에 충분한 혈액 공급을 가능하게 하고, 각질세포로부터 피부재생에 필요한 각종 단백질이 분비되어 빠른 시간 내에 피부재생을 촉진하므로 손상된 부위의 이차감염을 효과적으로 방지하면서, 광범위한 화상, 당뇨병 또는 허혈로 인한 족부 궤양, 다양한 만성 상처들을 치료하는데 적용할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 피부재생촉진제를 사용하면, 각질세포의 획득을 위한 자가 피부조직의 추가적인 채취과정이 없으므로, 또 다른 피부궤양의 발생을 막으면서 각질세포를 이식할 수 있다.

Claims

다음의 각 단계를 포함하는 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법:

(ⅰ) 신생아의 포피조직 또는 모낭이 포함된 자가모발을, 260 내지 320 mOsm/kg의 삼투압을 가지는 동물세포 배양용 배지에 항생제와 우태혈청(FBS)을 첨가한 안정화 용액에 넣어 2 내지 8℃의 냉장상태로 운반하는 단계;

(ⅱ) 전기 운반된 신생아 포피 또는 자가 모발에서 각질세포를 분리하고, 분리해 낸 각질세포를 섬유아세포 사육층 및 혈청배지를 이용한 1차 배양과 무혈청 배지를 사용한 2차 배양으로 각각 순차적으로 배양하여 증식한 후 단일 각질세포 현탁액을 수득하는 단계; 및,

(ⅲ) 전기 단일 각질세포 현탁액과 혼합된 트롬빈(thrombin) 용액으로 사람 혈액으로부터 분리한 피브리노겐과 성장인자의 혼합액을 중합하여, 단일 각질세포 현탁액과 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 수득하는 단계.
제 1항에 있어서,

동물세포 배양용 배지는 RPMI1640, MEM, DMEM 또는 MCDB153인 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항에 있어서,

항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 가나마이신, 네오마이신, 바시트라신, 젠타마이신 및 반코마이신으로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 1종이상의 항균제인 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항에 있어서,

항생제는 암포테리신-비, 니스타틴 및 폴리믹신으로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 1종이상의 항진균제인 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항에 있어서,

분리는 단백질 분해효소를 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 5항에 있어서,

단백질 분해효소는 트립신, 터모라이신 및 디스파아제로 구성되는 그 룹으로 부터 선택되는 1종이상의 효소인 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항에 있어서,

혈청배지는 DMEM과 Ham's F12 배지의 3:1(v/v) 혼합액을 기본배지로 하고, 1% 우태혈청(FBS), 1 내지 10 ㎍/ml 인슐린(insulin), 0.1 내지 0.5 ㎍/ml 하이드로콜티손(hydrocortisone), 0.135 내지 0.15 mM 아데닌(adenine), 0.1 내지 0.5 nM 콜레라 독소(cholera toxin), 2 내지 10nM 트리이오도티로닌(triiodothyronin), 10 내지 50 ng/ml 상피세포성장인자(EGF) 및 항생제가 첨가된 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항에 있어서,

무혈청 배지는 MCDB 153 배지를 기본배지로 하고, 칼슘(0.1 내지 0.5mM), 하이드로콜티손(0.1 내지 1.0 ㎍/ml), 상피세포성장인자(EGF, 0.5 내지 5 ng/ml), 인슐린(1 내지 10㎍/ml), 콜레라 독소(0.1 내지 1nM), 레티놀산(0.5 내지 5㎍/ml), 트랜스페린(2 내지 10㎍/ml), 아데닌(10 내지 50 nM), 에피네프린(0.1 내지 0.5 mM) 및 트리이오도티로닌(1 내지 10nM)을 함유하는 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항에 있어서,

성장인자는 혈관내피성장인자, 섬유아세포성장인자, 혈소판 유래 성장인자 또는 상피성장인자인 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항에 있어서,

피브린 접착제는 단백질 분해효소 저해제와 염화칼슘을 포함하는 것을 특징으로 하는

사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 주재로 한 피부재생촉진제의 제조방법.
제 1항의 방법으로 제조된 사람 각질세포 및 성장인자가 함유된 피브린 접착제를 포함하는 피부재생촉진제.
제 11항에 있어서,

이중 주사기와 연결클립으로 구성된 분무보조기구에 피브리노겐과 성장인자의 혼합액 및 단일 각질세포 현탁액과 혼합된 트롬빈용액을 각각 포장하여 보관하는 것을 특징으로 하는

피부재생촉진제.
제 11항에 있어서,

만성 피부질환과 화상치유에 이용하는 것을 특징으로 하는

피부재생촉진제.